Utveckling och validering av en metod för datorbaserad kvantifiering ...

Utveckling och validering av en metod för datorbaserad kvantifiering av neuritdegeneration
Fil.dr. Anna Forsby
Marika Nordin-Andersson
Helena Gustafsson
Victoria Wenehed
Institutionen för Neurokemi och Neurotoxikologi,
Stockholms Universitet,
106 91 Stockholm
Projekt: 15/00
Nyckelord: In vitro modell, cellinje, axonal degenerering, axonopati, akrylamid, mekanismer, toxikologi,
neuroblastoma, neurotoxicitet, bildanalysteknik, gliotoxin, diabetes
Syftet med projektet var att utveckla en av oss etablerad in vitro modell för neuritdegenerering genom
att tillämpa datorbaserad bildanalys-teknik istället för den manuella räknemetod som vi hittills har
använt. Neuritdegenerering är en viktig parameter i våra studier av akrylamid-, mögeltoxin- och
glukos-inducerad axonopati.
Neuronal degenerering kan orsakas av bl.a. av toxiska substanser och sjukdomar såsom diabetes.
Axonopati är en form av neuronal degenerering där degenerationen startar i axonerna. Idag utförs i
hög grad studier av neurodegeneration in vivo vilket betyder att en stor mängd djur avlivas ofta efter
plågsamma försök. Detta mycket beroende på att relevanta alternativ saknas eller är få. Vi har tidigare
utvecklat en in vitro-metod som baseras på manuell kvantifiering av antalet neuriter per cell i
differentierade humana neuronala, SH-SY5Y, celler som odlas i serumfritt definierat medium. Som
modellsubstans har vi använt akrylamid, som är känd för att inducera axonopati. Resultaten från en
prevalideringsstudie var goda och visade att metoden kunde särskilja möjliga axonopatiska
substanser.
Den manuella metoden är subjektiv och vi har nu därför införskaffat en avancerad digital kamera
(Olympus) med mjukvara till vårt faskontrastmikroskop.
Förutom att celler kan avbildas med hög upplösning i ljusmikroskopet, kan vi även ta mycket ljussvaga
bilder under fluorescensmikroskopet. De digitala bilderna analyseras sedan med hjälp av datorbaserade
bildanalysprogram. Ett sådant har köpts (Sigma Scan Pro) och vi håller på att anpassa det
efter våra behov.
Experiment under bildanalys
Differentierade SH-SYSY celler har exponerats med mögeltoxinet gliotoxin som produceras av
mögelsvampar som växer i fuktigt förvarat djurfoder. Gliotoxin orsakar neuritdegenerering vid mycket
låga koncentrationer, vilket gör att man kan misstänka att det även orsakar axonopati in vivo.
Försöken under analys har behandlats med gliotoxin tillsammans substanser som påverkar nysyntes
av glutation samt caspas- och calpain-inhibitorer. Syftet är att undersöka vilka mekanismer som kan
vara inblandade vid neuritdegenerationen.
Vi använder även bildanalysmetoden för att studera diabetes-associerad axonopati. Personer med
diabetes uppvisar ofta höga glukoskoncentrationer i blodet vilket kan leda till neurodegenerering. Vi
har sett att insulin-like growth factor, type 1 (IGF-I) kan verka som ett skydd för glukosinducerad
neuritdegenerering i SH-SY5Y-cellerna. Vi undersöker nu mekanismen för detta och har funnit indicier
på att s.k. uncoupling proteiner kan medverka till att glukosinducerade skador i cellerna förhindras.

Publikationer:
Nordin Andersson M., Walum E., Kjellstrand P. and Forsby A. Acrylamide-induced effects on general
and neurospecific cellular functions during exposure andrecovery. Submitted.
Gustafsson H., Adamsson L., Hedander J., Walum E. and Forsby A. (2001). Insulin-like growth factor
type I up-regulates uncoupling protein 3. Bioochem. Biophys. Research. Comm., 287, 1105–111.
JanOve Bratteng. (2002). The role of UCP3 in protection against hyperglycemia-induced oxidative
stress in differentiated human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Undergraduate thesis. Stockholm
University.
V. Wenehed, A. Solyakov, A. Stepinska, E. Jonsson, I. Thylin, P.
Häggblom and A. Forsby. Cytotoxic response of Aspergillus fumigatus-producedmycotoxins in broth,
corn and commercial animal feed substrates. Manuscript.
Abstracts
Gustafsson H. and Forsby A. (2001) IGF-I-mediated up-regulation of uncoupling protein 3 (UCP3) – A
neuroprotective pathway? l9th SSCT Workshop, Ringsted, Danmark
Gustafsson H., Bratteng J.O., Söderdahl T., Sjögren M. and Forsby A. (2002). Possible involvment of
uncoupling proteins in IGF-I mediated protection from diabetic neurodegeneration. 38th annual
meeting of the European association for the study of diabetes, Budapest, Hungary.
Wenehed V., Holbach S., Sjögren M. and Forsby A. (2002). Gliotoxin-induced oxidative stress in
neuronal SH-SYSY cells. EUROTOX-2002, Budapest, Hungary.