REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - USAMV Cluj-Napoca

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI
MEDICINĂ VETERINARĂ
CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ
FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ
Ovidiu-Ion ŞUTEU
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
Prof. univ. Dr. Vasile COZMA
CLUJ-NAPOCA
2009
I

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI
MEDICINĂ VETERINARĂ
CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ
FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ
Ovidiu-Ion ŞUTEU
NEOSPOROZA LA CÂINE ŞI BOVINE:
CERCETĂRI EXPERIMENTALE ŞI
EPIDEMIOLOGICE
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
Prof. univ. Dr. Vasile COZMA
CLUJ-NAPOCA
2009
II

INTRODUCERE
Neospora caninum este un parazit încadrat taxonomic
în Încrengătura Apicomplexa (Fig. 1), recent identificat, ce
afectează animalele de fermă, în special bovinele, iar dintre
cele de companie, câinele. De la descoperirea parazitului la
câini în Norvegia (Bjerkas şi col., 1984) şi descrierea
parazitului de către Dubey în 1988 (Dubey şi col., 1988a),
studiul neosporozei a constituit un subiect de cercetare pentru
numeroase personalităţi ale parazitologiei şi nu numai, de pe
tot globul. Datorită prevalenţei ridicate şi a impactului
economic important al neosporozei la speciile bovină şi canină,
tema de cercetare a stârnit un interes deosebit pentru elucidarea
diferitelor aspecte ale acestei grave protozooze.
Teza de doctorat este structurată în două părţi, o parte
bibliografică şi o parte de cercetări proprii. În partea
bibliografică sunt prezentate aspecte despre încadrarea
taxonomică, morfologia şi biologia parazitului, aspecte
referitoare la epidemiologia şi patogeneza neosporozei la gazda
definitivă (câine şi coiot) şi gazdele intermediare, metodologia
de diagnostic, şi în final terapia şi profilaxia bolii. În ce-a de-a
doua parte a tezei, a cercetărilor proprii, sunt dezvoltate
III

cercetări experimentale, studii epidemiologice la câine şi
bovine şi privind diagnosticul în avorturi la bovine.
Încrengătura: Protista
Phylum: Apicomplexa
Clasa: Conoidasida
Subclasa: Coccidiasina
Ordinul: Eucoccidiorida
Familia: Sarcocystidae
Genul: Neospora
Specia: Neospora caninum
Fig. 1: Incadrarea taxonomica N. Caninum
SCOPUL TEZEI DE DOCTORAT
N. caninum reprezintă unul din agenţii etiologici
primari principali ai avorturilor la bovine în întreaga lume
(Dubey şi Lindsay, 1996; Dubey, 2003; Hemphill şi Gottstein,
2000; Dubey şi col., 2006), determinând pierderi economice
importante. În Elveţia pierderile economice au fost estimate la
9.7 milioane de euro (Häsler şi col., 2006). Principala cale de
transmitere a infecţiei la bovine este cea transplacentară prin
reactivarea infecţiilor cronice (Paré şi col., 1996; Schares şi
col., 1998). O altă cale de contaminare este cea pe cale orală cu
oochisturi, postnatal (McAllister şi col., 1996; Hietala şi
Thurmond, 1999). Gazde definitive recunoscute la ora actuală
sunt câinele şi coiotul (McAllister şi col., 1998; Gondim şi col.,
IV

2004). În anul 2006 Wapenaar şi col. în urma unui studiu
efectuat la vulpi au identificat oochisturi de N. caninum la
acestea, sugerând posibila implicare ca şi gazdă definitivă în
biologia parazitului.
În urma cercetărilor efectuate s-a constatat că peste
50% dintre avorturi la bovine sunt cauzate de N. caninum
(Anderson şi col., 1995; Thorton, 1996). În urma unui studiu
epidemiologic standardizat, realizat în Europa s-a observat că
prevalenţa infecţiei la bovine variază foarte mult (Bartels şi
col., 2006). Sunt afectate atât vacile de lapte cât şi cele
specializate pentru producţia de carne. Sunt mai predispuse la
avorturi vacile serologic pozitive faţă de cele serologic
negative (Davison şi col., 1999; De Meerschman şi col., 2000;
Waldner, 2005). Pot avorta vacile de orice vârstă începând cu
luna a III-a de gestaţie până la termen, cu o medie în lunile 5-6
de gestaţie. Fetuşii pot muri, resorbi, mumifia, autoliza sau se
nasc vii, neviabili sau sănătoşi din punct de vedere clinic dar cu
infecţie persistentă. S-a observat că 95% dintre viţeii născuţi vii
din vaci serologic pozitive sunt infectaţi congenital, serologic
pozitivi şi fără semne clinice (Paré şi col., 1996).
Diagnosticul avorturilor neosporidiene este unul foarte
complex şi trebuie să stabilească o relaţie cauză-efect între
avort şi N. caninum, ceea ce presupune demonstrarea infecţiei
V

la mamă şi avorton (Dubey şi Schares, 2006). Pentru a atinge
aceste obiective este important a fi demonstrată prezenţa
tachizoiţilor de N. caninum la nivelul leziunilor şi a exclude
alte cauze (Anderson şi col., 1991; Wouda şi col., 1997).
Evidenţierea parazitului la nivelul leziunilor se face prin thenici
de histologie, imunohistochimie, PCR şi izolare pe culturi
celulare şi animale de laborator (şoareci imunosupresaţi). Până
la ora actuală au fost utilizate numeroase linii celulare pentru
cultivarea lui N. caninum, dar cea mai utilizată linie celulară
este linia VERO
Controlul bolii este dificil, cea mai recomandată metodă
fiind testarea animalelor şi eliminarea celor pozitive. Alte
metode care sunt în curs de testare sunt reprezentate de
vaccinare şi chimioterapie.
La noi în ţară acest agent patogen nu a fost studiat până
la această dată, existând un singur studiu seroepidemiologic
(Ionescu şi col., 2003). Având în vedere importanţa parazitului
în patologia abortigenă la bovine, în cadrul acestei teze de
doctorat ne-am propus următoarele obiective:
‣ dezvoltarea unei metode de obţinere, întreţinere şi
conservare a materialului antigenic de N. caninum pe
culturi celulare;
VI

‣ realizarea unui model experimental în infecţia cu N.
caninum la şoareci de laborator;
‣ reproducerea ciclului biologic la N. caninum, utilizând
modelul animal de laborator (gazdă intermediară)-câine
(gazdă definitivă);
‣ dezvoltarea unor metode serologice (imunofluorescenţă
indirectă, ELISA) în vederea diagnosticului
neosporozei la câine;
‣ evaluarea seroprevalenţei infecţiei cu N. caninum la
gazda definitivă – câine, comparativ cu stabilirea
seroprevalenţei infecţiei cu T. gondii;
‣ evaluarea seroprevalenţei infecţiei cu N. caninum la
gazda intermediară – bovine, atât în sistem intensiv cât
şi în sistem tradiţional gospodăresc;
‣ evaluarea seroprevalenţei infecţiei cu T. gondii la
bovine din zona de Nord-Vest a Romaniei;
‣ evaluarea prevalenţei avorturilor neosporidiene la
bovine din zona de Nord-Vest a Romaniei;.
CAP. 2. OBŢINEREA ŞI CONSERVAREA
MATERIALULUI ANTIGENIC DE NEOSPORA
CANINUM
VII

