Den perfekta markoren

IBS (Inflammatory Bowel Syndrome), även
kallad känslig tarm eller Colon Irritabile är
förmodligen en av de vanligaste orsakerna
till kronisk diarré hos vuxna. Patienter
med IBS lider av en funktionell tarmsjukdom
och representerar stor grupp inom
både primärvården och specialistvården.
Sjukdomen drabbar 6-22 % av befolkningen
i industriländer med en årlig incidens
på 6-9 % (1).
Att diagnosticera IBS kan vara en svår
uppgift eftersom det saknas laboratorietester
som kan påvisa sjukdomen. Tidigare
fick dessa patienter undergå invasiva
endoskopiska- och röntgenunder sökningar
för att utesluta den inflammatoriska tarmsjukdomen,
IBD (Inflammatory Bowel
Disease).
Idag finns det biokemiska markörer
som används för att skilja mellan IBS och
IBD. Kalprotektin är en av dessa markörer.
Inflammatorisk tarmsjukdom, IBD –
kronisk sjukdom med oklar etiologi.
Inflammatorisk tarmsjukdom, i engelskspråkig
litteratur benämnd som Inflammatory
Bowel Disease (IBD) kännetecknas
av kronisk inflammation i tarmens slemhinna.
Sjukdomen går vanligen med
perioder av ökad aktivitet så kallade
skov varvade med perioder av låg
sjukdomsaktivitet.
IBD innefattar diagnoserna Ulcerös
kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD). En
undergrupp inom IBD är de så kallade
Mikroskopiska koliterna: Lymfocytär
kolit som karakteriseras av ökat antal
6 | Laboratoriet Nr 6 2011
IBD-Diagnostik
Jakten på den
perfekta markören
Att diagnosticera kroniska tarmsjukdomar kan vara en svår
uppgift. En markör som på senare år fått utbredd användning är
kalprotektin. Men den perfekta markören saknas.
AV: ALEKSANDRA MANDIC HAVELKA
Karolinska Universitetssjukhuset
lymfocyter i ytepitelet och Kollagen kolit
med förekomst av tjocka fibrinogenskikt i
tarmslemhinnan.
Oklassificerad kolit är benämning på
diagnosen då man inte med säkerhet kan
klassificera mellan UC och CD.
Inflammatoriska tarmsjukdomar är
vanligare i den industrialiserade världen
med hög förekomst i Skandinavien och
Ulcerös kolit Colitis ulcerosa betyder
blödande tjocktarmsinflammation
och drabbar endast slemhinnan i
colon (tjocktamen och ändtarmen).
Inflammationen är ytlig och sprider
sig inte till djupare vägglager i tarmen.
Nordamerika. Incidensen har generellt
ökat de senaste decennierna och IBD har
blivit mer vanlig bland annat i Asien.
Nyinsjuknandet sker framför allt i de
yngre åldrarna. Den höga incidensen bland
unga resulterar i ackumulering av fall med
IBD och allt högre prevalens siffror.
Prevalensen i Sverige uppskattas idag
till 0.5 – 1.0 %.
Crohns sjukdom kan till skillnad från
UC drabba hela mag-tarmkanalen,
från munnen till anus. Oftast är slutet
av tunntarmen och delar av tjocktarmen
drabbade. Inflammationen
sträcker sig över alla tarmvägglager.
Oftast är bara vissa delar av tarmen
drabbade med tydliga gränser mellan
friska och sjuka regioner.

Incidens och prevalens
av IBD i Sverige
Incidens Prevalens
/100 000 /år /100 000
UC 5-13 > 400
CD 5-9 > 210
Incidens = Antal nya sjukdomsfall under
viss tid, Prevalens = Antal sjuka individer
vid en viss tidpunkt.
Källa: Robert Löfberg: IBD handboken
Orsaken till IBD är okänd. Faktorer som
anses vara av betydelse för sjukdomsutvecklingen
inkluderar bland annat
genetiska variationer, miljöpåverkan
(rökning, kost, fysisk aktivitet), den normala
tarmfloran och tarminfektioner.
Den rådande hypotesen är att inflammationen
utvecklas på grund av att kroppens
immunförsvar reagerar mot den
normala tarmfloran i tarmen hos genetiskt
predisponerade individer.
Symptom – IBD eller IBS? Patienter med
Crohns sjukdom och Ulcerös kolit besväras
av frekventa blodtillblandade diarréer,
buksmärtor och viktnedgång.
Samma symptom förekommer även
hos patienter som får diagnos IBS
(Inflammatory Bowel Syndrome) också
känd som Colon Irritabile eller känslig
tarm. Dessa patienter har ingen inflammation
i tarmen utan lider av en funktionell
tarmsjukdom.
Kalprotektin som diagnostisk markör
för IBD. Endoskopisk undersökning är för
närvarande ”Gold standard” metoden för
diagnos av IBD samt för bedömning av
sjukdomens svårighetsgrad och aktivitet.
Undersökningen är dock invasiv för
patienten, kostsam för sjukvården och
ställer höga krav på utrustning och kompetens.
