2005-08-13 - EUR-Lex

▼B
18. MJÖLKSYRA
1. PRINCIP FÖR METODEN
1.1 All mjölksyra (L-laktat och D-laktat) oxideras till pyruvat i närvaro av
nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) i en reaktion som katalyseras
av L-laktatdehydrogenas (L-LDH) och D-laktatdehydrogenas (D-
LDH).
Reaktionsjämvikten ligger vanligtvis närmare laktat. Om pyruvatet
avlägsnas från reaktionsblandningen förflyttas reaktionsjämvikten mot
bildning av pyruvat.
I närvaro av L-glutamat omvandlas pyruvat till L-alanin i en reaktion
som katalyseras av glutamatpyruvattransaminas (GPT):
1. L-laktat + NAD + pyruvat + NADH + H +
2. D-laktat + NAD + pyruvat + NADH + H +
3. Pyruvat + L-glutamat L-alanin + α-ketoglutarat
Den mängd NADH som bildas, bestämd på grundval av absorbansökningen
vid 340 nm våglängd, är proportionell mot den ursprungliga
mängden laktat.
Anmärkning:
L-mjölksyra kan bestämmas separat med reaktionerna 1 och 3.
D-mjölksyra kan bestämmas separat med reaktionerna 2 och 3.
1.2 Rutinmetod
Mjölksyra som separeras i en jonbytarkolonn oxideras till etanal och
bestäms kolorimetriskt efter reaktion med natriumnitroprussid och
piperidin.
2. REFERENSMETOD
2.1 Reagenser
2.1.1. Buffertlösning, pH 10 (glycylglycin 0,6 mol/l, L-glutamat 0,1 mol/l).
Lös 4,75 g glycylglycin och 0,88 g L-glutaminsyra i ca 50 ml dubbeldestillerat
vatten. Justera pH till 10 med några ml 10 M
2.1.2.
natriumhydroxid och fyll upp till 60 ml med dubbeldestillerat vatten.
Denna lösning är hållbar i minst 12 veckor vid 4 °C.
Nikotinamid-adenin-dinukleotidlösning (NAD), ca 40 × 10−3 M. Lös
900 mg NAD i 30 ml dubbeldestillerat vatten. Lösningen är hållbar i
minst fyra veckor vid 4 °C.
2.1.3. Glutamat-pyruvat-transaminas-suspension (GPT), 20 mg/ml. Suspensionen
är hållbar i minst ett år vid 4 °C.
2.1.4. L-laktatdehydrogenas-suspension (L-LDH), 5 mg/ml. Suspensionen är
hållbar i minst ett år vid 4 °C.
2.1.5. D-laktatdehydrogenas-suspension (D-LDH), 5 mg/ml. Suspensionen är
hållbar i minst ett år vid 4 °C.
Enzymaktiviteten bör kontrolleras före bestämningen.
Anmärkning:
Samtliga reagenser finns i handeln.
2.2 Apparatur
2.2.1. Spektrofotometer för bestämning vid 340 nm, den våglängd där
NADH har maximal absorption.
I avsaknad av sådan apparatur kan en spektrofotometer med diskontinuerligt
spektrum för bestämning vid 334 nm eller 365 nm användas.
Eftersom absoluta absorbansbestämningar skall utföras (dvs. kalibreringskurvor
används inte, utan bestämning görs med hjälp av
extinktionskoefficienten för NADH), måste apparatens våglängdsskalor
och absorptionsvärden kontrolleras.
1990R2676 — SV — 13.08.2005 — 011.001 — 101