2005-08-13 - EUR-Lex

▼B
1. PRINCIP FÖR METODEN
17. CITRONSYRA
Citronsyra omvandlas till oxalacetat och acetat i en reaktion som
katalyseras av citratlyas (CL):
citrat oxalacetat + acetat
I närvaro av malatdehydrogenas (MDH) och laktatdehydrogenas
(LDH) reduceras oxalacetatet och dess dekarbolyxeringsderivat,
pyruvat, till L-malat och L-laktat med hjälp av reducerad
nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH):
oxalacetat + NADH + H + L-malat + NAD +
pyruvat + NADH + H + L-laktat + NAD +
Mängden NADH som oxideras till NAD + i dessa reaktioner är proportionerlig
mot den mängd citrat som finns närvarande. Oxidationen av
NADH bestäms med hjälp av den resulterande absorbansminskningen
vid 340 nm våglängd.
2. REAGENSER
2.1. Buffertlösning, pH 7,8
(0,51 M glycylglycin, pH = 7,8, Zn 2+ : 0,6 × 10 −3 M):
Lös 7,13 g glycylglycin i ca 70 ml dubbeldestillerat vatten.
Justera pH till 7,8 med ca 13 ml 5 M natriumhydroxidlösning, tillsätt
10 ml zinkkloridlösning (80 mg ZnCl 2 i 100 ml H 2 O) och fyll upp till
100 ml med dubbeldestillerat vatten.
Denna tosning är hällbar i minst fyra veckor vid 4 °C.
2.2. Reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotidlösning (NADH) (ca 6. 10
−3 M): lös 30 mg NADH och 60 mg NaHCO3 i 6 ml dubbeldestillerat
vatten.
2.3. Lösning av malathydrogenas/laktathydrogenas (MDH/LDH, 0,5 mg
MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml): blanda 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml),
0,4 ml ammoniumsulfatlösning (3,2 M) och 0,5 ml LDH (5 mg/ml).
Denna suspension är hållbar i minst ett år vid 4 °C.
2.4. Citratlyas (CL, 5 mg protein/ml): lös 168 mg lyofilisat i 1 ml iskallt
vatten. Denna lösning är hållbar i minst en vecka vid 4 °C och i
minst fyra veckor i fruset tillstånd.
Enzymaktiviteten bör kontrolleras före bestämningen.
2.5. Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)
Anmärkning:
Samtliga ovannämnda reagenser finns i handeln.
3. APPARATUR
3.1. Spektrofotometer för bestämning vid 340 nm, den våglängd där
NADH har maximal absorption.
Om denna utrustning saknas, kan en spektrofotometer med diskontinuerligt
spektrum för bestämning vid 334 nm eller 365 nm användas.
Eftersom absoluta absorbansbestämningar skall utföras (dvs. kalibreringskurvor
används inte, utan bestämning görs med hjälp av
extinktionskoefficienten för NADH), måste apparatens våglängdsskalor
och absorption kontrolleras.
3.2. Glaskuvetter med en optisk vågängd av 1 cm eller engångskuvetter.
3.3. Mikropipetter för pipettering av volymer mellan 0,02 och 2 ml.
4. BEREDNING AV PROVET
Citratbestämning utförs normalt direkt i vinet utan föregående
avfärgning och spädning, under förutsättning att citronsyrahalten är
lägre än 400 mg/l. Om så inte är fallet späds vinet till dess att citrathalten
är mellan 20 och 400 mg/l (dvs. mellan 5 och 80 μg citrat i
provet).
1990R2676 — SV — 13.08.2005 — 011.001 — 98