Utveckling och validering av en metod för datorbaserad kvantifiering ...
Utveckling och validering av en metod för datorbaserad kvantifiering ...
Utveckling och validering av en metod för datorbaserad kvantifiering ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>Utveckling</strong> <strong>och</strong> <strong>validering</strong> <strong>av</strong> <strong>en</strong> <strong>metod</strong> <strong>för</strong> <strong>datorbaserad</strong> <strong>kvantifiering</strong> <strong>av</strong> neuritdeg<strong>en</strong>eration<br />
Fil.dr. Anna Forsby<br />
Marika Nordin-Andersson<br />
Hel<strong>en</strong>a Gustafsson<br />
Victoria W<strong>en</strong>ehed<br />
Institution<strong>en</strong> <strong>för</strong> Neurokemi <strong>och</strong> Neurotoxikologi,<br />
Stockholms Universitet,<br />
106 91 Stockholm<br />
Projekt: 15/00<br />
Nyckelord: In vitro modell, cellinje, axonal deg<strong>en</strong>erering, axonopati, akrylamid, mekanismer, toxikologi,<br />
neuroblastoma, neurotoxicitet, bildanalysteknik, gliotoxin, diabetes<br />
Syftet med projektet var att utveckla <strong>en</strong> <strong>av</strong> oss etablerad in vitro modell <strong>för</strong> neuritdeg<strong>en</strong>erering g<strong>en</strong>om<br />
att tillämpa <strong>datorbaserad</strong> bildanalys-teknik istället <strong>för</strong> d<strong>en</strong> manuella räkne<strong>metod</strong> som vi hittills har<br />
använt. Neuritdeg<strong>en</strong>erering är <strong>en</strong> viktig parameter i våra studier <strong>av</strong> akrylamid-, mögeltoxin- <strong>och</strong><br />
glukos-inducerad axonopati.<br />
Neuronal deg<strong>en</strong>erering kan orsakas <strong>av</strong> bl.a. <strong>av</strong> toxiska substanser <strong>och</strong> sjukdomar såsom diabetes.<br />
Axonopati är <strong>en</strong> form <strong>av</strong> neuronal deg<strong>en</strong>erering där deg<strong>en</strong>eration<strong>en</strong> startar i axonerna. Idag ut<strong>för</strong>s i<br />
hög grad studier <strong>av</strong> neurodeg<strong>en</strong>eration in vivo vilket betyder att <strong>en</strong> stor mängd djur <strong>av</strong>livas ofta efter<br />
plågsamma <strong>för</strong>sök. Detta mycket bero<strong>en</strong>de på att relevanta alternativ saknas eller är få. Vi har tidigare<br />
utvecklat <strong>en</strong> in vitro-<strong>metod</strong> som baseras på manuell <strong>kvantifiering</strong> <strong>av</strong> antalet neuriter per cell i<br />
differ<strong>en</strong>tierade humana neuronala, SH-SY5Y, celler som odlas i serumfritt definierat medium. Som<br />
modellsubstans har vi använt akrylamid, som är känd <strong>för</strong> att inducera axonopati. Resultat<strong>en</strong> från <strong>en</strong><br />
pre<strong>validering</strong>sstudie var goda <strong>och</strong> visade att <strong>metod</strong><strong>en</strong> kunde särskilja möjliga axonopatiska<br />
substanser.<br />
D<strong>en</strong> manuella <strong>metod</strong><strong>en</strong> är subjektiv <strong>och</strong> vi har nu där<strong>för</strong> in<strong>för</strong>skaffat <strong>en</strong> <strong>av</strong>ancerad digital kamera<br />
(Olympus) med mjukvara till vårt faskontrastmikroskop.<br />
Förutom att celler kan <strong>av</strong>bildas med hög upplösning i ljusmikroskopet, kan vi äv<strong>en</strong> ta mycket ljussvaga<br />
