studiul micromediului medular şi al complexelor de ... - Gr.T. Popa

Universitatea de Medicină şi Farmacie
Gr. T. Popa Iaşi, România
Universitatea Jean Monnet Saint-Etienne, Franţa
Facultatea de Medicină
STUDIUL MICROMEDIULUI MEDULAR ŞI AL
COMPLEXELOR DE ADERENŢĂ FOCALĂ ÎN
MIELODISPLAZII ŞI LEUCEMII ACUTE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
COORDONATORI ŞTIINŢIFICI,
PROF. DR. EUGEN CARASEVICI
PROF. DR. LYDIA CAMPOS
DOCTORAND,
CARMEN-MARIANA AANEI
IAŞI, 2011

CUPRINS
MOTIVAŢIA ŞI OBIECTIVUL STUDIULUI DOCTORAL 3
PARTEA PERSONALĂ - REZULTATE ORIGINALE
ARTICOL I– Deficienţe funcţionale intrinseci ale celulelor mezenchimale
stromale în Sindroamele Mielodisplazice 5
Scopul şi obiectivele studiului micromediului medular în mielodisplazii 5
Capitolul A - Aspecte privind comportamentul CSM izolate de la
pacienţii cu SMD în culturile primare şi analiza lor morfometrică
(analize comparative cu omologii lor normali) 9
A.I. Materiale şi Metode 9
A.II. Resultate 11
A.II.1 Evaluarea distribuţiei subpopulaţiilor de CSM în culturile
primare 11
A.II.2 Evaluarea morfometrică a CSM în culturile primare 12
Capitolul B – Fenotipul celulelor stromale medulare (analize
comparative între SMD şi normal) 14
B.I. Materiale şi Metode 14
B.II. Rezultate 16
B.II.1 Caracterizarea flow-citometrică a CSM amplificate in
vitro timp de 30-35 de zile 17
B.II.2 Evaluarea marcherilor de adeziune exprimaţi de CSM 21
B.II.3 Probleme tehnice 24
Capitolul C – Particularităţi de creştere ale CSM medulare selectate de
la pacienţii cu SMD vs. CSM normale 25
C.I. Materiale şi Metode 25
C.II. Rezultate 28
C.II.1. Proprietăţile funcţionale ale subpopulaţiilor de CSM
STRO-1 + CD73 - şi STRO-1 - CD73 + selectate din SMD
comparativ cu celulele selectate de la voluntarii sănătoşi 28
C.II.2. Scăderea expresiei marcherilor de aderenţă influenţează
negativ proprietăţile funcţionale ale CSM în SMD 30
C.II.3. Declinul CD49e pe suprafaţă CSM s-a corelat direct cu
diminuarea potenţialului clonogenic al CPH la pacienţii cu SMD 31
1
33

ARTICOL II – Anomaliile proteinelor de adeziune focală la nivelul celulelor
mezenchimale stromale mielodisplazice
Introducere 33
Capitolul D – Evaluarea proteinelor componente ale complexelor de
aderenţă focală la nivelul CSM CD73 + selectate de la pacienţii cu SMD vs.
celulele normale 34
D.I. Materiale şi Metode 34
D.II. Rezultate 39
D.II.1 Analiza morfologică a CSM în culturi primare 39
D.II.2. Evaluarea funcţională a CSM CD73 + selectate din culturile
pacienţilor cu SMD vs. omologii normali (corelaţii cu expresia
proteinelor de adeziune focală) 40
D.II.3. Caracterizarea proteinelor de adeziune focală la nivelul
celulelor CD73 + amplificate în cultură (SMD vs. omologii normali) 41
D.II.4. Analiza colocalizării proteinelor de adeziune focală în
celulele CD73 + în SMD vs. omologii normali 43
Capitolul E – Rolul căii de semnalizare Paxilină-pFAK [Y397]-HSP90 în
proliferarea celulelor CSM CD73 + 49
E.I. Rezultate 49
Capitolul F – Impactul defectelor de adeziune ale CSM CD73 + asupra
capacităţii proliferative a precursorilor hematopoietici în SMD 50
F.I. Rezultate 50
ARTICOL III – Supraexpresia proteinei Heat-Shock-Protein (HSP)-90 în
Sindroamele mielodisplazice cu risc înalt se însoţeşte de expresia crescută şi
activarea kinazei Focal Adhesion Kinase (FAK) 51
PERSPECTIVE 53
DISCUŢII 54
BIBLIOGRAFIE 58
2

MOTIVAŢIA ŞI OBIECTIVUL STUDIULUI DOCTORAL
În prezent, sindroamele mielodisplazice (SMD) sunt considerate a fi
maladii clonale ale celulelor stem hematopoietice (CSH). Dovezile
acumulate în ultimii ani demonstrează că, în plus faţă de defectele CSH, un
rol special, este jucat de disfuncţiile micromediului stromal, care mediază
contactul direct cu celule precursoare hematopoietice (CPH).
Până în prezent, datele cu privire la rolul disfuncţiilor micromediului
stromal în MDS sunt puţine şi contradictorii, în mare măsură din cauza
complexităţii acestei reţele de celule şi molecule, cât şi, datorită metodelor
de izolare, care au un impact important asupra compoziţiei preparatelor de
celule stromale mezenchimale (CSM), influenţând enorm rezultatele
diferitelor grupuri de cercetatori.
Studiile anterioare au arătat că straturile aderente de CSM medulare de la
pacienţii cu SMD ating confluenţa mult mai lent decât celulele normale ale
donatorilor sănătoşi, iar aceste defecte sunt asociate, în unele cazuri cu
activarea crescută a caspasei-3 şi cu neoangiogeneza [1].
În plus, există dovezi că aceste anomalii afectează funcţionalitatea
compartimentului hematopoietic, contribuind la avortul CPH şi la
anomaliile lor de dezvoltare în micromediul medular. Toate acestea par să
se datoreze mai degrabă contactelor dintre CSH-şi-CSM decât influenţei
factorilor solubili.
Aceste modificări ale micromediului sunt însoţite şi de aberaţii genomice,
care au fost deja descrise la nivelul CSM selectate de la pacienţii cu SMD.
De asemenea, ar trebui să fie luat în considerare rolul micromediului
medular în generarea rezistenţei la terapiile convenţionale. În acest sens,
este cunoscut faptul că leucemiile acute derivate din SMD reprezintă reale
provocări terapeutice, datorită selecţiei unor clone de celule tumorale cu
fenotip multirezistent şi cu răspuns slab la chimioterapie.
În lumina acestor constatări, scopul acestei teze a fost de a evalua
deficienţele funcţionale ale CSM selectate de la pacienţii cu SMD, prin
comparaţie cu controalele normale; de a explora profilul lor de adeziune, şi
mai apoi, de a evalua substraturile moleculare care stau la baza acestor
deficienţe; iar în final de a realiza corelaţii între aceste disfuncţii cu
3

anomaliile lor de creştere şi cu anomaliile întâlnite la nivelul
compartimentului hematopoietic.
În acest sens, am dezvoltat un protocol de selecţie pentru obţinerea unor
preparate de CSM care respectă standardele stabilite de Mesenchymal and
Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular
Therapy), exploatând expresia diferită faţă de marcherii specifici, STRO-1
şi CD73 ale subpopulaţiilor de CSM.
Evaluarea morfometrică, fenotipică şi funcţională a acestor subseturi
sprijină faptul că fracţia STRO-1 + CD73 - este mai imatură şi este mai utilă
pentru studiile funcţionale. Pe când fracţiile CD73 + , indiferent dacă acestea
sunt pozitive pentru STRO-1 sau nu, sunt mai utile pentru investigarea
marcherilor de aderenţă.
Apoi am evaluat fenotipul lor adeziv şi proliferarea acestor fracţii de CSM
selectate de la pacienţii SMD în raport cu controalele normale, în scopul de
a stabili corelaţii între presupusele lor anomalii şi disfuncţionalităţile
compartimentului hematopoietic.
Testele funcţionale au arătat că CSM selectate de la pacienţii cu SMD sunt
intrinsec patologice, prezentând o importantă scădere a ratei de proliferare
şi o capacitate clonogenică redusă pe parcursul a 14 zile de cultură, în
absenţa semnalelor din partea celulelor hematopoietice. Defectele
funcţionale ale CSM s-au corelat semnificativ cu scăderea expresiei
moleculelor de adeziune CD44 şi CD49e (α5-integrina). Mai mult, şi
potenţialul clonogenic al CPH se pare că este controlat prin mecanisme
dependente de adeziune la stroma, iar α5-integrină ar fi una dintre
moleculele implicate în acest proces.
În cele din urmă, am efectuat experimente de imunofluorescenţă pentru a
evalua două proteine componente ale complexelor de aderenţă focală (AF),
paxilina, şi pFAK [Y397] şi a două proteine reglatorii, HSP90αβ şi
p130CAS, în termeni de reactivitate, intensitate şi localizare celulară.
Microscopia de fluorescenţă a permis identificarea unor diferenţe calitative
şi cantitative ale acestor proteine, iar analiza localizării subcelulare a arătat
că, în CSM patologice, paxilina, pFAK, şi HSP90αβ formează complexe
nucleare. Expresia crescută a paxilinei, pFAK [Y397] şi HSP90αβ, precum
şi puternica lor co-localizarea nucleară s-au asociat unui avantaj
proliferativ în cazul CSM selectate de la pacienţii cu Anemii refractare cu
exces de blaşti (AREB) şi au avut un impact negativ asupra capacităţii
clonogenice a CPH.
4

