Tehnici de laborator in micologia medicala - PIM Copy

Copyright © 2007Societatea Română de Micologie Medicală şi MicotoxicologieNici o parte a acesteipublicaţii nupoate fi reprodusă, transmisă, stocatăsau difuzată în orice formă sau prin orice mijloace, fărăă acordul scriss alS.R.M.M.M. Toate cererile de reproducere a materialelor publicate vor fiadresate în scris pe adresa:Societatea Română de Micologie Medicală şi MicotoxicologieOP 6, CP 1356Iaşi – RomâniaEditor volum şi design copertă:ing. Ionuţ AilincăiComenzi la:Societatea Română de Micologie Medicală şi MicotoxicologieOP 6, CP 1356Iaşi – Româniae-mail: comenzi@fungi.rowww.fungi.roDescrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a RomânieiTehnici de laborator în micologia medicalăă / sub red.:Mihai Mareş. – Iaşi : PIM, 2007Bibliogr.Index.ISBN 978-973-716-677-7I. Mareş, Mihai (ed.)543.06582.28Editura PIMŞos. Ştefan cel Mare nr. 11www.pimcopy.roIaşi RomâniaII

CuprinsCap. 1 Tehnici de recoltare, transport şi procesare primarăa prelevatelor clinice ............................................................................................... 11.1. Sângele ..................................................................................................... 21.1.1. Recoltarea sângelui pentru hemocultură ................................... 31.1.2. Numărul de hemoculturi şi momentul prelevării ...................... 41.1.3. Volumul de sânge ce urmează a fi însămânţat .......................... 41.1.4. Medii de cultură ........................................................................ 41.1.5. Durata incubării şi prelucrarea hemoculturilor ......................... 71.1.6. Semnificaţia hemoculturilor pozitive cu fungi saprobioţi ........ 81.2. Măduva osoasă hematogenă ..................................................................... 81.3. Lichidul cefalo-rahidian ........................................................................... 81.4. Raclatul cornean ....................................................................................... 91.5. Prelevatul otic .......................................................................................... 91.6. Fluidele intraoculare ................................................................................ 91.7. Firele de păr ............................................................................................. 91.8. Fragmentele unghiale şi scuamele cutanate ............................................. 91.9. Secreţiile respiratorii joase ..................................................................... 101.10. Aspiratul pulmonar ................................................................................ 111.11. Biopsia pulmonară ................................................................................. 111.12. Alte fluide organice normal sterile ......................................................... 111.13. Secreţiile purulente din abcese subcutanate sau din plăgi deschise ....... 121.14. Produsele patologice de la nivelul mucoasei orale................................. 121.15. Urina ...................................................................................................... 121.16. Secreţiile vaginale .................................................................................. 141.17. Produse patologice de la nivelul tractului genital masculin ................... 151.18. Fragmentele tisulare biopsice ................................................................. 151.19. Tehnica aspiraţiei cu ac fin .................................................................... 15Bibliografie selectivă ............................................................................. 18Cap. 2 Tehnici de microscopie directă ................................................................. 212.1. Coloraţia negativă cu tuş de India .......................................................... 222.2. Coloraţia negativă cu mercurochrom 2% şi tuş de India ....................... 232.3. Coloraţia cu lactofenol şi albastru de anilină ......................................... 242.4. Coloraţia cu hidroxid de potasiu şi cerneală Parker ............................... 252.5. Clarificarea cu hidroxid de potasiu şi dimetil sulfoxid .......................... 252.6. Coloraţia cu calcofluor alb şi KOH 10% ............................................... 262.7. Coloraţia Gram ....................................................................................... 282.8. Coloraţia Gram - calcofluor alb ............................................................. 302.9. Coloraţia Giemsa.................................................................................... 312.10. Coloraţia May-Grunwald-Giemsa .......................................................... 322.11. Coloraţia Wright .................................................................................... 342.12. Coloraţia cu mucicarmin Southgat ......................................................... 352.13. Coloraţia Musto ..................................................................................... 36Bibliografie selectivă ............................................................................. 39VI

