PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) - タカラバイオ

製 品 コード RR037A
PrimeScript® RT reagent Kit
(Perfect Real Time)
説 明 書

本 製 品 は、 リ ア ル タ イ ム RT-PCR に 最 適 化 さ れ た 逆 転 写 反 応 キ ッ ト で す。 伸 長 性 能 に 優 れ た
PrimeScript® RTase を 使 用 し 短 時 間 の 反 応 で 効 率 良 くリアルタイム PCR 用 の 鋳 型 cDNA を 合 成 するこ
とができます。 実 験 操 作 も 簡 単 でハイスループットな 解 析 にも 適 しています。2 ステップのリアルタイ
ム RT-PCR に、リアルタイム PCR 試 薬 SYBR® Premix Ex Taq II(Perfect Real Time)や SYBR® Premix Ex
Taq(Perfect Real Time)、あるいは Premix Ex Taq(Perfect Real Time)と 組 み 合 わせて 使 用 します。
SYBR® Green アッセイを 行 う 場 合 、TaqMan® プローブアッセイを 行 う 場 合 のそれぞれに 最 適 化 したプロ
トコールを 用 意 していますので、アッセイ 方 法 にあわせて 選 択 してください。
I.キットの 内 容
1.5 × PrimeScript® Buffer(for Real Time) * 1 400 μl
2.PrimeScript® RT Enzyme Mix I
100 μl
3.Oligo dT Primer 50 μM 100 μl
4.Random 6 mers 100 μM 400 μl
5.RNase Free dH2O
1 ml
6.EASY Dilution(for Real Time PCR) * 2
1 ml
* 1:dNTP Mixture および Mg 2+ を 含 む。
* 2:total RNA や cDNA を 段 階 希 釈 する 際 に、 希 釈 溶 液 として 使 用 します。 水 や TE で 希 釈 する
と 正 確 な 希 釈 ができない 場 合 がありますが、この EASY Dilution を 用 いると 低 濃 度 までの
正 確 な 希 釈 ができます。なお、このバッファーが 逆 転 写 や PCR の 反 応 性 に 影 響 をおよぼす
ことはありません。 希 釈 した 鋳 型 溶 液 をそのまま 逆 転 写 反 応 や PCR 反 応 の 鋳 型 として 使 用
できます。
単 品 でも 購 入 できます。EASY Dilution(for Real Time PCR)( 製 品 コード 9160)
注 ) EASY Dilution は、タカラバイオのリアルタイム PCR 試 薬 と 組 み 合 わせてご 使 用 くだ
さい。 他 社 メーカーの 製 品 については 適 合 性 を 確 認 していません。
キット 以 外 に 必 要 な 試 薬 、 機 器 ( 主 なもの)
・サーマルサイクラー
(または 37℃、42℃ 恒 温 槽 、85℃ ヒートブロック)
・0.2 ml および 1.5 ml マイクロチューブ( 逆 転 写 反 応 用 )
・マイクロピペットおよびチップ(オートクレーブ 処 理 したもの)
II. 保 存 − 20℃
2

III. 特 長
(1) 短 時 間 の 反 応 で 効 率 良 くリアルタイム PCR 用 の 鋳 型 cDNA を 合 成 できます。2 ステップの
リアルタイム RT-PCR に 最 適 です。
(2) 逆 転 写 用 のプライマーとして Random 6 mers と Oligo dT Primer が 添 付 されています。 両 方
のプライマーを 混 合 して 用 いることも、 実 験 目 的 に 応 じて 使 い 分 けることも 可 能 です。また、
特 定 遺 伝 子 の 検 出 には Gene Specific Primer も 使 用 できます。
(3) SYBR® Green アッセイ 用 と TaqMan® プローブアッセイ 用 のプロトコールを 用 意 していま
す。リアルタイム PCR 時 のアッセイ 方 法 にあわせて 選 択 してください。