Aceste rezultate deschid oportunităţi interesante, cum ar fi faptul că
semnalizarea prin intermediul proteinelor AF ar media interacţiunile dintre
CPH-CSM. Având în vedere că FAK este una dintre proteinele cliente ale
HSP90αβ, expresia ei fiind modulată de aceasta, posibilitatea utilizării
inhibitorilor de HSP90αβ ca terapie adjuvantă ar putea reprezenta o
alternativă în SMD.
ARTICOL I – Deficienţe funcţionale intrinseci ale celulelor
mezenchimale stromale în Sindroamele Mielodisplazice
-Stem Cells and Development-
-In press-
Scopul şi obiectivele studiului micromediului medular în mielodisplazii
Trei tipuri morfologice de CSM normale au fost anterior descrise în
culturile primare: a) celule rotunjite; b) celule subţiri, fusiforme; şi c) celule
mari, plate [2], [3], [4], [5], [6], [7].
În ciuda faptului că morfologia lor este cunoscută de multă vreme, până în
prezent, există puţine date limitate cu privire la distribuţia lor în cadrul
populaţiilor de CSM şi la dimensiunile lor. Folosind criterii simple cum ar
fi mărimea şi granularitatea, Zohar et al., a descris două subpopulaţii
majore de CSM. Primul tip cuprinde celule mici, cu FSC şi SSC până în
15%, aflate în repaus în condiţii normale, care nu exprimă marcheri de
diferenţiere şi care au o mare capacitate proliferativă, de auto-reînnoire
după cultivare in vitro şi sunt multipotente. A două populaţie, mult mai
numeroasă, cuprinde celule mari, cu FSC şi SSC peste 15%, nu au
capacitate de auto-reînnoire şi au capacitate proliferativă limitată. [6]. În
acord cu aceste observaţii, Colter et al. afirmă faptul că expansiunea rapidă
a culturilor de CSM este dependentă de prezenţa în cultură a unei populaţii
reduse de celule mici [4].
Cernerea printr-o sită cu pori de 3 µm, a permis, de asemenea, izolarea a
două populaţii. Prima fiind o populaţie de celule cu dimensiuni mai mari de
3 µm. Celulele din această populaţie prezentând morfologie fibroblastică,
capacitate de auto-reînnoire şi multipotenţialitate - caracteristici specifice
ale CSM. Iar a două populaţie de celule fiind alcătuită din celule mai mici
de 3 µm, cu formă poligonală şi capacitate limitată de reînnoire [8].
5

În final, studiul lui Staszkiewicz et al., face referiri la dimensiunile CSM
izolate din ureche notând faptul că acestea variază între 8.1 - 26.6 µm în
diametru ; populaţia majoritară (~ 72%) situându-se între 12 şi 20 µm [9].
Studiul nostru propune:
- un protocol de izolare a CSM care să permită amplificarea lor din
cantităţi reduse de aspirat medular, şi, utilizând celule care prezintă
deficienţe de creştere cum sunt CSM selectate de la pacienţii cu SMD. În
aceast scop, trei medii au fost testate: RPMI 10% FCS, MyeloCult ®
H5100 şi MesenCult ®.
- identificarea in vitro a morfotipurilor subpopulaţiilor de CSM în culturile
primare;
- realizarea unor comparaţii morfologice şi morfometrice între culturile din
SMD şi cele normale.
Capitolul B se referă la evaluarea fenotipică a marcherilor specifici şi de
adeziune exprimaţi de celulele stromale izolate de la pacienţii cu SMD vs.
controalele normale.
Numeroase încercări au fost făcute pentru a îmbunătăţi procedurile de
izolare şi a caracteriza aceste celule, precum şi pentru stabilirea unei
ierarhii în cadrul acestor subpopulaţii de CSM.
Cele mai obişnuite metode de izolare se bazează pe abilitatea acestor celule
de a adera la plastic sau utilizează epitopii de suprafaţă exprimaţi de CSM,
cum ar fi marcherii specifici sau moleculele de adeziune.
Deşi molecula STRO-1 (stromal precursor antigen-1) este considerată a fi
un marcher specific, care apare timpuriu pe suprafaţa celulelor precursoare
mezenchimale, totuşi ea este, de asemenea, exprimată şi pe suprafaţa altor
celule umane medulare, inclusiv pe celule roşii nucleate glycophorin-A + , ca
şi pe o populaţie redusă de celule B CD19 + . Cu toate acestea, ea nu este
exprimată de celulele stem hematopoietice (CSH) [10]. Acest fapt a ridicat
multe întrebări cu privire la utilizarea sa ca marcher de selecţie în
protocoalele de sortare ale CSM [11], [2].
În schimb molecula CD73 (plasma membrane-bound ecto-5’-
5’nucleotidase) a fost propusă în acest scop, fiind considerată în prezent cea
mai utilă moleculă pentru realizarea unor teste funcţionale robuste in vitro
pentru studiul CSM [2].
Cu toate acestea, Simmons et al. a raportat că populaţia de celule STRO-1 + /
glycophorin-A - are o capacitate clonogenică remarcabilă (formând de
6

aproximativ 100 ori mai multe colonii CFU-F faţă de fracţiile neselectate),
fiind capabilă să genereze straturi de celule aderente care conţin diferite
tipuri de celule stromale, incluzând adipocite, celulele musculare netede şi
fibroblaşti. În plus, această populaţie s-a dovedit a fi mai utilă în coculturi,
în sprijinirea dezvoltării normale a lineajului mieloid comparativ cu stroma
generată din măduva nesortată [10]. Recent, Gronthos et al. au adus dovezi
că şi precursorii osteogenici sunt prezenţi în fracţia STRO-1 + a celulelor
medulare umane [12]. Psaltis et al. au constatat, de asemenea, că există o
corelaţie puternică între expresia marcherului STRO-1 cu nivelul de
expresie al mARN pentru factorii de transcripţie implicaţi în proliferarea
celulară şi diferenţiere, de aceea expresia acestui marcher a fost asociată
unui fenotip imatur, stem. [13].
Şi expresia moleculei CD73 a fost descrisă la nivelul mai multor celule, nu
doar la nivelul CSM; rolul său fiziologic fiind de a metaboliza adenozin 5'-
monofosfat (AMP) la adenozina [14]. CD73 acţionează ca o moleculă
transductoare de semnale pentru sistemul imunitar uman (în special,
acţionează ca moleculă co-stimulatoare în activarea limfocitelor T),
dovedindu-se a fi implicată şi în medierea interacţiunilor dintre limfocite şi
celulele endoteliale [15]. În plus s-a constat şi faptul că CD73 este exprimat
şi de o parte dintre celulele tumorale, având rolul de a le proteja de acţiunea
antitumorală a limfocitelor T, acţionând la nivelul axei CD39 (ecto-ATPaza)-CD73
[16]. Mult mai puţin se ştie despre rolul moleculei CD73 în
biologia CSM, totuşi a fost menţionat faptul că ar avea rol în interacţiunile
dintre fibroblaşti şi matricea extracelulară [17].
În ciuda tuturor eforturilor, nu există o părere comună privitoare la expresia
acestor markeri la nivelul diferitelor preparate de CSM; iar parcurgerea
literaturii de specialitate, nu permite nici stabilirea unei eventuale ierarhii
ale CSM bazate pe baza expresiei marcherilor STRO-1 şi CD73.
Un alt marker, care a ridicat numeroase controverse în ceea ce priveşte
expresia sa la nivelul celulelor CSM este molecula CD45. Cu toate acestea,
chiar dacă pe scară largă CSM sunt considerate a fi CD45 negative, există
totuşi şi autori care au raportat că CFU-F sunt CD45 + med / low [18], [19].
În plus, există dovezi că un procent mare de celule CSM proaspăt izolate
exprimă CD45, iar această expresie se pierde aproape complet odată cu
amplificarea lor în cultură de-a lungul mai multor pasaje [9], [7].
În unele articole a fost raportată de asemenea şi prezenţa unor marcheri
endoteliali la nivelul CSM, cum ar fi PECAM-1 (CD31), P-selectina
(CD62P), factorul VIII, şi trombomodulină [20], [21], dar acesta rămâne
încă un punct controversat.
7

În ceea ce priveşte expresia marcherilor de adeziune, este acceptată în mare
măsură expresia moleculelor CD44, CD29, CD105, CD106 la nivelul CSM
[22], [23], [24], [25]. Mult mai puţin investigaţi sunt alţi doi markeri, CD54
(34 citări), CD49e (18 citări), comparativ cu CD44 (262 citări), CD105
(252 citări) şi CD29 (191 citări). În ciuda faptului că aceşti marcheri sunt
profund implicaţi în procesele dependente de adeziune, cum ar fi
proliferarea, capacitatea clonogenică, apoptoza, menţinerea culturilor in
vitro, precum şi în medierea contactelor CPH-la-CSM, am găsit un singur
articol care notează prezenţa anomaliilor de expresie ale CD105 şi CD104
în CSM selectate de la pacienţii cu SMD [26].
Pentru prima dată, acest studiu demonstrează faptul că CSM selectate din
SMD prezintă anomalii de adeziune.
Capitolul C descrie metoda de selecţie pe baza celor doi marcheri specifici
(STRO-1 şi CD73) la nivelul populaţiilor de CSM, prezintă testele
funcţionale şi rezultatele în ceea ce priveşte abilităţile de creştere (potenţial
proliferativ şi clonogenic) ale CSM selectate de la pacienţii cu SMD în
raport cu cele ale voluntarilor sănătoşi.
În final, am realizat corelaţii statistice în vederea stabilirii semnificaţiei
acestor anomalii de aderenţă asupra proliferarii CSM şi asupra potenţialului
clonogenic hematopoietic.
Pe scurt schema experimentului descris în primul articol a fost:
1) CSM au fost izolate din fracţiile de celule mononucleare medulare pe
baza proprietăţii lor de aderare la plastic şi au fost amplificate timp de 30-
35 de zile în cultură.
2) au fost efectuate analize morfologice-morfometrice ale CSM izolate de
la pacienţii cu SMD în raport cu omologii normali.
3) apoi celulele stromale detaşate din mediul de cultură au fost supuse unei
selecţii pozitive în două etape cu scopul de a le discrimina pe baza expresiei
lor pentru marcherii STRO-1 şi CD73.
4) profilele de expresie ale marcherilor specifici (STRO-1, CD73),
marcherilor caracteristici lineajului endotelial (CD106, CD31) şi
marcherilor hematopoietici (CD45, CD16) şi ai moleculelor de adeziune au
fost stabilite prin citometrie în flux şi imunofluorescenţă. Puritatea şi
viabilitatea au fost monitorizate pe parcursul întregului experiment.
Randamentul proliferativ al celulelor precum şi caracteristicile de creştere
au fost evaluate pentru fiecare fracţiune şi pentru CSM selectate din MDS,
comparativ cu controalele normale.
8