Cap. 3 Medii de cultivare ...................................................................................... 413.1. Generalităţi ............................................................................................. 413.2. Compoziţia mediilor de cultură .............................................................. 423.3. Prepararea şi sterilizarea mediilor .......................................................... 433.4. Controlul de calitate şi păstrarea mediilor ............................................. 44Medii de cultivare .................................................................................. 46Bibliografie selectivă ............................................................................. 96Cap. 4 Tehnici de însămânţare şi transplantare ............................................... 1014.1. Tehnici uzuale ...................................................................................... 1014.2. Tehnici speciale.................................................................................... 1034.2.1. Tehnica de purificare a izolatelor levurice .............................. 1034.2.2. Tehnica însămânţării levurilor pe Agarul cu făinăde porumb şi tween 80 ......................................................... 1054.2.3. Tehnica de cultivare pe suporturi transparente ...................... 1054.2.4. Tehnica de cultivare în „picătură suspendată” ....................... 1064.2.5. Tehnica de cultivare pe bloc de geloză ................................. 1064.3. Tehnici de transplantare ....................................................................... 107Bibliografie selectivă ........................................................................... 108Cap. 5 Tehnici de examinare microscopică a fungilor din culturi ................. 1095.1. Preparatul extemporaneu cu lactofenol şi albastru de anilină(levuri) .............................................................................................. 1095.2. Preparatul extemporaneu cu lactofenol şi albastru de anilină(fungi filamentoşi) ............................................................................ 1105.3. Preparatul extemporaneu cu bandă adezivă ......................................... 1105.4. Lutarea preparatelor extemporanee ...................................................... 111Bibliografie selectivă ........................................................................... 112Cap. 6 Tehnici de histopatologie ........................................................................ 1136.1. Obţinerea probelor ............................................................................... 1136.2. Examenul macroscopic ........................................................................ 1136.3. Fixarea .............................................................................................. 1136.3.1. Formol soluţie 10% tamponată pH 6,8 ................................ 1156.3.2. Fixatorul Bouin ..................................................................... 1166.3.3. Fixatorul Hollande ................................................................ 1166.4. Procesarea ţesuturilor ........................................................................... 1176.4.1. Deshidratarea ........................................................................ 1186.4.2. Clarificarea ........................................................................... 1196.4.3. Impregnarea cu parafină ....................................................... 1196.4.4. Includerea ............................................................................. 1206.4.5. Secţionarea............................................................................ 1206.4.6. Etalarea secţiunilor ............................................................... 1216.4.7. Colorarea .............................................................................. 1236.5. Montarea .............................................................................................. 148VII

Index6.6. Etichetarea şi arhivarea ........................................................................ 150Bibliografie selectivă ........................................................................... 151Cap. 7 Tehnici de seromicologie ......................................................................... 1537.1 Fungitell ........................................................................................... 1537.1.1. Principiul testului .................................................................. 1537.1.2. Materiale furnizate împreună cu testul Fungitell .................. 1547.1.3. Materiale necesare dar nefurnizate împreună cu kitul .......... 1547.1.4. Atenţionări şi precauţii ......................................................... 1557.1.5. Păstrarea reactivilor .............................................................. 1557.1.6. Recoltarea / Stocarea / Marcarea probelor ............................ 1557.1.7. Tehnică de lucru ................................................................... 1557.1.8. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 1577.1.9. Controlul calităţii .................................................................. 1587.1.10. Limite ................................................................................... 1587.1.11. Interferarea cu alte substanţe ................................................ 1597.1.12. Valori aşteptate ..................................................................... 1597.2. Platelia ® Aspergillus ............................................................................ 1607.2.1. Principiul testului .................................................................. 1607.2.2. Materiale furnizate odată cu kitul ......................................... 1607.2.3. Materiale necesare, dar nefurnizate odată cu kitul ............... 1617.2.4. Conservarea reactivilor desigilaţişi a celor reconstituiţi ............................................................ 1617.2.5. Tehnica de lucru ................................................................... 1627.2.6. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 1647.3. Platelia ® Candida Ac ............................................................................ 1657.3.1. Introducere ............................................................................ 1657.3.2. Principiul testului .................................................................. 1657.3.3. Materiale furnizate împreună cu kitul ................................... 1657.3.4. Materiale necesare dar nefurnizate impreună cu kitul .......... 1667.3.5. Tehnica de lucru ................................................................... 1667.3.6. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 1677.4. Platelia ® Candida Ag ........................................................................... 1697.4.1. Introducere ............................................................................ 1697.4.2. Principiul testului .................................................................. 1697.4.3. Materiale furnizate odată cu kitul ......................................... 1697.4.4. Materiale necesare dar nefurnizate odată cu kitul ................ 1697.4.5. Tehnica de lucru ................................................................... 1707.4.6. Maniera de calcul şi interpretarea rezultatelor ...................... 1717.5. Identificarea speciei Candida dubliniensisprin latex-aglutinare .............................................................. 172Bibliografie selectivă ........................................................................... 173Cap. 8 Teste biochimice şi fiziologice ................................................................. 1798.1. Fermentarea zaharurilor ...................................................................... 1798.2. Capacitatea de asimilare a surselor de carbon ..................................... 1808.3. Capacitatea de asimilare a surselor de azot ......................................... 180VIII

