Rezumat Adina Chis romana - USAMV Cluj-Napoca

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞIMEDICINĂ VETERINARĂŞCOALA DOCTORALĂZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGIICRISTEA ADINA-ANCUŢA (CHIŞ)STUDIUL ACTIVITĂŢII UNOR ENZIMEHIDROLITICE UTILIZATE ÎNBIOTEHNOLOGIILE VEGETALEREZUMAT AL TEZEI DE DOCTORATCONDUCĂTOR ŞTIINŢIFICProf. Dr. Carmen SOCACIUCluj-Napoca2011

CUPRINSINTRODUCERE..................................................................................................................... 3CERCETĂRI PROPRII......................................................................................................... 41. APLICAŢII ALE SPECTROSCOPIEI FT-MIR ÎN DETERMINAREA RAPIDĂ AACTIVITĂŢII UNOR ENZIME HIDROLITICE PE SUBSTRAT DE CĂTINĂ(HIPPOPHAE RHAMNOIDES L.)........................................................................................ 4MATERIALE ŞI METODE…………………………………………….................................. 4REZULTATE ŞI DISCUŢII………………………………………………............................. 5Regiunile FT-MIR specifice şi curbele de calibrare pentru glucoză, fructoză, zaharoză,ramnoză şi acidul galacturonic………………………….......................................................... 5Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de cătină obţinut (cu sau fărătratament enzimatic)…………………………………….......................................................... 6Evaluarea cantitativă a glucozei, fructozei, ramnozei, zaharozei şi acidului galacturonic caprincipali produşi de hidroliză a enzimelor hidrolitice............................................................. 82. STUDII COMPARATIVE DE HIDROLIZĂ ENZIMATICĂ PE SUBSTRAT DEMĂR (MALUS DOMESTICA)…........................................................................................... 9MATERIALE ŞI METODE……………………………………………….............................. 9REZULTATE ŞI DISCUŢII………………………………………………............................. 10Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de măr obţinut cu sau fărătratament enzimatic………………………………………....................................................... 10Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidroliticeutilizând spectroscopia FT-MIR cuplată cu metode chemometrice.......................................... 11Concentraţiile prezise pe baza modelelor de regresie PLS pentru glucidele din sucul demăr…………………………………………………................................................................. 11Studii de analiză cantitativă, prin cromatografie HPLC, a principalilor produşi rezultaţi prinhidroliză enzimatică…………………………………......................................................... 16Studii de analiză calitativă prin metoda principalelor componente (PCA)............................... 183. STUDII COMPARATIVE DE HIDROLIZĂ ENZIMATICĂ PE SUBSTRAT DESFECLĂ DE ZAHĂR (BETA VULGARIS)........................................................................ 20MATERIALE ŞI METODE……………………………………………................................. 20REZULTATE ŞI DISCUŢII………………………………………………............................. 21Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de sfeclă de zahăr obţinut cusau fără tratament enzimatic………………………………............................................... 21Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidroliticeutilizând spectroscopia FT-MIR cuplată cu metode chemometrice.......................................... 25Construirea modelelor de calibrare pentru glucoză, fructoză, ramnoză, zaharoză şi acidulgalacturonic pe baza regresiei parţiale prin pătrate mici (PLS)…............................................ 25Concentraţiile prezise pe baza modelelor de regresie PLS pentru carbohidraţii din sucul desfeclă de zahăr……………………………………................................................................... 27Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidrolitice princromatografie HPLC………………………………................................................................. 31Studii de analiză calitativă prin metoda principalelor componente (PCA)............................... 32CONCLUZII GENERALE.................................................................................................... 34BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ............................................................................................. 362

INTRODUCEREDatorită progreselor în biotehnologii din ultimii ani, progrese ce vizează înlocuirea şioptimizarea unor procese şi tehnologii tradiţionale aplicate în diverse domenii, enzime cum ar ficelulazele, hemicelulazele şi pectinazele au fost şi sunt în mod continuu investigate datorităpotenţialelor lor aplicaţii în diverse industrii, cum ar fi cea alimentară, textilă, a detergenţilor,etc. (Bhat M. K., 2000; Hoondal G. S. şi col., 2000).Aplicaţii ale spectroscopiei în infraroşu cu transformantă Fourier (FT-IR) în procesul deevaluare a activităţii enzimatice au fost raportate în literatura de specialitate (Pacheco R. şi col.,2003; Lendl B. şi col., 1998; Schindler R. şi col., 1998; Schindler R. şi col., 1997; Krieg P. şicol., 1996; Cadet F. şi col., 1995). Utilizarea spectroscopiei în infraroşu (IR) permite eliminareareacţiilor secundare sau de separare în vederea monitorizării activităţii enzimatice, datorităbenzilor de absorbţie specifice în domeniul „middle” infraroşu, furnizând astfel informaţiimoleculare specifice asupra substratului şi produşilor de reacţie.Scopul acestei teze de doctorat a fost acela de a testa posibilitatea evaluării activităţiienzimatice a diferitelor preparate enzimatice pe substrat de cătină, măr şi sfeclă de zahărprin spectroscopie FT-MIR şi validarea rezultatelor obţinute prin cromatografia lichidă deînaltă performanţă (HPLC).În vederea atingerii acestui scop, obiective principale au fost:‣ Caracterizarea spectrelor FT-MIR înregistrate pentru sucul de cătină, măr şi sfeclă dezahăr în cazul probelor tratate enzimatic comparativ cu probele control (netratate enzimatic),stabilindu-se totodată şi regiunile de fingerprint specific fiecărui substrat.‣ Evaluarea activităţii enzimatice a diferitelor tipuri de pectinaze, celulaze şihemicelulaze prin determinarea cantitativă a produşilor rezultaţi în urma acţiunii acestora princuplarea spectroscopiei FT-MIR cu metoda chemometrică a regresiei PLS (“partial least squaresregression”).‣ Stabilirea condiţiilor optime de acţiune pentru fiecare tip de preparat enzimatic şi pefiecare tip de substat utilizat.‣ Studii de analiză calitativă a datelor obţinute prin FT-MIR, utilizând metodachemometrică a analizei principalelor componente (PCA).‣ Validarea rezultatelor cantitative obţinute prin spectroscopie FT-MIR şi regresie PLSprin metoda HPLC.Structura tezei: teza este structurată în două mari părţi, şi anume Studiu de literatură(Partea I) şi Contribuţii personale (Partea II).Prima parte include două capitole (1-2):v Capitolul 1 trece în revistă diferite aspecte ale enzimelor hidrolitice şi substratelorasupra cărora acţionează, şi anume ale pectinazelor, celulazelor şi hemicelulazelor, aspecte ce sereferă în special la structura chimică, clasificare, funcţii şi aplicaţii biotehnologice.v În Capitolul 2 sunt redate aspecte generale şi diverese aplicaţii ale spectroscopieiîn infraroşu, în special ale FT-MIR.Partea a doua cuprinde patru capitole (3-5):v Capitolul 3 se referă la studii de hidroliză enzimatică realizate pe substrat decătină.v Capitolul 4 include studii ale activităţii enzimatice a pectinazelor, celulazelor şihemicelulazelor pe substrat de măr prin spectroscopie FT-MIR şi validarea rezulatelor prinHPLC.3

