REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - USAMV Cluj-Napoca
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - USAMV Cluj-Napoca
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - USAMV Cluj-Napoca
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
UNIVERSITATEA <strong>DE</strong> ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI<br />
MEDICINĂ VETERINARĂ<br />
CLUJ-NAPOCA<br />
ŞCOALA DOCTORALĂ<br />
FACULTATEA <strong>DE</strong> MEDICINĂ VETERINARĂ<br />
Ovidiu-Ion ŞUTEU<br />
(REZUMAT AL <strong>TEZEI</strong> <strong>DE</strong> <strong>DOCTORAT</strong>)<br />
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC<br />
Prof. univ. Dr. Vasile COZMA<br />
CLUJ-NAPOCA<br />
2009<br />
I
UNIVERSITATEA <strong>DE</strong> ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI<br />
MEDICINĂ VETERINARĂ<br />
CLUJ-NAPOCA<br />
ŞCOALA DOCTORALĂ<br />
FACULTATEA <strong>DE</strong> MEDICINĂ VETERINARĂ<br />
Ovidiu-Ion ŞUTEU<br />
NEOSPOROZA LA CÂINE ŞI BOVINE:<br />
CERCETĂRI EXPERIMENTALE ŞI<br />
EPI<strong>DE</strong>MIOLOGICE<br />
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC<br />
Prof. univ. Dr. Vasile COZMA<br />
CLUJ-NAPOCA<br />
2009<br />
II
INTRODUCERE<br />
Neospora caninum este un parazit încadrat taxonomic<br />
în Încrengătura Apicomplexa (Fig. 1), recent identificat, ce<br />
afectează animalele de fermă, în special bovinele, iar dintre<br />
cele de companie, câinele. De la descoperirea parazitului la<br />
câini în Norvegia (Bjerkas şi col., 1984) şi descrierea<br />
parazitului de către Dubey în 1988 (Dubey şi col., 1988a),<br />
studiul neosporozei a constituit un subiect de cercetare pentru<br />
numeroase personalităţi ale parazitologiei şi nu numai, de pe<br />
tot globul. Datorită prevalenţei ridicate şi a impactului<br />
economic important al neosporozei la speciile bovină şi canină,<br />
tema de cercetare a stârnit un interes deosebit pentru elucidarea<br />
diferitelor aspecte ale acestei grave protozooze.<br />
Teza de doctorat este structurată în două părţi, o parte<br />
bibliografică şi o parte de cercetări proprii. În partea<br />
bibliografică sunt prezentate aspecte despre încadrarea<br />
taxonomică, morfologia şi biologia parazitului, aspecte<br />
referitoare la epidemiologia şi patogeneza neosporozei la gazda<br />
definitivă (câine şi coiot) şi gazdele intermediare, metodologia<br />
de diagnostic, şi în final terapia şi profilaxia bolii. În ce-a de-a<br />
doua parte a tezei, a cercetărilor proprii, sunt dezvoltate<br />
III
cercetări experimentale, studii epidemiologice la câine şi<br />
bovine şi privind diagnosticul în avorturi la bovine.<br />
Încrengătura: Protista<br />
Phylum: Apicomplexa<br />
Clasa: Conoidasida<br />
Subclasa: Coccidiasina<br />
Ordinul: Eucoccidiorida<br />
Familia: Sarcocystidae<br />
Genul: Neospora<br />
Specia: Neospora caninum<br />
Fig. 1: Incadrarea taxonomica N. Caninum<br />
SCOPUL <strong>TEZEI</strong> <strong>DE</strong> <strong>DOCTORAT</strong><br />
N. caninum reprezintă unul din agenţii etiologici<br />
primari principali ai avorturilor la bovine în întreaga lume<br />
(Dubey şi Lindsay, 1996; Dubey, 2003; Hemphill şi Gottstein,<br />
2000; Dubey şi col., 2006), determinând pierderi economice<br />
importante. În Elveţia pierderile economice au fost estimate la<br />
9.7 milioane de euro (Häsler şi col., 2006). Principala cale de<br />
transmitere a infecţiei la bovine este cea transplacentară prin<br />
reactivarea infecţiilor cronice (Paré şi col., 1996; Schares şi<br />
col., 1998). O altă cale de contaminare este cea pe cale orală cu<br />
oochisturi, postnatal (McAllister şi col., 1996; Hietala şi<br />
Thurmond, 1999). Gazde definitive recunoscute la ora actuală<br />
sunt câinele şi coiotul (McAllister şi col., 1998; Gondim şi col.,<br />
IV
2004). În anul 2006 Wapenaar şi col. în urma unui studiu<br />
efectuat la vulpi au identificat oochisturi de N. caninum la<br />
acestea, sugerând posibila implicare ca şi gazdă definitivă în<br />
biologia parazitului.<br />
În urma cercetărilor efectuate s-a constatat că peste<br />
50% dintre avorturi la bovine sunt cauzate de N. caninum<br />
(Anderson şi col., 1995; Thorton, 1996). În urma unui studiu<br />
epidemiologic standardizat, realizat în Europa s-a observat că<br />
prevalenţa infecţiei la bovine variază foarte mult (Bartels şi<br />
col., 2006). Sunt afectate atât vacile de lapte cât şi cele<br />
specializate pentru producţia de carne. Sunt mai predispuse la<br />
avorturi vacile serologic pozitive faţă de cele serologic<br />
negative (Davison şi col., 1999; De Meerschman şi col., 2000;<br />
Waldner, 2005). Pot avorta vacile de orice vârstă începând cu<br />
luna a III-a de gestaţie până la termen, cu o medie în lunile 5-6<br />
de gestaţie. Fetuşii pot muri, resorbi, mumifia, autoliza sau se<br />
nasc vii, neviabili sau sănătoşi din punct de vedere clinic dar cu<br />
infecţie persistentă. S-a observat că 95% dintre viţeii născuţi vii<br />
din vaci serologic pozitive sunt infectaţi congenital, serologic<br />
pozitivi şi fără semne clinice (Paré şi col., 1996).<br />
Diagnosticul avorturilor neosporidiene este unul foarte<br />
complex şi trebuie să stabilească o relaţie cauză-efect între<br />
avort şi N. caninum, ceea ce presupune demonstrarea infecţiei<br />
V
la mamă şi avorton (Dubey şi Schares, 2006). Pentru a atinge<br />
aceste obiective este important a fi demonstrată prezenţa<br />
tachizoiţilor de N. caninum la nivelul leziunilor şi a exclude<br />
alte cauze (Anderson şi col., 1991; Wouda şi col., 1997).<br />
Evidenţierea parazitului la nivelul leziunilor se face prin thenici<br />
de histologie, imunohistochimie, PCR şi izolare pe culturi<br />
celulare şi animale de laborator (şoareci imunosupresaţi). Până<br />
la ora actuală au fost utilizate numeroase linii celulare pentru<br />
cultivarea lui N. caninum, dar cea mai utilizată linie celulară<br />
este linia VERO<br />
Controlul bolii este dificil, cea mai recomandată metodă<br />
fiind testarea animalelor şi eliminarea celor pozitive. Alte<br />
metode care sunt în curs de testare sunt reprezentate de<br />
vaccinare şi chimioterapie.<br />
La noi în ţară acest agent patogen nu a fost studiat până<br />
la această dată, existând un singur studiu seroepidemiologic<br />
(Ionescu şi col., 2003). Având în vedere importanţa parazitului<br />
în patologia abortigenă la bovine, în cadrul acestei teze de<br />
doctorat ne-am propus următoarele obiective:<br />
‣ dezvoltarea unei metode de obţinere, întreţinere şi<br />
conservare a materialului antigenic de N. caninum pe<br />
culturi celulare;<br />
VI
‣ realizarea unui model experimental în infecţia cu N.<br />
caninum la şoareci de laborator;<br />
‣ reproducerea ciclului biologic la N. caninum, utilizând<br />
modelul animal de laborator (gazdă intermediară)-câine<br />
(gazdă definitivă);<br />
‣ dezvoltarea unor metode serologice (imunofluorescenţă<br />
indirectă, ELISA) în vederea diagnosticului<br />
neosporozei la câine;<br />
‣ evaluarea seroprevalenţei infecţiei cu N. caninum la<br />
gazda definitivă – câine, comparativ cu stabilirea<br />
seroprevalenţei infecţiei cu T. gondii;<br />
‣ evaluarea seroprevalenţei infecţiei cu N. caninum la<br />
gazda intermediară – bovine, atât în sistem intensiv cât<br />
şi în sistem tradiţional gospodăresc;<br />
‣ evaluarea seroprevalenţei infecţiei cu T. gondii la<br />