(4) リアルタイム RT-PCR による 定 量 には 検 量 線 の 作 成 が 必 須 です。 適 切 な 検 量 線 の 作 成 には、
total RNA や 逆 転 写 後 の cDNA を 低 濃 度 まで 正 確 に 希 釈 することが 重 要 ですが、 水 や TE で
希 釈 すると 特 に 低 濃 度 の 希 釈 が 不 安 定 となり、 利 用 できる 検 量 線 のレンジが 狭 くなる 場 合
があります。 製 品 添 付 の EASY Dilution(for Real Time PCR)を 希 釈 に 用 いることで 低 濃 度
まで 正 確 に 希 釈 でき、 幅 広 いレンジで 検 量 線 の 作 成 が 行 えます。
IV. 操 作 上 の 注 意
本 キットを 使 用 する 場 合 の 注 意 事 項 です。 使 用 前 に 必 ずお 読 みください。
(1) 反 応 液 は、 数 回 ~ 10 回 分 程 度 の Master Mix(RNase Free dH2O、バッファー、 酵 素 等 の 混
液 )をまとめて 調 製 すると 便 利 です。Master Mix を 作 ることにより、ピペッティングによ
るロスや、 試 薬 の 分 注 、 撹 拌 回 数 が 少 なくなり、 正 確 な 試 薬 の 分 注 を 行 うことができます。
その 結 果 、 実 験 間 のデータのばらつきも 防 げます。
(2) PrimeScript® RT Enzyme Mix I は、 使 用 前 に 軽 く 遠 心 して、 試 薬 をチューブの 底 に 落 として
ください。 酵 素 は 50%グリセロール 溶 液 で 粘 度 が 高 いので、 注 意 深 くゆっくりとピペッティ
ングを 行 ってください。
(3) 試 薬 の 分 注 を 行 うときは 必 ず 新 しいディスポーザブルチップを 用 い、サンプル 間 のコンタ
ミネーションを 極 力 防 止 してください。
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V. 操 作 : 逆 転 写 反 応
(RNA 調 製 方 法 は、「VII. B. RNA サンプルの 調 製 について」(9 ページ)を 参 照 して 下 さい)
【SYBR® Green Assay の 場 合 】
1. 下 記 に 示 す 逆 転 写 反 応 液 を 氷 上 で 調 製 する。
RNA サンプル 以 外 のコンポーネントを 必 要 本 数 + α 調 製 し、マイクロチューブに 分
注 後 、RNA サンプルを 添 加 すると 良 い。
< 1 反 応 あたり>
試 薬
使 用 量
最 終 濃 度
(または 添 加 量 )
5 × PrimeScript® Buffer(for Real Time) 2 μl 1 ×
PrimeScript® RT Enzyme Mix I
0.5 μl
Oligo dT Primer(50μM) * 1 0.5 μl 25 pmol
Random 6 mers(100μM) * 1 0.5 μl 50 pmol
total RNA
RNase Free dH2O
Total 10μl * 2
* 1:Oligo dT Primer と Random 6 mers の 両 方 を 用 いると mRNA 全 長 にわたり 効 率 よく
cDNA が 合 成 されます。なお、 各 プライマーを 単 独 で 用 いる 場 合 および Gene Specific
Primer の 場 合 の 使 用 量 は 以 下 の 通 りです。
プライマー 使 用 量 添 加 量
Oligo dT Primer(50 μM) 0.5 μl 25 pmol
Random 6 mers(100 μM) 0.5 μl 50 pmol
Gene Specific Primer(2 μM) 0.5 μl 1 pmol
* 2: 逆 転 写 反 応 は、 必 要 に 応 じてスケールアップすることも 可 能 です。10 μl の 反 応 液
で 逆 転 写 できるのは、およそ 500 ng までの total RNA です。
2. 逆 転 写 反 応 を 行 う。
37℃、15 分 * 3 ( 逆 転 写 反 応 )
85℃、5 秒 ( 逆 転 写 酵 素 を 熱 失 活 させる)