v În Capitolul 5 sunt prezentate rezultatele hidrolizei substanţelor pectice,celulozice şi hemicelulozice pe substrat de sfeclă de zahăr, rezultate obţinute prinspectroscopie FT-MIR şi HPLC.v În final sunt redate concluziile generale privind rezultatele obţinute prin FT-MIRşi HPLC asupra celor trei substrate amintite mai sus.CERCETĂRI PROPRII1. APLICAŢII ALE SPECTROSCOPIEI FT-MIR ÎN DETERMINAREA RAPIDĂ AACTIVITĂŢII UNOR ENZIME HIDROLITICE PE SUBSTRAT DE CĂTINĂ(HIPPOPHAE RHAMNOIDES L.)MATERIALE ŞI METODEEnzimele utilizate în acest studiu au fost reprezentate de preparatele comerciale Carezyme1000 L (1000 U/g) şi Pectinex Ultra SP-L (9.500U-ml) (Sigma Aldrich). Primul preparat conţineexclusiv activitate celulazică (celulaze provenite din Aspergillus sp.), în timp ce al doilea(pectinaze şi hemicelulaze din Aspergillus aculeatus) conţine atât activitate pectinazică, cât şicelulazică, cea pectinazică fiind acivitatea principală. În vederea asigurării pH-ului optim deacţiune (4,2) s-a utilizat tamponul acetatFructele de cătină (SB) utilizate în acest studiu au fost colectate din flora spontană ajudeţului Cluj (Transilvania, Nordul Romaniei) şi păstrate la - 20°C până în momentul utilizării.Fructele dezgheţate au fost macerate cu ajutorul unui blender, iar piureul obţinut a fostîmpărţit în patru probe, o probă control (netratată enzimatic) şi trei probe tratate cu enzimeleluate în studiu. Fiecare probă a costat din 15 g piure de fructe de cătină şi 7 ml tampon acetat (pH4.2). Tratamentul enzimatic s-a făcut conform tabelului de mai jos (Tabel 1.1).Tabel 1.1Tipul de enzime comerciale utilizate pentru hidroliza piureului de cătină şi raporturile faţă de substratTable 1.1Type of commercial enzymes used to hydrolyze the SB puree and their specific ratios to substateCantitatea şi tipul de enzimăRaportul enzimă:substratQuantity and type of enzymesRatio enzyme:substrate1 ml – Celulaze (C) 1000 U C:15 g piure de cătină0,3 ml - Pectinaze şi Hemicelulaze (PHC) 2850 U PHC:15 g piure de cătină1 ml Celulaze şi 0,3 ml Pectinaze şi Hemicelulaze 1000 U C şi 2850 U PHC:15 g piure de cătină(CPHC)- 15 g piure de cătinăDupă adăugarea enzimei, toate probele (inclusiv controlul) au fost agitate, iar apoi incubatetimp de 24 h la 40°C. După 24 h probele au fost centrifugate de trei ori câte 15 min la 4000 rpm(centrifuga Jouan, Franţa). Supernatantul corespunzător fiecărei probe a fost colectat şi filtrat pehârtie de filtru Whatman, acesta fiind mai departe uilizat pentru măsurătorile spectrometrice.Toate măsurătorile FT-MIR au fost realizate utilizând spectrometrul FT-MIR (ShimadzuPrestige 2, Apodization: Happ-Genzel). Pentru fiecare spectru întregistrat în regiunea MIR,4000-500 cm -1 , s-au acumulat 64 de scanări, utilizându-se sistemul orizontal de atenuare areflexiei (Horizontal Attenuated Total Reflection) (HATR).4

statistic ANOVA (One way ANOVA, Tukey Mean Comparison). În vederea determinăriicantitative a glucozei, fructozei, zaharozei şi acidului galacturonic, ca principali compuşieliberaţi în sucul de măr în urma hidrolizei substanţelor pectice, celuloze şi hemicelulozei, s-autilizat programul Unscrambler X, versiunea 10.1 CAMO Software AS, aplicându-se atâtmetoda regresiei PLS cât şi cea a principalelor componente, PCA.REZULTATE ŞI DISCUŢIISpectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de măr obţinut cu sau fărătratament enzymaticÎn figura 2.1 sunt redate spectrele FT-MIR integrale (4000–650 cm -1 ) (a) şi zonele defingerprint (1200–900 cm -1 ) (b) ale sucurilor de măr obţinute cu şi fără (control) tratamentenzimatic.Fig. 2.1. (a) Spectrele FT-MIR (4000–650 cm -1 ) ale sucului de măr obţinut cu şi fără (control) tratament enzimatic şicele patru regiuni specifice identificate (I, II, III şi F); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200–900 cm -1 ) ale probelordin fig. 2.1.(a). Am selectat cele mai reprezentative probe obţinuteFig. 2.1. (a) The FT-MIR spectra (4000–650 cm -1 ) of apple juice obtained by enzymatic treatment and withoutenzimatic treatment (control) and the four specific regions indentified (I, II, III and F); (b) The fingerprint regions(F) (1200–900 cm -1 ) of the samples from fig. 2.1 (a). We selected the most specific samples after enzymatictreatmentSpectrele FT-MIR ale sucurilor de măr, obţinute cu sau fără tratement enzimatic, prezintăcele patru zone de absorbţie ce apar în cazul spectrelor FT-MIR, cu mici modificări, şi anume:3700-2800 cm -1 (I), 1800-1200 cm -1 (II), 1200-900 cm -1 (F) şi 900-750 cm -1 (III). Regiunea defingerprint (F) în cazul sucului de măr este cea cuprinsă între 1200-900 cm -1 .După cum se observă şi în figura 2.1 (a), zona de fingerprint (F) a glucidelor din sucul demere este cuprinsă între 1200-900 cm -1 , în cazul tuturor probelor. Apariţia acestei zone sedatorează vibraţiilor date de legăturile C – O şi C – C, precum şi întinderilor simetrice date delegăturile dintre C – O – C (Dufour E., 2009). Aspectul acestei zone, în ceea ce priveşte forma,atât în cazul sucului de măr obţinut în urma unui tratament enzimatic cât şi a sucului obţinut fărăun tratament enzimatic prealabil, este similar, modificându-se doar intensitatea peak-urilor.Peak-ul major ce apare în zona de fingerprint este cel din jurul frecvenţei de 1040 cm -1 .După o normalizare a spectrului, în zona F se constată modificările formei spectruluiinduse de enzime. Astfel, în cazul probelor tratate cu enzime precum RPTE şi RDA6L seconstată cele mai multe modificări faţă de control în timp ce enzima R10L nu induce modificărisemnificative faţă de control.În figura 2.2 sunt redate atât spectrele FT-MIR integrale ale sucului de măr obţinute cu(RB1L3h24%, RCL3h24%) sau fără (control) tratament enzimatic (4000-650 cm -1 ) (a), cât şiregiunea de fingerprint a acestora (1200-900 cm -1 ) (b).10

(a (b)Fig 2.2. (a). Spectrele FT-MIR (4000–650 cm -1 ) ale sucului de măr obţinut cu şi fără (control) tratament enzimatic şicele trei regiuni specifice identificate (I, II şi F); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200–900 cm -1 ) ale probelor dinfig. 2.2 (a). Am selectat cele mai reprezentative probe obţinute.Fig. 2.2 (a). The FT-MIR spectra (4000–650 cm -1 ) of apple juice obtained by enzymatic treatment and withoutenzimatic treatment (control) and the three specific regions indentified (I, II and F); (b) The fingerprint regions (F)(1200–700 cm -1 ) of the samples from fig. 2.2 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatment.Se observă că în zona de fingerprint (1200-900 cm -1 ) (F) apar unele diferenţe în ceea cepriveşte aspectul spectrelor la probele tratate cu celulaze, hemicelulaze, respectiv proba control(Fig. 2.2 (b)). Astfel, în cazul probelor tratate cu enzima RB1L se observă apariţia unui peakdominant în jurul frecvenţei de 1033 cm -1 , peak caracterisic glucozei, şi a unui peak în jurulfrecvenţei de 990 cm -1 . Aspectul acestei zone din cadrul spectrelor FT-MIR a probelor tratate cuRB1L este asemănător cu spectrele obţinute în urma tratamentelor enzimatice efectuate cupectinaze, lucru oarecum aşteptat deoarece acest preparat comercial conţine pe lângă activitateahemicelulazică şi celulazică, şi activitate pectinazică.În cazul probelor tratate cu enzima RCL se observă că aspectul spectrelor este asemănătorcu cel al probelor control. În cadrul acestor spectre se constată apariţia a 2 peak-uri dominante înjurul frecvenţelor de 1055, respectiv 1030 cm -1 , peak-uri caracteristice zaharozei, respectivglucozei. Alte peak-uri care mai apar în zona de fingerprint sunt cele din jurul frecvenţelor de1016, 1060, 1080, 1105, 1149 cm -1 , toate fiind caracteristice glucidelor din structura pulpei demăr.Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidroliticeutilizând spectroscopia FT-MIR cuplată cu metode chemometriceConcentraţiile prezise pe baza modelelor de regresie PLS pentru glucidele din sucul de mărConcentraţiile principalilor produşi de hidroliză a substanţelor pectice, a celulozei şihemicelulozei în sucul de măr obţinut în urma unui tratament enzimatic cu pectinaze, comparativcu proba control (netratată enzimatic), au fost prezise pe baza modelelor de regresie PLSelaborate pentru fiecare compus, prezentate în detaliu în capitolul următor.În figura 2.3 sunt reprezentate grafic concentraţiile de carbohidraţi prezise prin regresiePLS, precum şi deviaţiile standard pentru fiecare probă analizată.11