5) analiza statistică a fost realizată în final cu scopul de a stabili eventuale
corelaţii între anomaliile fenotipice ale CSM din SMD şi funcţionalitatea
lor şi de a stabili corelaţii cu disfuncţiile compartimentului hematopoietic.
Capitolul A - Aspecte privind comportamentul CSM izolate de la
pacienţii cu SMD în culturile primare şi analiza lor morfometrică
(analize comparative cu omoloagele lor normale)
A.I. Materiale şi Metode
Materiale
MesenCult ® complete medium (StemCell Technologies, Vancouver,
BC, Canada):
- 450 ml MESENCULT BASAL MEDIUM
- 50 ml MESENCHYMAL STEM CELL STIMULATORY
SUPPLEMENTS (Human);
- 1ml Penicilină (10000 U/ml)-Streptomicină (10000 μg/ml) se adaugă
la 100 ml MesenCult Complete Medium (După această etapă termenul
de valabiliate al mediului este limitat la o săptămână conform
protocolului StemCell, dacă este păstrat la 4ºC).
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Sigma-Aldrich)
Methanol (Merck Chemicals Catalog # 106035, Frankfurt, Darmstadt,
Germany)
Giemsa Staining Solution (EMD Chemicals Catalog #R03055, USA)
Fetal calf serum (FCS, GIBCO ® Invitrogen)
Sistemul de achizitie
Inverted (TissueFAXSi ® ) System; TissueGnostics GmbH (Vienna,
Austria)
Metode
Obţinerea culturilor primare de celule stromale
1) Aspirate medulare au fost ficolate cu Lymphoprep TM (centrifugate
la 1500 r/min, 30 minute, 20 o C, acceleraţie-deceleraţie 2);
9

2) Celulele au fost spălate de 2 ori: prima dată cu mediu RPMI şi a
doua oară cu PBS prin centrifugare la 1500 r/min, 10 min;
3) Numărul de celule a fost evaluat utilizând camera Türk;
4) 2 - 2.5 milioane de celule au fost însămânţate în flaskuri de cultură
T25 (25 cm 2 ) în 10 ml MesenCult ® Complete Medium;
5) Flaskurile de cultură au fost incubate la 37 o C în atmosferă cu 95%
aer şi 5% CO 2 ;
După 1-2 zile de cultură, celulele care nu au aderat la flask sau care s-
au detaşat după aderare au fost îndepărtate prin schimbarea mediului: ½
mediu nou cu ½ supernatant de cultură (celulele stromale medulare
fiind separate de celulele hematopoietice pe baza proprietăţii lor de a
adera la suprafeţele de plastic);
6) După aceea mediul a fost schimbat de două ori pe săptămână (½
mediu nou cu ½ supernatant de cultură) până ce s-a obţinut 80%
confluenţă.
7) Culturile de celule astfel amplificate au fost spălate o dată cu RPMI
1640 fără FCS, după îndepărtarea mediului de cultură. Apoi pentru
detaşarea celulelor de pe flask s-a utilizat kitul MesenCult ®
Dissociation (StemCell Technologies): celulele se incubează cu
MesenCult®-ACF Enzymatic Dissociation Solution (Catalog
#05427 ; 2-3 ml / flask de 25cm 2 , încălzită în prealabil), la 37 o C
până ce se desprind celulele (de obicei 2-3 minute; sub control
microscopic).
8) 3 mL MesenCult®-ACF Enzyme Inhibition Solution se adaugă per
flask în final pentru oprirea reacţiei şi apoi celulele au fost colectate
într-un tub conic de 25 mL şi spalate cu 5 mL MesenCult Complete
Medium + 20% FCS.
9) Viabilitatea şi cuantificarea numărului de celule s-a realizat
utilizând tesul de excludere cu trypan blue.
Colorarea culturilor primare de celule stromale
1. Se îndepărtează mediul de cultură.
2. Coloniile aderente se spală de 2 ori cu PBS.
3. 5 mL metanol se adaugă per flask, timp de 5 minute, la temperatura
camerei (metanolul are rolul de a fixa celulele).
4. Apoi metanolul este îndepărtat şi flaskurile se usucă la aer.
5. 5 mL de Giemsa Staining Solution se adaugă în fiecare flask de cultură
timp de 5 minute.
10

6. În final, Giemsa Staining Solution se îndepărtează şi flaskurile de cultură
sunt spălate cu apă distilată pentru îndepărtarea colorantului nefixat.
7. Flaskurile de cultură se usucă în final la temperatura camerei.
Evaluarea culturilor de celule stromale obţinute de la pacienţii cu SMD
vs. controalele normale
Compoziţia straturilor de celule stromale a fost evaluată cu ajutorul unui
microscop inversat după obţinerea a 80% confluenţă.
Evaluarea morfometrică a celulelor stromale în culturi primare
Imaginile au fost achiziţionate în format TIFF cu ajutorul unei camere
PixelLINK PL-A622C/622000227 [Aegis Electronic Grup, Inc.], cu
obiectiv de 20x. Câmpuri (FOV; field of view) cu dimensiuni de 650 x 489
µm, la o rezoluţie de 1600 x 1200 pixeli, au fost achiziţionate din fiecare
flask. Aceste imagini au fost importate în MapInfoProfessional ® 6.5 (Pitney
Bowes Business Insight [formerly MapInfo Corp], USA), în scopul de a
realiza măsurători. Celulele şi nucleele au fost măsurate prin transformarea
pixelilor în µm folosind formula: x [1 pixel / 1 µm în MapInfo] = 0.406µm.
Calibrarea măsurătorilor s-a facut utilizându-se pătratul de 1 mm al camerei
Burker-Türk.
A.II. Rezultate
A.II.1 Evaluarea distribuţiei subpopulaţiilor de CSM în culturile primare
Culturile pe termen lung au fost utilizate pentru evaluarea caracteristicilor
celulelor stromale izolate de la pacienţii cu SMD vs. controale normale,
după amplificare in vitro.
În acest scop s-au utilizat trei sisteme de cultură plecând de la celule
mononucleare medulare umane.
12 controale normale, 35 de cazuri de SMD şi 3 cazuri de LAM-SMD au
fost incluse în studiu după obţinerea consimţământului donatorilor.
În acord cu clasificarea World Health Organization (WHO) din 2008,
încadrarea pacienţilor cu SMD a fost: Refractory cytopenia with unilineage
dysplasia [RCUD] în treisprezece cazuri, Refractory cytopenia with
multilineage dysplasia [RCMD] în nouă cazuri, Refractory anemia with
11

excess blasts-1 [AREB-1] în nouă cazuri, şi Refractory anemia with excess
blasts-2 [AREB-2] în patru cazuri.
Mediul RPMI-1640 suplimentat cu 10% FCS, ca şi mediul MesenCult ®
permit dezvoltarea unor straturi de stromale în absenţa celulelor
hematopoietice [27], [28]. Mediul MyeloCult ® HT5100 permite dezvoltarea
unor straturi de celule stromale cu progenitori hematopoietici [29].
Confluenţa celulară a fost cuantificată pe baza unui scor; scorurile atribuite
fiind între 0 şi 3, corespunzător gradului de confluenţă < 25% (scor 0), 25-
50% (scor 1), 50-70% (scor 2) şi > 75% din aria flaskului de cultură (scor
3).
După patru săptămâni, scorul 3 de confluenţă a fost obţinut pentru toate
culturile de celule normale, în toate cele trei sisteme de cultură.
În Refractory cytopenia, 50% dintre cazuri (11/22) au prezentat deficienţe
de confluenţă, în special în mediul RPMI-1640, dar şi în MyeloCult ®
HT5100:
- confluenţă 0 în două cazuri,
- confluenţă 1 în şase cazuri şi
- confluenţă 2 în trei cazuri.
De asemenea, în cazurile de LAM, am constat confluenţă scăzută (scor 0 şi
1) în două cazuri (2/3), iar în grupul AREB aceste anomalii au fost mult
mai rare şi nu aşa de importante (în 2/13 cazuri, scorul de confluenţă a fost
2).
De notat este şi faptul că straturile de celule stromale de la pacienţii cu
SMD au prezentat liză spontană între zilele 12-48 de cultură (în medie, în
ziua 35), în special în cazul culturilor în RPMI-1640.
A.II.2 Evaluarea morfometrică a CSM în culturile primare
Evaluarea morfometrică a constat din stabilirea:
-tipurilor celulare componente ale straturilor de culturi primare,
-frecvenţei fiecarui tip,
-raportului spaţial dintre ele,
-masurători pentru stabilirea dimensiunilor celulare / nucleare.
Mărimile celulare şi proporţia diferitelor subtipuri morfologice identificate
în culturile primare generate de la pacienţii cu SMD vs. culturile normale
sunt prezentate în Tabelul 1.
12