2.1. Material şi metodă
Studiul privind obţinerea, întreţinerea şi conservarea
materialului antigenic de N. caninum pe culturi celulare s-a
realizat în perioada mai-iunie 2003 în Laboratorul de culturi
celulare al Institutului Oncologic I. Chirichuţă, Cluj-Napoca şi
Laboratorul de Boli Parazitare al Facultăţii de Medicină
Veterinară Cluj-Napoca. Materialul biologic a fost reprezentat
de linia celulară VERO (fibroblaste endoteliale renale de
maimuţă) şi suşa de Neospora caninum N.C.1. Experimentul s-
a desfăşurat în două etape, şi anume cultivarea liniei de celule
VERO neinfectate în monostrat în diferite condiţii de mediu
(mediu de cultură fără piruvat de sodiu, mediu de cultură
suplimentat cu piruvat de sodiu şi mediu de cultură suplimentat
cu ser fetal bovin 10%), urmat de introducerea pe cultura
celulară a tachizoiţilor de N. caninum. S-a urmărit alegerea
formulei optime pentru cultivarea substratului celular,
dezvoltarea/multiplicarea tachizoiţilor de N. caninum la diferite
intervale de timp (la 24 de ore, timp de 10 zile), determinarea
momentului optim pentru pasaj şi aprecierea capacităţii
infectante a tachizoiţilor îmbătrâniţi.
VIII

2.2. Rezultate şi discuţii
Celulele din linia VERO s-au dezvoltat în condiţii
optime în mediul de cultură RPMI fără adaus de piruvat de
sodiu, suplimentat cu ser fetal bovin 10% şi în atmosferă de
CO 2 5%. La 2 zile după introducerea tachizoiţilor de N.
caninum pe linia celulară VERO, numai 30% dintre acestea au
fost intacte(Figura 2), dar prezentau forme tachizoidale
intracitoplasmatic .
Fig. 2: Tachizoiţi de Neospora caninum în culturi celulare: dispunere în
pereche (X200)
N. caninum tachizoites in cell culture: pair forms (X200)
Intervalul de timp optim dintre pasaje a fost în medie de
4-5 zile, timp în care celulele VERO au fost infectate şi
distruse în totalitate. Îmbătrânirea tachizoiţilor de N. caninum
(vârstă 10 zile) s-a caracterizat prin diminuarea evidentă a
mobilităţii până la imobilitate, cu modificări morfologice,
IX

exprimate prin pierderea formei alungite clasice, devenind
ovoizi, dar fără să îşi piardă capacitatea infectantă, infecţia
substratului celular realizându-se într-un timp mai lung.
Cultivarea ”in vitro” a tachizoiţilor de N. caninum are
aplicaţii practice referitoare la obţinerea de material antigenic
utilizat în studiile de epidemiologie şi diagnostic serologic al
neosporozei (Bjorkman şi col., 1994b; Bjorkman şi Lunden,
1998; Bjorkman şi Uggla, 1999; Hemphill şi Gottstein, 2000),
izolarea agentului etiologic (N. caninum) în cazuri de avort la
bovine, studierea eficacităţii unor agenţi terapeutici (Derouin şi
Chastang, 1988; Lindsay şi col., 1997; Benoit-Vical şi col.,
2000; Gozalbes şi col., 2000; Lindsay şi col., 1996), în studiul
invaziei celulare de către parazit (Hemphill şi col., 1996) şi în
manipulările genetice ale parazitului (Howe şi col., 1997;
Radke şi col., 2000).
CAP. 3. MODEL EXPERIMENTAL ÎN INFECŢIA CU
NEOSPORA CANINUM LA ŞOARECI DE LABORATOR
3.1. Material şi metodă
Model experimental. Pentru realizarea modelului
experimental animal au fost folosiţi 16 şoareci linia NMRI de
sex mascul, în vârstă de 8 săptămâni. Aceştia au fost grupaţi în
X

patru loturi experimentale a câte 4 şoareci, după cum urmează:
lot 1 –infectat cu tachizoiţi de N. caninum pe cale
intramusculară (i.m.); lot 2 - infectat cu tachizoiţi de N.
caninum pe cale i.m. şi imunosupresat cu dexametazonă (0,5
ml s.c. cu Dexamethasone 2mg/ml – Alfasan Woerden-
Holland); lot 3 - infectat cu tachizoiţi de N. caninum pe cale
s.c. şi lot 4 – lot martor, neinfectat, la care s-a administrat i.m.
ser fiziologic. Infecţia experimentală s-a realizat cu tachizoiţi
de N. caninum suşa N.C.1 în doză de 10.000 tachizoiţi/animal,
suspendaţi în 0.33 ml PBS cu adaus de antibiotice. Şoarecii au
fost urmăriţi clinic timp de 16 zile, înregistrându-se
modificările apărute iar la sfârşitul perioadei de observare au
fost sacrificaţi prin dislocare cervico-cervicală. S-a efectuat
examen necropsic, examen microscopic între lamă şi lamelă
din encefal pentru identificarea chisturilor de N. caninum şi
secţiuni histologice din creier colorate hematoxilină-eozină.
Reproducerea ciclului biologic. În cazul reproducerii
ciclului biologic la N. caninum s-au folosit doi câini de sex
mascul în vârstă de 6 luni, rasă comună. În ziua 0, la câinile 1
s-a administrat în hrană şoareci infectaţi cu N. caninum suşa
N.C.1, iar la câinele 2 şoarecii din lotul martor (lotul 4). Înainte
cu 3 zile de infecţia experimentală şi postinfectant, 30 de zile
au fost recoltate probe de fecale zilnic şi de sânge la 7 zile
XI

interval. În fecale s-a urmărit identificarea oochisturilor prin
examen coproparazitologic utilizând metoda de flotaţie cu
soluţie suprasaturată de clorură de sodiu. Probele de ser au fost
testate prin testul de imunofluorescenţă indirectă în vederea
detecţiei anticorpilor anti-N. caninum şi anti-T. gondii.
3.2. Rezultate şi discuţii
Model experimental. Infecţia cu N. caninum a reuşit la
toate cele trei loturi de şoareci cu infecţie experimentală, atât la
cei imunocompetenţi cât şi la cei imunosupresaţi, fiind mai
gravă la cei din urmă. Primele semne clinice au apărut la 4 zile
postinfectant (p.i.) la şoarecii imunosupresaţi cu dexametazonă,
administrare unică, acestea fiind reprezentate de abatere,
anorexie, ataxie, imobilitate, conjunctivită (Figura 3), fotofobie
şi abdomen balonat. Primele cazuri de mortalitate au apărut la
14 zile p.i..
În preparatele microscopice native efectuate din encefal
au fost puse în evidenţă chisturi cu bradizoiţi
caracteristice(Figura 4) iar în secţiunile histologice leziuni cu
caracter necrotic în focar, multiple, nesupurative şi cu infiltrat
celular abundent(Figura 5).
XII

Modelele experimentale pe şoareci îşi găsesc aplicaţii în
diagnosticul neosporozei şi în studiile experimentale referitoare
la găsirea unor soluţii terapeutice, imunoprofilactice
(Ramamoorthy şi col., 2007), în studiile imunologice şi în
studiile de biologie etc.
Reproducerea ciclului biologic. La examenul
coproparazitologic şi serologic efectuat înainte de infecţia
experimentală cei doi câini au fost negativi. După
administrarea în hrană la câinele 1 de şoareci infectaţi cu N.
caninum nu au fost observate oochisturi în probele de fecale,
dar a fost înregistrată seroconversie la 28 zile p.i., neprezentând
anticorpi anti-T. gondii. Câinele neinfectat a fost serologic
negativ pe toată durata experimentului.
Numeroase cercetări experimentale evidenţiază faptul
că cuantumul coproeliminărilor de oochisturi este dependent de
vârsta câinilor. În general căţeii elimină un număr mai mare de
oochisturi după infecţia primară comparativ cu câinii adulţi
(166.400, respectiv 2.900 oochisturi) (Gondim şi col., 2005).
Un alt factor care se pare că influenţează excreţia de oochisturi
este reprezentat de tipul de ţesuturi consumat de câini, astfel
câini adulţi care au consumat ţesut nervos provenit de la bovine
infectate nu au eliminat oochisturi, dar au prezentat
seroconversie (Gondim şi col., 2005).
XIII