(a)Concentratia/Concentration (%)121086420ControlRPL30min2.4%RPL30min12%RPL30min24%RPL3h2.4%RPL3h12%RPL3h24%RPL24h2.4%RPL24h12%RPL24h24%R10L30min2.4%R10L30min12%R10L30min24%R10L3h2.4%R10L3h12%R10L3h24%R10L24h2.4%R10L24h12%R10L24h24%Proba/SampleGlucozăFructozăZaharoză(b)12Concentratia/Concentration (%)1086420GlucozăFructozăZaharozăControlRPTE30min2.4%RPTE30min12%RPTE30min24%RPTE3h2.4%RPTE3h12%RPTE3h24%RPTE24h2.4%RPTE24h12%RPTE24h24%RDA6L30min2.4%Proba/SampleRDA6L30min12%RDA6L30min24%RDA6L3h2.4%RDA6L3h12%RDA6L3h24%RDA6L24h2.4%RDA6L24h12%RDA6L24h24%Fig. 2.3. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru glucoză, fructoză şi zaharozăîn sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RPL (a), R10L (a), RPTE (b) şi RDA6L (b),comparativ cu proba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri)Fig.2.3. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for glucose, fructose and sucrosein apple juice obtained after enzymatic treatment with RPL (a), R10L (a), RPTE (b) and RDA6L (b), compared withcontrol sample (see Materiale şi meode cap. for the codes)În cazul probelor tratate cu enzima RPL, cele mai mari concentraţii de glucoză (5,87%),fructoză (8,00%) şi zaharoză (6,78%) s-au obţinut în cazul tratării piureului cu o concentraţie de12

Concentratia/Concentration (%)20181614121086420C ontrolRPTE30min2.4%RPTE30min12%RPTE30min24%RPTE3h2.4%RPTE3h12%RPTE3h24%RPTE24h2.4%RPTE24h12%RPTE24h24%RDA6L30min2.4%Proba/SampleRDA6L30min12%RDA6L30min24%RDA6L3h2.4%RDA6L3h12%RDA6L3h24%RDA6L24h2.4%RDA6L24h12%RDA6L24h24%RamnozăAcidgalacturonicFig. 2.4. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru ramnoză şi acidulgalacturonic în sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RPL (a), R10L (a), RPTE (b) şi RDA6L(b), comparativ cu proba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri)Fig. 2.4. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for rhamnose and galacturonicacid in apple juice obtained after enzymatic treatment with RPL (a), R10L (a), RPTE (b) and RDA6L (b), comparedwith control sample (see Materiale şi meode cap. for the codes)În cazul probelor de măr tratate cu enzima RPL, concentraţia maximă de ramnoză (7,53%)s-a obţinut în urma unui timp de incubare de 24 ore şi cu o concentraţie enzimatică de 24% (Fig.2.4 (a)), în timp ce concentraţia maximă de acid galacturonic (17,71%) s-a obţinut în cazulprobelor tratate cu o concentraţie de 2,4%, timp de 3 ore (Fig. 2.4 (a)). Pentru enzimele R10L şiRPTE optimul activităţii enzimatice, determinat prin eliberarea ramnozei şi acidului galacturonics-a atins după 24 de ore de incubare, la o concentraţie de 24% enzimă în cazul enzimei R10L,respectiv 12% în cazul enzimei RPTE. Concentraţia maximă de ramnoză a fost de 9,85% pentruenzima R10L şi de 8,23% pentru enzima RPTE, iar concentraţia maximă de acid galacturonic afost de 18,13% pentru R10L, respectiv 17,88% pentru RPTE (Fig. 2.4 (a) şi (b)). În cazulenzimei RDA6L concentraţiile maxime obţinute au fost de 9,03% ramnoză şi 18,22% acidgalacturonic (Fig. 2.4 (b)). Aceste concentraţii au fost obţinute după 24 de ore de incubare cu oconcentraţie de 24% enzimă, respectiv după 3 ore de incubare la o concentraţie de 2,4%.Concentraţiile de glucoză, fructoză şi zaharoză prezise prin regresie PLS în cazul probelortratate cu celulaze şi hemicelulaze, comparativ cu proba control sunt redate grafic în figura 2.5.14

C oncentratia/C oncentration (%)14121086420C ontrolRB1L30min24%RB1L30min12%RB1L30min2.4%RB1L3h24%RB1L3h12%RB1L3h2.4%RB1L24h24%RB1L24h12%RB1L24h2.4%RC L30min24%RC L30min12%RC L30min2.4%Proba/SampleRC L3h24%RC L3h12%RC L3h2.4%RC L24h24%RC L24h12%RC L24h2.4%GlucozăFructozăZaharozăFig. 2.5. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru glucoză, fructoză şi zaharozăîn sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RB1L şi RCL, comparativ cu proba control (vezi cap.Materiale şi metode pentru coduri)Fig. 2.5. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for glucose, fructose andsucrose in apple juice obtained after enzymatic treatment with RB1L and RCL, compared with control sample (seeMateriale şi meode cap. for the codes)După cum era şi de aşteptat, în urma activităţii enzimatice a preparatului RB1L asuprasubstartului de măr se constată că, concentraţiile de glucoză, fructoză şi zaharoză cresc, dar nu lafel de mult ca şi în cazul probelor tratate cu enzima RCL, acest lucru explicându-se prin faptul căenzima RCL are activitate principală celulazică, în timp ce enzima RB1L are activitate principalăpectinazică şi hemicelulazică. Spre deosebire de enzima RB1L, sub acţiunea enzimei RCL s-aueliberat concentraţii mai mari de glucide, 7,23% glucoză, 11,42% fructoză, în timp ce în cazulzaharozei concentraţiile prezise au fost mai mici (4,46%) (Fig. 2.5).Figura 2.6 reprezintă grafic concentraţiile de ramnoză şi acid galacturonic prezise în suculde măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RB1L şi RCL, comparativ cu probacontrol.15