Tabel 1. Dimensiunile medii şi proporţiile dintre cele trei subpopulaţii de CSM
medulare amplificate timp de 30-35 zile de cultură, selectate de la pacienţii cu SMD vs.
donatorii sănătoşi
Culturi
primare de
CSM a
Subpopulaţiile de
CSM
Procentele
Dimensiunile b
L/l (μm)
Normal Rotunde 4.3±0.1 17.6±5.9 / 15.0±3.3
n=8 Fuziforme 21.7±1.6 135.2±49.7 / 18.8±7.5
Mari, poligonale 73.9±6 83.8±27.5 / 38.4±18.0
CR Rotunde 8.5±0.1 15.4±5.6 / 12.0±4.0
n=10 Fuziforme 36.6±0.8 111.3±15.7 / 7.6±2.8
Mari, poligonale 54.8±0.5 39.2±38.7 / 20.4±10.7
AREB Rotunde 16.7±0.9 16.1±2.1 / 13.4±2.6
n=10 Fuziforme 24.8±2.8 164.7±96.5 / 25.4±11.4
Mari, poligonale 58.4±7.7 109.1±50.1 / 56.5±27.9
a Normal = culturi de CSM de la donatorii sănătoşi; CR = culturi de CSM de la pacienţii cu
citopenii refractare; AREB = culturi de CSM de la pacienţii cu citopenii refractare cu exces
de blaşti.
b Dimensiunile medii au fost stabilite pe baza analizei a n round = 15, n spindle-shaped = 50, şi n
large flat = celule din fiecare grup studiat.
Valorile îngroşate reflectă principalele diferenţe, în termen de distribuţie şi mărime, între
principalele subtipuri de celule stromale identificate în stările patologice comparativ cu
omoloagele lor normale.
13

Capitolul B – Fenotipul celulelor stromale medulare (analize
comparative între celulele din SMD şi cele normale)
B.I. Materiale şi Metode
Materiale
MesenCult ® Dissociation Kit (StemCell Technologies)
Ser fetal de viţel (FCS, GIBCO ® Invitrogen)
MesenCult ® complete medium (StemCell Technologies, Vancouver, BC,
Canada)
Filtre de 70-μm (Falcon, Becton Dickinson)
Solutie de Trypan blue (0.4% PBS)
Tampon de spălare (PBS containing 1% FCS, and 0.05% EDTA)
Iodură de Propidium (PI, Sigma, Poole, UK)
Paraformaldehyde 4% w/v (Merck Chemicals Catalog, Frankfurt,
Darmstadt, Germany)
Soluţie de tampon pentru spălări şi diluţii ale anticorpilor (Ab; Antibody
buffer) care conţine:
PBS (1x) / FCS (1% w/v) / BSA (bovine serum albumin, Sigma-Aldrich,
St Louis, MO, USA, 0.1% w/v)
Triton X-100 (Sigma-Aldrich)
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole) (Sigma)
Mediu de montare a lamelor: Faramount Aqueous Mounting Medium
(Dako Denmark)
Sisteme de achiziţie
FACS Canto I flow cytometer; BD Biosciences (San Jose, USA)
TissueFAXS ® ) System; TissueGnostics GmbH (Vienna, Austria)
DM Microscop; Leica (Heidelberg, Germany)
Metode
Imunofenotiparea CSM medulare prin citometrie în flux
14

CSM amplificate timp de 30 - 35 zile au fost detaşate din flaskurile de
cultură cu ajutorul MesenCult ® Dissociation Kit, colectate în tuburi de
sticlă conţinând 5 mL MesenCult ® îmbogăţit cu 20% FCS şi filtrate prin
filtre de 70 μm diametru. Numărul de celule a fost evaluat utilizând soluţia
de trypan blue (0.4% în PBS). Apoi celulele au fost resuspensionate în 50
µL tampon de spălare şi marcate, pe gheaţă timp de 30 minute. Datele
despre anticorpii utilizaţi sunt prezentate în detaliu în Tabelul 2.
Viabilitatea celulară a fost evaluată după marcarea cu 1 µL PI (sol. 1
mg/ml), înainte de achiziţia datelor.
Pentru achiziţia datelor s-a utilizat un citometru FACS Canto I; programul
de analiză fiind DIVA software (Becton Dickinson).
Tabel 2. Clone anticorpi, izotipuri şi surse
Nume Sursa Clona Conjugat Izotip
Marcheri specifici CSM
anti-
STRO-1
Santa Cruz
Biotechnology
sc-
47733
FITC
Mouse
IgM
anti-CD73 BD
Pharmingen TM AD2 PE Mouse
IgG1
Marcheri endoteliali
anti-CD31 BD
Pharmingen TM
M89D
3
Alexa
Fluor®
Mouse
IgG2a
anti-
CD106
BD
51-
Pharmingen TM 10C9
488
FITC
Mouse
IgG1
2D1 PerCP Mouse
B73.1 PE-Cy 7 Mouse
MAR4 PE-Cy TM 5 Mouse
HA58 APC Mouse
515 PE Mouse
Marcheri hematopoietici
anti-CD45 BD
Pharmingen TM TM IgG1
anti-CD16 BD
Pharmingen TM IgG1
Marcheri de adeziune
anti-CD29 BD
Pharmingen TM IgG1
anti-CD54 BD
Pharmingen TM IgG1
anti-CD44 BD
Pharmingen TM IgG1
anti-
BD
IIA1 PE Mouse
CD49e Pharmingen TM IgG1
anti-
BD
55- PE
Mouse
CD144 Pharmingen TM 7H1
IgG1
15

Evaluarea subpopulaţiilor de celule CSM medulare normale prin
imunofluorescenţă
a) pe lame de cultură
Celulele cultivate în camere Lab-Tek au fost spălate bine pentru înlăturarea
mediului rezidual şi apoi fixate în paraformaldehidă 4% w/v, timp de 10
minute la temperatura camerei. Fixarea a fost oprită prin spălarea celulelor
de 3 ori cu PBS, pH 7.2. Marcarea nespecifică a fost blocată prin tratarea
preparatelor cu antibody (Ab) buffer timp de 1 h.
Celulele au fost apoi permeabilizate utilizând soluţie Triton X-100 (0.1% în
PBS) timp de 20 minute înainte de aplicarea anticorpilor. Anticorpii au fost
diluaţi în Ab buffer astfel: FITC-conjugated mouse anti-human STRO-1
mAb (diluţie finală 1:50) şi PE-conjugated mouse anti-human CD73 mAb
(diluţie finală 1:25). Înainte de achiziţie s-a realizat marcajul nuclear cu
4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 μg/ml) timp de 30 minute la 4 °C.
Lamele au fost fixate în Faramount Aqueous Mounting Medium.
b) pe preparate citospin
Celulele rămase după achiziţia flow-citometrică au fost centrifugate şi
resuspendate în soluţie PBS tamponat cu paraformaldehidă 4% şi conţinând
10 µg/mL DAPI, astfel încât concentraţia finală a fost de 5000 celule /µL.
10 µL din această suspensie au fost plasaţi pe o lamă de sticlă şi acoperiţi
cu o lamelă.
Preparatele dublu marcate au fost evaluate cu ajutorul unui microscop DM
Microscope (Leica, Heidelberg, Germany) la o mărire de 40 x, respectiv
100 x.
B.II. Rezultate
Celulele CD73 + selectate din straturile de stromale ale culturilor primare au
fost lăsate să ajungă la confluenţă timp de două săptămâni în camere Lab-
Tek şi apoi au fost imunomarcate cu marcheri specifici (STRO-1 şi CD73),
marcheri endoteliali (CD31, CD106) şi doi marcheri de aderenţă (CD44 şi
CD144).
16

B.II.1 Caracterizarea flow-citometrică a CSM amplificate in vitro timp de
30-35 de zile
Pe baza caracterelor de mărime şi pe baza expresiei faţă de marcherii
specifici STRO-1 şi CD73 s-au identificat trei subpopulaţii de celule
stromale în culturile primare.
În plus, în vederea stabilirii dimensiunilor celulelor CSM prin citometrie în
flux, o standardizare a FSC a fost realizată utilizând două tipuri de bile de
referinţă cu mărimi de 4 µm şi 6 µm, care au fost achiziţionate în paralel cu
celulele (Figura 1).
Strategia de analiză a implicat realizarea unei ferestre pe populaţia de
singleţi, urmată de excluderea celulelor ne-viabile PI + şi în final realizarea
de porţi utilizând expresia celulară pentru marcherii specifici.
În termen de mărime, celulele mai mici de 50 pe scala FSC (cu mărime
aproximativă ca şi bilele de 4 µm) au fost considerate FSC low , cele aflate în
apropierea valorii 50 pe scala FSC (situate între bilele de 4 şi 6 µm) au fost
desemnate FSC med , iar cele cu FSC mai mare de 50 (mai mari decât bilele
de 6 µm) au fost considerate FSC hi .
Populaţia STRO-1 + CD73 - a fost predominant FSC low şi a fost asimilată
populaţiei de celule mici, rotunde identificată prin analiza morfometrică.
Populaţia de celule dublu-pozitive pentru STRO-1 şi CD73 a fost
predominant FSC med , iar cea STRO-1 - CD73 + a prezentat valori variabile
pentru FSC. Această observaţie ne-a condus la ideea că nu se poate realiza
o delimitare clară a acestor subpopulaţii doar pe baza mărimii lor, ci un
marcaj suplimentar cu marcheri specifici ar fi necesar în acest scop.
Expresia fenotipică a celor doi marcheri STRO-1 şi CD73, precum şi
morfologia celulară au fost confirmate prin imagini de microscopie de
fluorescenţă. Proporţiile celor trei subtipuri celulare la momente diferite de
cultură, atât în cazul celulelor normale, cât şi în cazul celulelor selectate de
la pacienţii cu SMD, au fost evaluate prin citometrie în flux şi sunt
prezentate în Tabelul 3.
17