4℃
* 3:Gene Specific Primer を 用 いる 場 合 :
逆 転 写 反 応 を 42℃、15 分 で 行 ってください。PCR で 非 特 異 的 な 増 幅 が 生 じた 場 合
には、 逆 転 写 温 度 を 50℃に 変 更 すると 改 善 される 場 合 があります。
( 注 ) 2. で 得 た 逆 転 写 反 応 液 をリアルタイム PCR の 系 に 持 ち 込 む 場 合 には、PCR 反 応 液
容 量 の 10%までとしてください。
( 注 ) TaqMan® Probe Assay 用 のプロトコール(5 ページ)で 逆 転 写 反 応 を 行 うことはお
勧 めしません。リアルタイム PCR の 際 に SYBR® Green のバックグラウンドが 高 く
なることがあります。
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【TaqMan® Probe Assay の 場 合 】
1. 下 記 に 示 す 逆 転 写 反 応 液 を 氷 上 で 調 製 する。
RNA サンプル 以 外 のコンポーネントを 必 要 本 数 + α 調 製 し、マイクロチューブに 分
注 後 、RNA サンプルを 添 加 すると 良 い。
< 1 反 応 あたり>
試 薬
使 用 量
最 終 濃 度
(または 添 加 量 )
5 × PrimeScript® Buffer(for Real Time) 2 μl 1 ×
PrimeScript® RT Enzyme Mix I
0.5 μl
Oligo dT Primer(50μM) * 1 0.5 μl 25 pmol
Random 6 mers(100μM) * 1 2 μl 200 pmol
total RNA
RNase Free dH2O
Total 10μl * 2
* 1:Oligo dT Primer と Random 6 mers の 両 方 を 用 いると mRNA 全 長 にわたり 効 率 よく
cDNA が 合 成 されます。なお、 各 プライマーを 単 独 で 用 いる 場 合 および Gene Specific
Primer の 場 合 の 使 用 量 は 以 下 の 通 りです。
プライマー 使 用 量 添 加 量
Oligo dT Primer(50 μM) 0.5 μl 25 pmol
Random 6 mers(100 μM) 2 μl 200 pmol
Gene Specific Primer(2 μM) 0.5 μl 1 pmol
* 2: 逆 転 写 反 応 は、 必 要 に 応 じてスケールアップすることも 可 能 です。10 μl の 反 応 液
で 逆 転 写 できるのは、およそ 1 μg までの total RNA です。
2. 逆 転 写 反 応 を 行 う。
37℃、15 分 * 3 ( 逆 転 写 反 応 )
85℃、5 秒 ( 逆 転 写 酵 素 を 熱 失 活 させる)
4℃
* 3:Gene Specific Primer を 用 いる 場 合 :
逆 転 写 反 応 を 42℃、15 分 で 行 ってください。PCR で 非 特 異 的 な 増 幅 が 生 じた 場 合
には、 逆 転 写 温 度 を 50℃に 変 更 すると 改 善 される 場 合 があります。
( 注 ) 2. で 得 た 逆 転 写 反 応 液 をリアルタイム PCR の 系 に 持 ち 込 む 場 合 には、PCR 反 応 液
容 量 の 10%までとしてください。
( 注 ) SYBR® Green Assay 用 のプロトコール( 前 頁 )で 反 応 することも 可 能 ですが、その
場 合 、10 μl の 反 応 液 で 逆 転 写 できるのはおよそ 500 ng までの total RNA です。
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VI. 備 考 :リアルタイム PCR
以 下 には、 本 キットで 逆 転 写 反 応 を 行 った 後 、SYBR® Premix Ex Taq II(Perfect Real Time)( 製 品
コード RR081A)を 用 いてリアルタイム PCR を 行 う 場 合 のプロトコール 例 を 示 します。