Fig. 3.: Şoarece din lotul 1 la 8 zile p.i. Modificarea stării clinice: abatere,
imobilitate şi conjunctivită
Mouse from 1 st group at 8 days after experimental infection.
Clinical signs: weakness, immobility and conjunctivitis
Fig. 4.: Chist de N. caninum – Fig. 5.: Necroză cu infiltrat
preparat nativ creier (X400)
limfohistiocitar (HE-X1000)
N. caninum cyst – brain (X400) Necrosis and cellular infiltrate
(HE-1000X)
XIV

CAP. 4. SEROPREVALENŢA INFECŢIEI CU
NEOSPORA CANINUM ŞI TOXOPLASMA GONDII LA
CÂINI
4.1. Material şi metodă
În cadrul capitolului referitor la seroprevalenţa
infecţiei cu N. caninum şi T. gondii la câini au fost urmărite
trei obiective principale:
‣ dezvoltarea unor metode serologice de detecţie a
anticorpilor anti-N. caninum;
‣ evaluarea comparativă a metodelor;
‣ efectuarea unui studiu epidemiologic.
Pentru realizarea metodei de IFI au fost folosite
seruri de câini pozitive şi negative şi tachizoiţi de N.
caninum suşa N.C.1 întreţinută pe culturi celulare. S-a
determinat diluţia optimă a serurilor şi concentraţia
tachizoiţilor/ml suspensie necesare realizării metodei. În
cazul metodei ELISA au fost testate 2 tipuri de antigen de N.
caninum, un antigen total obţinut prin liza tachizoiţilor (TL)
şi o proteină membranară de suprafaţă, proteina p38 (p38).
S-a determinat diluţia optimă a serurilor, a antigenului şi s-a
stabilit valoarea cut-off pentru interpretare.
XV

În toate cele trei situaţii s-a calculat sensibilitatea
(Se), specificitatea (Sp), valoarea predictivă pozitivă (VPP)
şi negativă (VPN). Concordanţa între testele aplicate s-a
analizat prin calcularea indicelui k, cu programul
WinEpiscope iar nivelul de corelaţie între teste, între titrul
anticorpilor la IFI şi DO (densitatea optică) la ELISA prin
calcularea indicelui r cu programul Statistica.
În cadrul studiului epidemiologic au fost luaţi în
studiu 57 de câini comunitari din Cluj Napoca, rasă comună,
cu vârste cuprinse între 2 luni şi 13 ani. De la aceştia s-au
prelevat probe de sânge care au fost prelucrate prin tehnica
imunofluorescenţei indirecte (IFI) în vederea detecţiei
anticorpilor de tipul IgG anti-Neospora şi anti-Toxoplasma,
precum şi prin tehnica ELISA („in hause”), aplicând cele 2
variante experimentale dezvoltate. Tehnica ELISA a fost
utilizată numai pentru identificarea subiecţilor infectaţi cu
N. caninum. S-a calculat semnificaţia statistică a prevalenţei
infecţiei cu T. gondii şi N. caninum la câini, între grupele de
vârstă şi sex.
4.2. Rezultate şi discuţii
XVI

La IFI diluţia optimă pentru tachizoiţii de N.
caninum a fost de 2.5 milioane paraziţi/ml suspensie, câte
17 μl/godeu iar pentru seruri de 1:100. La ELISA diluţia
optimă pentru antigen a fost de 10 μg/ml în cazul
antigenului TL şi 1 μg/ml în cazul antigenului p38, iar
pentru seruri de 1:100 în ambele variante experimentale.
Valoarea cut-off a fost de 0.147 DO la varianta TL şi de
0.087 DO varianta p38. Cele douặ variante de lucru ELISA
au prezentat Se, Sp, VPP şi VPN de 100%, metoda standard
fiind consideratặ IFI. De asemenea, a existat corelaţie
perfectă între rezultatele obţinute pentru infecţia cu N.
caninum la IFI, ELISA TL şi ELISA p38 (k=1.00), asociere
foarte bună între titrul de anticorpi obţinut la IFI şi
densitatea optică obţinută la cele două variante ELISA (TL
şi p38) (r=0.84-0.96).
Anticorpi anti-T. gondii au fost indentificaţi la
24.7% câini (14/57), seroprevalenţa fiind semnificativ mai
mare la câinii peste 2 ani (71.4%) iar anticorpi anti-N.
caninum au fost indentificaţi la 12.3% câini (7/57), fără a
exista diferenţe semnificative statistic între grupele de vârstă
(Tabel 1, 2). La un câine din cei 57 examinaţi serologic a
fost înregistrat rezultat dubios la T. gondii, dar pozitiv la N.
caninum.
XVII

Titrul anticorpilor de tipul IgG anti-N. caninum la
IFI s-au situat între 1:100 şi 1:400, neobservându-se
corelaţie între acesta şi vârsta câinilor (r=0.04).
Tabelul 1
Numărul de probe serologic pozitive prin IFI şi ELISA, examinate în
direcţia neosporozei, la câini comunitari din Cluj Napoca
The number of positive sera samples for N. caninum infection tested by
IFAT and ELISA in stray dogs from Cluj Napoca
IFI
ELISA
TL
p38
Pozitive n(%)
Positive
7(12.28%) 7(12.28%) 7(12.28%)
CI 95% (%) 5.1-23.7
Negative n(%)
Negative
50(87.72%) 50(87.72%) 50(87.72%)
Total n
Total
57 57 57
Tabelul 2
Numărul de probe serologic negative şi pozitive, examinate în direcţia
detecţiei de anticorpi anti-N. caninum, la câini comunitari din Cluj
Napoca în funcţie de sex şi vărstă
The number of negative and positive sera samples for N. caninum
infection in stray dogs from Cluj Napoca according with gender and age
Sex
Gender
Femele
Females
Masculi
Males
Vârstă
Age
< 6 luni
2 ani
>2 years
Pozitive n(%)
Positive
5 (12.5) 2 (11.8) 1 (11.1) 3 (15) 3 (10.7)
IC 95% (%) 4.2-26.8 1.5-36.4 0.3-48.2 3.4-39.6 2.2-27.4
RR 0.991 1.055 0.939 0.991
Negative n(%)
Negative
Total
Total
35 15 (88.2) 8 (88.9) 17 (85) 25 (89.3
40 17 9 20 28
XVIII