C oncenmtratia/C oncentration (%)181614121086420C ontrolRB1L30min24%RB1L30min12%RB1L30min2.4RB1L3h24%RB1L3h12%RB1L3h2.4%RB1L24h24%RB1L24h12%RB1L24h2.4%RC L30min24%RC L30min12%RC L30min2.4%RC L3h24%RC L3h12%RC L3h2.4%RC L24h24%RC L24h12%RC L24h2.4%Proba/SampleRamnozăAcid galacturonicFig. 2.6. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru ramnozăşi acidul galacturonic în sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RB1L şiRCL comparativ cu proba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri)Fig. 2.6. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations forrhamnose and galacturonic acid in apple juice obtained after enzymatic treatment with RB1L andRCL compared with control sample (see Materiale şi metode cap. for the codes)În ceea ce privesc concentraţiile de ramnoză şi acid galacturonic, principalii produşi dehidroliză ai substaţelor pectice, în cazul enzimei RB1L au fost prezise cele mai mari concentraţii,lucru explicat prin activitatea pectinazică a preparatului. Spre deosebire de enzima RB1L, pentruprobele tratate cu enzima RCL valorile concentraţiilor prezise de ramnoză şi acid galacturonic aufost mai scăzute: 4,63%, respectiv 14,22%.Studii de analiză cantitativă, prin cromatografie HPLC, a principalilor produşi rezultaţiprin hidroliză enzimaticăÎn scopul validării metodei spectroscopice FT-MIR şi a metodei de prezicere aconcentraţiei prin regresie PLS, ca metode adecvate determinării concentraţiilor diferiţilorglucide/compuşi în anumite probe, au fost determinate concentraţiile de glucoză, fructoză,ramnoză, zaharoză şi acid galacturonic şi prin metoda HPLC.În figura 2.7 este prezentată o cromatogramă reprezentativă a probelor tratate cu enzimelemai sus amintite.16

Fig. 2.7. O cromatogramă reprezentativă ce evidenţiază separarea glucidelor în sucul de măr rezultat dupătratatament enzimaticFig. 2.7. A representative chromatogram of the separation of carbohydrates from apple juice obtained afterenzymatic treatmentÎn urma elaborării standardelor de glucoză şi acid galacturonic, s-a constat că aceşti doicompuşi au acelaşi timp de retenţie, ceea ce înseamnă că într-un amestec care conţine ambiicompuşi, aceştia nu se separă, apărând un singur peak caracteristic (vezi cromatogramă încapitolul următor). Astfel, concentraţiile de glucoză şi acid galacturonic determinate prin HPLCîn probele de suc de măr au fost calculate împreună, pe baza ariei aceluiaşi peak (Fig. 2.7).În tabelul 2.1 sunt redate concentraţiile de carbohidraţi obţinute atât prin regresie PLS cât şiprin HPLC.Tabel 4.4Valori prezise şi determinate prin HPLC pentru glucoză şi acig galacturonic, fructoză, ramnoză şi zaharoză în zecesucuri de măr obţinute prin tratament enzimatic şi o probă controlTable 4.4Predicted and HPLC determined concentrations of glucose and glacturonic acid, fructose, rhamnose and sucrose inten apple juices obtained after enzymatic treatment and an control sampleProbaSampleGlucoză şi ac. gal.Glucose and gal. ac.PrezisăPredicted(%)HPLC(%)PrezisăPredicted(%)FructozăFructoseHPLC(%)RamnozăRhamnosePrezisăPredicted(%)HPLC(%)PrezisăPredicted(%)ZaharozăSucroseControl 9,15 9,20 4,84 4,81 2,65 2,33 1,51 1,32RPL24h24% 23,51 23,66 8,00 8,12 7,53 7,54 6,78 6,73RPL24h2,4% 19,80 19,77 4,73 4,80 2,85 2,77 1,89 1,90R10L24h24% 25,84 25,90 10,62 10,54 9,85 9,99 8,49 8,51R10L30min24% 20,29 20,32 4,81 4,76 3,34 3,38 3,03 3,06RPTE30min24% 24,57 24,47 9,18 9,22 7,24 7,22 7,92 8,00RPTE30min2,4% 22,33 22,37 4,98 5,01 3,61 3,67 5,45 5,57RB1L3h24% 22,54 22,51 9,42 9,47 7,77 7,79 6,84 6,75RB1L24h24% 14,90 14,83 4,92 4,96 4,57 4,66 3,81 3,93HPLC(%)17

Continuare Tabel 2.1ProbaSampleGlucoză şi ac. gal.Glucose and gal. ac.PrezisăPredicted(%)HPLC(%)PrezisăPredicted(%)FructozăFructoseHPLC(%)RamnozăRhamnosePrezisăPredicted(%)HPLC(%)PrezisăPredicted(%)ZaharozăSucroseRCL30min24% 20,99 20,90 11,42 11,39 4,47 4,51 4,15 4,19RCL24h24% 20,26 20,20 10,52 10,61 4,09 4,11 3,84 3,80HPLC(%)Astfel, se observă că, concentraţiile determinate prin HPLC sunt aproximativ egale cu celeprezise prin spectroscopie FT-MIR şi regresie PLS, existând unele diferenţe, însă aceste nu suntsemnificative.Studii de analiză calitativă prin metoda principalelor componente (PCA)În scopul evidenţierii unor diferenţe calitative între probele de suc de măr obţinute în urmatratamentelor enzimatice cu celulaze, hemicelulaze şi pectinaze, datele obţinute prin înregistrareaspectrelor FT-MIR au fost normalizate iar apoi prelucrate prin metoda chemometrică aprincipalelor componente (PCA).În urma analizării rezultatelor obţinute prin prelucrarea probelor tratate cu cele patru tipuride pectinaze, după cum se observă şi în figura 2.8, se poate afirma faptul că, comparativ cuprobele de sfeclă de zahăr tratate cu aceleaşi preparate enzimatice, în acest caz nu s-a obţinut ogrupare satisfăcătoare a probelor în funcţie de tratamentul aplicat.Fig. 2.8. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şiPC2, obţinute din analiza PCA a sucurilor de măr tratate cu cele patru tipuri de pectinaze (RPL, R10L, RPTE şiRDA6L)Fig. 2.8. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtainedfrom the PCA of the apple juices treated with the four types of enzymes (RPL, R10L, RPTE and RDA6L)18

Chiar dacă nu s-a obţinut o discriminare satisfăcătoare, cele mai bune rezultate au fostobţinute prelucrând datele FT-MIR pe intervalul 1200-900 cm -1 . Astfel, în figura 2.8 se observăcă în acest caz primele două componente explică un total de 92% din varianta totală, din carePC1 explică 82%, în timp ce PC2 explică doar 10% din varianţă.În cazul probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze, se poate constată că acestea segrupează mult mai bine decât cele tratate cu pectinaze, distingându-se două grupe distincte, înfuncţie de tratamentul enzimatic aplicat (Fig. 2.9).Fig. 2.9. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şiPC2, obţinute din analiza PCA a sucurilor de măr tratate cu cele două tipuri de celulaze şi hemicelulaze (RB1L şiRCL)Fig. 2.9. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtainedfrom the PCA of the apple juices treated with the two types of enzymes (RB1L and RCL)Se constată că şi în acest caz cele mai bune rezultate s-au obţinut în cazul prelucrăriiprobelor pe domeniul 1200-900 cm -1 şi primele două componente principale sunt cele careexplică cel mai mult din varianţa totală. PC1 explică şi în acest caz cel mai mult din varianţatotală, 96%, în timp ce PC2 explică doar 3% din varianţă, împreună cele două componenteexplicând 99% din varianţa totală (Fig. 2.9). Se mai poate observa faptul că cele două grupeseparate sunt distribuite de-a lungul axei PC1, confirmând faptul că prima componentă principalăare cel mai important rol în separarea probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze.Frecvenţele care joacă rolul cel mai important în gruparea probelor de-a lungul axe PC1sunt cele caracteristice în special glucozei, şi anume, 1033, 999 şi 1100 cm -1 .În figura 2.10 se observă separarea probelor de suc de măr în funcţie de tratamentulenzimatic aplicat iniţial piureului de măr.19