リアルタイム PCR を TaqMan® プローブ 検 出 で 行 う 場 合 には Premix Ex Taq(Perfect Real
Time)( 製 品 コード RR039A)をご 使 用 ください。
< Thermal Cycler Dice® Real Time System を 用 いる 場 合 の 操 作 方 法 >
1. 下 記 に 示 す PCR 反 応 液 を 調 製 する。
< 1 反 応 あたり>
試 薬 使 用 量 最 終 濃 度
SYBR® Premix Ex Taq II(2×) 12.5 μl 1 ×
PCR Forward Primer(10μM) 1 μl 0.4 μM * 1
PCR Reverse Primer(10μM) 1 μl 0.4 μM * 1
RT 反 応 液 (cDNA 溶 液 ) 2 μl * 2
dH2O( 滅 菌 蒸 留 水 )
8.5 μl
Total
25 μl
* 1: 最 終 primer 濃 度 は 0.4 μM で 良 い 結 果 が 得 られる 場 合 が 多 いが、 反 応 性 に 問 題 がある
ときは 0.2 〜 1.0 μM の 範 囲 で 最 適 な 濃 度 を 検 討 すると 良 い。
* 2 :total RNA 10 pg 〜 100 ng 相 当 量 の cDNA を template として 使 用 することが 望 ましい。
また、 逆 転 写 反 応 液 の 持 込 みは、PCR 反 応 液 容 量 の 10% 以 下 になるようにする。
2. 反 応 を 開 始 する。
PCR 反 応 は、 下 記 のシャトル PCR 標 準 プロトコールで 行 うことをお 勧 めします。まずはこの
プロトコールを 試 し、 必 要 に 応 じて PCR 条 件 を 至 適 化 してください。Tm 値 が 低 めのプライマー
など、シャトル PCR での 反 応 が 難 しい 場 合 には、3 ステップ PCR を 行 います。
〔 シャトル PCR 標 準 プロトコール〕
Hold( 初 期 変 性 )
Cycle:1
95℃ 30 秒
2 Step PCR
Cycle:40
95℃ 5 秒
60℃ 30 秒
Dissociation
※ 使 用 上 の 注 意
本 製 品 に 使 用 している TaKaRa Ex Taq ® HS はポリメラーゼ 活 性 を 抑 制 する 抗 Taq 抗 体 を 利 用 し
たホットスタート PCR 用 酵 素 です。 他 社 の 化 学 修 飾 タイプのホットスタート PCR 酵 素 で 必 要 な
PCR 反 応 前 の 95℃(5 〜)15 分 の 活 性 化 ステップは 行 わないで 下 さい。 必 要 以 上 の 熱 処 理 を 加
えると 酵 素 活 性 が 低 下 し、 増 幅 効 率 、 定 量 精 度 に 影 響 を 及 ぼす 傾 向 があります。
PCR 反 応 前 に 鋳 型 の 初 期 変 性 を 行 う 場 合 でも、 通 常 95℃ 30 秒 で 充 分 です。
3. 反 応 終 了 後 、 解 析 を 行 う。
反 応 終 了 後 、 増 幅 曲 線 と 融 解 曲 線 を 確 認 し、 定 量 を 行 う 場 合 は 検 量 線 を 作 成 する。 *
*: 解 析 方 法 の 詳 細 は、Thermal Cycler Dice® Real Time System 取 扱 説 明 書 を 参 照 してください。
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ABI PRISM® 7000/7700 および 7300/7500 Real-Time PCR System を 用 いる 場 合 の 操 作 方 法 >
※ 各 機 種 の 取 扱 説 明 書 (Applied Biosystems 社 )に 従 って 操 作 してください。
1. 下 記 に 示 す PCR 反 応 液 を 調 製 する。
< 1 反 応 あたり>
試 薬 使 用 量 使 用 量 最 終 濃 度
SYBR® Premix Ex Taq II(2×) 10 μl 25 μl 1 ×
PCR Forward Primer(10μM) 0.8 μl 2 μl 0.4 μM * 1
PCR Reverse Primer(10μM) 0.8 μl 2 μl 0.4 μM * 1