bovine din zona de Nord-Vest a Romaniei;<br />
‣ evaluarea prevalenţei avorturilor neosporidiene la<br />
bovine din zona de Nord-Vest a Romaniei;.<br />
CAP. 2. OBŢINEREA ŞI CONSERVAREA<br />
MATERIALULUI ANTIGENIC <strong>DE</strong> NEOSPORA<br />
CANINUM<br />
VII
2.1. Material şi metodă<br />
Studiul privind obţinerea, întreţinerea şi conservarea<br />
materialului antigenic de N. caninum pe culturi celulare s-a<br />
realizat în perioada mai-iunie 2003 în Laboratorul de culturi<br />
celulare al Institutului Oncologic I. Chirichuţă, <strong>Cluj</strong>-<strong>Napoca</strong> şi<br />
Laboratorul de Boli Parazitare al Facultăţii de Medicină<br />
Veterinară <strong>Cluj</strong>-<strong>Napoca</strong>. Materialul biologic a fost reprezentat<br />
de linia celulară VERO (fibroblaste endoteliale renale de<br />
maimuţă) şi suşa de Neospora caninum N.C.1. Experimentul s-<br />
a desfăşurat în două etape, şi anume cultivarea liniei de celule<br />
VERO neinfectate în monostrat în diferite condiţii de mediu<br />
(mediu de cultură fără piruvat de sodiu, mediu de cultură<br />
suplimentat cu piruvat de sodiu şi mediu de cultură suplimentat<br />
cu ser fetal bovin 10%), urmat de introducerea pe cultura<br />
celulară a tachizoiţilor de N. caninum. S-a urmărit alegerea<br />
formulei optime pentru cultivarea substratului celular,<br />
dezvoltarea/multiplicarea tachizoiţilor de N. caninum la diferite<br />
intervale de timp (la 24 de ore, timp de 10 zile), determinarea<br />
momentului optim pentru pasaj şi aprecierea capacităţii<br />
infectante a tachizoiţilor îmbătrâniţi.<br />
VIII
2.2. Rezultate şi discuţii<br />
Celulele din linia VERO s-au dezvoltat în condiţii<br />
optime în mediul de cultură RPMI fără adaus de piruvat de<br />
sodiu, suplimentat cu ser fetal bovin 10% şi în atmosferă de<br />
CO 2 5%. La 2 zile după introducerea tachizoiţilor de N.<br />
caninum pe linia celulară VERO, numai 30% dintre acestea au<br />
fost intacte(Figura 2), dar prezentau forme tachizoidale<br />
intracitoplasmatic .<br />
Fig. 2: Tachizoiţi de Neospora caninum în culturi celulare: dispunere în<br />
pereche (X200)<br />
N. caninum tachizoites in cell culture: pair forms (X200)<br />
Intervalul de timp optim dintre pasaje a fost în medie de<br />
4-5 zile, timp în care celulele VERO au fost infectate şi<br />
distruse în totalitate. Îmbătrânirea tachizoiţilor de N. caninum<br />
(vârstă 10 zile) s-a caracterizat prin diminuarea evidentă a<br />
mobilităţii până la imobilitate, cu modificări morfologice,<br />
IX
exprimate prin pierderea formei alungite clasice, devenind<br />
ovoizi, dar fără să îşi piardă capacitatea infectantă, infecţia<br />
substratului celular realizându-se într-un timp mai lung.<br />
Cultivarea ”in vitro” a tachizoiţilor de N. caninum are<br />
aplicaţii practice referitoare la obţinerea de material antigenic<br />
utilizat în studiile de epidemiologie şi diagnostic serologic al<br />
neosporozei (Bjorkman şi col., 1994b; Bjorkman şi Lunden,<br />
1998; Bjorkman şi Uggla, 1999; Hemphill şi Gottstein, 2000),<br />
izolarea agentului etiologic (N. caninum) în cazuri de avort la<br />
bovine, studierea eficacităţii unor agenţi terapeutici (Derouin şi<br />
Chastang, 1988; Lindsay şi col., 1997; Benoit-Vical şi col.,<br />
2000; Gozalbes şi col., 2000; Lindsay şi col., 1996), în studiul<br />
invaziei celulare de către parazit (Hemphill şi col., 1996) şi în<br />
manipulările genetice ale parazitului (Howe şi col., 1997;<br />
Radke şi col., 2000).<br />
CAP. 3. MO<strong>DE</strong>L EXPERIMENTAL ÎN INFECŢIA CU<br />
NEOSPORA CANINUM LA ŞOARECI <strong>DE</strong> LABORATOR<br />
3.1. Material şi metodă<br />
Model experimental. Pentru realizarea modelului<br />
experimental animal au fost folosiţi 16 şoareci linia NMRI de<br />
sex mascul, în vârstă de 8 săptămâni. Aceştia au fost grupaţi în<br />
X
patru loturi experimentale a câte 4 şoareci, după cum urmează:<br />
lot 1 –infectat cu tachizoiţi de N. caninum pe cale<br />
intramusculară (i.m.); lot 2 - infectat cu tachizoiţi de N.<br />
caninum pe cale i.m. şi imunosupresat cu dexametazonă (0,5<br />
ml s.c. cu Dexamethasone 2mg/ml – Alfasan Woerden-<br />
Holland); lot 3 - infectat cu tachizoiţi de N. caninum pe cale<br />
s.c. şi lot 4 – lot martor, neinfectat, la care s-a administrat i.m.<br />
ser fiziologic. Infecţia experimentală s-a realizat cu tachizoiţi<br />
de N. caninum suşa N.C.1 în doză de 10.000 tachizoiţi/animal,<br />
suspendaţi în 0.33 ml PBS cu adaus de antibiotice. Şoarecii au<br />
fost urmăriţi clinic timp de 16 zile, înregistrându-se<br />
modificările apărute iar la sfârşitul perioadei de observare au<br />
fost sacrificaţi prin dislocare cervico-cervicală. S-a efectuat<br />
examen necropsic, examen microscopic între lamă şi lamelă<br />
din encefal pentru identificarea chisturilor de N. caninum şi<br />
secţiuni histologice din creier colorate hematoxilină-eozină.<br />
Reproducerea ciclului biologic. În cazul reproducerii<br />
ciclului biologic la N. caninum s-au folosit doi câini de sex<br />
mascul în vârstă de 6 luni, rasă comună. În ziua 0, la câinile 1<br />
s-a administrat în hrană şoareci infectaţi cu N. caninum suşa<br />
N.C.1, iar la câinele 2 şoarecii din lotul martor (lotul 4). Înainte<br />
cu 3 zile de infecţia experimentală şi postinfectant, 30 de zile<br />
au fost recoltate probe de fecale zilnic şi de sânge la 7 zile<br />
XI
interval. În fecale s-a urmărit identificarea oochisturilor prin<br />
examen coproparazitologic utilizând metoda de flotaţie cu<br />
soluţie suprasaturată de clorură de sodiu. Probele de ser au fost<br />
testate prin testul de imunofluorescenţă indirectă în vederea<br />
detecţiei anticorpilor anti-N. caninum şi anti-T. gondii.<br />
3.2. Rezultate şi discuţii<br />
Model experimental. Infecţia cu N. caninum a reuşit la<br />
toate cele trei loturi de şoareci cu infecţie experimentală, atât la<br />
cei imunocompetenţi cât şi la cei imunosupresaţi, fiind mai<br />
gravă la cei din urmă. Primele semne clinice au apărut la 4 zile<br />
postinfectant (p.i.) la şoarecii imunosupresaţi cu dexametazonă,<br />
administrare unică, acestea fiind reprezentate de abatere,<br />
anorexie, ataxie, imobilitate, conjunctivită (Figura 3), fotofobie<br />
şi abdomen balonat. Primele cazuri de mortalitate au apărut la<br />
14 zile p.i..<br />
În preparatele microscopice native efectuate din encefal<br />
au fost puse în evidenţă chisturi cu bradizoiţi<br />
caracteristice(Figura 4) iar în secţiunile histologice leziuni cu<br />
caracter necrotic în focar, multiple, nesupurative şi cu infiltrat<br />
celular abundent(Figura 5).<br />
XII
Modelele experimentale pe şoareci îşi găsesc aplicaţii în<br />
diagnosticul neosporozei şi în studiile experimentale referitoare<br />
la găsirea unor soluţii terapeutice, imunoprofilactice<br />
(Ramamoorthy şi col., 2007), în studiile imunologice şi în<br />
studiile de biologie etc.<br />
Reproducerea ciclului biologic. La examenul<br />
coproparazitologic şi serologic efectuat înainte de infecţia<br />
experimentală cei doi câini au fost negativi. După<br />
administrarea în hrană la câinele 1 de şoareci infectaţi cu N.<br />
caninum nu au fost observate oochisturi în probele de fecale,<br />
dar a fost înregistrată seroconversie la 28 zile p.i., neprezentând<br />
anticorpi anti-T. gondii. Câinele neinfectat a fost serologic<br />
negativ pe toată durata experimentului.<br />