Därför har man i flera decennier
letat efter markörer som skulle underlätta
diagnosticeringen av IBD.
En idealisk markör skulle vara billig
och icke-invasiv, stabil i avföringen och ha
hög sensitivitet och specificitet för inflammation
i mag-tarm kanalen.
Kalprotektin är ett protein som har flera
av de önskade egenskaperna. Man har
visat att proteinet är stabilt i avföringen i
upp till 7 dagar vilket innebär att provet
kan skickas till laboratoriet med vanlig
post (2). Det finns en billig och icke-invasiv
ELISA metod för mätning av kalprotekin i
feces. Kalprotektin har relativt hög sensitivitet
för IBD och används för att utesluta
IBD vid misstanke om funktionell tarmsjukdom
(IBS).
Hur hamnar kalprotektin i avföringen?
Kalprotektin uttrycks framför allt i neutrofila
granulocyter där den utgör upp till 60
% av proteininnehållet i cytoplasman. Den
förekommer även i monocyter, makrofager
och epitelceller. Neutrofila granulocyter,
monocyter och makrofager är celler som
är involverade i immunförsvaret och är
aktiva i de inflammatoriska processerna
i kroppen. Således förekommer de i stor
mängd i den inflammerade tarmen.
Den inflammerade tarmslemhinnan
har ökad genomsläpplighet och förlorar
sin barriärfunktion vilket medför att bakterier
från tarmlumen kan passera barriären
men också att immunsystemets
celler som neutrofila granulocyter och/
eller deras innehål kan passera ut i tarmlumen.
Detta leder till ökad koncentration
av kalprotektin och andra proteiner från
dessa celler i avföringen.
Kalprotektin – historik och egenskaper.
Kalprotektin tillhör S100-proteinfamiljen
som består av ca 20 lågmolekylära,
kalcium-bindande proteiner. Inbindning
av kalcium leder till konformationsförändringar
och aktivering av proteiner.
Kalprotektin binder både kalcium och
zink och består av ett komplex mellan proteinerna
S100 A8 och S100 A9.
Molekylär modell som visar den sekundära
strukturen av kalprotektin
Dr Mark J. Winter / Science Photo Library
Kalprotektin upptäcktes i början av 80-talet
av Magne Fagerhol och hans medarbetare
vid Ullevaal Universitetssjukhus i Oslo,
och fick namnet L1 protein (Leukocyte 1)
eftersom det identifierades i de neutrofila
granulocyterna (3). 10 år senare föreslog
man ett namnbyte till kalprotektin. ”Kal”
– för att proteinet binder kalcium och ”protektin”
– för dess antimikrobiella och antifungicida
egenskaper (4).
Klinisk användning. Resultaten som
visade signifikant korrelation mellan kalprotektin
i feces och fekal utsöndring av
Indium-111-märkta leukocyter resulterade
i ett ökat intresse för användning av kalprotektin
som markör för inflammatorisk
tarmsjukdom. Roseth och medarbetare
visade att man kunde använda kalprotektin
som ett mått på leukocyternas förekomst
i feces och därmed som ett indirekt
mått på inflammationsgraden i tarmen (5).
Kalprotektin har hittat sin plats i den
kliniska vardagen och används vid utredning
av patienter med oklara mag–tarm
symptom samt för diagnos och uppföljning
av patienter med känd inflammatorisk
tarmsjukdom. Med hjälp av
F-kalprotektin kan man följa sjukdomsaktivitet
och terapisvar.
Normala värden av F-kalprotektin ligger
under 50 mg/kg (med en gråzon mellan
50-100 mg/kg) hos vuxna och barn äldre
än 4 år. Yngre barn har högre gränsvärden
och hos nyfödda kan normala nivåer ligga
på 200-300 mg/kg (6).
I en metaanalys omfattande 30 studier
och 5983 patienter (1210 med IBD) fann
man att F-kalprotektin kunde skilja individer
med IBD från friska med en sensitivitet
och specificitet på 89 % respektive
81 % vid cut-off värdet på 50 mg/kg. Ökade
man gränsvärdet till 100 mg/kg kunde
man med hjälp av F-kalprotektin skilja
mellan sjuka och friska med 98 % sensitivitet
och 91 % specificitet (7).
SENSITIVITET
Andelen sjuka som identifieras
med en test
VETENSKAP
SPECIFICITET
Andelen friska som friskförklaras
med en test
Man har i flera studier jämfört kalprotektin
i feces med de vanligaste inflammationsmarkörerna
i blodet. Resultaten
visade att F-kalprotektin är överlägsen
de serologiska markörerna som CRP, SR
(sänka), anti-Saccharomyces cerevisiae antibody
(ASCA) och perinuclear neutrophil
cytoplasmic antibody (ANCA) (7).
Med F-kalprotektin kunde man
diagnosticera IBD hos barn med
Laboratoriet Nr 6 2011 | 7

SoniC - det första helautomatiska systemet för pre-analytisk upparbetning av avföringsprover
SoniC används idag för upparbetning av prover för analys av fekalt kalprotektin men kan
även användas för extraktion av DNA, RNA och andra biomarkörer i feces. Systemet utför
identifiering, vägning, homogenisering, centrifugering och alikvotering av prover med hög
effektivitet och reproducerbarhet.