ROX Reference Dye or Dye II(50×) * 3 0.4 μl 1 μl 1 ×
RT 反 応 液 (cDNA 溶 液 ) 2 μl 4 μl * 2
dH2O( 滅 菌 蒸 留 水 ) 6 μl 16 μl
Total 20 μl * 4 50 μl * 4
* 1: 最 終 primer 濃 度 は 0.4 μM で 良 い 結 果 が 得 られる 場 合 が 多 いが、 反 応 性 に 問 題 がある
ときは 0.2 〜 1.0 μM の 範 囲 で 最 適 な 濃 度 を 検 討 すると 良 い。
* 2:20 μl 反 応 液 あたり total RNA 10 pg 〜 100 ng 相 当 量 の cDNA を template として 使 用
することが 望 ましい。また、 逆 転 写 反 応 液 の 持 込 みは、PCR 反 応 液 容 量 の 10% 以 下 に
なるようにする。
* 3:ROX Reference Dye II(50×)は、ROX Reference Dye(50×)より 濃 度 が 低 く 設 定 さ
れています。7500 Real-Time PCR System で 解 析 する 場 合 には、ROX Reference Dye II
(50 ×)の 使 用 を 推 奨 します。
なお、ABI PRISM 7000/7700 および 7300 Real-Time PCR System には、ROX Reference
Dye(50 ×)を 使 用 してください。
* 4:96 ウェルプレート、シングルチューブおよび 8 連 チューブでの 反 応 は 50 μl 反 応 系 で
行 う。384 ウェルプレートでの 反 応 は 20 μl 反 応 系 で 行 う。
2. 反 応 を 開 始 する。
PCR 反 応 は、 下 記 のシャトル PCR 標 準 プロトコールで 行 うことをお 勧 めします。まずは、こ
のプロトコールを 試 し、 必 要 に 応 じて PCR 反 応 条 件 を 至 適 化 してください。Tm 値 が 低 めの
プライマーなど、シャトル PCR での 反 応 が 難 しい 場 合 には、3 ステップ PCR を 行 います。
〔 シャトル PCR 標 準 プロトコール〕
Stage 1: 初 期 変 性
Reps:1
95℃ 30 秒
Stage 2:PCR 反 応
Reps:40
95℃ 5 秒
60℃ 30 秒 〜 34 秒 *
Dissociation Stage
*:7700 では 30 秒 に、7000
お よ び 7300 で は 31 秒
に、7500 では 34 秒 に 設
定 する。
※ 使 用 上 の 注 意
本 製 品 に 使 用 している TaKaRa Ex Taq ® HS はポリメラーゼ 活 性 を 抑 制 する 抗 Taq 抗 体 を 利 用 し
たホットスタート PCR 用 酵 素 です。 他 社 の 化 学 修 飾 タイプのホットスタート PCR 酵 素 で 必 要 な
PCR 反 応 前 の 95℃(5 〜)15 分 の 活 性 化 ステップは 行 わないで 下 さい。 必 要 以 上 の 熱 処 理 を 加
えると 酵 素 活 性 が 低 下 し、 増 幅 効 率 、 定 量 精 度 に 影 響 を 及 ぼす 傾 向 があります。
PCR 反 応 前 に 鋳 型 の 初 期 変 性 を 行 う 場 合 でも、 通 常 95℃ 30 秒 で 充 分 です。
3. 反 応 終 了 後 、 解 析 を 行 う。
反 応 終 了 後 、 増 幅 曲 線 と 融 解 曲 線 を 確 認 し、 定 量 を 行 う 場 合 は 検 量 線 を 作 成 する。 *
*: 解 析 方 法 は、リアルタイム PCR 装 置 の 取 扱 説 明 書 を 参 照 してください。
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VII.Appendix
A. 実 験 例 : 逆 転 写 反 応 時 間 と cDNA 合 成 量
【 方 法 】
逆 転 写 反 応
試 薬 : PrimeScript® RT reagent Kit(Perfect Real Time)
鋳 型 : マウス 肝 臓 由 来 total RNA 2 pg ~ 2 μg および 滅 菌 水