Numeroase cercetări experimentale evidenţiază faptul<br />
că cuantumul coproeliminărilor de oochisturi este dependent de<br />
vârsta câinilor. În general căţeii elimină un număr mai mare de<br />
oochisturi după infecţia primară comparativ cu câinii adulţi<br />
(166.400, respectiv 2.900 oochisturi) (Gondim şi col., 2005).<br />
Un alt factor care se pare că influenţează excreţia de oochisturi<br />
este reprezentat de tipul de ţesuturi consumat de câini, astfel<br />
câini adulţi care au consumat ţesut nervos provenit de la bovine<br />
infectate nu au eliminat oochisturi, dar au prezentat<br />
seroconversie (Gondim şi col., 2005).<br />
XIII
Fig. 3.: Şoarece din lotul 1 la 8 zile p.i. Modificarea stării clinice: abatere,<br />
imobilitate şi conjunctivită<br />
Mouse from 1 st group at 8 days after experimental infection.<br />
Clinical signs: weakness, immobility and conjunctivitis<br />
Fig. 4.: Chist de N. caninum – Fig. 5.: Necroză cu infiltrat<br />
preparat nativ creier (X400)<br />
limfohistiocitar (HE-X1000)<br />
N. caninum cyst – brain (X400) Necrosis and cellular infiltrate<br />
(HE-1000X)<br />
XIV
CAP. 4. SEROPREVALENŢA INFECŢIEI CU<br />
NEOSPORA CANINUM ŞI TOXOPLASMA GONDII LA<br />
CÂINI<br />
4.1. Material şi metodă<br />
În cadrul capitolului referitor la seroprevalenţa<br />
infecţiei cu N. caninum şi T. gondii la câini au fost urmărite<br />
trei obiective principale:<br />
‣ dezvoltarea unor metode serologice de detecţie a<br />
anticorpilor anti-N. caninum;<br />
‣ evaluarea comparativă a metodelor;<br />
‣ efectuarea unui studiu epidemiologic.<br />
Pentru realizarea metodei de IFI au fost folosite<br />
seruri de câini pozitive şi negative şi tachizoiţi de N.<br />
caninum suşa N.C.1 întreţinută pe culturi celulare. S-a<br />
determinat diluţia optimă a serurilor şi concentraţia<br />
tachizoiţilor/ml suspensie necesare realizării metodei. În<br />
cazul metodei ELISA au fost testate 2 tipuri de antigen de N.<br />
caninum, un antigen total obţinut prin liza tachizoiţilor (TL)<br />
şi o proteină membranară de suprafaţă, proteina p38 (p38).<br />
S-a determinat diluţia optimă a serurilor, a antigenului şi s-a<br />
stabilit valoarea cut-off pentru interpretare.<br />
XV
În toate cele trei situaţii s-a calculat sensibilitatea<br />
(Se), specificitatea (Sp), valoarea predictivă pozitivă (VPP)<br />
şi negativă (VPN). Concordanţa între testele aplicate s-a<br />
analizat prin calcularea indicelui k, cu programul<br />
WinEpiscope iar nivelul de corelaţie între teste, între titrul<br />
anticorpilor la IFI şi DO (densitatea optică) la ELISA prin<br />
calcularea indicelui r cu programul Statistica.<br />
În cadrul studiului epidemiologic au fost luaţi în<br />
studiu 57 de câini comunitari din <strong>Cluj</strong> <strong>Napoca</strong>, rasă comună,<br />
cu vârste cuprinse între 2 luni şi 13 ani. De la aceştia s-au<br />
prelevat probe de sânge care au fost prelucrate prin tehnica<br />
imunofluorescenţei indirecte (IFI) în vederea detecţiei<br />
anticorpilor de tipul IgG anti-Neospora şi anti-Toxoplasma,<br />
precum şi prin tehnica ELISA („in hause”), aplicând cele 2<br />
variante experimentale dezvoltate. Tehnica ELISA a fost<br />
utilizată numai pentru identificarea subiecţilor infectaţi cu<br />
N. caninum. S-a calculat semnificaţia statistică a prevalenţei<br />
infecţiei cu T. gondii şi N. caninum la câini, între grupele de<br />
vârstă şi sex.<br />
4.2. Rezultate şi discuţii<br />
XVI
La IFI diluţia optimă pentru tachizoiţii de N.<br />
caninum a fost de 2.5 milioane paraziţi/ml suspensie, câte<br />
17 μl/godeu iar pentru seruri de 1:100. La ELISA diluţia<br />
optimă pentru antigen a fost de 10 μg/ml în cazul<br />
antigenului TL şi 1 μg/ml în cazul antigenului p38, iar<br />
pentru seruri de 1:100 în ambele variante experimentale.<br />
Valoarea cut-off a fost de 0.147 DO la varianta TL şi de<br />
0.087 DO varianta p38. Cele douặ variante de lucru ELISA<br />
au prezentat Se, Sp, VPP şi VPN de 100%, metoda standard<br />
fiind consideratặ IFI. De asemenea, a existat corelaţie<br />
perfectă între rezultatele obţinute pentru infecţia cu N.<br />
caninum la IFI, ELISA TL şi ELISA p38 (k=1.00), asociere<br />
foarte bună între titrul de anticorpi obţinut la IFI şi<br />
densitatea optică obţinută la cele două variante ELISA (TL<br />
şi p38) (r=0.84-0.96).<br />
Anticorpi anti-T. gondii au fost indentificaţi la<br />
24.7% câini (14/57), seroprevalenţa fiind semnificativ mai<br />
mare la câinii peste 2 ani (71.4%) iar anticorpi anti-N.<br />
caninum au fost indentificaţi la 12.3% câini (7/57), fără a<br />
exista diferenţe semnificative statistic între grupele de vârstă<br />
(Tabel 1, 2). La un câine din cei 57 examinaţi serologic a<br />
fost înregistrat rezultat dubios la T. gondii, dar pozitiv la N.<br />
caninum.<br />
XVII
Titrul anticorpilor de tipul IgG anti-N. caninum la<br />
IFI s-au situat între 1:100 şi 1:400, neobservându-se<br />
corelaţie între acesta şi vârsta câinilor (r=0.04).<br />
Tabelul 1<br />
Numărul de probe serologic pozitive prin IFI şi ELISA, examinate în<br />
direcţia neosporozei, la câini comunitari din <strong>Cluj</strong> <strong>Napoca</strong><br />
The number of positive sera samples for N. caninum infection tested by<br />
IFAT and ELISA in stray dogs from <strong>Cluj</strong> <strong>Napoca</strong><br />
IFI<br />
ELISA<br />
TL<br />
p38<br />
Pozitive n(%)<br />
Positive<br />
7(12.28%) 7(12.28%) 7(12.28%)<br />
CI 95% (%) 5.1-23.7<br />
Negative n(%)<br />
Negative<br />
50(87.72%) 50(87.72%) 50(87.72%)<br />
Total n<br />
Total<br />
57 57 57<br />
Tabelul 2<br />
Numărul de probe serologic negative şi pozitive, examinate în direcţia<br />
detecţiei de anticorpi anti-N. caninum, la câini comunitari din <strong>Cluj</strong><br />
<strong>Napoca</strong> în funcţie de sex şi vărstă<br />
The number of negative and positive sera samples for N. caninum<br />
infection in stray dogs from <strong>Cluj</strong> <strong>Napoca</strong> according with gender and age<br />
Sex<br />
Gender<br />
Femele<br />
Females<br />
Masculi<br />
Males<br />
Vârstă<br />
Age<br />
< 6 luni<br />
2 ani<br />
>2 years<br />
Pozitive n(%)<br />
Positive<br />
5 (12.5) 2 (11.8) 1 (11.1) 3 (15) 3 (10.7)<br />
IC 95% (%) 4.2-26.8 1.5-36.4 0.3-48.2 3.4-39.6 2.2-27.4<br />
RR 0.991 1.055 0.939 0.991<br />
Negative n(%)<br />
Negative<br />
Total<br />
Total<br />
35 15 (88.2) 8 (88.9) 17 (85) 25 (89.3<br />
40 17 9 20 28<br />
XVIII
Prevalenţa infecţiei cu N. caninum la câini sănătoşi<br />
din punct de vedere clinic, variază de la zero aparent în<br />
Insulele Falkland şi Kenya, la aproximativ 20% în Tanzania<br />
şi Uruguay (Barber şi col., 1997a) şi până la 54.2% la câinii<br />
din jurul fermelor de bovine în Argentina (Basso şi col.,<br />
2001). Procente similare ale seroprevalenţei infecţiei cu N.<br />
caninum la câini sunt raportate şi în alte părţi din America<br />
de Sud (Gennari şi col., 2002; Fernandez şi col., 2004;<br />
Azevedo şi col., 2005). În ţara noastră nu sunt raportate<br />
studii epidemiologice privind infecţia cu N. caninum la<br />
câini, iar procentul obţinut de noi în acest studiu la câini<br />
comunitari (12.28%) se încadrează în limitele citate de alţi<br />
autori pe continentul european. Astfel, în Europa 2% până la<br />
13% din câinii studiaţi în mod aleator au fost seropozitivi la<br />
infecţia cu N. caninum în Austria (Wanha şi col., 2005),<br />