Fig. 2.10. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şiPC2, obţinute din analiza PCA a sucurilor de măr tratat cu celulaze, hemicelulaze (CHC) şi pectinaze (P)Fig. 2.10. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtainedfrom the PCA of the apple juices treated with cellulases, hemicelulases (CHC) and pectinases (P)Se observă că, dacă se compară din punct de vedere calitativ probele tratate cu celulaze şihemicelulaze (CHC) cu probele tratate cu pectinaze (P), acestea se separă distinct în două grupecorespunzătoare tratamentului enzimatic. Astfel, se constată din nou că primele două componetejoacă rolul cel mai important în separarea probelor, PC1 explicând cel mai mult din varianţatotală, 89%, iar PC2 explicând doar 6%, totalul fiind de 95% varianţă totală explicată. Deasemenea, se observă că probele tratate cu pectinaze se separă mai ales de-a lungul axei PC1, înschimb probele tratate cu celulaze şi hemicelulaze se separă atât de-a lungul axei PC1, caât şi dealungul axei PC2 (Fig. 2.10).Deci, se poate spune că s-a obţinut o grupare a probelor hidrolizate în funcţie detratamentul enzimatic aplicat pe substrat de piure de măr. Metoda principalelor componentepoate fi astfel utilizată în vederea discriminării diferitelor tipuri de probe tratate cu diverse tipuride enzime hidrolitice.3. STUDII COMPARATIVE DE HIDROLIZĂ ENZIMATICĂ PE SUBSTRAT DESFECLĂ DE ZAHĂR (BETA VULGARIS)MATERIALE ŞI METODEAu fost utilizate aceleaşi tipuri de enzime descrise la studiu pe măr. pH-urile optime deacţiune al acestor enzime au fost asigurate de tamponul acetat cu pH de 3,9, în cazul enzimelorRPL, R10L, RPTE, RDA6L şi de 4,4 în cazul enzimelor RB1L şi RCL.20

(a)(b)Fig. 3.3. (a) Spectrele FT-MIR (4000-650 cm -1 ) ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut după un tratament enzimaticcu RPTE şi a sucului de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic (control) şi cele patru regiuni specificeidentificate (I, II, F şi III); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale probelor din fig. 3.3 (a). Am selectatcele mai reprezentative probe obţinuteFig. 3.3. (a) The FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained after an enzymatic treatment withRPTE and the FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained without enzimatic treatment (control)and the four specific regions indentified (I, II, F and III); (b) The fingerprint regions (F) (1200-900 cm -1 ) of thesamples from fig. 3.3 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatmentŞi în cazul celor patru regiuni identificate în spectrele FT-MIR ale sucului de sfeclă dezahăr obţinut în urma unui tratament prealabil a pulpei cu enzima RPTE sunt aproape identice cucele ale probei control (Fig. 3.3 (a)). Diferenţa dintre pobele tratate cu acest preparat enzimatic şiproba control apare în regiunea de fingerprint (1200-900 cm -1 ) şi se referă la raportul dintreprincipalele peak-uri ce apar în această regiune: 1045 şi 991 cm -1 . Dacă în cazul probei control,peak-ul 991 cm -1 este peak-ul dominant, în cazul majorităţii probelor tratate cu enzima RPTE,peak-ul dominat devine cel din jurul frecvenţei 1045 cm -1 . În ceea ce priveşte regiunea 900-700cm -1 , nu apar diferenţe semnificative faţă de proba control.d) Tratamente enzimatice efectuate cu RDA6LÎn figura 3.4 sunt redate atât regiunile de fingerprint (1200-900 cm -1 ) (F) (b), cât şicelelalte regiuni caracteristice sucului de sfeclă de zahăr (I, II, III) (a) obţinut prin tratareapiureului de sfeclă cu enzima Rohapect DA6L, comparativ cu proba control.(a)(b)Fig. 3.4. (a) Spectrele FT-MIR (4000-650 cm -1 ) ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut după un tratament enzimaticcu RDA6L şi a sucului de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic (control) şi cele patru regiuni specificeidentificate (I, II, F şi III); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale probelor din fig. 3.4 (a). Am selectatcele mai reprezentative probe obţinuteFig. 3.4. (a) The FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained after an enzymatic treatment withRDA6L and the FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained without enzimatic treatment (control)23

and the four specific regions indentified (I, II, F and III); (b) The fingerprint regions (F) (1200-900 cm -1 ) of thesamples from fig. 3.4 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatmentLa fel ca şi în cazul probelor tratate cu enzima R10L şi în cazul probelor tratate cu enzimaRDA6L se constată că dispariţia peak-ului din jurul frecvenţei 1558 cm -1 este asociată cu apariţiapeak-ului din jurul frecvenţei de 1030 cm -1 . De asemenea, diferenţele care mai apar constau înfaptul că, dacă în cazul probei control raportul dintre peak-urile majore din regiunea defingerprint (1200-900 cm -1 ) este de aproximativ 1:1, în cazul probelor tratate cu enzima peak-uldin jurul frecvenţei 1030 cm -1 devine dominant.e) Tratamente enzimatice efectuate cu RB1LÎn figura 3.5 (a) şi (b) sunt redate atât spectrele FT-MIR integrale (4000-650 cm -1 ), cât şizonele de fingerprint (1200-900 cm -1 ) (F) a probelor de sfeclă de zahăr tratate cu enzima RB1L,comparativ cu proba control.(a)(b)Fig. 3.5.(a) Spectrele FT-MIR (4000-650 cm -1 ) ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut după un tratament enzimatic cuRB1L şi a sucului de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic (control) şi cele patru regiuni specificeidentificate (I, II, F şi III); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale probelor din fig. 3.5 (a). Am selectatcele mai reprezentative probe obţinuteFig. 3.5. (a) The FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained after an enzymatic treatment withRB1L and the FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained without enzimatic treatment (control)and the four specific regions indentified (I, II, F and III); (b) The fingerprint regions (F) (1200-900 cm -1 ) of thesamples from fig. 3.5 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatmentRegiunea de fingerprint (1200-900 cm -1 ) a sucului de sfeclă de zahăr atât a celui obţinut înurma unui tratament prealabil cu celulaze şi pectinaze, cât şi a probelor control, este foarte bineconturată. Apar însă unele diferenţe în ceea ce priveşte aspectul acestei regiuni, precum şi aregiunii caracteristice substanţelor polizaharidice (1800-1200 cm -1 ), şi anume:• în cazul sucului de sfeclă de zahăr obţinut prin tratatrea piureului de sfeclă cuenzima RB1L, peak-urile care apar în regiunea de fingerprint sunt: 1103, 1026, 991 şi 923 cm -1 .Astfel, se constată că dispare peak-ul 1132 cm -1 prezent la proba control, caracteristic legăturilorC – O – C, rămânând doar peak-ul caracteristic legăturilor C – O şi C – C din ciclurile piranozice(1103 cm -1 ). Apariţia peak-urilor la frecvenţele de 1029 şi 991 cm -1 , caracteristice grupărilor C –C, sugerează eliberarea unei concentraţii mai mari de zaharuri sub acţiunea acestei enzime,aceste legături intrând în structura acestor carbohidraţi. Peak-ul 923 cm -1 este atribuit vibraţiilordate de legăturile C – O din puntea 3,6-anhidră a carbohidraţilor (Sekkal M. şi Legrand P.,1993).• în cazul tratării probelor cu enzima RB1L peak-ul din jurul frecvenţei de 1637cm -1 este mai slab reprezentat faţă de proba control şi probele tratate cu pectinaze.24