反 応 液 量 : 20 μl
プライマー: Random 6 mers
反 応 条 件 : 37℃ 15、30、60 分 → 85℃ 5 秒 → 4℃
リアルタイム PCR
試 薬 : SYBR® Premix Ex Taq(Perfect Real Time)
鋳 型 : 上 記 の 逆 転 写 反 応 液 各 2 μl
反 応 液 量 : 25 μl
測 定 遺 伝 子 : Mouse Actb
プライマー: Perfect Real Time サポートシステムのプライマーを 使 用
反 応 条 件 : Thermal Cycler Dice® Real Time System 用 標 準 プロトコール
【 結 果 】
増 幅 曲 線
検 量 線
15 分 ( 紫 )
30 分 ( 赤 )
60 分 ( 茶 )
15 分 ( 紫 ) Rsq:0.999 Eff = 98.7% Y = - 3.522 * LOG(X)+ 33.94
30 分 ( 赤 ) Rsq:0.999 Eff = 93.3% Y = - 3.495 * LOG(X)+ 34.61
60 分 ( 茶 ) Rsq:0.999 Eff = 95.2% Y = - 3.441 * LOG(X)+ 34.28
反 応 時 間 を 15 分 、30 分 、60 分 に 設 定 した 場 合 の 反 応 性 を 比 較 しました。この 実 験 では、
いずれの 反 応 時 間 でも 広 い 鋳 型 濃 度 範 囲 にわたって 同 等 な 効 率 で 反 応 できていることが 分
かります。
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B.RNA サンプルの 調 製 について
純 度 の 高 い RNA サンプルを 得 るためには、 細 胞 内 に 含 まれる RNase の 作 用 を 抑 えること、
また 使 用 する 器 具 や 溶 液 など 外 部 からの RNase の 混 入 を 避 けることが 大 切 です。RNA 調
製 にあたっては、 実 験 者 の 汗 や 唾 液 に 含 まれる RNase の 混 入 を 防 ぐため 作 業 中 は 不 必 要
に 話 さず、 清 潔 なディスポーザブルグローブを 着 用 し、RNA 調 製 専 用 の 実 験 台 を 設 ける
などの 細 心 の 注 意 を 払 ってください。
【 器 具 】
実 験 器 具 に 関 しては、 可 能 な 限 りディスポーザブルのプラスチック 製 品 を 使 用 してくださ
い。 一 般 のガラス 器 具 は 以 下 の 処 理 の(1)あるいは(2)を 行 ってから 使 用 してください。
(1) 乾 熱 滅 菌 (180℃、60 分 )
(2) ガラス 器 具 を 0.1%ジエチルピロカーボネート(DEPC) 溶 液 で、37℃ , 12 時
間 処 理 する。 残 留 DEPC を 除 去 するためにオートクレーブ 処 理 (120℃ , 30 分 )
する。
RNA 実 験 に 用 いる 器 具 (プラスチックおよびガラス)は、 他 の 器 具 と 区 別 して RNA 専 用
として 用 いることをお 勧 めします。
【 溶 液 】
実 験 に 用 いる 試 薬 溶 液 は、 上 記 の 条 件 で 乾 熱 滅 菌 (180℃ , 60 分 )あるいは DEPC 処 理 し
たガラス 器 具 で 調 製 し、 用 いる 蒸 留 水 はあらかじめ 0.1% DEPC 処 理 を 行 いオートクレー
ブしてください。 用 いる 溶 液 、 蒸 留 水 はすべて RNA 実 験 専 用 としてお 使 いください。
【RNA サンプルの 調 製 法 】
RT-PCR 法 に 用 いる RNA サンプルは、 通 常 少 量 の RNA があればよい 場 合 が 多 いので 簡 便
な 精 製 法 が 用 いられることもありますが、できれば GTC 法 (グアニジンチオシアネート 法 )
等 で 高 純 度 に 精 製 した RNA を 用 いることをお 勧 めします。
タカラバイオの FastPure® RNA Kit( 製 品 コード 9190)や RNAiso Plus( 製 品 コード
9108/9109)などの 市 販 の RNA 抽 出 キットを 用 いて、 短 時 間 で 高 純 度 の total RNA を 調 製