Prevalenţa infecţiei cu N. caninum la câini sănătoşi
din punct de vedere clinic, variază de la zero aparent în
Insulele Falkland şi Kenya, la aproximativ 20% în Tanzania
şi Uruguay (Barber şi col., 1997a) şi până la 54.2% la câinii
din jurul fermelor de bovine în Argentina (Basso şi col.,
2001). Procente similare ale seroprevalenţei infecţiei cu N.
caninum la câini sunt raportate şi în alte părţi din America
de Sud (Gennari şi col., 2002; Fernandez şi col., 2004;
Azevedo şi col., 2005). În ţara noastră nu sunt raportate
studii epidemiologice privind infecţia cu N. caninum la
câini, iar procentul obţinut de noi în acest studiu la câini
comunitari (12.28%) se încadrează în limitele citate de alţi
autori pe continentul european. Astfel, în Europa 2% până la
13% din câinii studiaţi în mod aleator au fost seropozitivi la
infecţia cu N. caninum în Austria (Wanha şi col., 2005),
Belgia (Barber şi col., 1997b), Anglia (Trees şi col., 1993),
Ungaria (Hornok şi col., 2006), Italia (Capelli şi col., 2004),
Olanda (Wouda şi col., 1993), Spania (Ortuño şi col., 2002),
Suedia (Björkman şi col., 1994), Cehia (Václavek şi col.,
2007) şi Turcia (Coskun şi col., 2000).
XIX

CAP. 5. SEROPREVALENŢA INFECŢIEI CU
NEOSPORA CANINUM ŞI TOXOPLASMA GONDII LA
BOVINE
5.1. Material şi metodă
Cercetặrile privind seroprevalenţa infecţiei cu N.
caninum şi T. gondii la bovine s-au desfặşurat în perioada
2005-2007 la bovine crescute în sistem tradiţional, exetensiv
(gospodăresc) (judeţul Cluj) şi la bovine întreţinute în sistem
intensiv (judeţul Mureş). În judeţul Cluj (sistem tradiţional)
au fost recoltate 877 probe de sânge de la vaci în lactaţie,
din 8 localităţi, probele fiind prelucrate prin tehnica
imunofluorescenţei indirecte, în vederea detecţiei
anticorpilor de tipul IgG anti-N. caninum.
În judeţul Mureş (sistem intensiv) au fost recoltate
267 de probe de sânge, dintre care 69 au provenit de la
juninci, iar 198 de la vaci multipare. Testarea serologică s-a
realizat prin tehnica ELISA (chit comercial) evaluand
prezenţa anticorpilor anti-T. gondii şi anti-N. caninum. De
asemenea 9 dintre bovinele din sistemul intensiv au fost
retestate la interval de o lunặ.
Rezultatele obtinute au fost prelucrate statistic prin
testul Hi-pătrat (GraphPad InStat 3) si s-a calculat prezenţa
XX

sau absenţa corelaţiei (r s ) (Statistica) între prezenţa
anticorpilor anti-N. caninum şi vârsta bovinelor, nivelul de
corelaţie între tipul de avort si luna de gestatie, intre
seropozitivitatea la N. caninum si tipul de avort, intre
seropozitivitatea la N. caninum si luna de gestatie in care s-a
produs avortul.
5.2. Rezultate şi discuţii
Seroprevalenţa infecţiei cu N. caninum la bovine
întreţinute în sistem gospodăresc s-a situat intre 0 si 16%, cu
o medie de 5.4% (IFI, la 47/877), iar la cele din sistem
intensiv de 60.3% (161/267). Nu au existat diferenţe
semnificativ statistic între juninci şi vaci multipare.
Seroprevalenţa infecţiei cu T. gondii (ELISA), la bovinele
din sistemul intensiv a fost de 21% (56/267), iar la 14.6%
(39/267) s-au înregistrat infecţii mixte cu N. caninum şi T.
gondii. Toate cele 9 vaci din sistemul intensiv testate de 2
ori la interval de o lună, au prezentat rezultate egale referitor
la prezenţa anticorpilor anti-N. caninum, iar referitor la
prezenţa anticorpilor anti-T. gondii, numai 5 vaci din cele 9
testate au avut aceleaşi rezultate serologice la interval de o
lună de zile. La aproximativ 34/40 (85%) vaci gestante din
XXI

sistemul intensiv în anul 2007 s-au inregistrat avorturi
spontane (25/40, 62.5%) între lunile 3 şi 8 de gestaţie,
avorturi cu fetus mumifiat (7/40, 17.5%), între lunile 5-8 de
gestaţie, avorturi succesive (1/40, 2.5%) şi repetarea
căldurilor (1/40, 2.5%). S-a observat un grad de asociere
slab spre mediu intre tipul de avort si luna de gestatie in care
s-a produs acesta (r=0,38), fara a exista vreo corelatie intre
statusul serologic la infectia cu N. caninum si T. gondii al
vacilor si tipul de avort sau luna de gestatie in care acesta s-
a produs.
CAP. 6. DIAGNOSTICUL AVORTURILOR PRODUSE
DE NEOSPORA CANINUM LA BOVINE
6.1. Material şi metodă
Au fost recoltaţi un număr de 9 avortoni bovini cu
vârstă fetală de 3-7 luni dintr-o fermă de bovine din sudul
Transilvaniei specializată pentru producţia de lapte şi laptecarne.
Avortonii au fost supuşi examenului necropsic şi au
fost recoltate probe de ţesut nervos (encefal) care au fost
XXII

prelucrate prin metode de histologie clasicặ (sectiuni
colorate hematoxilinặ-eozinặ) si prin biologie moleculară
(PCR) în vederea detectării ADN-ului genomic de N.
caninum.
6.2. Rezultate şi discuţii
77.8% (7/9) dintre avorturi s-au produs în lunile 3-5
de gestaţie (Figura 6), iar 33.3% (3/9) avortoni au prezentat
leziuni de miozită şi miocardită, iar 11% (1/9) au fost
mumifiaţi. Nu au fost identificate leziuni caracteristice la
nivelul creierului, atât la examenul necropsic cât şi la
exemenul histopatologic. Prin PCR a fost detectat ADN
genomic de N. caninum la 33.3% (3/9) (Figura 7) avortoni
cu vârstă fetală de 3, 4 respectiv 7 luni. Doar in cazul unui
singur avort (avorton mumifiat, luna 7 de gestaţie) s-a putut
preciza ca şi cauză a avortului infecţia cu N. caninum,
datorită asocierii leziune (mumifiere)-PCR pozitiv. Nu s-a
înregistrat corelaţie între luna de apariţie a avortului şi
infecţia cu N. caninum (r=0.12).
3.5
umarul de avortur
umber of abortion
3
2.5
2
1.5
1
3
2 2
XXIII

Fig. 6. Histograma avorturilor înregistrate în ferma de bovine
din sudul Transilvaniei
Histogram of abortions registred in a dairy farm in southern
Transylvania
Fig. 7.: Rezultatele obţinute la PCR, efectuat din probe de creier
recoltate de la avortoni bovini colectaţi dintr-o fermă de bovine din
sudul Transilvaniei
Results obtained by PCR made from brain samples collected from a
dairy farm in southern Transylvania
CAP. 7. CONCLUZII GENERALE
XXIV

Cercetările experimentale [(i) întreţinerea unei suşe
de N. caninum pe culturi celulare, (ii) realizarea unui model
experimental în infecţia cu N. caninum, (iii) reproducerea
ciclului biologic la N. caninum)] şi epidemiologice [(iv)
evaluarea seroprevalenţei infecţiei cu N. caninum şi T.
gondii la câine şi bovine, (v) evaluarea prevalenţei
avorturilor neosporidiene la bovine)] privind neosporoza la
animale, derulate în perioada 2002-2007 în cadrul
Disciplinei de Parazitologie şi Boli Parazitare a Facultặţii de
Medicinặ Veterinarặ Cluj, FMV Liege-Belgia si FMV Brno-
Cehia au condus la urmặtoarele concluzii:
‣ pentru prima dată în România s-a reuşit cultivarea
„in vitro” a unei suşe de N. caninum(NC-1),
asigurâdu-se material antigenic viabil necesar
realizării unor tehnici de diagnostic
(imunofluorescenţă indirectă, ELISA);
‣ tachizoiţii de N. caninum au fost cultivaţi în condiţii
optime pe linia celulară VERO, în mediu de cultură
RPMI fără adaos de piruvat de sodiu, dar suplimentat
cu ser fetal bovin 10%;
‣ intervalul optim pentru efectuarea pasajelor a fost în
medie de 4-5 zile, timp în care celulele VERO au
fost infectate şi distruse în totalitate;
XXV