95 % sensitivitet medan sensitivitet för
CRP och SR var betydligt lägre och låg på
36 % respektive 41 % (8). Kalprotektin i
plasma/serum är inte lika känslig markör
för IBD som kalprotektin i feces vilket
förklaras med den naturliga kontakten
mellan avföringen och den inflammerade
tarmslemhinnan.
Dessvärre är kalprotektin inte specifik
markör för IBD. Förhöjd koncentration
av kalprotektin i avföringen förekommer
även vid gastrointestinal cancer,
tarminfektioner, blod i provmaterialet,
kolonpolyp, NSAID-enteropati och luftvägsinfektioner
(9).
Hur mäter man kalprotektin i
avföringen? Antalet kalprotektin analyser
har ständigt ökat sedan introduktionen
i landets laboratorieverksamhet. I
Sverige analyseras ca 70 000 kalprotektin
prover/år och trenden mot ökat antal
beställningar fortsätter.
Metoden som används i de flesta laboratorierna
är en ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay). Metoden är relativt
enkel och billig. Den är dock tidskrävande
och medför 1-3 veckor långa svarstider,
delvis beroende på den pre-analytiska
upparbetningen av avföringsprover.
De flesta tillverkare av ELISA-metoden
erbjuder även semi-kvantitativa eller
kvantitativa snabbtester för kalprotektin.
Avsikten är att de ska användas i
8 | Laboratoriet Nr 6 2011
primärvården, alternativt att patienten
ska kunna utföra testet i hemmet och själv
läsa av resultaten.
Utmaningar inför framtiden. Långa
svarstider är en klar nackdel och utgör hinder
i den kliniska vardagen. En självklar
utmaning inför framtiden är att förkorta
svarstider med snabbare analysprocess.
Både den pre-analytiska upparbetningen
av prover och själva analysen av
kalprotektin i avföringen bör automatiseras
för snabb och effektivt leverans av
analysresultat.
Lösningen för automatiserad upparbetning
av avföringsprover är redan framtagen
och utgörs av en robot som ersätter
den manuella upparbetningen och utför
extraktion av kalprotektin ur avföringsprover
(se bild ovan).
Metoden som skulle kunna ersätta
ELISA finns för närvarande inte på
marknaden men är en utmaning för tillverkare
av kalprotektin kit. Dessutom
är en enkel och pålitlig snabbtest för
primärvården och eventuell hemmabruk
ett önskvärt alternativ som komplement
till kalprotektin analysen som utförs på
laboratoriet.
Fekalt kalprotektin är hittills den
mest studerade och bästa markören för
IBD. Förutom kalprotektin finns det flera
intressanta proteiner som studeras i samband
med sjukdomar i mag-tarm kana len.
S100A12 är ett protein som liksom kalprotektin
uttrycks i neutrofila granulocyter
men sägs vara något mer specifik än
kalprotektin eftersom den inte uttrycks i
monocyter, makrofager och epitelceller.
Flera proteiner från eosinofila granulocyter
studeras i samband med tarminflammation
som potentiella markörer för IBD.
Likväl är ingen av markörerna som står
till förfogande idag specifik markör för IBD
vilket innebär att jakten på den perfekta
markören fortsätter.
Referenser
1. Functional bowel disorders and irritable
bowel syndrome in Europe.
Delvaux M. Aliment Pharmacol Ther
2003; 18 Suppl 3: 75-9
2. Assessment of the neutrophil dominating
protein Calprotectin in feces. A
methodologic study
Roseth et al., Scandinavian Journal of
Gastroenterology, 1992:27 (9): 792-8
3. Release and quantification of leukocyte
derived protein (L1).
Fagerhol MK et al., Scand. J. Haematol.
1980; 24:393-8
4. Antimicrobial actions of calcium binding
leucocyte L1 protein, Calprotectin
Steinback et al., Lancet 1990; 336:
763-65
5. Correlation between faecal excretion
of indium-111-labelled granulocytes and
Calprotectin, a granulocyte marker protein,
in patients with inflammatory bowel
disease
Roseth et al., Scandinavian Journal of
Gastroenterology, 1999:34 (1): 5 0-4
6. Fecal Calprotectin levels in healthy
children studied with an improved assay
Fagerberg et al., Journal of Pediatric
Gastroenterology and Nutrition, 2003;
37(4): 468-72
7. Diagnostic precision of fecal
Calprotectin for inflammatory bowel disease
and colorectal malignancy
Von Roon et al., American Journal of
Gastroenterology, 2000; 95(10): 2831-7
8. Colorectal Inflammation is Well
Predicted by Fecal Calprotectin in
Children with Gastrointestinal Symptoms
Fagerberg et al., Journal of Pediatric
Gastroenterology and Nutrition 2005;
40: 450-455
9. Calprotectin, Calgranulin C, and
Other Members of the S100 Protein
Family in Inflammatory Bowel Disease
Manolakis et al., Dig Dis Sci, 2011;
56:1601-11