することもできます。
RNA サンプルは、 最 終 的 に 滅 菌 蒸 留 水 または TE Buffer 溶 液 となるように 調 製 してください。
RNA の 調 製 法 につきましては、【 書 籍 】< 普 及 版 > PCR テクノロジー( 製 品 コード 8556)「サ
ンプルの 簡 単 迅 速 な 調 製 法 」(p. 45 〜 54)、 実 験 医 学 増 刊 「PCR とその 応 用 」、8、1063-
1071(1990)なども 参 考 にしてください。
【ゲノム DNA の 混 入 とその 対 策 】
total RNA サンプルには 微 量 のゲノム DNA が 混 入 していることがあります。ゲノム DNA
も PCR の 鋳 型 となりうるため、ゲノム DNA が 混 入 した total RNA を 鋳 型 として 用 いると
解 析 結 果 が 不 正 確 になります。それを 避 けるためには、(1)ゲノム DNA 由 来 の 増 幅 が 起
こらないようなプライマーを 設 計 する、あるいは、(2)DNase I 処 理 によりゲノム DNA
を 除 去 する、といった 対 策 を 取 ります。
(1)ゲノム DNA 由 来 の 増 幅 が 起 こらないプライマー 設 計
ゲノム DNA は、エキソン、イントロン 構 造 を 持 っているため、これを 利 用 してゲ
ノム DNA 由 来 の 増 幅 が 起 こらないようなプライマーを 設 計 することができます。
まず、 目 的 遺 伝 子 のゲノム 構 造 を 確 認 し、サイズの 大 きなイントロンを 選 びます。
そして、このイントロンを 挟 む 2 つのエキソン 上 に 上 流 プライマー、 下 流 プライマー
をそれぞれ 設 計 します。イントロンのサイズが 十 分 に 大 きければ、ゲノム DNA 由
来 の 増 幅 が 起 こりません。また、イントロンのサイズが 小 さい 場 合 にも、ゲノム 由
来 の PCR 増 幅 産 物 は、mRNA 由 来 のものよりもサイズが 大 きくなるため、 融 解 曲 線
分 析 で 区 別 できます。
しかし、この 方 法 は、シングルエキソンの 遺 伝 子 や 偽 遺 伝 子 を 持 つ 遺 伝 子 には 適 用 でき
ません。また、イントロンを 持 たない 生 物 種 やゲノム 情 報 が 解 析 されていない 生 物 種 で
も 同 様 な 問 題 が 起 こります。これらの 場 合 には、(2)の DNase I 処 理 を 行 ってください。
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(2)DNase I 処 理 によるゲノム DNA の 除 去
total RNA を 抽 出 した 後 、DNase I(RNase-free)( 製 品 コード 2215A)により 混 入 し
たゲノム DNA を 分 解 します。 反 応 後 、DNase I は、 熱 処 理 またはフェノール / クロ
ロホルム 抽 出 により 失 活 させ 除 去 します。
操 作 手 順
1. 以 下 の 反 応 液 を 調 製 する。
total RNA
20 〜 50 μg
10 × DNase I Buffer 5 μl
RNase Inhibitor
20 U
DNase I(RNase-free) 2 μl(10 U)
DEPC 処 理 水
50 μl に fill up
2.37℃で 20 分 間 反 応 する。
3. 以 下 のいずれかの 方 法 で DNase I を 失 活 させる。
A. 熱 処 理
(1) 2.5 μl の 0.5M EDTA を 加 えて、80℃で 2 分 間 インキュベートする。
(2) DEPC 処 理 水 で 100 μl に fill up する。
B.フェノール / クロロホルム 抽 出
(1) 50 μl の DEPC 処 理 水 と 100 μl のフェノール / クロロホルム / イソアミ
ルアルコール(25:24:1)を 加 えて 混 合 する。
(2) 室 温 、15,000 rpm で 5 分 間 遠 心 し、 上 層 を 新 しいチューブに 移 す。
(3) 等 量 のクロロホルム / イソアミルアルコール(24:1)を 加 えて 混 合 する。