Belgia (Barber şi col., 1997b), Anglia (Trees şi col., 1993),<br />
Ungaria (Hornok şi col., 2006), Italia (Capelli şi col., 2004),<br />
Olanda (Wouda şi col., 1993), Spania (Ortuño şi col., 2002),<br />
Suedia (Björkman şi col., 1994), Cehia (Václavek şi col.,<br />
2007) şi Turcia (Coskun şi col., 2000).<br />
XIX
CAP. 5. SEROPREVALENŢA INFECŢIEI CU<br />
NEOSPORA CANINUM ŞI TOXOPLASMA GONDII LA<br />
BOVINE<br />
5.1. Material şi metodă<br />
Cercetặrile privind seroprevalenţa infecţiei cu N.<br />
caninum şi T. gondii la bovine s-au desfặşurat în perioada<br />
2005-2007 la bovine crescute în sistem tradiţional, exetensiv<br />
(gospodăresc) (judeţul <strong>Cluj</strong>) şi la bovine întreţinute în sistem<br />
intensiv (judeţul Mureş). În judeţul <strong>Cluj</strong> (sistem tradiţional)<br />
au fost recoltate 877 probe de sânge de la vaci în lactaţie,<br />
din 8 localităţi, probele fiind prelucrate prin tehnica<br />
imunofluorescenţei indirecte, în vederea detecţiei<br />
anticorpilor de tipul IgG anti-N. caninum.<br />
În judeţul Mureş (sistem intensiv) au fost recoltate<br />
267 de probe de sânge, dintre care 69 au provenit de la<br />
juninci, iar 198 de la vaci multipare. Testarea serologică s-a<br />
realizat prin tehnica ELISA (chit comercial) evaluand<br />
prezenţa anticorpilor anti-T. gondii şi anti-N. caninum. De<br />
asemenea 9 dintre bovinele din sistemul intensiv au fost<br />
retestate la interval de o lunặ.<br />
Rezultatele obtinute au fost prelucrate statistic prin<br />
testul Hi-pătrat (GraphPad InStat 3) si s-a calculat prezenţa<br />
XX
sau absenţa corelaţiei (r s ) (Statistica) între prezenţa<br />
anticorpilor anti-N. caninum şi vârsta bovinelor, nivelul de<br />
corelaţie între tipul de avort si luna de gestatie, intre<br />
seropozitivitatea la N. caninum si tipul de avort, intre<br />
seropozitivitatea la N. caninum si luna de gestatie in care s-a<br />
produs avortul.<br />
5.2. Rezultate şi discuţii<br />
Seroprevalenţa infecţiei cu N. caninum la bovine<br />
întreţinute în sistem gospodăresc s-a situat intre 0 si 16%, cu<br />
o medie de 5.4% (IFI, la 47/877), iar la cele din sistem<br />
intensiv de 60.3% (161/267). Nu au existat diferenţe<br />
semnificativ statistic între juninci şi vaci multipare.<br />
Seroprevalenţa infecţiei cu T. gondii (ELISA), la bovinele<br />
din sistemul intensiv a fost de 21% (56/267), iar la 14.6%<br />
(39/267) s-au înregistrat infecţii mixte cu N. caninum şi T.<br />
gondii. Toate cele 9 vaci din sistemul intensiv testate de 2<br />
ori la interval de o lună, au prezentat rezultate egale referitor<br />
la prezenţa anticorpilor anti-N. caninum, iar referitor la<br />
prezenţa anticorpilor anti-T. gondii, numai 5 vaci din cele 9<br />
testate au avut aceleaşi rezultate serologice la interval de o<br />
lună de zile. La aproximativ 34/40 (85%) vaci gestante din<br />
XXI
sistemul intensiv în anul 2007 s-au inregistrat avorturi<br />
spontane (25/40, 62.5%) între lunile 3 şi 8 de gestaţie,<br />
avorturi cu fetus mumifiat (7/40, 17.5%), între lunile 5-8 de<br />
gestaţie, avorturi succesive (1/40, 2.5%) şi repetarea<br />
căldurilor (1/40, 2.5%). S-a observat un grad de asociere<br />
slab spre mediu intre tipul de avort si luna de gestatie in care<br />
s-a produs acesta (r=0,38), fara a exista vreo corelatie intre<br />
statusul serologic la infectia cu N. caninum si T. gondii al<br />
vacilor si tipul de avort sau luna de gestatie in care acesta s-<br />
a produs.<br />
CAP. 6. DIAGNOSTICUL AVORTURILOR PRODUSE<br />
<strong>DE</strong> NEOSPORA CANINUM LA BOVINE<br />
6.1. Material şi metodă<br />
Au fost recoltaţi un număr de 9 avortoni bovini cu<br />
vârstă fetală de 3-7 luni dintr-o fermă de bovine din sudul<br />
Transilvaniei specializată pentru producţia de lapte şi laptecarne.<br />
Avortonii au fost supuşi examenului necropsic şi au<br />
fost recoltate probe de ţesut nervos (encefal) care au fost<br />
XXII
prelucrate prin metode de histologie clasicặ (sectiuni<br />
colorate hematoxilinặ-eozinặ) si prin biologie moleculară<br />
(PCR) în vederea detectării ADN-ului genomic de N.<br />
caninum.<br />
6.2. Rezultate şi discuţii<br />
77.8% (7/9) dintre avorturi s-au produs în lunile 3-5<br />
de gestaţie (Figura 6), iar 33.3% (3/9) avortoni au prezentat<br />
leziuni de miozită şi miocardită, iar 11% (1/9) au fost<br />
mumifiaţi. Nu au fost identificate leziuni caracteristice la<br />
nivelul creierului, atât la examenul necropsic cât şi la<br />
exemenul histopatologic. Prin PCR a fost detectat ADN<br />
genomic de N. caninum la 33.3% (3/9) (Figura 7) avortoni<br />
cu vârstă fetală de 3, 4 respectiv 7 luni. Doar in cazul unui<br />
singur avort (avorton mumifiat, luna 7 de gestaţie) s-a putut<br />
preciza ca şi cauză a avortului infecţia cu N. caninum,<br />
datorită asocierii leziune (mumifiere)-PCR pozitiv. Nu s-a<br />
înregistrat corelaţie între luna de apariţie a avortului şi<br />
infecţia cu N. caninum (r=0.12).<br />
3.5<br />
umarul de avortur<br />
umber of abortion<br />
3<br />
2.5<br />
2<br />
1.5<br />
1<br />
3<br />
2 2<br />
XXIII
Fig. 6. Histograma avorturilor înregistrate în ferma de bovine<br />
din sudul Transilvaniei<br />
Histogram of abortions registred in a dairy farm in southern<br />
Transylvania<br />
Fig. 7.: Rezultatele obţinute la PCR, efectuat din probe de creier<br />
recoltate de la avortoni bovini colectaţi dintr-o fermă de bovine din<br />
sudul Transilvaniei<br />
Results obtained by PCR made from brain samples collected from a<br />
dairy farm in southern Transylvania<br />
CAP. 7. CONCLUZII GENERALE<br />
XXIV
Cercetările experimentale [(i) întreţinerea unei suşe<br />
de N. caninum pe culturi celulare, (ii) realizarea unui model<br />
experimental în infecţia cu N. caninum, (iii) reproducerea<br />
ciclului biologic la N. caninum)] şi epidemiologice [(iv)<br />
evaluarea seroprevalenţei infecţiei cu N. caninum şi T.<br />
gondii la câine şi bovine, (v) evaluarea prevalenţei<br />
avorturilor neosporidiene la bovine)] privind neosporoza la<br />
animale, derulate în perioada 2002-2007 în cadrul<br />
Disciplinei de Parazitologie şi Boli Parazitare a Facultặţii de<br />
Medicinặ Veterinarặ <strong>Cluj</strong>, FMV Liege-Belgia si FMV Brno-<br />
Cehia au condus la urmặtoarele concluzii:<br />
‣ pentru prima dată în România s-a reuşit cultivarea<br />
„in vitro” a unei suşe de N. caninum(NC-1),<br />
asigurâdu-se material antigenic viabil necesar<br />
realizării unor tehnici de diagnostic<br />
(imunofluorescenţă indirectă, ELISA);<br />
‣ tachizoiţii de N. caninum au fost cultivaţi în condiţii<br />
optime pe linia celulară VERO, în mediu de cultură<br />
RPMI fără adaos de piruvat de sodiu, dar suplimentat<br />
cu ser fetal bovin 10%;<br />
‣ intervalul optim pentru efectuarea pasajelor a fost în<br />
medie de 4-5 zile, timp în care celulele VERO au<br />
fost infectate şi distruse în totalitate;<br />
XXV
‣ tachizoiţii de N. caninum îmbătrâniţi (vârstă 10 zile)<br />
au fost infectanţi, dar infecţia substratului celular s-a<br />
realizat într-un timp mai lung;<br />
‣ s-a reuşit punerea la punct a tehnicii de conservare a<br />
materialului antigenic reprezentat de tachizoiţi de N.<br />
caninum viabili;<br />
‣ şoarecii din linia NMRI dezvoltă formă clinică de<br />
boală în urma infecţiei experimentale cu N. caninum<br />
(10000 tachizoiţi, suşa NC-1);<br />