• de asemenea, se poate constata că în regiunea de fingerprint apar modificări înceea ce privesc raporturile peak-urilor din jurul frecvenţei de 1030, respectiv 991 cm -1 : dacă încazul probei cele doă peak-uri apar în raport de aproximativ 1:1, în cazul probelor tratate cuenzima RB1L raportul se modifică, fie în favoarea unui peak, fie a celuilalt, în funcţie deacţiunea enzimei.f) Tratamente enzimatice efectuate cu RCLLa fel ca şi în cazul probelor tratate cu enzima RB1L, se observă că şi în cazul probelortratate cu enzima RCL spectrele FT-MIR ale sucurilor de sfeclă de zahăr sunt bine definite (Fig.3.6 (a)). Regiunea de fingerprint (F) este, de asemenea, cuprinsă între frecvenţele 1200-900 cm -1(Fig 3.6 (b)).(a)(b)Fig. 3.6. (a) Spectrele FT-MIR (4000-650 cm -1 ) ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut după un tratament enzimaticcu RCL şi a sucului de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic (control) şi cele patru regiuni specificeidentificate (I, II, F şi III); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale probelor din fig. 3.6 (a). Am selectatcele mai reprezentative probe obţinuteFig. 3.6 (a). The FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained after an enzymatic treatment withRCL and the FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained without enzimatic treatment (control)and the four specific regions indentified (I, II, F and III); (b) The fingerprint regions (F) (1200-900 cm -1 ) of thesamples from fig. 3.6 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatmentAnalizându-se spectrele sucului de sfeclă de zahăr obţinut în urma unui tratament prealabilcu preparatul enzimatic RCL se constată că sub aspectul formei, spectrele sunt în mare măsurăidentice cu cele înregistrate în urma unui tratament enzimatic efectuat cu enzima RB1L.Diferenţa care apare este în regiunea de fingerprint, şi anume, dacă în cazul probelor tratate cuenzima RB1L raportul dintre peak-urile care apar în jurul frecvenţei de 1030, respectiv 991 cm -1este, în general, în favoarea peak-ului 1030 cm -1 , în cazul probelor tratate cu enzima RCLsituaţia se inversează, raportul devenind favorabil peak-ului 991 cm -1 .Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidroliticeutilizând spectroscopia FT-MIR cuplată cu metode chemometriceConstruirea modelelor de calibrare pentru glucoză, fructoză, ramnoză, zaharoză şi acidulgalacturonic pe baza regresiei pătratice parţiale (PLS)În vederea calibrării metodei, utilizând modelele de regresie PLS elaborate, au fostdeterminate concentraţiile acestor compuşi în soluţiile standard de glucoză, fructoză, ramnoză,zaharoză şi acid galacturonic. În tabelul 3.1 sunt redate concentraţiile măsurate şi cele prezise(%, w/w), precum şi erorile standard pentru soluţiile standard de carbohidraţi.25

Tabel 3.1Concentraţiile (%, w/w) măsurate şi cele prezise ale soluţiilor standard de glucoză, fructoză, ramnoză, zaharoză şi acid galacturonic şierorile standard (ES) corespunzătoareTable 3.1Measured and predicted concentrations (%, w/w) of the standard solutions of glucose, fructose, rhamnose, sucrose and galacturonic acid and their corresponding standard errors(SE)GlucozăGlucoseFructozăFructoseRamnozăRhamnoseZaharozăSucroseAcid galacturonicGalacturonic acid% Prezisă ES % Prezisă ES % Prezisă ES % Prezisă ES % Prezisă DSPredicted SE Predicted SE Predicted SE predicted SEPredicted1 1,03 0,24 3 2,49 0,35 2 2,03 0,1 1 0,92 0,37 1 0,71 0,592 2,04 0,21 4 4,13 0,32 3 2,87 0,1 2 2,13 0,34 4,5 5,02 0,423 3,05 0,19 5 5,09 0,3 4 3,93 0,1 3 2,99 0,27 6,5 6,51 0,384 4,47 0,17 7 7,61 0,51 5 4,98 0,1 4 3,91 0,29 10,3 10,1 0,445 4,77 4,77 10 9,91 0,29 6 5,99 0,1 5 5,15 0,3 14,9 15,12 0,5710 9,65 0,26 15 14.66 0,33 10 10,3 0,12 10 10,65 0,38 16 15,68 0,5315 14,64 0,26 20 20,16 0,32 15 15,03 0,11 15 13,97 0,42 26,2 26,24 0,6620 20,13 0,23 25 24,91 0,38 18 17,93 0,11 20 19,89 0,39 - - -25 25,17 0,34 - - - - - - 25 25,34 0,51 - - -

Concentraţiile prezise pe baza modelelor de regresie PLS pentru carbohidraţii din sucul desfeclă de zahărPe baza modelelor de regresie PLS descrise mai sus, au fost determinate concentraţiileprezise şi erorile standard pentru glucoză, fructoză, ramnoză, zaharoză şi acid galacturoic însucurile de sfeclă de zahăr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu pectinaze comparativcu sucul de sfeclă obţinut fără un tratament enzimatic cu pectinaze (control).În figura 3.7 sunt reprezentate grafic concentraţiile prezise şi deviaţiile standard deglucoză, fructoză şi zaharoză din sucul de sfeclă de zahăr obţinute în urma tratamentelorenzimatice cu pectinaze(a)C oncentratia/C oncentration(% )109876543210C ontrolRPL30min2.4%RPL30min12%RPL30min24%RPL3h2.4%RPL3h12%RPL3h24%RPL24h2.4%RPL24h12%RPL24h24%R10L30min2.4%R10L30min12%R10L30min24%R10L3h2.4%R10L3h12%R10L3h24%R10L24h2.4%R10L24h12%R10L24h24%Proba/SampleGlucozăFructozăZaharozăC oncentratia/C oncentration(% )(b)109876543210C ontrolR P TE30min2.4%R P TE 30min12%R P TE 30min24%R P TE 3h2.4%R PTE 3h12%R PTE 3h24%R P TE 24h2.4%R P TE24h12%R P TE24h24%R DA6L 30min2.4%R DA6L30min12%R DA6L30min24%R DA6L3h2.4%R DA6L3h12%R DA6L3h24%R DA6L 24h2.4%R DA6L 24h12%R DA6L 24h24%Proba/SampleGlucozăFructozăZaharozăFig. 3.7. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru glucoză, fructoză şi zaharozăîn sucul de sfeclă de zahăr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RPL (a), R10L (a), RPTE (b) şi RDA6L(b), comparativ cu proba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri)Fig. 3.7. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for glucose, fructose andsucrose in sugar beet juice obtained after enzymatic treatment with RPL (a), R10L (a), RPTE (b) and RDA6L (b),compared with control sample (see Materiale şi meode cap. for the codes)

Analizându-se rezultatele obţinute în urma determinării concentraţiilor carbohidraţilor maipuţini specifici pentru degradarea substanţelor pectice de către pectinaze (glucoză, fructoză şizaharoză), se constată că, concentraţia acestor compuşi creşte în cazul probelor tratate enzimaticcu cele patru tipuri de preparate comerciale, comparativ cu proba control (Fig. 3.7 (a) şi (b)).Acest lucru poate fi explicat prin faptul că pe lângă resturile de acid galacturonic şi ramnoză ceformează structura de bază a pectinei, aceasta mai prezintă ramificaţii ce pot conţine diferitecantităţi de zaharuri neutre (Bădărău C. L. şi Neamţu G., 1998). În plus, unele preparatecomerciale, prezintă, pe lângă activitatea principală pectinazică, şi alte activităţi enzimaticesecundare (celulazică şi hemicelulazică), ceea ce justifică creşterea concentraţiilor acestorcompuşi în probele tratate enzimatic.Aplicând modelul regresiei PLS pentru produşii caracteristici degradării substanţelorpectice de către pectinaze (ramnoză şi acid galacturonic) se constată o creştere semnificativă aconcentraţiilor acestora în toate probele cărora li s-a aplicat un tratament enzimatic, comparativcu proba control (Fig. 3.8 (a) şi (b)).C oncentratia/C oncentration (%)(a)2520151050C ontrolRPL30min2.4%RPL30min12%RPL30min24%RPL3h2.4%RPL3h12%RPL3h24%RPL24h2.4%RPL24h12%RPL24h24%R10L30min2.4%R10L30min12%Proba/SampleR10L30min24%R10L3h2.4%R10L3h12%R10L3h24%R10L24h2.4%R10L24h12%R10L24h24%RamnozăAcidgalacturonic28

