2005-08-13 - EUR-Lex

▼B
1. PRINCIP FÖR METODEN
19. L-ÄPPELSYRA
L-äppelsyra (L-malat) oxiderar i närvaro av nikotinamid-adenindinukleotid
(NAD) till oxalacetat i en reaktion som katalyseras av Lmalatdehydrogenas
(L-MDH).
Reaktionsjämvikten ligger vanligtvis närmare malat. Om oxalacetat
avlägsnas från reaktionsblandningen förflyttas reaktionsjämvikten mot
bildning av oxalacetat. I närvaro av L-glutamat omvandlas oxalacetat
till L-aspartat i en reaktion som katalyseras av glutamat-oxalacetattransaminas
(GOT):
1. L-malat + NAD + oxalacetat + NADH + H +
2. Oxalacetat + L-glutamat L-aspartat + α-ketoglutarat
Den mängd NADH som bildas, bestämd på grundval av absorbansökningen
vid 340 nm, är proportionell mot den ursprungliga mängden Lmalat.
2. REAGENSER
2.1. Buffertlösning, pH 10
(0,60 M glycylglycin, 0,1 M L-glutamat).
Lös 4,75 g glycylglycin och 0,88 g L-glutaminsyra i ca 50 ml dubbeldestillerat
vatten. Justera pH till 10 med ca 4,6 ml 10 M
natriumhydroxid och späd till 60 ml med dubbeldestillerat vatten.
Denna lösning är hållbar i minst 12 veckor vid 4 °C.
2.2. Nikotinamid-adenin-dinukleotidlösning (NAD), ca 47 × 10 − 3 M: lös
420 mg NAD i 12 ml dubbeldestillerat vatten. Denna lösning är
hållbar i minst 4 veckor vid 4 °C.
2.3. Suspension av glutamat-oxalacetat-transaminas (GOT), 2 mg/ml.
Suspensionen är hållbar i minst 1 år vid 4 °C.
2.4. L-malatdehydrogenaslösning (L-MDH), 5 mg/ml. Denna lösning är
hållbar i minst 1 år vid 4 °C.
Anmärkning:
Samtliga ovannämnda reagenser finns i handeln.
3. APPARATUR
3.1. Spektrofotometer för bestämning vid 340 nm, den våglängd där
NADH har maximal absorption.
Om sådan apparatur saknas, är det möjligt att använda en spektrofotometer
med diskontinuerligt spektrum som tillåter bestämning vid 334
eller 365 nm.
Eftersom absoluta absorbansbestämningar görs (dvs. kalibreringskurvor
används inte, utan standardisering görs med hjälp av extinktionskoefficienten
för NADH), måste apparatens våglängdsskalor och absorption
kontrolleras.
3.2. Glaskuvetter med en optisk väglängd av 1 cm eller engångskuvetter.
3.3. Mikropipetter för pipettering av prov med en volym mellan 0,01 och
2 ml.
4. BEREDNING AV PROVET
Bestämning av L-malat utförs normalt direkt i vinet utan föregående
avfärgning och spädning, under förutsättning att halten av L-äppelsyra
är mindre än 350 mg/l (bestämt vid 365 nm). Om så inte är fallet
späds vinet med dubbeldestillerat vatten till dess att halten av L-malat
ligger mellan 30 och 350 mg/l (dvs. mängden L-malat i analysprovet
är mellan 3 och 35 μg).
Om halten av L-malat i vinet är mindre än 30 mg/l kan analysprovets
volym ökas till 1 ml. I så fall minskas den vattenvolym som tillsätts på
så sätt att den totala volymen i de båda kuvetterna blir densamma.
1990R2676 — SV — 13.08.2005 — 011.001 — 104