‣ infecţia experimentală cu tachizoiţi de N. caninum a<br />
fost mai severă la şoarecii imunosuporesaţi (cu<br />
dexametazonă, doză unică), primele semne clinice<br />
apărând la 4 zile p.i., iar mortalitate la 14 zile p.i.;<br />
‣ semnele clinice înregistrate la şoarecii infectaţi au<br />
fost reprezentate de abatere, anorexie, ataxie,<br />
imobilitate, conjunctivită, fotofobie, abdomen<br />
balonat;<br />
‣ în preparatele microscopice native efectuate din<br />
encefal (de la şoareci infectaţi) au fost puse în<br />
evidenţă chisturi cu bradizoiţi caracteristice, iar în<br />
secţiunile histologice colorate prin metoda<br />
hematoxilină-eozină au fost depistate leziuni cu<br />
XXVI
caracter necrotic în focar, multiple, nesupurative şi<br />
cu infiltrat celular abundent;<br />
‣ nu s-a reuşit reproducerea ciclului biologic la câine,<br />
examenul coproparazitologic p.i. fiind negativ, iar<br />
cel serologic-pozitiv (anticorpi anti-N. caninum), la<br />
28 zile p.i.;<br />
‣ au fost puse la punct metode serologice de detecţie a<br />
anticorpilor anti-N. caninum la câine, şi anume<br />
imunofluorescenţă indirectă şi ELISA;<br />
‣ s-a observat o corelaţie directă între testele de IFI şi<br />
ELISA variantele TL şi p38 (k=1.00), aplicate în<br />
direcţia detecţiei de anticorpi anti-N. caninum la<br />
câini, iar sensibiliatea, specificitatea, valorile<br />
predictive negative şi pozitive ale celor două<br />
variante ELISA (TL, p38) au fost de 100%;<br />
‣ anticorpi anti-N. caninum au fost indentificaţi la<br />
12.3% câini comunitari (7/57) din <strong>Cluj</strong> <strong>Napoca</strong>, fără<br />
a exista diferenţe semnificative statistic între grupele<br />
de vârstă, iar anticorpi anti-T. gondii au fost<br />
indentificaţi la 24.7% câini (14/57), seroprevalenţa<br />
fiind semnificativ mai mare la câinii peste 2 ani;<br />
‣ seroprevalenţa infecţiei cu N. caninum a fost<br />
semnificativ mai mare (p=0.0001) la bovinele<br />
XXVII
‣ seroprevalenţa infecţiei cu T. gondii (ELISA), la<br />
bovinele din sistemul intensiv a fost de 21%<br />
(56/267), iar la 14.6% (39/267) dintre acestea s-au<br />
înregistrat infecţii mixte cu N. caninum şi T. gondii;<br />
‣ din totalul de 9 avortoni bovini examinaţi în direcţia<br />
neosporozei, la 3 a fost identificat ADN genomic de<br />
N. caninum (33.3%), aceştia având o vârstă fetală de<br />
3, 4 respectiv 7 luni;<br />
‣ se impune introducerea neosporozei în diagnosticul<br />
diferenţial al afecţiunilor neuromusculare şi de<br />
reproducţie la speciile canină şi bovină.<br />
RECOMANDARI<br />
În sinteză, subliniem importanţa introducerii unui<br />
program de supraveghere şi control la nivel de ferme privind<br />
neosporoza bovină, având în vedere seroprevalenţa foarte<br />
mare înregistrată în judeţul Mureş la ferma „S”, la care se<br />
XXVIII
adaugă procentul mare de avorturi, care trebuie investigate<br />
la nivel de laborator. Un astfel de program ar trebui să<br />
includă: (1) testarea serologică a vacilor ce se introduc în<br />
fermă (Dubey şi col., 2007), precum şi a unui procent de<br />
vaci din fermă, anual; (2) în fermele cu seroprevalenţă<br />
scăzută (sub 10%) îndepărtarea vacilor serologic pozitive;<br />
(3) evitarea repopulării cu juninci ce provin din mame<br />
serologic pozitive; (4) implementarea de măsuri de<br />
îmbunătăţire a siguranţei instalaţiilor din fermă şi a<br />
condiţiilor de depozitare a furajelor (Gonzalez Warleta şi<br />
col., 2008); (5) controlul câinilor din fermă, chiar<br />
îndepărtarea acestora; (6) implementarea unui protocol<br />
terapeutic.<br />
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA<br />
1. Anderson, M.L., P.C. Blanchard, B.C. Barr, J.P. Dubey, R.L.<br />
Hofman, P.A. Conrad, 1991, Neospora like protozoan as a<br />
major cause of abortion in California dairy cattle, J. Am. Vet.<br />
Med. Assoc., 198, 241-244.<br />
2. Anderson, M.L., C. Palmer, M. Thurmond, J. Picanso, P.C.<br />
Blanchard, R.E. Breitmeyer, A.W. Layton, M. McAllister, B.<br />
Daft, H. Kinde, D.H. Read, J.P. Dubey, P. Conrad, B.C. Barr,<br />
1995, Evaluation of abortions in cattle atributabile to neosporosis<br />
XXIX
in selected dairy herds in California, J. Am. Vet. Med. Assoc.,<br />
207, 1206-1210.<br />
3. Azevedo, S.S., C.S.A. Batista, S.A. Vasconcellos, D.M.<br />
Aguiar, A.M.A. Ragozo, A.A.R. Rodriguez, C.J. Alves, S.M.<br />
Gennari, 2005, Seroepidemiology of Toxoplasma gondii and<br />
Neospora caninum in dogs from the state Paraiba, Northeast<br />
region of Brazil. Res. Vet. Science, 79:1, 51-56.<br />
4. Barber, J.S., R.B. Gasser, J. Ellis, M.P. Reichel, D. McMillan,<br />
A.J. Trees, 1997a, Prevalence of antibodies to Neospora<br />
caninum in different canid populations, J. Parasitol., 83:6, 1056-<br />
1058.<br />
5. Barber, J.S., L. Van Ham, I. Polis, A.J. Trees, 1997b,<br />
Seroprevalence of antibodies to Neospora caninum in belgian<br />
dogs, J. Small Anim. Practice, 38, 15-16.<br />
6. Bartels CJM, Ruiz-Santa-Quitera JA, Arnaiz-Seco I, Björkman<br />
C, Frössling J, von Blumröder D, Conraths FJ, Schares G, Van<br />
Maanen C, Wouda W, Ortega-Mora LM, 2006. Supranational<br />
comparison of Neospora caninum seroprevalences in cattle in<br />
Germany, The Netherlands, Spain and Sweden. Vet Parasitol,<br />
137: 17-27.<br />
7. Basso W, Venturini L, Venturini MC, Moore P, Rambeau M.,<br />
Unzaga JM, Campero C., Bacigalupe D, Dubey JP, 2001.<br />
Prevalence of Neospora caninum infection in dogs from beefcattle<br />
farms, dairy farms, and from urban areas of Argentina. J<br />
Parasitol, 87: 906-907.<br />
8. Benoit-Vical F, Santillana-Hayat M, Kone-Bamba D, Mallie M,<br />
Derouin F, 2000. Anti-Toxoplasma activity of vegetal extracts<br />
used in West African traditional medicine. Parasitol, 7: 3-7.<br />
XXX
9. Bjerkas I, Mohn SF, Presthus J, 1984. Unidentified cystforming<br />
sporozoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs.<br />
Zparasitenkd, 70: 271-4.<br />
10. Bjorkman C, Lunden A, Uggla A, 1994a. Prevalence af<br />
antibodies to Neospora caninum and Toxoplasma gondii in<br />
Swedish dogs. Acta Vet Scand, 35:445-7.<br />
11. Bjorkman C, Lunden A, Holmdahl J, Barber J, Trees AJ, Uggla<br />
A, 1994b. Neospora caninum in dogs: detection of antibodies by<br />
ELISA using an iscom antigen. Parasite Immunol, 16: 643-8.<br />
12. Bjorkman C, Lunden A, 1998. Application of iscom antigen<br />
preparations in ELISAs for diagnosis of Neospora and<br />
Toxoplasma infections. Int J Parasitol, 28: 187-93.<br />
13. Bjorkman C, Uggla A, 1999. Serological diagnosis of Neospora<br />
caninum infection. Int J Parasitol, 29: 1497-507.<br />
14. Capelli G, Nardelli S, Regalbono AF, Scala A, Pietrobelli M,<br />
2004. Sero-epidemiological survey of Neospora caninum<br />
infection in dogs in north-eastern Italy. Vet Parasitol, 123: 143-<br />
8.<br />
15. Coskun SZ, Aydyn L, Bauer C, 2000. Seroprevalence of<br />
Neospora caninum infection in domestic dogs in Turkey. Vet<br />
Record, 146(22): 649.<br />
16. Davison HC, Otter A, Trees AJ, 1999. Significance of Neospora<br />
caninum in British dairy cattle determined by estimation of<br />
seroprevalence in normally calving cattle and aborting cattle. Int<br />
J Parasitol, 29: 1189-94.<br />
17. DeMeerschman F, Focant C, Boreux R, Leclipteux T, Losson B,<br />
2000. Cattle neosporosis in Belgium: a case-control study in<br />
dairy and beef cattle. Int J Parasitol 30: 887-90.<br />