(4) 室 温 、15,000 rom で 5 分 間 遠 心 し、 上 層 を 新 しいチューブに 移 す。
4. 10 μl の 3 M 酢 酸 ナトリウムと 250 μl の 冷 エタノールを 加 えて 氷 上 で 10 分 間 静
置 する。
5.4℃、15,000 rpm で 15 分 間 遠 心 し、 上 清 を 捨 てる。
6.70%エタノールで 沈 殿 を 洗 浄 し、4℃、15,000 rpm で 5 分 間 遠 心 し、 上 清 を 捨 てる。
7. 沈 殿 を 乾 燥 させる。
8. 適 当 量 の DEPC 処 理 水 に 溶 解 する。
【 混 入 ゲノム DNA の 確 認 方 法 】
逆 転 写 反 応 をせずにリアルタイム PCR を 行 うことにより、ゲノム DNA の 混 入 量 を 確 認 す
ることができます。この 実 験 には、ゲノム DNA と mRNA の 両 方 から PCR 増 幅 が 可 能 な
プライマーを 使 用 すると 便 利 です。DNase I 処 理 によりゲノム DNA が 除 去 されたことを
確 認 するには、このような 反 応 を 行 ってください。なお、ゲノム DNA 由 来 の 増 幅 が 起 こ
らないように 設 計 したプライマーでも、 偽 遺 伝 子 由 来 の 増 幅 が 起 こる 場 合 があります。そ
のような 疑 いがある 場 合 にも、この 方 法 で 確 認 することができます。
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VIII. 関 連 製 品
SYBR® Premix Ex Taq II(Perfect Real Time)( 製 品 コード RR081A)
SYBR® Premix Ex Taq(Perfect Real Time)( 製 品 コード RR041A)
SYBR® Premix DimerEraser®(Perfect Real Time)( 製 品 コード RR091A)
Premix Ex Taq(Perfect Real Time)( 製 品 コード RR039A)
EASY Dilution(for Real Time PCR)( 製 品 コード 9160)
Thermal Cycler Dice® Real Time System( 製 品 コード TP800/TP850/TP860/TP870)
Smart Cycler® II System( 製 品 コード SC200N/SC210N)
FastPure® RNA Kit( 製 品 コード 9190)
RNAiso Plus( 製 品 コード 9108/9109)
Perfect Real Time サポートシステム *
*: ヒト、マウス、ラットの RefSeq に 対 してリアルタイム RT-PCR 用 プライマーが 設 計 済 みです。
ご 注 文 によりカスタム 合 成 してお 届 けします。 本 製 品 および SYBR® Premix Ex Taq II(Perfect
Real Time)または SYBR® Premix Ex Taq(Perfect Real Time)と 組 合 せて、SYBR® Green I 検
出 によるリアルタイム RT-PCR を 行 うことができます。
http://www.takara-bio.co.jp/realtime/
IX. 参 考 文 献
1) 山 本 純 子 , 向 井 博 之 (1999) 蛋 白 質 ・ 核 酸 ・ 酵 素 44, 189-193
2) 川 上 文 清 , 石 田 由 和 (1997) 細 胞 工 学 別 冊 「PCR Tips」94-99
X. 注 意
・ 本 製 品 は 研 究 用 として 販 売 しております。ヒト、 動 物 への 医 療 、 臨 床 診 断 用 には 使 用 しないよ
うご 注 意 ください。また、 食 品 、 化 粧 品 、 家 庭 用 品 等 として 使 用 しないでください。
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SYBR は Molecular Probe Inc. の 登 録 商 標 です。
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