Detektion av könskromosomer med hjälp av FISH - Umeå universitet
Detektion av könskromosomer med hjälp av FISH - Umeå universitet
Detektion av könskromosomer med hjälp av FISH - Umeå universitet
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>Umeå</strong> Universitet<br />
Bio<strong>med</strong>icinska analytikerprogrammet<br />
<strong>Detektion</strong> <strong>av</strong> <strong>könskromosomer</strong> <strong>med</strong> <strong>hjälp</strong> <strong>av</strong> <strong>FISH</strong><br />
XXXX XXXX, YYYY YYYYY<br />
GGGG GGGGG, ZZZZZ ZZZZZZZ<br />
Årskull: BMA-08<br />
Laborationsrapport i Laboratorie<strong>med</strong>icin 1, termin 5<br />
Laborationsdatum: 2010-11-01 – 2010-12-01 Inlämnad: 2010-12-02 Godkänd: [(2010-12-XX)]<br />
Handledare: XXXX XXXXX
Abstrakt<br />
Fluorescerande in situ hybridisering är en metod där en fluorescence inmärkt probe binder in till en<br />
specifik nukleotidsekvens hos patientens DNA för att synliggöra förekomst eller <strong>av</strong>saknad <strong>av</strong> en<br />
kromosom eller ett kromosomfragment. Vid Turners syndrom saknas en X kromosom hos flickor som<br />
yttrar sig <strong>med</strong> bland annat kortväxthet och infertilitet. En sann Turners innebär att X kromosomen<br />
saknas i alla celler, <strong>med</strong>an en mosaik innebär en blandning <strong>av</strong> celler <strong>med</strong> genuppsättningarna 45 X0<br />
och 46 XX. Syftet <strong>med</strong> laborationen var att detektera <strong>av</strong>vikelser i <strong>könskromosomer</strong>nas uppsättning<br />
<strong>med</strong> <strong>hjälp</strong> <strong>av</strong> <strong>FISH</strong>. T-lymfocyter från en gr<strong>av</strong>id kvinna preparerades för <strong>FISH</strong> och analyserades i<br />
fluorescencemikroskop. Slutsatsen var att kvinnan saknade en X kromosom vilket tydde på Turners<br />
syndrom.<br />
Nyckelord:<br />
Fluorescence in situ hybridisation, Turners syndrom, <strong>könskromosomer</strong>, probe, mosaik<br />
1
Introduktion<br />
Normalt innehåller alla somatiska celler hos människan 46 kromosomer eller 23 par, 22 par är<br />
autosomala och 1 par är <strong>könskromosomer</strong>. De vanligaste <strong>av</strong>vikelserna hos <strong>könskromosomer</strong>na är<br />
Klinefelter’s (47,XXY), Turner’s (45, X0), Trippel-X (47, XXX) och XYY syndrom (47, XYY) (1).<br />
Turner’s syndrom kan uppkomma i äggcellerna när separationen <strong>av</strong> XX kromosomerna misslyckas så<br />
att den ena dottercellen helt saknar X kromosom. Vid befruktning <strong>med</strong> en X-spermie bildas ett embryo<br />
<strong>med</strong> 45 X0 (sann Turners), men om den befruktas <strong>av</strong> en Y-spermie så dör cellen (2). Om den felaktiga<br />
separationen uppkommer efter befruktningen, bildas en så kallad mosaik där några celler har<br />
genuppsättningen 45 X0 och andra har 46 XX. Dessa individer är ofta mindre drabbade <strong>av</strong> sjukdomen<br />
och dess symptom och kan spontant bli gr<strong>av</strong>ida (3). Flickor <strong>med</strong> syndromet är ofta kortväxta, har<br />
defekter i inre organ såsom skelettet, kardiovaskulärt och urinsystemet, går inte in i puberteten och är<br />
ofta infertila (4).<br />
Trisomier och monosomier kan detekteras vid karyotypering där kromosomerna färgats <strong>med</strong> Giemsa<br />
(G-bandning), och man ser <strong>av</strong>vikelser i antalet kromosomer. Men vid ytterligare diagnostik och vid<br />
mer specifika frågeställningnar är Fluorescence in situ hybridization (<strong>FISH</strong>) att föredra.<br />
Vid både G-bandning och <strong>FISH</strong> måste kromosomerna vara i sitt mest kondenserade tillstånd. I<br />
cellcykeln är kromosomerna endast synliga under mitosen, när själva DNAt ska replikera sig. Inom<br />
mitosen är kromosomerna som mest kondenserade i metafasen och kan då differentieras. Tillsatts <strong>av</strong><br />
phytohemagglutinin vid cellodlingen ökar cellproliferationen och ett större antal celler fås (5). Efter<br />
skörd tillsätts colcemid som förhindrar bildning <strong>av</strong> mitosspindeln vilket gör att cellcykeln stannar upp<br />
i metafasen (6).<br />