(b)C oncentratia/C oncentration (%)2520151050C ontrolR P TE 30min2.4%R P TE 30min12%R P TE 30min24%R P TE 3h2.4%R P TE 3h12%R P TE 3h24%R P TE 24h2.4%R P TE 24h12%R P TE 24h24%R DA6L30min2.4%R DA 6L30min12%Proba/SampleR DA 6L30min24%R DA6L 3h2.4%R DA6L3h12%R DA6L3h24%R DA6L24h2.4%R DA 6L24h12%R DA 6L24h24%RamnozăAcidgalacturonicFig. 3.8. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru ramnoză şi acidulgalacturonic în sucul de sfeclă de zahăr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RPL (a), R10L (a), RPTE (b)şi RDA6L (b), comparativ cu proba control, pe baza modelelor de regresie PLS (vezi cap. Materiale şi metodepentru coduri)Fig. 3.8. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for rhamnose and galacturonicacid in sugar beet juice obtained after enzymatic treatment with RPL (A), R10L (A), RPTE (B) and RDA6L (B),compared with control sample, based on the PLS regression models (see Materiale şi meode cap. for the codes)Astfel, în cazul probelor tratate cu enzima RPL, cea mai mare concentraţie de ramnoză(8,8%) a fost determinată în cazul probei tratate cu 24% enzimă timp de 24 ore, în timp ceconcentraţia cea mai mare de acid galacturonic (18,7%) a fost înregistrată tot în urma uneiconcentraţii de 24% enzimă, timpul de incubare fiind însă mult mai scurt (30 min) (Fig. 3.8 (a)).În cazul probelor tratate cu enzima R10L, concentraţia de 24% enzimă pare a fi cea optimăpentru degradarea substanţelor pectice din structura pulpei sfeclei de zahăr, în urma acţiunii eieliberându-se 11,07% ramnoză (timp de incubare 3h) şi 19,14% acid galacturonic (timp deincubare 24h) (Fig. 3.8 (a)).Cele mai mari concentraţii de ramnoză (9,15%) şi acid galacturonic (18,92%) determinateîn cazul tratării probelor cu enzima RPTE, au fost înregistate în probele tratate cu o concentraţieenzimatică de 2,4% (timp de incubare 24h), respectiv 24% (timp de incubare 3h) (Fig. 3.8 (b)).Pentru ezima RDA6L, concentraţiile maxime înregistrate au fost de 9,23% (ramnoză) şi18,73% (acid galacturonic) pentru probele RDA6L3h2,4%, respectiv RDA6L3h24% (Fig. 3.8(b)).După cum se observă în figurile 3.9 şi 3.10, concentraţiile tuturor carbohidraţilordeterminaţi prin metoda regresiei PLS au crescut în probele tratate cu cele două tipuri de celulazeşi hemicelulaze.29

Fig. 3.9. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru glucoză, fructoză şi zaharozăîn sucul de sfeclă de zahăr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RB1L şi RCL, comparativ cu probacontrol (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri)Fig. 3.9. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for glucose, fructose andsucrose in sugar beet juice obtained after enzymatic treatment with RB1L and RCL, compared with control sample(see Materiale şi meode cap. for the codes)În ceea ce priveşte enzima RB1L, se poate constata că acţiunea ei asupra pulpei sfeclei dezahăr duce la o eliberare crescută de carbohidraţi în sucul obţinut. În comparaţie cu enzima RCL,sub acţiunea enzimei RB1L se eliberează o cantitate mai mare de zaharoză, în schimb cantitateade glucoză şi fructoză fiind mult redusă (Fig. 3.9). Enzima RCL a avut un maxim de activitate,activitate evaluată prin cuantificarea glucozei, fructozei şi zaharozei, la un timp de incubare de24 ore (glucoză şi fructoză) şi 30 min (zaharoză) şi la concentraţii de 12% (glucoză şi zaharoză),respectiv 2,4% (fructoză) (Fig. 3.9).În figura 3.10 sunt reprezentate grafic concentraţiile de ramnoză şi acid galacturonicprezise în cazul probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze.În ceea ce privesc concentraţiile de ramnoză şi acid galacturonic obţinute în urma acţiuniicelor două preparate enzimatice, după cum era şi de aşteptat, cele mai mari valori s-au obţinut încazul probelor de sfeclă de zahăr tratate cu enzima RB1L, enzimă care conţine şi activitatepectinazică (Fig. 3.10). În cazul tratării probelor cu enzima RCL, cantitatea de ramnoză şifructoză sunt mult reduse comparativ cu probele tratate cu enzima RB1L însă sunt mai ridicatecomparativ cu proba control (Fig. 5.15).30

C oncentratia/C oncentration (%)181614121086420C ontrolRB1L30min24%RB1L30min12%RB1L30min2.4%RB1L3h24%RB1L3h12%RB1L3h2.4%RB1L24h24%RB1L24h12%RB1L24h2.4%RC L30min24%RC L30min12%RC L30min2.4%RC L3h24%RC L3h12%RC L3h2.4%RC L24h24%RC L24h12%RC L24h2.4%Proba/SampleRamnozăAcidgalacturonicFig. 3.10. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru ramnoză şi acidulgalacturonic în sucul de sfeclă de zahăr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RB1L şi RCL comparativ cuproba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri)Fig. 3.10. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for rhamnose and galacturonicacid in sugar beet juice obtained after enzymatic treatment with RB1L and RCL compared with control sample (seeMateriale şi metode cap. for the codes)Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidroliticeprin cromatografie HPLCÎn figura 3.11 sunt redate câte o cromatogramă pentru soluţiile standard de compuşi (a) şi ocrmatogramă reprezentativă pentru proba de suc de sfeclă de zahăr (b).(a)31

(b)Fig. 3.11. Separarea standardelor de carbohidraţi (a) şi o cromatogramă reprezentativă a probelor (b) după tratamentenzimaticFig. 3.11. Separation of carbohydrate standards (a) and a representative sample chromatogram (b) after enzymatictreatmentConcentraţiile determinate prin HPLC confirmă concentraţiile acestor compuşi prezise prinregresie PLS, existând unele diferenţe, fiind însă nesemnificative. În general, se poate observacă, concentraţiile determinate prin HPLC sunt uşor mai ridicate decât cele prezise prin regresiePLS.Există deci, o foarte bună corelaţie între valorile prezise prin regresie PLS (pe baza datelorobţinute prin FT-MIR) şi valorile obţinute prin cromatografie HPLC.Studii de analiză calitativă prin metoda principalelor componente (PCA)Figura 3.12 ilustrează discriminarea probelor de sfeclă de zahăr în funcţie de tratamentulenzimatic cu pectinaze aplicat iniţial probelor.Fig. 3.12. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şi PC2, obţinute din analiza PCA asucurilor de sfeclă de zahăr tratate cu cele patru tipuri de pectinase (RPL, R10L, RPTE şi RDA6L)Fig. 3.12. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtainedfrom the PCA of the sugar beet juices treated with the four types of enzymes (RPL, R10L, RPTE and RDA6L32

Se constată că primele două componente principale (PC1 şi PC2), explică 95% din varianţatotală: PC1 explică 72% din varianţa, în schimb PC2 explică doar 23% din varianţă (Fig. 3.12).Astfel, în aria definită de cele două PC, se observă că probele tratate cu cele patru tipuri deenzime, se grupează în patru grupe, în funcţie de tipul enzimei cu care s-a efectuat tratamentul.Această grupare a probelor în funcţie de tipul de enzimă testată, poate sugera o dinamică deacţiune diferită a acestor preparate enzimatice comerciale.În cazul probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze, se constată că probele se separă de-alungul axelor PC1 şi PC2 în două grupe distincte (Fig. 3.13).PC-2 (19%)Fig. 3.13. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şiPC2, obţinute din analiza PCA asucurilor de sfeclă de zahăr tratat cu cele două tipuri de celulaze şi hemicelulaze (RB1L şi RCL)Fig. 3.13. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtainedfrom the PCA of the sugar beetjuices treated with the two types of enzymes (RB1L and RCL)Şi în cazul probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze, se observă că primele douăprincipale componente explică cel mai bine varianţa dintre cele 2 grupe separate. Astfel, PC1explică 76%, PC2 explică 19%, iar totalul varianţei explicate este de 95%. Se observă totodatăcă, cele două grupe de probe se separă de-a lungul axei PC1, axa PC2 neavând un rol majoritarîn separarea acestor probe.În figura 3.14 se observă că probele tratate cu celulaze şi hemicelulaze, se separă distinctde probele tratate cu pectinaze.33