XXXI
18. Derouin F, Chastang C, 1988. Enzyme immunoassay to assess<br />
effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue<br />
culture. Antimicrob Agents Chemother, 32: 303-7.<br />
19. Dubey JP, Carpenter JL, Speer CA, Topper MJ, Uggla A, 1988.<br />
Newly recognized fatal protozoan disease of dogs. J Am Vet Med<br />
Assoc, 192: 1269-85.<br />
20. Dubey JP, Buxton D, Wouda W, 2006. Pathogenesis of Bovine<br />
Neosporosis. J Compar Pathol, 134(4): 267-89.<br />
21. Dubey JP, Schares G, Ortega-Mora LM, 2007. Epidemiology<br />
and control of neosporosis and Neospora caninum. Clin<br />
Microbiol Rev, 20: 323-67.<br />
22. Dubey JP, Lindsay DS, 1996. A review of Neospora caninum<br />
and neosporosis. Vet Parasitol, 67: 1-59.<br />
23. Dubey JP, Schares G, 2006. Diagnosis of bovine neosporosis.<br />
Vet Parasitol, 140: 1-34.<br />
24. Dubey JP, 2003. Review of Neospora caninum and neosporosis<br />
in animals. Korean J Parasitol, 41(1): 1-16.<br />
25. Fernandez BC, Gennari SM, Souza SL, Carvalho JM, Oliveira<br />
WG, Cury MC, 2004. Prevalence of anti-Neospora caninum<br />
antibodies in dogs from urban, periurban and rural areas of the<br />
city of Uberlandia, Minas Gerais-Brazil. Vet Parasitol, 123: 33-<br />
40.<br />
26. Gennari SM, Yai LE, D'Auria SN, Cardoso SM, Kwok OC,<br />
Jenkins MC, Dubey JP, 2002. Occurence of Neospora caninum<br />
antibodies in sera from dogs of the the city of Sao Paulo, Brazil.<br />
Vet Parasitol, 106: 177-79.<br />
XXXII
27. Gondim LFP, Mc Allister MM, Pitt WC, Zemlicka <strong>DE</strong>, 2004.<br />
Coyotes are definitive hosts of Neospora caninum. Int J<br />
Parasitol, 34: 159-61.<br />
28. Gondim LFP, Mc Allister MM, Gao L, 2005. Effects of host<br />
maturity and prior exposure history on the production of<br />
Neospora caninum oocysts by dogs. Vet Parasitol, 134: 33-9.<br />
29. González-Warleta Marta, Castro-Hermida JA, Carro-Corral<br />
Carmen, Cortizo-Mella J, Mezo M, 2008. Epidemiology of<br />
neosporosis in dairy cattle in Galicia (NW Spain). Parasitol Res,<br />
102: 243–9.<br />
30. Gozalbes R, Brun-Pascaud M, Garcia-Domenech R, Galvez J,<br />
Girard PM, Doucet JP, Derouin F, 2000. Anti-toxoplasma<br />
activities of 24 quinolonesan difluoroquinolones in vitro:<br />
prediction of activity by molecular topology and virtual<br />
computational techniques. Antimicrob Agents Chemother, 44:<br />
2771-6.<br />
31. Häsler B, Regula G, Stärk KD, Sager H, Gottstein B, Reist M,<br />
2006. Financial analysis of various strategies for the control of<br />
Neospora caninum in dairy cattle in Switzerland. Prev Vet Med,<br />
18, 77(3-4): 230-53.<br />
32. Hemphill A, Gottstein B, Kaufmann H, 1996. Adhesion and<br />
invasion of bovine endhotelial cells by Neospora caninum<br />
Parasitol, 112: 183-197.<br />
33. Hemphill A, Gottstein B, 2000. A European perspective on<br />
Neospora caninum. Int J Parasitol, 30: 877-924.<br />
34. Hietala SK, Thurmond MC, 1999. Postnatal Neospora caninum<br />
transmission and transient serologic responses in two dairies. Int<br />
J Parasitol, 29: 1669-76.<br />
XXXIII
35. Hornok S, Edelhofer R, Hajtós I, 2006. Seroprevalence of<br />
neosporosis in beef and dairy cattle breeds in Northeast Hungary.<br />
Acta Vet Hung, 54(4): 485-91.<br />
36. Howe DK, Mercier C, Messina M, Sibley LD, 1997. Expression<br />
of Toxoplasma gondii genes in the closely-related apicomplexan<br />
parasite Neospora caninum. Mol Biochem Parasitol, 86: 29-36.<br />
37. Ionescu V, Popa E, Moldoveanu D, 2003. Neosporoza la bovine.<br />
Revista Romana de Parazitologie, Vol XIII, Nr 1 :125-6.<br />
38. Lindsay DS, Butler JM, Rippey NS Blagburn BL, 1996.<br />
Demonstration of synergistic effects of sulfonamides and<br />
dihydrofolate reductase/thymidylate synthase inhibitors against<br />
Neospora caninum tachyzoites in cultured cells and<br />
characterization of mutans resistant to pyrimethamine. Am J Vet<br />
Res, 57: 68-72.<br />
39. Lindsay DS, Butler JM, Blagburn BL, 1997. Efficacy of<br />
decoquinate against Neospora caninum tachyzoites in cell<br />
cultures. Vet Parasitol, 68: 35-40.<br />
40. McAllister MM, Huffman EM, Hietala SK, Conrad PA,<br />
Anderson ML, Salman MO, 1996. Evidence suggesting a point<br />
source exposure ia an outbreak of bovine abortion due to<br />
neosporosis. J Vet Diagn Invest, 8: 355-7.<br />
41. McAllister MM, Dubey JP, Linsday DS, Jolley WR, Wills RA,<br />
McGuire AM, 1998. Dogs are definitive hosts of Neospora<br />
caninum. Int. J Parasitol, 28: 1473-8.<br />
42. Ortuno A, Castella J, Almeria S, 2002. Seroprevalence of<br />
antibodies to Neospora caninum in dogs from Spain. Journal for<br />
Parasitology, 88: 1263-6.<br />
XXXIV
43. Paré J, Thurmond MC, Hietala SK, 1996. Congenital Neospora<br />
caninum infection in dairy cattle and associated calfhood<br />
mortality. Can J Vet Res, 60(2): 133-9.<br />
44. Radke JR, Guerini MN, White MW, 2000. Toxoplasma gondii:<br />
characterization of temperature- sensitive tachyzoite cell cycle<br />
mutants. Exp Parasitol, 96: 168-77.<br />
45. Ramamoorthy S, Duncan R, Lindsay DS, Sriranganathan N,<br />
2007. Optimization of the use of C57BL/6 mice as a laboratory<br />
animal model for Neospora caninum vaccine studies. Vet<br />
Parasitol, 145: 253-9.<br />
46. Schares G, Peters M, Wurm R, Barwald A, Conhrats FJ, 1998.<br />
The efficiency of vertical transmission of Neospora caninum in<br />
dairy cattle analysed by serological techniques. Vet Parasitol, 80:<br />
87-98.<br />
47. Thornton R, 1996. Bovine abortion diagnoses in 1995. Surveill,<br />
23: 21-2.<br />
48. Trees AJ, Guy F, Tennant BJ, Balfour AH Dubey JP, 1993.<br />
Prevalence of antibodies to Neospora caninum in a population of<br />
urban dogs in England. Vet Rec, 132: 125-6.<br />
49. Václavek P, Sedlák K, Hůrková L, Vodrázka P, Sebesta R,<br />
Koudela B, 2007. Serological survey of Neospora caninum in<br />
dogs in the Czech Republic and a long-term study of dynamics of<br />
antibodies. Vet Parasitol, 143: 35-41.<br />
50. Waldner CL, 2005. Serological status for Neospora caninum,<br />
bovine viral diarrhea virus, and infectious bovine rhinotracheitis<br />
virus at pregnancy testing and reproductive performance in beef<br />
herds. Anim reprod Sci, 90: 219-42.<br />
XXXV
51. Wanha K, Edelhofer R, Gabler-Eduardo C, Prosl H, 2005.<br />
Prevalence of antibodies against Neospora caninum and<br />
Toxoplasma gondii in dogs and foxes in Austria. Vet Parasitol,<br />
128: 189-93.<br />
52. Wapenaar W, Jenkins MC, O'Handley RM, Barkema HW, 2006.<br />
Neospora caninum-like oocysts observed in feces of free-ranging<br />
red foxes (Vulpes vulpes) and coyotes (Canis latrans). J<br />
Parasitol, 92(6): 1270-4.<br />
53. Wouda W, De Jong JK, Van Knapen F and Walvoort HC, 1993.<br />
Neospora caninum als oorzak van Verlammingsverschijnselen<br />
bij jonge honden. Tijdschr Diergeneeskd 118: 397-401.<br />
54. Wouda W, Moen AR, Visser IJR and Van Knapen F, 1997.<br />
Bovine fetal neosporosis: A comparison of epizootic and<br />
sporadic abortion cases and different age classes with regards to<br />
lesion severity and immunohistochemical identification in brain,<br />
heart and liver. J Vet Diagn Invest, 9(2): 180-5.<br />
XXXVI
NEOSPOROSIS IN DOGS AND BOVINES:<br />
EXPERIMENTAL AND EPI<strong>DE</strong>MIOLOGICAL<br />
RESEARCHES<br />
(SUMMARY OF PhD THESIS)<br />
Neospora caninum is a sporozoan from Sarcocystidae family,<br />