<strong>Detektion</strong> <strong>av</strong> specifika gensekvenser sker <strong>med</strong> prober riktade mot kända loci som normalt finns hos<br />
kromosomerna. Det möjliggör att antal, förekomst eller <strong>av</strong>saknad <strong>av</strong> gener kan bestämmas som ett led<br />
i diagnostiken <strong>av</strong> bland annat cancer och könsbestämning. En probe är en kort DNA sekvens <strong>med</strong> känd<br />
nukleotidsekvens som är inmärkt <strong>med</strong> flourescence som hybridiserar <strong>med</strong> DNA och kan detekteras i<br />
flourescence mikroskop. Proberna kan vara centromerprober, lokus-specifika, telomerprober eller<br />
kromosomspecifika. Prober riktade mot centromerer används ofta vid aneuploiditet (trisomier och<br />
monosomier) hos <strong>könskromosomer</strong>na (1) vid könsbestämning eller prenatal diagnostik, men även<br />
efter benmärgstransplantationer. Telomerprobe märker in telomererna på kromosomerna och kan<br />
dels användas vid åldersbestämning, men även vid cancergenetik. Lokus-specifika prober används för<br />
att se <strong>av</strong>vikelser som deletioner, amplifieringar, insertioner och translokationer (7), <strong>med</strong>an<br />
kromosomspecifika prober färgar varje kromosom <strong>med</strong> en specifik färg i så kallad Multicolour <strong>FISH</strong><br />
(M-<strong>FISH</strong>) och visar mer omfattande kromosomstörningar som ger komplexa karyotyper.<br />
Prober som kan användas vid könsbestämning är CEPX, en centromerprobe som märker in Xp11.1 –<br />
q11.1 och <strong>av</strong>ger en orange färg och CEPY som märker in Yq12 och <strong>av</strong>ger en grön färg. Med <strong>hjälp</strong> <strong>av</strong><br />
dessa räknas antalet X och Y kromosomer i metafaser och interfaser.<br />
Syftet <strong>med</strong> laborationen var att <strong>med</strong> <strong>hjälp</strong> <strong>av</strong> interfas- och metafas <strong>FISH</strong> upptäcka <strong>av</strong>vikelser i antalet<br />
<strong>könskromosomer</strong> i ett patientprov i fluorescencemikroskop.<br />
2
Material och metoder<br />
Patient<br />
Helblod i Na-Heparinrör från gr<strong>av</strong>id kvinna (född 1976) <strong>med</strong> Turner frågeställning.<br />
Odling och fixering <strong>av</strong> celler<br />
Lymfocyter från perifert blod odlades i cellodlings<strong>med</strong>ium och phytohemagglutinin i 37◦C i 72 timmar.<br />
Colcemid tillsattes och efter två timmar centrifugerades röret och supernatanten <strong>av</strong>lägsnades och en<br />
hypoton lösning tillsattes till cellerna. Röret inkuberades i 20 minuter i rumstemperatur. Efter<br />
centrifugering sögs supernatanten bort och nygjord fixeringslösning tillsattes (metanol:ättiksyra 3:1).<br />
Detta upprepades två till tre gånger. Röret centrifugerades och supernatanten <strong>av</strong>lägsnades så att rätt<br />
koncentration lösning erhölls. Fixerade celler droppades på glas och glaset lades på en kyvett i ett<br />
vattenbad i 55◦C i några minuter. Antalet metafaser i preparatet bedömdes i mikroskop. Glaset<br />
förvarades i rumstemperatur över natten för att åldras.<br />
Hybridisering <strong>med</strong> probe<br />
Arbete <strong>med</strong> probe utfördes i mörker. Proben (CEP X/CEP Y) (Cat # 7J2050, Vysis, Illinois) vortexades<br />
och snabbcentrifugerades. 10 µL probe applicerades på det område på glaset <strong>med</strong> flest metafaser. Ett<br />
täckglas lades ovanpå proben och limmades fast. Proben denaturerades genom att inkubera glaset på<br />
värmeblock, 73 ◦C i 3 minuter. Glaset inkuberades i en fuktkammare i 37 ◦C över natten.<br />
Färgning <strong>av</strong> kromosomer<br />
En kyvett <strong>med</strong> tvättlösning (0,4xSSC/0,3%NP40) placerades i ett vattenbad, 73 ◦C. Täckglaset<br />
<strong>av</strong>lägsnades och glaset tvättades i tvättlösningen i 2 minuter. Glaset sattes i en kyvett <strong>med</strong> 2xSSC i<br />
rumstemperatur i 3 minuter. Glaset kontrastfärgades <strong>med</strong> DAPI (20µL DAPI + 80 mL 2xSSC) i<br />
rumstemperatur i 3 minuter. Tre droppar antifade applicerades på glaset och ett stort täckglas sattes<br />
ovanpå. Glaset förvarades i en svart box tills det analyserades <strong>med</strong> ett fluorescensmikroskop.<br />
3
Resultat<br />