Figura 1. Caracterizarea celulelor CSM medulare normale amplificate timp de 30-35
de zile în cultură primară, evaluată prin citometrie în flux: În funcţie de mărimea şi
expresia lor pentru marcherii STRO-1 şi CD73 s-au identificat trei subtipuri de CSM:
FSC low STRO-1 +low CD73 - (roşu), FSC med STRO-1 + CD73 + (verde) şi FSC var STRO-1 - CD73 +
(albastru). Două tipuri de bile de referinţă de 4 µm şi 6 µm au fost achiziţionate în paralel
pentru standardizarea FSC.
18

Tabel 3. Subpopulaţiile de celule CSM medulare normale şi din SMD evaluate pe
parcursul a 60 de zile de cultură utilizând citometria în flux
Culturi
primare
de CSM
Normal
CSM
Subpopulaţia
de CSM
STRO-1 + CD73 -
%
Val. absolută*
STRO-1 + CD73 +
%
Val. absolută *
STRO-1 - CD73 +
%
Val. absolută *
CR STRO-1 + CD73 -
%
Val. absolută *
STRO-1 + CD73 +
%
Val. absolută *
STRO-1 - CD73 +
%
Val. absolută *
AREB STRO-1 + CD73 -
%
Val. absolută *
STRO-1 + CD73 +
%
Val. absolută *
STRO-1 - CD73 +
%
Val. absolută *
Ziua 10 Ziua 20 Ziua 30 Ziua 40 Ziua 60
5.0±2.5
1.0±0.5
17.0±9.9
3.4±2.0
78.0±11.6
15.6±2.3
7.3±1.5
1.5±0.3
20.9±2.6
4.2±0.5
71.8±7.1
14.3±1.4
6.1±3.3
1.2±0.7
18.1±1.5
3.6±0.3
75.8±5.7
15.2±1.1
22.0±9.2
4.4±1.8
25.8±6.4
5.2±1.3
52.2±9.1
10.4±1.8
13.8±5
2.7±1.0
20.4±9.8
4.1±2.0
65.8±12.7
13.2±2.5
64.7±9.0
12.9±1.8
6.8±3.2
1.4±0.6
28.5±7.4
5.7±1.5
12.9±6.9
2.6±1.4
21.7±3.3
4.3±0.7
65.4±9
13.1±1.8
19.5±5.5
3.9±1.1
27.6±5.0
5.5±1.0
52.9±6.6
10.6±1.3
45.4±9.0
9.1±1.8
14.0±5.8
2.8±1.2
40.6±9.5
8.1±1.9
16.4±6.7
3.3±1.3
24.2±5.9
4.8±1.2
59.4±11.3
11.9±2.3
10.7±2.8
2.1±0.6
43.0±10.2
8.6±2.0
46.3±7.9
9.3±1.6
15.0±4.1
3.0±0.8
18.0±4.1
3.6±0.8
67.0±7.0
13.4±1.4
21.9±3.2
4.4±0.6
0.7±0.2
0.1±0.01
77.4±3.4
15.5±0.7
15.3±4.1
3.1±0.8
39.5±5.1
7.9±1.0
45.2±6.9
9.0±1.4
6.6±1.4
1.3±0.3
24.2±7.1
4.8±1.4
69.2±13.6
13.9±2.7
Valorile reprezintă procentele medii şi valorile absolute ± SD a opt experimente distincte.
*valoarea absolută = media valorii obtinute x 10 3 . Nivelul de semnificaţie statistică a fost
de P < 0.05. Valorile îngroşate reflectă diferenţele majore, în termen de distribuţie a celor
trei subpopulaţii de CSM discriminate pe baza expresiei marcherilor specifici, în SMD
vs.controalele normale.
Analiza imunofenotipică a expresiei marcherilor hematopoietici şi
endoteliali evidentiază faptul că subpopulaţiile de celule STRO-1 + (STRO-
1 + CD73 - şi STRO-1 + CD73 + ) izolate atât din măduvele normale cât şi din
SMD sunt CD45 +low (MFIR=2.55±0.78, n=20, p

p

B.II.2 Evaluarea marcherilor de adeziune exprimaţi de CSM
Profilul de adeziune al CSM izolate din SMD comparativ cu celulele
normale, după amplificare in vitro, a fost evaluat utilizându-se următoarea
combinaţie de anticorpi monoclonali (mAbs): VLA 5 sau α-5 β1 integrin
(CD49e, CD29), ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) sau CD54 şi
proteina de adeziune la matricea extracelulară (CD44) (Figura 3).
Testele au fost realizate pe celule amplificate timp 20 de zile în cultură,
valorile medii prezentate în Tabelul 4 fiind media a cinci experimente
diferite.
Nivelele de expresie pentru diferiţi marcheri au fost cuantificate cu ajutorul
valorilor MFIR (median fluorescence intensity ratio), în scopul de a realiza
analize statistice.
În acest studiu, am considerat lipsa de expresie a unui marcher în cazul
valorii MFIR < 2, expresie redusă sau medie dacă MFIR a fost între 2 şi 10
şi expresie intens pozitivă dacă MFIR a fost >10.
21

Figura 3. Profilul de expresie al marcherilor de adeziune exprimaţi de CSM izolate de
la pacienţii cu SMD comparativ cu cele ale martorilor sănătoşi
Exemple reprezentative care ilustrează expresia diferiţilor marcheri de adeziune la nivelul
subpopulaţiilor celulare STRO-1 + CD73 + (verde) şi STRO-1 - CD73 + (albastru) comparativ
cu controalele izotipice (gri).
22

Tabel 4. Rezumatul profilelor de adeziune ale CSM normale şi displazice
CD29 CD54 CD44 CD49e
% de
celule
CD29 + MFIR % de
celule
CD54 + MFIR % de
celule
CD44 + MFIR % de
celule
CD49e +
Normal STRO-1 +
45.6± 27.2± 18.3± 34.6± 3.6± 38.0±
CD73 - 29.4±
11.0 13.4 9.0 4.1 12.6 1.9 15.7
STRO-1 +
34.3± 134.8± 30.3± 46.2± 32.0± 55.2± 28.6±
CD73 + 46.7 46.7 32.8 17.7 16.6 21.7 4.0
STRO-1 -
66.3±
CD73 + 14.8
CR STRO-1 +
9.9±
CD73 - 3.5
STRO-1 +
12.6±
CD73 + 5.2
STRO-1 -
82.7±
CD73 + 7.6
AREB STRO-1 +
59.2±
CD73 - 7.7
STRO-1 +
6.6±
CD73 + 2.4
STRO-1 -
40.3±
CD73 + 10.3
102.4±
25.9
44.2±
20.2
54.6±
18.1
28.6±
9.0
18.2±
4.1
43.2±
14.6
54.5±
18.9
64.8±
12.7
7.9±
3.6
10.9±
4.9
79.8±
9.8
56.2±
4.5
7.1±
2.9
37.6±
11.1
30.8±
12.4
12.1±
3.5
21.7±
5.3
12.4±
5.6
22.1±
5.2
28.7±
10.2
23.0±
5.0
72.4±
16.9
18.6±
8.8
8.9±
1.9
81.5±
17.6
73.7±
15.6
5.6±
3.2
20.7±
3.0
69.6±
22.9
4.8±
2.7
9.2±
3.9
6.4±
2.6
2.5±
0.8
12.5±
1.7
19.1±
5.5
70.9±
11.0
14.0±
5.2
13.9±
8.8
69.7±
7.3
71.2±
13.7
4.9±
0.3
36.6±
12.6
MFIR
4.3±
2.6
31.3±
3.7
31.2±
16.9
6.0±
1.6
19.6±
5.9
15.8±
4.7
3.8±
1.3
15.4±
2.5
9.6±
5.3
Valorile reprezintă media MFIR a marcherilor de adeziune ± SD calculată pentru 5
experimente diferite; pentru fiecare subpopulaţie şi grup de cazuri în parte; după 20 de zile
de cultură. Nivelul de semnificaţie statistică a fost P < 0.001. Valorile îngroşate reflectă
diferenţele cele mai semnificative, în termen de intensitate de expresie, pentru marcherii de
adeziune.
În condiţii normale, din punct de vedere al expresiei marcherilor de
adeziune, straturile de celule stromale conţin două subpopulaţii majore.
Celulele STRO-1 + CD73 - care prezintă nivele scăzute de expresie pentru
marcherii de adeziune analizaţi: CD44, CD54, CD29 şi CD49e.
Si celulele CD73 + care, spre deosebire subpopulaţia anterioară exprimă
aceşti marcheri cu nivele crescute de expresie.
Această expresie diferită pentru marcherii de adeziune ar putea fi amprenta
unor stadii diferite de diferenţiere în cadrul populaţiei de CSM şi sprijină
ideea că celulele din fracţia STRO-1 + ar conţine precursorii mai imaturi.
De asemenea ar putea fi expresia unor populaţii cu roluri distincte în cadrul
coloniei de CSM [30].
În cazul preparatelor izolate de la pacienţii cu SMD, subseturile de celule
CD73 + , fie că exprimă sau nu STRO-1, au prezentat o reducere
semnificativă a marcherilor CD54 şi CD29 (de aproximativ 2 şi respectiv
23