similar from morphological and life cycle point of view with<br />
Toxoplasma gondii, with which it was till recently misidentified. In the<br />
life cycle of the parasite, two hosts are involved: a definitive host<br />
represented by dog and coyotes and an intermediate host represented by<br />
different mammals, mainly bovines. So, since 1984 when the parasite<br />
was identified and described, the abortion of parasitic cause was<br />
reconsidered.<br />
The main clinical symptom in bovine neosporosis is abortion.<br />
Cows may abort from 3 months of gestation to term with mummified,<br />
autolyzed, stillborn, born alive, but diseased, or born clinically normal<br />
but chronically infected fetuses. Neosporidian abortions may be endemic<br />
or epidemic. It is considered that over 50% of bovine abortions are<br />
caused by N. caninum infection, with important economical losses.<br />
Transplacental route is the main natural infection transmission<br />
mechanism in bovines, because of chronical reactivation of infection. A<br />
less important route is the oral one, by ingestion of oocysts. In Romania<br />
this pathogen has not been sistematicaly screened and before this study<br />
only one seroepidemiological survey was published.<br />
Considering the importance of the parasite in bovine reproduction, the<br />
aims of this PhD thesis were to: (i) obtain, maintain and preserve N.<br />
caninum in cell cultures; (ii) develope an experimenthal model of N.<br />
caninum infection in mice and (iii) experimentally reproduce the life<br />
cycle, using laboratory rodents and dogs; (iv) determine the<br />
seroprevalence of N. caninum infection in dogs and bovines in<br />
comparison with T. gondii; (v) diagnose and determine the prevalence of<br />
N. caninum –induced abortions in bovines from Romania.<br />
The PhD thesis is structured in a bibliographical part and<br />
original research. The first part contains data about taxonomy,<br />
morphology, life cycle, epidemiology, pathogenesis in definitive and<br />
intermediate hosts, diagnostic tehniques, therapy and control. The<br />
original research part presents the results of experimental transmissions,<br />
epidemiological studies in dogs and bovines and diagnostic in bovine<br />
abortions.<br />
XXXVII
Experimental trials consisted of the development of obtaining, maintaing<br />
and preserving tehniques of N. caninum antigens on cell cultures and<br />
also an experimental model of N. caninum infection in mice as well as<br />
laboratory transmission of N. caninum using animal models:<br />
intermediate rodent hosts and dogs.<br />
Maintainance and preservation of N. caninum antigens in cell<br />
cultures was done in May-June 2003 in the Laboratory of Cell Cultures<br />
of Oncological Institute from <strong>Cluj</strong>-<strong>Napoca</strong> and Laboratory of Parasitic<br />
Diseases, Faculty of Veterinary Medicine <strong>Cluj</strong> <strong>Napoca</strong>. We used VERO<br />
cells (monkey kidney endothelial fibroblasts) and N. caninum<br />
N.C.1.strain. The study was splited into two stages. In the first stage,<br />
non-infected VERO cells were cultivated in monolayer in different<br />
media (with and without sodium pyruvate and with commercial 10%<br />
fetal calf sera). In the second stage, N. caninum was cultured in the<br />
obtained VERO cells.The best composition formula of the cultivation<br />
medium was evaluated, for: (1) development and multiplication of N.<br />
caninum tachizoites at different moments (every 24 hours for 10 days)<br />
and (2) finding the suitable moment for cell passage and observing the<br />
infective capacity of old tachizoites. VERO cells proved that the optimal<br />
development in RPMI medium without sodium pyruvate and with 10%<br />
bovine calf sera added, in 5% CO 2 atmosphere.Two days after infecting<br />
VERO culture, only 30% of the cells had intact walls(Figure 1), but all<br />
of them had intracitoplasmatic tachizoidal forms. Best period for passing<br />
was found to be 4-5 days.<br />
Figure 1. N. caninum tachizoites in cell culture: pair forms (X200)<br />
During these days, all VERO cells had been infected and totally<br />
lysed.The old N. caninum tachizoites were characterized by a lower<br />
mobility, with morphological changes with the loss of the typical slender<br />
shape to ovoid, but without totally losing the infective capacity.<br />
XXXVIII
For animal experimental model, we used 16 males of 8 weeks<br />
NMRI mice. Mice were divided in four experimental groups (4 mice<br />
per group) as folowing: group no. 1 – infected with N. caninum i.m.;<br />
group no 2 – infected with N. caninum i.m. and immunosuppressed with<br />
a single 1 mg/animal dose of dexamethasone; group no. 3 – infected<br />
with N. caninum s.c.; group no. 4 – noninfected control - physiological<br />
saline i.m.For experimental infection we used N. caninum N.C.1. strain<br />
(10,000 tachizoites/mouse suspended in 0.33 PBS, with antibiotics<br />
added).Mice were clinicaly observed for 16 days. All changes have been<br />
recorded and at the end of the observation period all animals were<br />
euthanized.Necropsy and brain examination (hematoxilin-eozin stain)<br />
for identification of N. caninum cysts was performed in all mice. N.<br />
caninum infection succesed in infected groups, being more agressive in<br />
the immunosuppressed group.First clinical signs appeared 4 days after<br />
inoculation in imunosuppressed mice. Clinical signs observed were:<br />
anorexy, ataxy, imobility, conjuctivitis( Figure 2), fotophobia and<br />
swollen abdomen. First mortalities occured 14 days after inoculation.<br />
Figure 2. Clinical signs: weakness, immobility and conjunctivitis<br />
In fresh smears from brain, some cysts with bradyzoites(Figure<br />
3) histologically appeared in multiple focal necrotic lesions with<br />
neutrophilic and lymphocytic infiltrate.<br />
XXXIX
Figure 3. Brain. N. caninum cyst – direct examination (X400)<br />
Two dogs were used for experimental transmission of N. caninum, both<br />
outbred males of six months. In day 0, dog no. 1 was fed with mice<br />
infected with N. caninum N.C. 1, and dog no. 2 was fed with mice from<br />
uninfected control group. Starting 3 days before infection till 30 days<br />
after infection, daily fecal samples and weekly blood samples were<br />
collected from both dogs. Fecal samples were screened for the presence<br />
of oocysts using saline flotation. Sera samples were tested using indirect<br />
fluorescent antibody test for detecting N. caninum and T. gondi. Both<br />
coproscopy and serology before inoculation were negativ.After feeding<br />
dog no 1 with infected mice, no oocysts were found in fecal samples.<br />
Serology shoved seroconversion at 28 days after inoculation for N.<br />
caninum. No Toxoplasma gondii antibodies have been detected.<br />
Epidemiological aim was to evaluate the prevalence of N.<br />
caninum and T. gondii infection in dogs and bovines and also to record<br />
the prevalence of neosporosis abortion in bovines. In the chapter<br />
containing results of seroprevalence of N. caninum and T. gondii in dogs<br />
three main targets have been set: development of a serological method<br />
for detection of N. caninum antibodies and comparative evaluation of<br />
the serological test to other epidemiological surveys.For indirect<br />