bilder under fluoresc<strong>en</strong>smikroskopet. De digitala bilderna analyseras sedan med hjälp <strong>av</strong> <strong>datorbaserad</strong>e<br />
bildanalysprogram. Ett sådant har köpts (Sigma Scan Pro) <strong>och</strong> vi håller på att anpassa det<br />
efter våra behov.<br />
Experim<strong>en</strong>t under bildanalys<br />
Differ<strong>en</strong>tierade SH-SYSY celler har exponerats med mögeltoxinet gliotoxin som produceras <strong>av</strong><br />
mögelsvampar som växer i fuktigt <strong>för</strong>varat djurfoder. Gliotoxin orsakar neuritdeg<strong>en</strong>erering vid mycket<br />
låga konc<strong>en</strong>trationer, vilket gör att man kan misstänka att det äv<strong>en</strong> orsakar axonopati in vivo.<br />
Försök<strong>en</strong> under analys har behandlats med gliotoxin tillsammans substanser som påverkar nysyntes<br />
<strong>av</strong> glutation samt caspas- <strong>och</strong> calpain-inhibitorer. Syftet är att undersöka vilka mekanismer som kan<br />
vara inblandade vid neuritdeg<strong>en</strong>eration<strong>en</strong>.<br />
Vi använder äv<strong>en</strong> bildanalys<strong>metod</strong><strong>en</strong> <strong>för</strong> att studera diabetes-associerad axonopati. Personer med<br />
diabetes uppvisar ofta höga glukoskonc<strong>en</strong>trationer i blodet vilket kan leda till neurodeg<strong>en</strong>erering. Vi<br />
har sett att insulin-like growth factor, type 1 (IGF-I) kan verka som ett skydd <strong>för</strong> glukosinducerad<br />
neuritdeg<strong>en</strong>erering i SH-SY5Y-cellerna. Vi undersöker nu mekanism<strong>en</strong> <strong>för</strong> detta <strong>och</strong> har funnit indicier<br />
på att s.k. uncoupling proteiner kan medverka till att glukosinducerade skador i cellerna <strong>för</strong>hindras.
Publikationer:<br />
Nordin Andersson M., Walum E., Kjellstrand P. and Forsby A. Acrylamide-induced effects on g<strong>en</strong>eral<br />
and neurospecific cellular functions during exposure andrecovery. Submitted.<br />
Gustafsson H., Adamsson L., Hedander J., Walum E. and Forsby A. (2001). Insulin-like growth factor<br />
type I up-regulates uncoupling protein 3. Bio<strong>och</strong>em. Biophys. Research. Comm., 287, 1105–111.<br />
JanOve Bratt<strong>en</strong>g. (2002). The role of UCP3 in protection against hyperglycemia-induced oxidative<br />
stress in differ<strong>en</strong>tiated human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Undergraduate thesis. Stockholm<br />
University.<br />
V. W<strong>en</strong>ehed, A. Solyakov, A. Stepinska, E. Jonsson, I. Thylin, P.<br />
Häggblom and A. Forsby. Cytotoxic response of Aspergillus fumigatus-producedmycotoxins in broth,<br />
corn and commercial animal feed substrates. Manuscript.<br />
Abstracts<br />
Gustafsson H. and Forsby A. (2001) IGF-I-mediated up-regulation of uncoupling protein 3 (UCP3) – A<br />
neuroprotective pathway? l9th SSCT Workshop, Ringsted, Danmark<br />
Gustafsson H., Bratt<strong>en</strong>g J.O., Söderdahl T., Sjögr<strong>en</strong> M. and Forsby A. (2002). Possible involvm<strong>en</strong>t of<br />
uncoupling proteins in IGF-I mediated protection from diabetic neurodeg<strong>en</strong>eration. 38th annual<br />
meeting of the European association for the study of diabetes, Budapest, Hungary.<br />
W<strong>en</strong>ehed V., Holbach S., Sjögr<strong>en</strong> M. and Forsby A. (2002). Gliotoxin-induced oxidative stress in<br />
neuronal SH-SYSY cells. EUROTOX-2002, Budapest, Hungary.