‣ tachizoiţii de N. caninum îmbătrâniţi (vârstă 10 zile)
au fost infectanţi, dar infecţia substratului celular s-a
realizat într-un timp mai lung;
‣ s-a reuşit punerea la punct a tehnicii de conservare a
materialului antigenic reprezentat de tachizoiţi de N.
caninum viabili;
‣ şoarecii din linia NMRI dezvoltă formă clinică de
boală în urma infecţiei experimentale cu N. caninum
(10000 tachizoiţi, suşa NC-1);
‣ infecţia experimentală cu tachizoiţi de N. caninum a
fost mai severă la şoarecii imunosuporesaţi (cu
dexametazonă, doză unică), primele semne clinice
apărând la 4 zile p.i., iar mortalitate la 14 zile p.i.;
‣ semnele clinice înregistrate la şoarecii infectaţi au
fost reprezentate de abatere, anorexie, ataxie,
imobilitate, conjunctivită, fotofobie, abdomen
balonat;
‣ în preparatele microscopice native efectuate din
encefal (de la şoareci infectaţi) au fost puse în
evidenţă chisturi cu bradizoiţi caracteristice, iar în
secţiunile histologice colorate prin metoda
hematoxilină-eozină au fost depistate leziuni cu
XXVI

caracter necrotic în focar, multiple, nesupurative şi
cu infiltrat celular abundent;
‣ nu s-a reuşit reproducerea ciclului biologic la câine,
examenul coproparazitologic p.i. fiind negativ, iar
cel serologic-pozitiv (anticorpi anti-N. caninum), la
28 zile p.i.;
‣ au fost puse la punct metode serologice de detecţie a
anticorpilor anti-N. caninum la câine, şi anume
imunofluorescenţă indirectă şi ELISA;
‣ s-a observat o corelaţie directă între testele de IFI şi
ELISA variantele TL şi p38 (k=1.00), aplicate în
direcţia detecţiei de anticorpi anti-N. caninum la
câini, iar sensibiliatea, specificitatea, valorile
predictive negative şi pozitive ale celor două
variante ELISA (TL, p38) au fost de 100%;
‣ anticorpi anti-N. caninum au fost indentificaţi la
12.3% câini comunitari (7/57) din Cluj Napoca, fără
a exista diferenţe semnificative statistic între grupele
de vârstă, iar anticorpi anti-T. gondii au fost
indentificaţi la 24.7% câini (14/57), seroprevalenţa
fiind semnificativ mai mare la câinii peste 2 ani;
‣ seroprevalenţa infecţiei cu N. caninum a fost
semnificativ mai mare (p=0.0001) la bovinele
XXVII

‣ seroprevalenţa infecţiei cu T. gondii (ELISA), la
bovinele din sistemul intensiv a fost de 21%
(56/267), iar la 14.6% (39/267) dintre acestea s-au
înregistrat infecţii mixte cu N. caninum şi T. gondii;
‣ din totalul de 9 avortoni bovini examinaţi în direcţia
neosporozei, la 3 a fost identificat ADN genomic de
N. caninum (33.3%), aceştia având o vârstă fetală de
3, 4 respectiv 7 luni;
‣ se impune introducerea neosporozei în diagnosticul
diferenţial al afecţiunilor neuromusculare şi de
reproducţie la speciile canină şi bovină.
RECOMANDARI
În sinteză, subliniem importanţa introducerii unui
program de supraveghere şi control la nivel de ferme privind
neosporoza bovină, având în vedere seroprevalenţa foarte
mare înregistrată în judeţul Mureş la ferma „S”, la care se
XXVIII

adaugă procentul mare de avorturi, care trebuie investigate
la nivel de laborator. Un astfel de program ar trebui să
includă: (1) testarea serologică a vacilor ce se introduc în
fermă (Dubey şi col., 2007), precum şi a unui procent de
vaci din fermă, anual; (2) în fermele cu seroprevalenţă
scăzută (sub 10%) îndepărtarea vacilor serologic pozitive;
(3) evitarea repopulării cu juninci ce provin din mame
serologic pozitive; (4) implementarea de măsuri de
îmbunătăţire a siguranţei instalaţiilor din fermă şi a
condiţiilor de depozitare a furajelor (Gonzalez Warleta şi
col., 2008); (5) controlul câinilor din fermă, chiar
îndepărtarea acestora; (6) implementarea unui protocol
terapeutic.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA
1. Anderson, M.L., P.C. Blanchard, B.C. Barr, J.P. Dubey, R.L.
Hofman, P.A. Conrad, 1991, Neospora like protozoan as a
major cause of abortion in California dairy cattle, J. Am. Vet.
Med. Assoc., 198, 241-244.
2. Anderson, M.L., C. Palmer, M. Thurmond, J. Picanso, P.C.
Blanchard, R.E. Breitmeyer, A.W. Layton, M. McAllister, B.
Daft, H. Kinde, D.H. Read, J.P. Dubey, P. Conrad, B.C. Barr,
1995, Evaluation of abortions in cattle atributabile to neosporosis
XXIX

in selected dairy herds in California, J. Am. Vet. Med. Assoc.,
207, 1206-1210.
3. Azevedo, S.S., C.S.A. Batista, S.A. Vasconcellos, D.M.
Aguiar, A.M.A. Ragozo, A.A.R. Rodriguez, C.J. Alves, S.M.
Gennari, 2005, Seroepidemiology of Toxoplasma gondii and
Neospora caninum in dogs from the state Paraiba, Northeast
region of Brazil. Res. Vet. Science, 79:1, 51-56.
4. Barber, J.S., R.B. Gasser, J. Ellis, M.P. Reichel, D. McMillan,
A.J. Trees, 1997a, Prevalence of antibodies to Neospora
caninum in different canid populations, J. Parasitol., 83:6, 1056-
1058.
5. Barber, J.S., L. Van Ham, I. Polis, A.J. Trees, 1997b,
Seroprevalence of antibodies to Neospora caninum in belgian
dogs, J. Small Anim. Practice, 38, 15-16.
6. Bartels CJM, Ruiz-Santa-Quitera JA, Arnaiz-Seco I, Björkman
C, Frössling J, von Blumröder D, Conraths FJ, Schares G, Van
Maanen C, Wouda W, Ortega-Mora LM, 2006. Supranational
comparison of Neospora caninum seroprevalences in cattle in
Germany, The Netherlands, Spain and Sweden. Vet Parasitol,
137: 17-27.
7. Basso W, Venturini L, Venturini MC, Moore P, Rambeau M.,
Unzaga JM, Campero C., Bacigalupe D, Dubey JP, 2001.
Prevalence of Neospora caninum infection in dogs from beefcattle
farms, dairy farms, and from urban areas of Argentina. J
Parasitol, 87: 906-907.
8. Benoit-Vical F, Santillana-Hayat M, Kone-Bamba D, Mallie M,
Derouin F, 2000. Anti-Toxoplasma activity of vegetal extracts
used in West African traditional medicine. Parasitol, 7: 3-7.
XXX

