QST*R - Gen-Probe, Inc.

10. Vortexblanda noga igen vid hög hastighet i 10 sekunder.
11. Centrifugera proverna vid 12 000 g i 3 minuter. Supernatanten innehåller det
extraherade DNA:t.
12. Fortsätt till PCR-förberedelserna eller förvara det extraherade DNA:t vid –20 °C tills
det ska användas.
DNA-koncentration
Vi rekommenderar att alternativa metoder för DNA-extraktion och alternativa provtyper
utvärderas noga med Elucigene QST*R-analysen innan resultaten används för
diagnostik.
Under optimala PCR-förhållanden och med användning av de rekommenderade
inställningarna* för provinjektion som anges i kapillärkolonnkörningsmodulen (sid. 13),
erhålls godtagbara resultat konsekvent med inmatade DNA-mängder på 1,25 ng till
10 ng.
*Anm. Inställningar för provinjektion kan ändras så att de passar mängden amplikon som
produceras under PCR-reaktionen, vilken kan variera beroende på mängden inmatat
genom-DNA som tillsatts. Mindre amplikon kan appliceras till kolonnen för analys genom
att man reducerar injektionstiden. Omvänt kan mer amplikon appliceras till kolonnen för
analys genom att man ökar antingen tiden eller spänningen för injektionen. Tidigare
amplifierade prover kan återinjiceras flera gånger för ny analys.
Analysprotokoll
Amplifieringsprocedur
Där prover har extraherats med användning av Instagene-metoden rekommenderar vi att
outspädd supernatant används direkt i PCR-reaktionen.
Anm. För att minimera risken för kontamination måste steg 3–5 utföras i ett område som
är fritt från DNA. Dessutom ska steg vidtas för att undvika kontamination med PCRprodukt.
1. Programmera den termiska cyclern för en enstegscykel för att aktivera DNApolymeraset
vid 95 °C i 15 minuter kopplat till ett program för amplifieringscykling på
30 sekunder vid 95 °C (denaturering), 1 minut och 30 sekunder vid 59 °C
(primerbindning) och 1 minut och 30 sekunder vid 72 °C (förlängning) under 26 cykler.
Detta ska kopplas till en 30-minuters tidsfördröjningsfil vid 72 °C (förlängning) i den sista
cykeln.
AN000BY001SV Rev.07/2012 Sida 10 av 36