3.5 ori comparativ cu celulele normale), dar aceste modificări nu au atins
nivelul semnificaţiei statistice.
În schimb, diferenţe semnificative au fost constatate în cazul marcherilor
CD44 şi CD49e. Scăderea antigenului CD44 a fost substanţială atât în cazul
celulelor STRO-1 - CD73 + (11 ori), cât şi a celulelor STRO-1 + CD73 + (6 ori)
izolate din grupul CR (p=0.001), dar mai puţin importantă în cazul
omoloagelor lor din grupul AREB (3.5 ori şi respectiv 4 ori ; p

Capitolul C – Particularităţi de creştere ale CSM medulare selectate de
la pacienţii cu SMD vs. CSM normale
C.I. Materiale şi Metode
Materiale
EasySep ® FITC Selection Kit (StemCell Technologies)
EasySep ® PE Selection Kit (StemCell Technologies)
EasySep ® magnet (StemCell Technologies)
MesenCult ® complete medium (StemCell Technologies, Vancouver, BC,
Canada)
Soluţie de Trypan blue (0.4% PBS)
Iodură de Propidium (PI, Sigma, Poole, UK)
Metanol (Merck Chemicals Catalog # 106035, Frankfurt, Darmstadt,
Germany)
Colorant Giemsa (EMD Chemicals Catalog #R03055, USA)
Plăci de cultură de 35-mm (StemCell Technologies)
Mediu MethoCult ® H4434 (StemCell Technologies)
Sisteme de achiziţie
TissueFAXS ® System; TissueGnostics GmbH (Vienna, Austria)
Metode
Selecţia imunomagnetică a CSM STRO-1 + şi CD73 + prin metoda
EasySep
Pentru a confirma faptul că marcherii STRO-1 şi CD73 discriminează
subpopulaţii celulare funcţional distincte am realizat o sortare
imunomagnetică pozitivă a acestor celule pe baza acestor marcheri. Fracţia
de celule STRO-1 + CD73 - a fost separată de cea STRO-1 + CD73 + prin
exploatarea diferenţelor de densitate şi aviditatea anticorpului pentru
epitopul STRO-1 (Figura 4).
25

Figura 4. Strategia experimentală a selecţiei imunomagnetice pe baza marcherilor
STRO-1 / CD73
Astfel, celulele CSM desprinse din flaskurile de cultură, au fost tratate cu
anticorpul anti-Human CD32 (Fcγ RII) pentru blocarea legării nespecifice
şi apoi au fost marcate cu anticorpul FITC-conjugated mouse Anti-Human
STRO-1, 3.0 μg/ml pentru 10 7 celule, timp de 1 oră pe gheaţă. Celulele au
fost procesate ulterior conform instrucţiunilor producătorului utilizându-se
EasySep ® FITC Selection Cocktail (100 μg/ml celule), EasySep ® Magnetic
Nanoparticles şi magnetul EasySep ® (StemCell Technologies). După
izolarea fracţiei de celule STRO-1 pozitive, celulele rămase au fost marcate
cu PE-conjugated mouse Anti-Human CD73 mAb (BD Pharmingen; 3.0
μg/ml pentru 10 7 celule), timp de 1 oră, pe gheaţă şi apoi au fost procesate
conform etapelor descrise anterior, utilizându-se EasySep ® PE Selection
Kit (StemCell Technologies) în scopul de a izola cea de-a doua populaţie
de celule, celulele CD73-pozitive. Toate etapele de selecţie au fost
monitorizate prin flow-citometrie pentru evaluarea purităţii şi viabilităţii.
Viabilitaţile iniţiale ale fracţiilor STRO-1 + CD73 - şi STRO-1 - CD73 + , după
detaşarea lor din cultură au fost în jur de 79.6±10.6% pentru celulele
normale, 77.6±7.26% pentru stromalele din CR şi 67.4±10.2% pentru cele
din AREB.
După selecţie, fracţiile STRO-1 + şi CD73 + au fost îmbogăţite peste 95%
(96.34±2.26 pentru STRO-1 + şi 97.74±0.95 pentru celulele CD73 + );
procentele au fost evaluate din evenimentele înregistrate în fereastra de
singleţi după excluderea celulelor non-viabile PI + .
Patru reprize de selecţie au fost realizate pentru fiecare populaţie sortată.
26

Caracteristicile de creştere ale populaţiilor sortate
Pentru a evalua proprietăţile funcţionale ale celor două subpopulaţii majore
de CSM, STRO-1 + CD73 - şi STRO-1 - CD73 + , au fost realizate teste de
proliferare şi clonogenicitate.
Astfel, 1x10 3 CSM viabile (cuantificate utilizând testul de excludere cu
trypan blue) au fost cultivate în flaskuri T25-cm 2 şi apoi au fost realizate
numărători de celule în zilele 1, 7 şi 14 de cultură.
Apoi au fost calculaţi indicii de proliferare (diferenţa dintre numărul de
celule evaluat la momentul final (ziua 14) şi numărul iniţial de celule
cultivate) şi timpii de dedublare (timp de dedublare = durata unei mitoze)
estimaţi prin raportul dintre timpul necesar pentru ca 1x10 3 CSM să atingă
80% confluenţă şi numărul de populaţii dedublate. Numărul de populaţii
dedublate a fost obţinut pe baza formulei: n = log (x/y) / log2, unde “x”
reprezintă numărul iniţial de CSM puse în cultură şi “y” reprezintă numărul
de celule la momentul încheierii experimentului (ziua 14) [23], [24].
Potenţialul clonogenic al CSM a fost evaluat pe baza eficienţei de peletare
(PE) = randamentului de însămânţare, utilizându-se testul CFU efficiency
assay. După 14 zile de cultură mediul a fost îndepărtat, coloniile au fost
fixate cu metanol şi colorate Giemsa. Numărul de colonii a fost apoi
cuantificat. O colonie a fost definită ca fiind compusă din cel puţin 50 de
celule.
PE a fost stabilit pe baza raportului dintre numărul de colonii formate şi
numărul iniţial de celule însămânţate în cultură x 100%. [25].
Teste pentru evaluarea clonogenicităţii CPH
(Human hematopoietic CFC assays)
Pentru a evalua potenţialul clonogenic al celulelor progenitoare
hematopoietice (CPH), 1.25x10 4 celule mononucleare ficolate din
aspiratele medulare au fost resuspendate în 1.2 ml MethoCult ® (StemCell
Technologies) şi cultivate la 37 °C în atmosferă controlată ( 5% CO 2 ) în
plăci de cultură de 35-mm (StemCell Technologies) timp de 14 zile.
Fiecare probă a fost procesată în duplicat. Numărul de colonii formate a
fost evaluat prin microscopie optică în zilele 7 şi 14 de cultură.
27

C.II. Rezultate
C.II.1. Proprietăţile funcţionale ale subpopulaţiilor de CSM STRO-1 +
CD73 - şi STRO-1 - CD73 + selectate din SMD comparativ cu celulele
selectate de la voluntarii sănătoşi
Această etapă a studiului a utilizat, aşa cum am menţionat şi anterior,
populaţii de celule sortate pe baza expresiei lor pentru marcherii STRO-1 şi
CD73. Această selecţie a avut rolul de a reduce erorile rezultate din
compararea unor populaţii de celule stromale cu compoziţii diferite cum
sunt cele obţinute după detaşarea lor din culturile primare.
În controalele normale, testele de proliferare pentru fracţiile STRO-
1 + CD73 - şi STRO-1 - CD73 + au relevat existenţa a două faze de proliferare, o
fază iniţială de creştere în platou, în primele 7 zile de cultură şi o creştere
exponenţială în următoarele 7 zile. Fracţiile STRO-1 + CD73 - au proliferat
mai eficient decât cele STRO-1 - CD73 + (Figura 5 E). Media indicilor de
proliferare pentru celulele STRO-1 + CD73 - a fost de 200.0 ± 32.45 vs. 77.99
± 19.85 pentru cele STRO-1 - CD73 + la momentul finalizării culturilor
(Figurile 5 C, D), iar randamentul de însămânţare pentru celulele STRO-
1 + CD73 - a fost de 7.5 % ± 1.28 %, comparativ cu 4.83 % ± 1.48 % în
fracţia STRO-1 - CD73 + , pentru 10 3 celule sedimentate (Figurile 5 A, B).
Producţia de CSM în culturile de celule STRO-1 + şi CD73 + selectate din
aspiratele medulare de la pacienţii cu SMD s-a dovedit a fi deficitară
(Figurile 5 C, D, E). Media indicilor de proliferare a CSM selectate de la
pacienţii cu CR, după 2 săptămâni de cultură a fost de 17 ori mai mică în
cazul fracţiilor STRO-1 + şi de 2.23 ori mai mică pentru fracţiile CD73 + ,
comparativ cu mediile calculate pentru omologele lor normale (Figura 5 C,
D, E).
O scădere de 6.5 ori în cazul fracţiei STRO-1 + şi de 2.4 ori pentru fracţia
CD73 + a fost înregistrată în grupul AREB (Figurile 5 C, D, E).
În plus, şi abilitatea de a forma colonii a fracţiilor selectate de la pacienţii
cu SMD a fost puternic diminuată, diferenţe importante comparativ cu
fracţiile normale fiind înregistrate în cazul celulelor STRO-1 + CD73 - .
Astfel, celulele CSM selectate din grupul CR au prezentat o capacitate
clonogenică de 3.5 ori mai mică pentru fracţia STRO-1 + CD73 - şi de
aproximativ de 2 ori mai mică pentru celulele STRO-1 - CD73 + comparativ
cu normalul. Acelaşi declin s-a constatat şi în cazul celulelor selectate din
grupul AREB comparativ cu controalele normale (fiind de aproximativ de 4
28