9. Bjerkas I, Mohn SF, Presthus J, 1984. Unidentified cystforming
sporozoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs.
Zparasitenkd, 70: 271-4.
10. Bjorkman C, Lunden A, Uggla A, 1994a. Prevalence af
antibodies to Neospora caninum and Toxoplasma gondii in
Swedish dogs. Acta Vet Scand, 35:445-7.
11. Bjorkman C, Lunden A, Holmdahl J, Barber J, Trees AJ, Uggla
A, 1994b. Neospora caninum in dogs: detection of antibodies by
ELISA using an iscom antigen. Parasite Immunol, 16: 643-8.
12. Bjorkman C, Lunden A, 1998. Application of iscom antigen
preparations in ELISAs for diagnosis of Neospora and
Toxoplasma infections. Int J Parasitol, 28: 187-93.
13. Bjorkman C, Uggla A, 1999. Serological diagnosis of Neospora
caninum infection. Int J Parasitol, 29: 1497-507.
14. Capelli G, Nardelli S, Regalbono AF, Scala A, Pietrobelli M,
2004. Sero-epidemiological survey of Neospora caninum
infection in dogs in north-eastern Italy. Vet Parasitol, 123: 143-
8.
15. Coskun SZ, Aydyn L, Bauer C, 2000. Seroprevalence of
Neospora caninum infection in domestic dogs in Turkey. Vet
Record, 146(22): 649.
16. Davison HC, Otter A, Trees AJ, 1999. Significance of Neospora
caninum in British dairy cattle determined by estimation of
seroprevalence in normally calving cattle and aborting cattle. Int
J Parasitol, 29: 1189-94.
17. DeMeerschman F, Focant C, Boreux R, Leclipteux T, Losson B,
2000. Cattle neosporosis in Belgium: a case-control study in
dairy and beef cattle. Int J Parasitol 30: 887-90.
XXXI

18. Derouin F, Chastang C, 1988. Enzyme immunoassay to assess
effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue
culture. Antimicrob Agents Chemother, 32: 303-7.
19. Dubey JP, Carpenter JL, Speer CA, Topper MJ, Uggla A, 1988.
Newly recognized fatal protozoan disease of dogs. J Am Vet Med
Assoc, 192: 1269-85.
20. Dubey JP, Buxton D, Wouda W, 2006. Pathogenesis of Bovine
Neosporosis. J Compar Pathol, 134(4): 267-89.
21. Dubey JP, Schares G, Ortega-Mora LM, 2007. Epidemiology
and control of neosporosis and Neospora caninum. Clin
Microbiol Rev, 20: 323-67.
22. Dubey JP, Lindsay DS, 1996. A review of Neospora caninum
and neosporosis. Vet Parasitol, 67: 1-59.
23. Dubey JP, Schares G, 2006. Diagnosis of bovine neosporosis.
Vet Parasitol, 140: 1-34.
24. Dubey JP, 2003. Review of Neospora caninum and neosporosis
in animals. Korean J Parasitol, 41(1): 1-16.
25. Fernandez BC, Gennari SM, Souza SL, Carvalho JM, Oliveira
WG, Cury MC, 2004. Prevalence of anti-Neospora caninum
antibodies in dogs from urban, periurban and rural areas of the
city of Uberlandia, Minas Gerais-Brazil. Vet Parasitol, 123: 33-
40.
26. Gennari SM, Yai LE, D'Auria SN, Cardoso SM, Kwok OC,
Jenkins MC, Dubey JP, 2002. Occurence of Neospora caninum
antibodies in sera from dogs of the the city of Sao Paulo, Brazil.
Vet Parasitol, 106: 177-79.
XXXII

27. Gondim LFP, Mc Allister MM, Pitt WC, Zemlicka DE, 2004.
Coyotes are definitive hosts of Neospora caninum. Int J
Parasitol, 34: 159-61.
28. Gondim LFP, Mc Allister MM, Gao L, 2005. Effects of host
maturity and prior exposure history on the production of
Neospora caninum oocysts by dogs. Vet Parasitol, 134: 33-9.
29. González-Warleta Marta, Castro-Hermida JA, Carro-Corral
Carmen, Cortizo-Mella J, Mezo M, 2008. Epidemiology of
neosporosis in dairy cattle in Galicia (NW Spain). Parasitol Res,
102: 243–9.
30. Gozalbes R, Brun-Pascaud M, Garcia-Domenech R, Galvez J,
Girard PM, Doucet JP, Derouin F, 2000. Anti-toxoplasma
activities of 24 quinolonesan difluoroquinolones in vitro:
prediction of activity by molecular topology and virtual
computational techniques. Antimicrob Agents Chemother, 44:
2771-6.
31. Häsler B, Regula G, Stärk KD, Sager H, Gottstein B, Reist M,
2006. Financial analysis of various strategies for the control of
Neospora caninum in dairy cattle in Switzerland. Prev Vet Med,
18, 77(3-4): 230-53.
32. Hemphill A, Gottstein B, Kaufmann H, 1996. Adhesion and
invasion of bovine endhotelial cells by Neospora caninum
Parasitol, 112: 183-197.
33. Hemphill A, Gottstein B, 2000. A European perspective on
Neospora caninum. Int J Parasitol, 30: 877-924.
34. Hietala SK, Thurmond MC, 1999. Postnatal Neospora caninum
transmission and transient serologic responses in two dairies. Int
J Parasitol, 29: 1669-76.
XXXIII

35. Hornok S, Edelhofer R, Hajtós I, 2006. Seroprevalence of
neosporosis in beef and dairy cattle breeds in Northeast Hungary.
Acta Vet Hung, 54(4): 485-91.
36. Howe DK, Mercier C, Messina M, Sibley LD, 1997. Expression
of Toxoplasma gondii genes in the closely-related apicomplexan
parasite Neospora caninum. Mol Biochem Parasitol, 86: 29-36.
37. Ionescu V, Popa E, Moldoveanu D, 2003. Neosporoza la bovine.
Revista Romana de Parazitologie, Vol XIII, Nr 1 :125-6.
38. Lindsay DS, Butler JM, Rippey NS Blagburn BL, 1996.
Demonstration of synergistic effects of sulfonamides and
dihydrofolate reductase/thymidylate synthase inhibitors against
Neospora caninum tachyzoites in cultured cells and
characterization of mutans resistant to pyrimethamine. Am J Vet
Res, 57: 68-72.
39. Lindsay DS, Butler JM, Blagburn BL, 1997. Efficacy of
decoquinate against Neospora caninum tachyzoites in cell
cultures. Vet Parasitol, 68: 35-40.
40. McAllister MM, Huffman EM, Hietala SK, Conrad PA,
Anderson ML, Salman MO, 1996. Evidence suggesting a point
source exposure ia an outbreak of bovine abortion due to
neosporosis. J Vet Diagn Invest, 8: 355-7.
41. McAllister MM, Dubey JP, Linsday DS, Jolley WR, Wills RA,
McGuire AM, 1998. Dogs are definitive hosts of Neospora
caninum. Int. J Parasitol, 28: 1473-8.
42. Ortuno A, Castella J, Almeria S, 2002. Seroprevalence of
antibodies to Neospora caninum in dogs from Spain. Journal for
Parasitology, 88: 1263-6.
XXXIV