<strong>Detektion</strong> <strong>av</strong> <strong>könskromosomer</strong><br />
I interfas <strong>FISH</strong> fanns en cell <strong>med</strong> en orange fluorescerande signal, som bundit till centromeren hos en<br />
X-kromosom, figur 1. En orange fluorescerande signal syntes i metafas <strong>FISH</strong> i centromeren hos en Xkromosom,<br />
figur 2. I metafas <strong>FISH</strong> fanns 45 kromosomer.<br />
4
Diskussion<br />
Den fluorescerande signalen i både interfas- och metafas <strong>FISH</strong> visade att patienten saknade en X<br />
kromosom och att det endast fanns 45 kromosomer bekräftade frågeställningen om Turners syndrom<br />
(2). Vidare fanns en frågeställning om mosaik eftersom patienten spontant blivit gr<strong>av</strong>id, men på glaset<br />
fanns för få metafaser för att kunna bekräfta misstanken.<br />
I fluorescencemikroskop detekterades en X kromosom i interfas och metafas <strong>FISH</strong>.<br />
5
Referenser<br />
1. Shaffer L.G, Bejjani B.A. Development of new postnatal diagnostic methods for chromosome<br />
disorders. Semin Fetal Neonatal Med. 2010 Nov 25.<br />
2. Turners syndrom. Wikipedia (29 september 2010).<br />
http://sv.wikipedia.org/wiki/Turners_syndrom, 101202<br />
3. Pasquino A.M, Passeri F, Pucarelli I, Segni M, Municchi G (1997). Spontaneous Pubertal<br />
Developements in Turner’s Syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 1997 Jun 82(6): 1810-3.<br />
4. Bouchlariotou S, Tsikouras P, Dimitraki M et al. Turner’s syndrome and pregnancy: has the<br />
45,X/47XXX mosaicism a different prognosis?. J Matern Fetal Neonatal Med. 2010 Oct 5.<br />
5. Phytohemagglutinin. Wikipedia (29 november 2010).<br />
http://en.wikipedia.org/wiki/Phytohaemagglutinin, 101201<br />
6. Colcemid. Wikipedia (2 december 2010). http://en.wikipedia.org/wiki/Colcemid, 101202<br />
7. <strong>FISH</strong>. Wikipedia (11 september 2010). http://sv.wikipedia.org/wiki/<strong>FISH</strong>, 101201<br />
6
Figur 1. Visar interfas <strong>FISH</strong> där CEPX ska <strong>av</strong>ge en orange färg, och CEPY ska <strong>av</strong>ge en grön färg. I cellen<br />
syns en orange fluorescerande signal.<br />
7
Figur 2. Visar metafas <strong>FISH</strong> där CEPX ska <strong>av</strong>ge en orange färg och CEPY ska <strong>av</strong>ge en grön färg. I<br />
figuren finns 45 kromosomer och centromeren hos X kromosomen fluorescerar <strong>med</strong> en orange signal.<br />
8
Bilaga 1<br />
Riskbedömning<br />
Riskbedömning <strong>av</strong> Colcemid<br />
På vilket sätt är kemikalien farlig?<br />
Mutagen, teratogen, toxisk.<br />
Hantering <strong>av</strong> kemikalien samt adekvat skyddsutrustning<br />
Kemikalien förvaras i +4˚C. Skyddsrock och skyddshandskar används, gärna dubbla. Arbeta i<br />
dragskåp.<br />
Skyddsåtgärder<br />
Uppsök vård.<br />
Avfallshantering<br />
Cytostatika <strong>av</strong>fall. Undvik utsläpp i <strong>av</strong>loppet. (1)<br />
Riskbedömning <strong>av</strong> Metanol<br />
På vilket sätt är kemikalien farlig?<br />
Mycket brandfarlig och giftig.<br />
Hantering <strong>av</strong> kemikalien samt adekvat skyddsutrustning<br />
Använd skyddsrock, handskar och glasögon. Arbeta i dragskåp.<br />
Skyddsåtgärder<br />
Undvik inandning, hudkontakt och förtäring.<br />
Avfallshantering<br />
Hanteras som farligt <strong>av</strong>fall. Undvik utsläpp i <strong>av</strong>loppet. (2)<br />
Riskbedömning <strong>av</strong> Ättiksyra (Etansyra)<br />
På vilket sätt är kemikalien farlig?<br />
Starkt frätande.<br />
Hantering <strong>av</strong> kemikalien samt adekvat skyddsutrustning<br />
Använd skyddsrock, handskar och glasögon. Arbeta i dragskåp.<br />
Skyddsåtgärder<br />
Undvik inandning, hudkontakt och ögonkontakt.<br />
Avfallshantering<br />
Hanteras som farligt <strong>av</strong>fall. Mindre mängder kan spolas ner i <strong>av</strong>loppet <strong>med</strong> mycket vatten. (3)<br />
9
Referenser<br />
1. Colcemid. Enzo Lifescience (2010). www.enzolifescineces.com/ALX-430-033/colcemid/, 101202<br />
2. Säkerhetsdatablad, Metanol. VWR (2006-05-18). www.varor.lul.se/webbreg/infoblad/54.pdf,<br />
101202<br />
3. Säkerhetsdatablad, Ättiksyra. VWR (1999-11-01). www.varor.lul.se/webbreg/infoblad/6132.pdf,<br />
101202<br />
10