fluorescent antibody test (IFAT) positive and negative dogs sera and N.<br />
caninum tachizoites NC1 strain have been used. N caninum tachizoites<br />
were obtained after cultivation in cell cultures. The best sera dilution and<br />
concentration of tachizoites suspension were determined.In ELISA, two<br />
types of N. caninum antigens were tested: one total antigen obtained by<br />
tachizoites lysate (TL) and one purified antigen (p38).For both tests<br />
(ELISA and IFAT) sensibility, specificity, positive and both, positive<br />
and negative predictive values (PPV and NPV) were established.The<br />
concordance among the tests was evaluated by k index, using<br />
XL
WinEpiscope software and corelation level between antibodies titers in<br />
IFAT and optic density in ELISA by r(Statistica software).<br />
Epidemiological study consisted in serology status evaluation<br />
of 57 outbread dogs from <strong>Cluj</strong> <strong>Napoca</strong>, from 2 months to 13 years old.<br />
From this dogs blood samples have been collected and examinated using<br />
IFAT. in order to detect IgG antibodies against Neospora and<br />
Toxoplasma. We also performed an in-house ELISA, on the 2<br />
experimental designs.ELISA was used only for identification of animals<br />
infected with N. caninum. Statistical significance was calculated for the<br />
infection with Neospora and Toxoplasma in dogs, according to age and<br />
sex. In IFAT, the optimal dilution of tachyzoites was 2.5 millions/ml, 17<br />
μl/plate, and for sera 1:100. In ELISA, hte optimal dilution was 10<br />
μg/ml for TL antigen and 1 μg/ml for p38, and for sera 1:000 for both<br />
variants. The cut-off values was 0.147 ODU for TL and 0.087 ODU for<br />
p38. Both ELISA variants showed SE, SP, VPP and VPN of 100%, the<br />
standard reference method being IFAT. We also found an absolute<br />
correlation between IFAT, ELISA TL and ELISA p38 (k=100), with a<br />
very good correlation between antibody titre obtained in IFAT and both<br />
ELISA ODU values (r=0.84-0.96). Anti-T. gondii antibodies were found<br />
in 24.7 of the examined dogs and seroprevalence was significantly<br />
higher in dogs over 2 years old (71.4%). Anti-N. caninum antibodies<br />
were identified in 12.3% of the dogs (7/57), with no statistical<br />
differences between age groups. The IgG antibody titre against N.<br />
caninum in IFAT was between 1:100-1:400, with no correlation between<br />
age groups.<br />
Seroprevalence of infection with N. caninum and T. gondii in<br />
bovines was studied between 2005 and 2007 in private household<br />
system from <strong>Cluj</strong> county and farms form Mureş county. In <strong>Cluj</strong>, 877<br />
samples were collected from lactating cows from 8 localities and<br />
processed using IFAT in order to detect IgG antibodies against N.<br />
caninum. In Mureş, 267 samples were collected, from which 69 from<br />
heifers and 198 from multiparous females. Testing was done using<br />
ELISA (commercial kit) for detection of anti-T. gondii and anti-N.<br />
caninum antibodies. Nine bovines were re-tested after one month.<br />
Seroprevalence in cows from households (<strong>Cluj</strong>) was between – and 16%<br />
(avg 5.4%) (IFAT 47/877) and in farms (Mureş) 60.3% (161/267).No<br />
significant differences were noted between heifers and multiparous<br />
cows. Seroprevalence of T. gondii (ELISA) was 21% (56/267) and in<br />
14.6% (39/267) both infections were present. All the nine re-tested cows<br />
had similar results for N. caninum but only 5 were positive at the second<br />
trial for T. gondii. Abortions were noted un 85% (34/40) of the pregnant<br />
XLI
cows from farms (year 2007), between 3 and 8 month of gestation, with<br />
mummified fetus (17.5%), succesive abortions between 5-8 month<br />
(2.5%) and repeated oestrus (2.5%). No correlation (r=0.38) was found<br />
between the month of abortion and type and serological status for the<br />
infection with N. caninum or T. gondii.<br />
The last chapter deals with the diagnosis and prevalence of<br />
Neospora-induced abortions in cows. For this, we collected 9 aborted<br />
fetuses of 3-7 month from a dairy-beef farm in Southern Transylvania.<br />
Abortuses were dissected and brain were examined using histology (HE<br />
staining) and PCR. 77.9% (7/9) of the abortions were between 3 and 5<br />
months of gestation, and 33.3% shown miositis and miocarditis; 11%<br />
were mumified. No characteristic lesions were found in the brain by<br />
histology. PCR revealed N. caninum DNA in 33.3% of the samples, all<br />
in abortuses aged between 3 and 7 months. Alltogether, we consider<br />
only one abortus to be of Neospora origin, as both lesions and PCR were<br />
carachteristic. No correlation between the months of the abortion and<br />
infection with N. caninum were found.<br />
Figure 4. Results obtained by PCR made from brain samples<br />
XLII
CUPRINS<br />
INTRODUCERE ..................................................................................... I<br />
SCOPUL <strong>TEZEI</strong> <strong>DE</strong> <strong>DOCTORAT</strong> ...................................................... IV<br />
CAP. 2. OBŢINEREA ŞI CONSERVAREA MATERIALULUI<br />
ANTIGENIC <strong>DE</strong> NEOSPORA CANINUM..........................................VII<br />
2.1. Material şi metodă....................................................................VIII<br />
2.2. Rezultate şi discuţii .................................................................... IX<br />
CAP. 3. MO<strong>DE</strong>L EXPERIMENTAL ÎN INFECŢIA CU NEOSPORA<br />
CANINUM LA ŞOARECI <strong>DE</strong> LABORATOR.......................................X<br />
3.1. Material şi metodă........................................................................X<br />
3.2. Rezultate şi discuţii ...................................................................XII<br />
CAP. 4. SEROPREVALENŢA INFECŢIEI CU NEOSPORA<br />
CANINUM ŞI TOXOPLASMA GONDII LA CÂINI............................XV<br />
4.1. Material şi metodă.....................................................................XV<br />
4.2. Rezultate şi discuţii ................................................................. XVI<br />
CAP. 5. SEROPREVALENŢA INFECŢIEI CU NEOSPORA<br />
CANINUM ŞI TOXOPLASMA GONDII LA BOVINE........................XX<br />
5.1. Material şi metodă.....................................................................XX<br />
5.2. Rezultate şi discuţii ................................................................. XXI<br />
CAP. 6. DIAGNOSTICUL AVORTURILOR PRODUSE <strong>DE</strong><br />
NEOSPORA CANINUM LA BOVINE .............................................XXII<br />
6.1. Material şi metodă..................................................................XXII<br />
6.2. Rezultate şi discuţii ...............................................................XXIII<br />
CAP. 7. CONCLUZII GENERALE ............................................... XXIV<br />
RECOMANDARI.........................................................................XXVIII<br />
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA ...................................................... XXIX<br />
NEOSPOROSIS IN DOGS AND BOVINES: EXPERIMENTAL AND<br />
EPI<strong>DE</strong>MIOLOGICAL RESEARCHES...................................... XXXVII<br />
XLIII