43. Paré J, Thurmond MC, Hietala SK, 1996. Congenital Neospora
caninum infection in dairy cattle and associated calfhood
mortality. Can J Vet Res, 60(2): 133-9.
44. Radke JR, Guerini MN, White MW, 2000. Toxoplasma gondii:
characterization of temperature- sensitive tachyzoite cell cycle
mutants. Exp Parasitol, 96: 168-77.
45. Ramamoorthy S, Duncan R, Lindsay DS, Sriranganathan N,
2007. Optimization of the use of C57BL/6 mice as a laboratory
animal model for Neospora caninum vaccine studies. Vet
Parasitol, 145: 253-9.
46. Schares G, Peters M, Wurm R, Barwald A, Conhrats FJ, 1998.
The efficiency of vertical transmission of Neospora caninum in
dairy cattle analysed by serological techniques. Vet Parasitol, 80:
87-98.
47. Thornton R, 1996. Bovine abortion diagnoses in 1995. Surveill,
23: 21-2.
48. Trees AJ, Guy F, Tennant BJ, Balfour AH Dubey JP, 1993.
Prevalence of antibodies to Neospora caninum in a population of
urban dogs in England. Vet Rec, 132: 125-6.
49. Václavek P, Sedlák K, Hůrková L, Vodrázka P, Sebesta R,
Koudela B, 2007. Serological survey of Neospora caninum in
dogs in the Czech Republic and a long-term study of dynamics of
antibodies. Vet Parasitol, 143: 35-41.
50. Waldner CL, 2005. Serological status for Neospora caninum,
bovine viral diarrhea virus, and infectious bovine rhinotracheitis
virus at pregnancy testing and reproductive performance in beef
herds. Anim reprod Sci, 90: 219-42.
XXXV

51. Wanha K, Edelhofer R, Gabler-Eduardo C, Prosl H, 2005.
Prevalence of antibodies against Neospora caninum and
Toxoplasma gondii in dogs and foxes in Austria. Vet Parasitol,
128: 189-93.
52. Wapenaar W, Jenkins MC, O'Handley RM, Barkema HW, 2006.
Neospora caninum-like oocysts observed in feces of free-ranging
red foxes (Vulpes vulpes) and coyotes (Canis latrans). J
Parasitol, 92(6): 1270-4.
53. Wouda W, De Jong JK, Van Knapen F and Walvoort HC, 1993.
Neospora caninum als oorzak van Verlammingsverschijnselen
bij jonge honden. Tijdschr Diergeneeskd 118: 397-401.
54. Wouda W, Moen AR, Visser IJR and Van Knapen F, 1997.
Bovine fetal neosporosis: A comparison of epizootic and
sporadic abortion cases and different age classes with regards to
lesion severity and immunohistochemical identification in brain,
heart and liver. J Vet Diagn Invest, 9(2): 180-5.
XXXVI

NEOSPOROSIS IN DOGS AND BOVINES:
EXPERIMENTAL AND EPIDEMIOLOGICAL
RESEARCHES
(SUMMARY OF PhD THESIS)
Neospora caninum is a sporozoan from Sarcocystidae family,
similar from morphological and life cycle point of view with
Toxoplasma gondii, with which it was till recently misidentified. In the
life cycle of the parasite, two hosts are involved: a definitive host
represented by dog and coyotes and an intermediate host represented by
different mammals, mainly bovines. So, since 1984 when the parasite
was identified and described, the abortion of parasitic cause was
reconsidered.
The main clinical symptom in bovine neosporosis is abortion.
Cows may abort from 3 months of gestation to term with mummified,
autolyzed, stillborn, born alive, but diseased, or born clinically normal
but chronically infected fetuses. Neosporidian abortions may be endemic
or epidemic. It is considered that over 50% of bovine abortions are
caused by N. caninum infection, with important economical losses.
Transplacental route is the main natural infection transmission
mechanism in bovines, because of chronical reactivation of infection. A
less important route is the oral one, by ingestion of oocysts. In Romania
this pathogen has not been sistematicaly screened and before this study
only one seroepidemiological survey was published.
Considering the importance of the parasite in bovine reproduction, the
aims of this PhD thesis were to: (i) obtain, maintain and preserve N.
caninum in cell cultures; (ii) develope an experimenthal model of N.
caninum infection in mice and (iii) experimentally reproduce the life
cycle, using laboratory rodents and dogs; (iv) determine the
seroprevalence of N. caninum infection in dogs and bovines in
comparison with T. gondii; (v) diagnose and determine the prevalence of
N. caninum –induced abortions in bovines from Romania.
The PhD thesis is structured in a bibliographical part and
original research. The first part contains data about taxonomy,
morphology, life cycle, epidemiology, pathogenesis in definitive and
intermediate hosts, diagnostic tehniques, therapy and control. The
original research part presents the results of experimental transmissions,
epidemiological studies in dogs and bovines and diagnostic in bovine
abortions.
XXXVII

Experimental trials consisted of the development of obtaining, maintaing
and preserving tehniques of N. caninum antigens on cell cultures and
also an experimental model of N. caninum infection in mice as well as
laboratory transmission of N. caninum using animal models:
intermediate rodent hosts and dogs.
Maintainance and preservation of N. caninum antigens in cell
cultures was done in May-June 2003 in the Laboratory of Cell Cultures
of Oncological Institute from Cluj-Napoca and Laboratory of Parasitic
Diseases, Faculty of Veterinary Medicine Cluj Napoca. We used VERO
cells (monkey kidney endothelial fibroblasts) and N. caninum
N.C.1.strain. The study was splited into two stages. In the first stage,
non-infected VERO cells were cultivated in monolayer in different
media (with and without sodium pyruvate and with commercial 10%
fetal calf sera). In the second stage, N. caninum was cultured in the
obtained VERO cells.The best composition formula of the cultivation
medium was evaluated, for: (1) development and multiplication of N.
caninum tachizoites at different moments (every 24 hours for 10 days)
and (2) finding the suitable moment for cell passage and observing the
infective capacity of old tachizoites. VERO cells proved that the optimal
development in RPMI medium without sodium pyruvate and with 10%
bovine calf sera added, in 5% CO 2 atmosphere.Two days after infecting
VERO culture, only 30% of the cells had intact walls(Figure 1), but all
of them had intracitoplasmatic tachizoidal forms. Best period for passing
was found to be 4-5 days.
Figure 1. N. caninum tachizoites in cell culture: pair forms (X200)
During these days, all VERO cells had been infected and totally
lysed.The old N. caninum tachizoites were characterized by a lower
mobility, with morphological changes with the loss of the typical slender
shape to ovoid, but without totally losing the infective capacity.
XXXVIII

For animal experimental model, we used 16 males of 8 weeks
NMRI mice. Mice were divided in four experimental groups (4 mice
per group) as folowing: group no. 1 – infected with N. caninum i.m.;
group no 2 – infected with N. caninum i.m. and immunosuppressed with
a single 1 mg/animal dose of dexamethasone; group no. 3 – infected
with N. caninum s.c.; group no. 4 – noninfected control - physiological
saline i.m.For experimental infection we used N. caninum N.C.1. strain
(10,000 tachizoites/mouse suspended in 0.33 PBS, with antibiotics
added).Mice were clinicaly observed for 16 days. All changes have been
recorded and at the end of the observation period all animals were
euthanized.Necropsy and brain examination (hematoxilin-eozin stain)
for identification of N. caninum cysts was performed in all mice. N.
caninum infection succesed in infected groups, being more agressive in
the immunosuppressed group.First clinical signs appeared 4 days after
inoculation in imunosuppressed mice. Clinical signs observed were:
anorexy, ataxy, imobility, conjuctivitis( Figure 2), fotophobia and
swollen abdomen. First mortalities occured 14 days after inoculation.
Figure 2. Clinical signs: weakness, immobility and conjunctivitis
In fresh smears from brain, some cysts with bradyzoites(Figure
3) histologically appeared in multiple focal necrotic lesions with
neutrophilic and lymphocytic infiltrate.
XXXIX

