Nr 2 2012 - Neurologi i Sverige

••• forskning
Forskning
DIFFERENTIERING TILL GLIACELLER
Mesenkymala stamceller erhölls från benmärg från friska patienter
som skulle genomgå rekonstruktiv kirurgi. Dessa celler
odlades upp i cellodlingsfl askor och karaktäriserades med
hjälp av ett fl ertal markörer (antikroppar) för att påvisa dess
karaktär. Resultatet visade att de var positiva mot MSC-markörerna
(CD54, CD90, CD44, Stro-1) men negativa mot de
hematopoetiska markörerna (CD45, CD14). Vi kunde även
påvisa dess multipotentiella egenskaper genom att differentiera
dem till kondrocyter, osteocyter och adipocyter 7 .
När cellerna behandlats med tillväxtfaktorerna GGF-2,
PDGF, bFGF och forskolin kunde vi efter tre veckor se att
cellerna ändrade utseende morfologiskt från att vara stamceller/fi
broblastlika celler till att bli mer Schwanncellslika. Cellerna
immunofärgades med markörer för gliaceller, S100 och
p75, och de var 80 procent positiva efter differentiering. Differentiering
ökade även uttrycket av gliamarkörerna S100,
P75, GFAP och erbB3 på både gen- och proteinnivå vilket
kunde påvisas med tekniker som PCR och Western blot.
En funktionell studie gjordes i ett så kallat co-kultur-system
där sensoriska nervceller från råtta (DRG) odlades med
de humana cellerna. Efter 24 timmars inkubering kunde vi
se att de differentierade cellerna påskyndade nervutväxten
s i g n i fi k a nt .
När stamcellerna har fått differentiera har vi sett att de
uttrycker Schwanncellsmarkörer både på gen- och proteinnivå,
men mest intressant är att de fungerar funktionellt genom
att påskynda nervtillväxten i det skadade området. Vi
har transplanterat celler i en skadad perifer nerv och i en
skadad ryggmärg, och kunnat påvisa ökad nervcellsöverlevnad
och nervtillväxt.
”Cellbaserade terapier kan
bli ett nytt och förhoppningsvis
framgångsrikt alternativ
till att behandla nervskador.”
ÅLDER OCH PERIFER NERVSKADA
Mesenkymala stamceller från patienter odlades under tio
veckor för att undersöka betydelsen av ålder hos donator. Celler
från de yngre patienterna (16–18 år) behöll sin förmåga att
prolifi era medan cellerna från den äldre patientgruppen (67–
75 år) minskade sin förmåga att expandera in vitro efter tid i
kultur.
Cellerna ändrade också morfologi och blev större efter tid i
odling. Odifferentierade MSC från båda patientgrupperna
ökade den totala nervläkningen i en odling med känselnervceller
efter två och efter tio veckor i odling. Efter differentiering
kunde de yngre patienternas celler signifi kant öka nervutväxten
ytterligare men inte celler från äldre donatorer (fi gur1).
20 neurologi i sverige nr 2– 12
MSC uttryckte transkript för nervtillväxtfaktorerna NGT,
NT-3, GDNF, BDNF och VEGF. Differentieringen ökade
uttrycket och utsöndringen av VEGF och BDNF från både
gamla och unga donatorer.
NERVUTVÄXT I CO-KULTUR AV MSC OCH DRG-NERVCELLER
A
B
Total nervlängd (µm)
10000
7500
5000
2500
0
DRG enbart
+ α-MEM
n.s n.s
+ diff α-MEM
***
young uMSC
***
***
young dMSC
old uMSC
n.s
*** ***
old dMSC
Figur 1A. Mesenkymala stamceller från människa ökar nervutväxten
av sensoriska nervceller från råtta (DRG) i en co-kulturmodell.
Immunofärgning av βIII-tubulin (AlexaFlour 488) visar
nervutväxt efter 24 timmar från kontroller med endast medium
(α-MEM och diff α-MEM) samt odifferentierade MSC (uMSC) och
differentierade MSC (dMSC) från ung och gammal donator som
odlats på inserts placerade ovanför nervcellerna.
Figur 1B. Kvantitativ analys av totala nervutväxten i co-kultur.
*** Signifi kant skillnad från respektive cellmedium och kontroller
(p