Doubling time (days)
Proliferation index
Proliferation index
CFU-F No. / 10 3 STRO-1 + cells
CFU-F No. / 10 3 CD73 + cells
ori mai redusă pentru fracţia STRO-1 + CD73 - şi de 1.65 ori mai mică pentru
celulele STRO-1 - CD73 + ) (Figurile 5 A, B).
În concluzie, nivelele relative de proliferare ale celulelor selectate de la
pacienţii cu SMD sunt rezultatul unui proces de diviziune continuu, cu o
rată scăzută de proliferare şi fără a avea capacitatea funcţională de a forma
colonii (proporţia de clustere [

C.II.2. Scăderea expresiei marcherilor de aderenţă s-a corelat negativ cu
proprietăţile funcţionale ale CSM în cazurile de SMD
Pentru a stabili impactul anomaliilor de adeziune asupra integrităţii
funcţionale a CSM, corelaţii statistice au fost realizate cu parametrii lor
funcţionali.
O primă concluzie care a rezultat din această analiză a fost că, în ciuda
descreşterii expresiei marcherilor CD54 şi CD29 la nivelul CSM displazice,
nu s-au obţinut corelaţii statistice semnificative între aceşti marcheri şi
deficienţele lor funcţionale.
Însă corelaţii statistice s-au obţinut pentru celelalte două molecule de
adeziune investigate CD44 şi CD49e.
După cum indică şi Figura 6 A, o relaţie pozitivă a fost observată între
descreşterea intensităţii de expresie a marcherului CD44 la nivelul
subpopulaţiei STRO-1 + CD73 + din CR şi AREB şi eficienţa clonogenică
(numărul de CFU) determinată pentru fracţiile CD73 + selectate de la aceşti
pacienţi.
Mai mult decât atât, şi timpii de dedublare calculaţi pentru fracţiile STRO-
1 + şi CD73 + selectate de la pacienţii cu AREB s-au corelat invers cu nivelul
de expresie al moleculei CD49e la nivelul subpopulaţiilor STRO-1 + CD73 +
şi STRO-1 - CD73 + (Figura 6 B).
Aceste observaţii sprijină ipoteza că expansiunea CSM este un process
dependent de adeziune şi că moleculele CD44 şi CD49e sunt implicate în
acest proces.
A/ Eficienţa de peletare a celulelor CD73 pozitive selectate de la
pacienţii cu SMD vs. intensitatea de expresie a marcherului CD44 la
nivelul acestor celule
CR
AREB
30

B/ Potenţialul proliferativ al fracţiilor STRO-1 + şi CD73 + selectate de la
pacienţii cu AREB vs. intensitatea de expresie a marcherului CD49e
Figura 6. Semnificaţia expresiei marcherilor CD44 şi CD49e la nivelul CSM selectate
din SMD asupra parametrilor lor funcţionali
Nivele crescute de expresie ale marcherului CD44 pe populaţia STRO-1 + CD73 + selectată
din SMD s-a corelat pozitiv cu potenţialul lor clonogenic. Eficienţa CFU a celulelor CD73 +
a fost evaluată pentru 1x10 3 celule însămânţate (A). Un nivel crescut de expresie al
marcherului CD49e la nivelul subpopulaţiilor STRO-1 + CD73 + şi STRO-1 - CD73 + s-a
corelat direct cu capacitatea lor proliferativă (B).
C.II.3. Declinul CD49e pe suprafaţa CSM s-a corelat direct cu diminuarea
potenţialului clonogenic al CPH la pacienţii cu SMD
În mod similar am investigat şi semnificaţia expresiei acestor marcheri de
adeziune de la nivelul CSM asupra funcţionalităţii compartimentului conex,
al celulelor hematopoietice.
Astfel, o descreştere de aproximativ 1.5 ori a expresiei α5-integrinei la
nivelul fracţiilor de celule STRO-1 + CD73 + şi STRO-1 - CD73 + din grupul
CR s-a corelat semnificativ cu descreşterea potenţialului clonogenic al
precursorilor mieloizi (de 1.3 ori) şi al precursorilor eritroizi (de 2.5 ori)
(Figura 7).
31

Şi în grupul AREB s-a remarcat o relaţie directă între scăderea MFIR
pentru CD49e la nivelul CSM (de aproximativ 2 ori) şi declinul numărului
de colonii CFU-GM şi BFU-E (de 2 ori) (Figura 7).
Aceste observaţii susţin rolul important al stromei în menţinerea capacităţii
funcţionale normale şi în dezvoltarea precursorilor hematopoietici, precum
şi faptul că acestea sunt procese α5-integrin-dependente. Analiza statistică
reflectă faptul că expansiunea celulelor mieloide este cea mai afectată în
această relaţie.
Figura 7. Expresia moleculei CD49e la nivelul celulelor stromale patologice şi impactul
ei asupra potenţialului clonogenic al precursorilor hematopoietici
Ambele grafice prezintă numărul mediu de colonii BFU-E şi CFU-GM cuantificate în
grupul CR (graficul din stânga) şi în AREB (graficul din dreapta) comparativ cu celulele
normale; în relaţie cu expresia marcherului CD49e la nivelul subpopulaţiilor de CSM
STRO-1 + CD73 + şi STRO-1 - CD73 + . Expresia marcherului CD49e la nivelul CSM
(reprezentată prin coloane; valorile sunt prezentate pe scala din stânga) s-a corelat direct
cu scăderea numărului de BFU-E (linia intreruptă) şi a numărului de CFU-GM (linia
continuă) (valorile sunt reprezentate pe scala din dreapta).
32

ARTICOL II – Anomaliile proteinelor de adeziune focală la nivelul
celulelor mezenchimale stromale mielodisplazice
Introducere
-Experimental Cell Research-
-Vol. 317 (2011) 2616 – 2629-
Contactele directe dintre HPCs şi celulele stromale din micromediu sunt
esenţiale pentru menţinerea "stemness".
Se ştie în prezent faptul că proteinele de adeziune focală sunt implicate întro
varietate largă de tumori solide umane în transmiterea semnalelor de
supravieţuire celulară.
În prezentul studiu am analizat nivelele de expresie şi localizarea celulară a
proteinelor de adeziune focală la nivelul stromei displazice prin comparaţie
cu stroma normală, pentru a determina dacă expresia lor se corelează cu
progresia tumorală.
În acest scop celulele stromale mezenchimale (CSM) CD73 + au fost
imunomarcate pentru paxilină, pFAK [Y 397 ], HSP90α/β şi p130CAS şi
analizate din punct de vedere al expresiei, intensitatii de expresie şi
localizării lor celulare.
Microscopia de fluorescenţă ne-a permis identificarea unor diferenţe de
expresie calitative şi cantitative a acestor proteine în SMD comparativ cu
celulele normale, iar analiza localizării subcelulare a evidenţiat faptul că
trei dintre aceste proteine, paxilina, pFAK [Y 397 ] şi HSP90α/β formează
complexe moleculare cu localizare nucleară.
Aceste experimente au pus în evidenţă şi faptul că există o relaţie strânsă
între nivelele de expresie ale proteinelor AF şi co-localizarea lor nucleară
cu potenţialul proliferativ al CSM.
În plus, nivele crescute de pFAK [Y 397 ] în CSM izolate de la pacienţii cu
SMD s-au corelat invers cu capacitatea clonogenica a CPH izolate de la
aceleaşi cazuri.
Per ansamblu, rezultatele noastre sugerează faptul că evaluarea expresiei
proteinelor AF în CSM în asociere cu testele de clonalitate ale CPH ar
putea fi o unealtă utilă pentru identificarea pacienţilor cu SMD cu risc
crescut de progresie a bolii şi ar putea ghida terapia acestor cazuri.
33

Capitolul D – Evaluarea proteinelor componente ale complexelor de
aderenţă focală la nivelul CSM CD73 + selectate de la pacienţii cu SMD
vs. celulele normale
D.I. Materiale şi Metode
Materiale
Lymphoprep (FreseniusKabi)
Filtru pentru celule cu diametru de 70-μm (Falcon, Becton Dickinson)
EasySep ® PE Selection Kit (StemCell Technologies)
Magnet EasySep ® (StemCell Technologies)
MesenCult ® complete medium (StemCell Technologies, Vancouver, BC,
Canada)
MethoCult ® H4434 methylcellulose-based medium (StemCell
Technologies)
MesenCult ® Dissociation Kit (StemCell Technologies)
Soluţie deTrypan blue (0.4% PBS)
Iodură de Propidium (PI, Sigma, Poole, UK)
Metanol (Merck Chemicals Catalog # 106035, Frankfurt, Darmstadt,
Germany)
Colorant Giemsa (EMD Chemicals Catalog #R03055, USA)
Placi de cultură de 35-mm (StemCell Technologies)
Lab-Tek ® II Chamber Slides (Nalge Nunc International Corp.)
Tampon de dilutie a anticorpilor alcatuit din FCS (1% w/v) şi BSA (bovine
serum albumin, Sigma-Aldrich, 1% w/v)
Triton X-100 (Sigma-Aldrich)
4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 μg/ml)
Mediu de montare Faramount Aqueous Mounting Medium (Dako
Denmark)
Anticorpi primari:
FITC-conjugated mouse anti-human paxillin monoclonal Ab (mAb) (clone
349/Paxillin, BD Bioscience),
PE-conjugated mouse anti-human CD73 mAb (clone AD2, BD
Pharmingen ),
unconjugated rabbit anti-phospho-specific FAK [pY 397 ] polyclonal Ab,
(Invitrogen Corporation), mouse anti-human p130CAS mAb (clone
35B.1A4, Santa Cruz Biotechnology, Inc.),
34