Figure 3. Brain. N. caninum cyst – direct examination (X400)
Two dogs were used for experimental transmission of N. caninum, both
outbred males of six months. In day 0, dog no. 1 was fed with mice
infected with N. caninum N.C. 1, and dog no. 2 was fed with mice from
uninfected control group. Starting 3 days before infection till 30 days
after infection, daily fecal samples and weekly blood samples were
collected from both dogs. Fecal samples were screened for the presence
of oocysts using saline flotation. Sera samples were tested using indirect
fluorescent antibody test for detecting N. caninum and T. gondi. Both
coproscopy and serology before inoculation were negativ.After feeding
dog no 1 with infected mice, no oocysts were found in fecal samples.
Serology shoved seroconversion at 28 days after inoculation for N.
caninum. No Toxoplasma gondii antibodies have been detected.
Epidemiological aim was to evaluate the prevalence of N.
caninum and T. gondii infection in dogs and bovines and also to record
the prevalence of neosporosis abortion in bovines. In the chapter
containing results of seroprevalence of N. caninum and T. gondii in dogs
three main targets have been set: development of a serological method
for detection of N. caninum antibodies and comparative evaluation of
the serological test to other epidemiological surveys.For indirect
fluorescent antibody test (IFAT) positive and negative dogs sera and N.
caninum tachizoites NC1 strain have been used. N caninum tachizoites
were obtained after cultivation in cell cultures. The best sera dilution and
concentration of tachizoites suspension were determined.In ELISA, two
types of N. caninum antigens were tested: one total antigen obtained by
tachizoites lysate (TL) and one purified antigen (p38).For both tests
(ELISA and IFAT) sensibility, specificity, positive and both, positive
and negative predictive values (PPV and NPV) were established.The
concordance among the tests was evaluated by k index, using
XL

WinEpiscope software and corelation level between antibodies titers in
IFAT and optic density in ELISA by r(Statistica software).
Epidemiological study consisted in serology status evaluation
of 57 outbread dogs from Cluj Napoca, from 2 months to 13 years old.
From this dogs blood samples have been collected and examinated using
IFAT. in order to detect IgG antibodies against Neospora and
Toxoplasma. We also performed an in-house ELISA, on the 2
experimental designs.ELISA was used only for identification of animals
infected with N. caninum. Statistical significance was calculated for the
infection with Neospora and Toxoplasma in dogs, according to age and
sex. In IFAT, the optimal dilution of tachyzoites was 2.5 millions/ml, 17
μl/plate, and for sera 1:100. In ELISA, hte optimal dilution was 10
μg/ml for TL antigen and 1 μg/ml for p38, and for sera 1:000 for both
variants. The cut-off values was 0.147 ODU for TL and 0.087 ODU for
p38. Both ELISA variants showed SE, SP, VPP and VPN of 100%, the
standard reference method being IFAT. We also found an absolute
correlation between IFAT, ELISA TL and ELISA p38 (k=100), with a
very good correlation between antibody titre obtained in IFAT and both
ELISA ODU values (r=0.84-0.96). Anti-T. gondii antibodies were found
in 24.7 of the examined dogs and seroprevalence was significantly
higher in dogs over 2 years old (71.4%). Anti-N. caninum antibodies
were identified in 12.3% of the dogs (7/57), with no statistical
differences between age groups. The IgG antibody titre against N.
caninum in IFAT was between 1:100-1:400, with no correlation between
age groups.
Seroprevalence of infection with N. caninum and T. gondii in
bovines was studied between 2005 and 2007 in private household
system from Cluj county and farms form Mureş county. In Cluj, 877
samples were collected from lactating cows from 8 localities and
processed using IFAT in order to detect IgG antibodies against N.
caninum. In Mureş, 267 samples were collected, from which 69 from
heifers and 198 from multiparous females. Testing was done using
ELISA (commercial kit) for detection of anti-T. gondii and anti-N.
caninum antibodies. Nine bovines were re-tested after one month.
Seroprevalence in cows from households (Cluj) was between – and 16%
(avg 5.4%) (IFAT 47/877) and in farms (Mureş) 60.3% (161/267).No
significant differences were noted between heifers and multiparous
cows. Seroprevalence of T. gondii (ELISA) was 21% (56/267) and in
14.6% (39/267) both infections were present. All the nine re-tested cows
had similar results for N. caninum but only 5 were positive at the second
trial for T. gondii. Abortions were noted un 85% (34/40) of the pregnant
XLI

cows from farms (year 2007), between 3 and 8 month of gestation, with
mummified fetus (17.5%), succesive abortions between 5-8 month
(2.5%) and repeated oestrus (2.5%). No correlation (r=0.38) was found
between the month of abortion and type and serological status for the
infection with N. caninum or T. gondii.
The last chapter deals with the diagnosis and prevalence of
Neospora-induced abortions in cows. For this, we collected 9 aborted
fetuses of 3-7 month from a dairy-beef farm in Southern Transylvania.
Abortuses were dissected and brain were examined using histology (HE
staining) and PCR. 77.9% (7/9) of the abortions were between 3 and 5
months of gestation, and 33.3% shown miositis and miocarditis; 11%
were mumified. No characteristic lesions were found in the brain by
histology. PCR revealed N. caninum DNA in 33.3% of the samples, all
in abortuses aged between 3 and 7 months. Alltogether, we consider
only one abortus to be of Neospora origin, as both lesions and PCR were
carachteristic. No correlation between the months of the abortion and
infection with N. caninum were found.
Figure 4. Results obtained by PCR made from brain samples
XLII

CUPRINS
INTRODUCERE ..................................................................................... I
SCOPUL TEZEI DE DOCTORAT ...................................................... IV
CAP. 2. OBŢINEREA ŞI CONSERVAREA MATERIALULUI
ANTIGENIC DE NEOSPORA CANINUM..........................................VII
2.1. Material şi metodă....................................................................VIII
2.2. Rezultate şi discuţii .................................................................... IX
CAP. 3. MODEL EXPERIMENTAL ÎN INFECŢIA CU NEOSPORA
CANINUM LA ŞOARECI DE LABORATOR.......................................X
3.1. Material şi metodă........................................................................X
3.2. Rezultate şi discuţii ...................................................................XII
CAP. 4. SEROPREVALENŢA INFECŢIEI CU NEOSPORA
CANINUM ŞI TOXOPLASMA GONDII LA CÂINI............................XV
4.1. Material şi metodă.....................................................................XV
4.2. Rezultate şi discuţii ................................................................. XVI
CAP. 5. SEROPREVALENŢA INFECŢIEI CU NEOSPORA
CANINUM ŞI TOXOPLASMA GONDII LA BOVINE........................XX
5.1. Material şi metodă.....................................................................XX
5.2. Rezultate şi discuţii ................................................................. XXI
CAP. 6. DIAGNOSTICUL AVORTURILOR PRODUSE DE
NEOSPORA CANINUM LA BOVINE .............................................XXII
6.1. Material şi metodă..................................................................XXII
6.2. Rezultate şi discuţii ...............................................................XXIII
CAP. 7. CONCLUZII GENERALE ............................................... XXIV
RECOMANDARI.........................................................................XXVIII
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA ...................................................... XXIX
NEOSPOROSIS IN DOGS AND BOVINES: EXPERIMENTAL AND
EPIDEMIOLOGICAL RESEARCHES...................................... XXXVII
XLIII