PC-2 (13%)Fig. 3.14. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şi PC2, obţinute din analiza PCA asucurilor de sfeclă de zahăr tratat cu celulaze, hemicelulaze (CHC) şi pectinaze (P)Fig. 3.14. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtained from the PCA of the sugar beetjuices treated with cellulases, hemicelulases (CHC) and pectinases (P)În acest caz, primele două principale componente explică un total de 90% din varianţă(Fig. 3.14). Frecvenţele ce apar pentru prima componentă PC1 explică majoritatea varianţei(77%), în timp ce frecvenţele ce apar pentru PC2 explică doar 13% din varianţa totală.În concluzie, se poate spune că în urma analizelor principalelor componente s-a obţinut oseparare a probelor de suc de sfeclă de zahăr în funcţie de tratamentul enzimatic aplicat iniţialpiureului de pulpă de sfeclă. Principalii compuşi care determină gruparea acestor probe suntramnoza şi acidul galacturonic, în cazul probelor tratate cu pectinaze, şi glucoza, fructoza şizaharoza în cazul probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze.CONCLUZII GENERALEConcluziile rezultate din cercetările proprii conferă originalitate şi noutate acestui studiu şise referă la:1. Determinarea activităţilor hidrolitice a opt tipuri de preparate comerciale (de tippectinaze, celulaze şi hemicelulaze) pe trei substraturi diferite (cătină, măr şi sfeclă de zahăr),prin determinarea calitativă şi cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a substanţelorpectice, celulozei şi hemicelulozei şi anume glucide simple: glucoza, fructoza, ramnoza,zaharoza şi acidul galacturonic.2. Compararea eficienţa enzimelor hidrolitice utilizate: s-au utilizat diferite raporturienzimă/substrat şi diferite durate de acţiune, la pH-uri şi temperaturi specifice fiecărui tip deenzimă. S-a dovedit ca acţiunea acestor enzime este independentă şi specifică, combinareaacestora pe acelaşi substrat neavând efect sinergic.3. Utilizarea analizei spectrometrice de tip FT-MIR pentru a evidenţia zonele derecunoaştere (fingerprint) a substraturilor şi a compuşilor glucidici eliberaţi în urma34

tratamentelor enzimatice, prin evidenţierea domeniului (900-1200 cm -1 ) şi a frecvenţelorspecifice fiecărui compus.4. Calibrarea metodei FT-MIR, pentru analiză cantitativă, prin utilizarea de soluţiistandard (individuale şi în amestec, cu concentraţii cunoscute de glucoză, fructoză, ramnoză,zaharoză şi acid galacturonic), stabilindu-se relaţia dintre frecvenţele de vibraţie specifice şi ariasemnalelor. Pe baza acestor date a fost previzionată cantitatea acestor glucide eliberate dinsubstraturile vegetale (pulpă de cătină, măr şi sfeclă de zahăr), după tratamente enzimatice.5. Interpretarea datelor şi selecţia celor mai eficiente enzime hidrolitice s-a făcut prinanaliza chemometrică (PCA şi PLS) a datelor experimentale colectate prin spectrometrie FT-MIR6. Validarea rezultatelor obţinute prin spectroscopie FT-MIR, utilizând analizacromatografică HPLC a glucidelor obţinute după tratamentul enzimatic, asociată cu analizachemometrică. Au fost evidenţiate astfel corelaţiile semnificative dintre concentraţiile fiecăruiglucid, prezise prin regresie PLS pe baza măsurătorilor FT-MIR şi concentraţiile acestoradeterminate prin HPLC.Se poate afirma în final că scopul acestei teze de doctorat a fost atins, rezultatele obţinuteprin spectroscopie FT-MIR fiind validate, prin corelaţie pozitivă şi semnificativă cu rezultateleobţinute prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC).S-a demonstrat astfel că spectroscopia FT-MIR cuplată cu analiza chemometrică, poate fiutilizată şi este recomandată ca metodă ne-distructivă, eficientă şi de încredere pentru evaluarearapidă a activităţii enzimelor hidrolitice pe substraturi naturale bogate în celuloze şi pectine, prindeterminarea calitativă şi cantitativă a glucidelor simple, ca produşi de hidroliză.BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ1. BHAT, M.K., 2000. Cellulases and related enzymes in biotechnology, Biotechnol Adv, 18 (5):355-383.2. CADET, F., PIN, F.W., ROUCH, C., CH, R., BARET, P., 1995. Enzyme kinetics by mid-infraredspectroscopy: β-fructosidase study by a one-step assay, Biochim Biophys Acta, 1246:142–150.3. CHIŞ, A., FETEA, F., TAOUTAOU, A., SOCACIU, C., 2010. Application of FTIR spectroscopy for arapid determination of some hydrolytic enzymes activity on sea buckthorn substrate, Rom Biotechnol Lett,15(6):5738-5744.4. COPIKOVA, J., SYNYTSYA, A., CERNA, M., KAASOVA, J., NOVOTNA, M., 2001. Application ofFT-IR specroscopy in detection of food hydrocolloids in confectionery jellies and food supplements, CzechJ Food Sci, 19(2):51-56.5. DUFOUR, E., 2009. Principles of infrared spectroscopy. In: Infrared spectroscopy for food qualityanalysis and control, Sun D.-W. (ed.), Acad Press, USA, 1-27.6. FILIPPOV, M.P., 1978. Infrared spectra of pectic compounds, Shtiintsa, Kishine, 14-21.7. HOONDAL, G.S., TIWARI, R.P., TIWARI, R., DAHIYA, N., BEG, Q.K., 2000. Microbial alkalinepectinases and their applications: a review, Appl Microbiol Biotechnol, 59:409–418.8. KRIEG, P., LENDL, B., VONACH, R., KELLNER, R., 1996. Determination of α-amylase activityusing Fourier transform infrared spectroscopy, Fresenius J Anal Chem, 356:504–507.9. LENDL, B., KRIEG, P., KELLNER, R., 1998. Determination of alkaline phosphatase activity in humansera by mid-FTIR spectroscopy. Fresenius J Anal Chem, 360:717–720.10. PACHECO, R., SERRALHEIRO, M.L.M., KARMALI, A., HARIS, P.I., 2003. Measuring enzymaticactivity of a recombinant amidase using Fourier transform infrared spectroscopy, Anal Biochem, 322:208–214.11. SCHINDLER, R., LE THANH, H., LENDL, B., KELLNER, R., 1998. Determination of enzymekinetics and chemometric evaluation of reaction products by FTIR spectroscopy on the example of β-fructofuranosidase, Vib Spectrosc, 16:127–135.35

12. SCHINDLER, R., LENDL, B., KELLNER, R., 1997. Determination of amyloglucosidase activity usingflow injection analysis with Fourier transform infrared spectrometric detection, Analyst 122:531–534.13. SEKKAL, M., LEGRAND, P.,1993. A spectroscopic investigation of the carragenans and agar in the1500 – 100 cm -1 spectral range, Spectrochim Acta, 49A: 205-221.14. WELLNER, N., KAKURAKOVA, M., MALOVIKOVA, A., WILSON, R.H., BELTON, P., 1998. FT-IR sudy of pectate and pectinate gels formed by divalent cations, Carbohydr Res, 308:123-131.36