8.4. Testul de hidroliză a ureei (producerea de urează) la levuri ................ 1808.5. Testul de hidroliză a ureei (producerea de urează) la dermatofiţi ........ 1818.6. Testarea rezistenţei la cicloheximidă ................................................... 1818.7. Producerea de fenol-oxidază ................................................................ 1828.8. Testarea producerii altor enzime .......................................................... 1828.9. Testul de depistare a necesităţilor nutritive speciale ............................ 1828.10. Testul de cultivare pe Agar BCP-lapte-glucoză. .................................. 1838.11. Testul de perforare a firului de păr in vitro. ......................................... 1848.12. Testul de cultivare pe boabe de orez .................................................... 1858.13. Testul de filamentare (testul de blasteză sau germ-tube test) ............... 1858.14. Testul de termotoleranţă / termostimulare ........................................... 186Bibliografie selectivă ........................................................................... 188Cap. 9 Tehnici de micologie moleculară ............................................................ 1919.1. Extracţia ADN-ului pentru PCR .......................................................... 1919.2. Extracţia ADN-ului cu ajutorul kit-uluiHigh Pure Template Preparation Kit (levuri) .................................... 1919.3. Extracţia ADN-ului prin crioprecipitare (fungi filamentoşi) ............... 1929.4. Controlul calităţii acizilor nucleici extraşi ........................................... 1939.5. Identificarea speciei Candida dubliniensis prin PCR duplex ............... 1949.6. Identificarea moleculară a levurilor prin PCR şisecvenţializarea regiunilor ITS ......................................................... 1969.7. Reactivi utilizaţi în tehnicile de biologie moleculară ........................... 200Bibliografie selectivă ........................................................................... 201Cap. 10 Tehnici de evaluare a sensibilităţii la antifungice ............................... 20310.1. Tehnica de lucru pentru levuri ............................................................. 20310.2. Tehnica de lucru pentru fungi filamentoşi ........................................... 20610.3. Testarea sensibilităţii la antifungice prin metodadifuzimetrică Kirby-Bauer ................................................................ 208Bibliografie selectivă ........................................................................... 210Cap. 11 Tehnici de aeromicologie ...................................................................... 21111.1. Caseta AIR-O-CELL ........................................................................ 21211.2. Caseta MICRO-5.................................................................................. 21411.3. Caseta CYCLEX-D .............................................................................. 21511.4. Caseta BIOCELL ................................................................................. 21511.5. Caseta LARO 100 ................................................................................ 21611.6. Impactorul Zefon Z-A6 ........................................................................ 21711.7. Dispozitivul CIP 10M .......................................................................... 21911.8. Aprecierea încărcăturii fungice aeropurtate ......................................... 22411.9. Tehnici de recoltare/examinare directă a probelor ............................... 22511.9.1. Banda adezivă BIO TAPETM (Zefon International) ............ 22511.9.2. Recoltarea fragmentelor inerte .............................................. 22611.9.3. Recoltarea cu ajutorul tamponului tip exsudat ...................... 226Bibliografie selectivă ........................................................................... 227IX

IndexCap. 12 Norme generale de biosecuritate înlaboratoarele de micologie medicală ................................................ 22912.1. Clasificarea fungilor în funcţie de clasele de risc biologic .................. 22912.2. Norme generale de biosecuritate .......................................................... 23012.2.1. Tehnici de laborator folosite în zona de lucru ....................... 23212.3. Metode de protecţie primară ................................................................ 23212.3.1. Hote de protecţie biologică ................................................... 23212.4. Substanţe decontaminante folosite înlaboratoarele de micologie medicală ................................................. 23312.5. Măsuri de protecţie împotriva substanţelor chimice ........................... 235Bibliografie selectivă ........................................................................... 236Anexă .................................................................................................................... 237Index ..................................................................................................................... 245X