PE-conjugated mouse anti-human HSP90α/β mAb (clone F-8, Santa Cruz
Biotechnology, Inc.), FITC-conjugated mouse anti-human IgG2a,k mAb
(clone G155-178, BD Pharmingen ),
PE-conjugated mouse anti-human IgG1,k mAb (clone MOPC-21, BD
Pharmingen ), and
rabbit anti-human IgG polyclonal Ab (DakoCytomation).
Anticorpi secundari (Invitrogen Corporation):
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L),
PE-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L), and
Alexa Fluor 633-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)
Sisteme de achizitie
TissueFAXS ® System; TissueGnostics GmbH (Vienna, Austria)
Microscop confocal spectral TCS-SP2; Leica (Heidelberg, Germany)
FACS Canto I flow cytometer; Becton Dickinson (San Jose, USA)
Pacienţi şi voluntari sănătoşi
Aspiratele medulare au fost obţinute de la 9 pacienţi cu SMD cu vârsta
medie de 76 ani (56-85 ani) şi de la 4 voluntari sănătoşi cu vârsta medie 59
ani (39-69 ani). Probele au fost recoltate în absenţa oricărui tratament.
Diagnosticul a fost stabilit pe baza rezultatelor furnizate de evaluarea
citologică a frotiurilor aspiratelor medulare, colorate May-Grünwald-
Giemsa şi pe baza testelor citogenetice, conform clasificării World Health
Organization (WHO) revizuită în 2008.
Consimţămâtul informat a fost obţinut de la toţi pacienţii şi voluntarii
sănătoşi cuprinşi în studiu.
Metode
Teste pentru evaluarea clonogenicităţii CPH
(Human Haematopoietic Colony-Forming Cell Assays)
Metoda de evaluare a clonogenicităţii precursorilor hematopoietici a fost
prezentată în detaliu în Capitolul C, articolul I.
35

Amplificarea CSM în culturile primare
Cantităţile reduse de aspirat au impus realizarea unei etape de amplificare a
celulelor stromale în culturi primare.
Metoda de amplificare a fost prezentată în detaliu în Capitolul A, Articolul
I (Obţinerea culturilor primare de celule stromale).
Evaluarea straturilor de celule stromale din culturile primare
Această etapă a fost realizată pentru a detecta eventualele anomalii
morfologice ale celulelor stromale. Coloraţia culturilor de CSM a fost
realizată conform instrucţiunilor producătorului (StemCell Technologies) şi
au fost prezentate în detaliu în Capitolul A (Articolul I).
Selecţia CSM CD73 + cu potenţial clonogenic crescut
După obţininerea a 80% confluenţă în culturile primare, celulele stromale
au fost detaşate din flaskurile de cultură utilizându-se MesenCult ®
Dissociation Kit (StemCell Technologies). Celulele au fost colectate
ulterior în tuburi de sticlă în 5 ml MesenCult ® cu 20% Foetal Calf Serum
(FCS, GIBCO ® Invitrogen) şi filtrate prin filtre de 70 μm diametru (Falcon,
Becton Dickinson). Numărul de celule şi viabilitatea după detaşarea lor din
cultură au fost evaluate cu ajutorul unei soluţii de Trypan Blue (0.4% în
PBS) (StemCell Technologies). Celulele au fost apoi centrifugate blând
timp de 10 minute la 1200 rpm în vederea marcării. Blocarea marcajului
nespecific s-a realizat folosind anticorpul anti-Human CD32 (Fcγ RII)
Blocker din kitul EasySep ® PE Selection (StemCell Technologies) şi apoi
s-a efectuat marcajul propriu-zis cu anticorpul PE-conjugated mouse anti-
Human CD73 monoclonal antibody (BD Pharmingen ) într-o concentraţie
de 3.0 μg/ml per 10 7 celule, timp de 1 oră pe gheaţă. Celulele au fost apoi
spălate cu MesenCult ® / FCS (1:1) şi analizate în paralel cu controalele
izotipice; achiziţia datelor s-a realizat cu ajutorul unui citometru FACS
Canto I (Becton Dickinson). Pentru sortare, celulele marcate cu CD73 au
fost procesate în următoarele etape utilizându-se EasySep ® PE Selection
Cocktail (100 μg/ml), EasySep ® Magnetic Nanoparticles şi folosind
magnetul EasySep ® al kitului de selecţie EasySep ® PE Selection Kit
(StemCell Technologies). Puritatea fracţiilor celulare a fost evaluată înainte
şi după sortare prin citometrie, 1 x 10 5 celule fiind utilizate de fiecare dată
36

în acest scop. Viabilitatea celulară a fost stabilită prin marcarea celulelor cu
1 µl iodură de propidium (PI, 1 mg/ml, Sigma). Datele au fost analizate cu
ajutorul programului DIVA (Becton Dickinson).
Analiza flow-citometrică a fracţiilor CD73 + a relevat o puritate a fracţiilor
sortate conformă cerinţelor standardului (90-99% celule CD73 + PI - în
poarta de singleţi).
Caracterele funcţionale ale CSM
Testele de proliferare au fost efectuate pe celulele CSM CD73+ selectate de
la pacienţii cu SMD şi donatorii sănătoşi. În acest scop, 1 x 10 3 celule CSM
viabile (cuantificate folosind testul de excludere cu Trypan Blue) au fost
însămânţate în flaskuri T25-cm 2 . Numărul de celule amplificate prin cultură
a fost evaluat în zilele 7 şi 14. Apoi, s-au calculat indicii de proliferare
(diferenţa dintre numărul de celule obţinute în momentul opririi culturilor şi
numărul celulelor iniţial însămânţate).
Culturile Lab-Tek
După sortare, celulele au fost colectate în mediul MesenCult ® / FCS (1:1).
Apoi 1x10 3 celule au fost însămânţate per godeu în camere Lab-Tek ® II
Chamber Slides (Nalge Nunc International Corp.) în 0.5 ml mediu
MesenCult ® . Celulele au atins pragul de 70-80% confluenţă în decurs de 2
săptămâni.
Imunomarcajul
Celulele au fost spălate pentru îndepărtarea mediului rezidual şi fixate în
paraformaldehidă 4% w/v, timp de 10 minute, la temperatura camerei.
Fixarea a fost oprită prin spălarea celulelor de 3 ori cu PBS, pH 7.2 (BD
Bioscience).
Marcarea nespecifică a fost blocată cu tamponul de diluţie al anticorpilor
[antibody (Ab) buffer] care conţine PBS (1x), FCS (1% w/v) şi BSA
(bovine serum albumin, Sigma-Aldrich, 1% w/v), care a fost lăsat în
contact cu celulele timp de 1 oră. Celulele au fost apoi permeabilizate cu
Triton X-100 (0.1%) (Sigma-Aldrich) în PBS timp de 20 minute înainte de
aplicarea anticorpilor. Anticorpii primari au fost diluaţi în Ab buffer înainte
de aplicare astfel: FITC-conjugated mouse anti-human paxillin monoclonal
Ab (mAb) (diluţie finală 1:50, clone 349/Paxillin, BD Bioscience), PE-
37

conjugated mouse anti-human CD73 mAb (diluţie finală 1:25, clone AD2,
BD Pharmingen ), unconjugated rabbit anti-phospho-specific FAK [pY 397 ]
polyclonal Ab, (diluţie finală 1:100, Invitrogen Corporation), mouse antihuman
p130CAS mAb (diluţie finală 1:40, clone 35B.1A4, Santa Cruz
Biotechnology, Inc.), PE-conjugated mouse anti-human HSP90α/β mAb
(diluţie finală 1:40, clone F-8, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), FITCconjugated
mouse anti-human IgG2a,k mAb (diluţie finală 1:50, clone
G155-178, BD Pharmingen ), PE-conjugated mouse anti-human IgG1,k
mAb (diluţie finală 1:40, clone MOPC-21, BD Pharmingen ), şi rabbit
anti-human IgG polyclonal Ab (diluţie finală 1:100, DakoCytomation).
Anticorpii secundari (Invitrogen Corporation) utilizaţi au fost: FITCconjugated
goat anti-mouse IgG (H+L) diluţie1:50, PE-conjugated goat
anti-mouse IgG (H+L) 1:25 şi Alexa Fluor 633-conjugated goat anti-rabbit
IgG (H+L) diluţie 1:100 în Ab buffer. Preparatele au fost incubate peste
noapte cu anticorpii primari şi timp de 2 ore cu anticorpii secundari, la
temperatura de 4 °C, într-o cameră umedă. Înainte de achiziţie s-a realizat
marcajul nuclear cu 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 μg/ml) timp
de 30 minute, la 4 °C. Lamele au fost montate în Faramount Aqueous
Mounting Medium (Dako Denmark).
Evaluarea intensitătii relative de fluorescentă şi analiza colocalizarii
proteinelor
Preparatele triplu marcate au fost vizualizate cu ajutorul unui microscop
Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Inc.) la o mărire de 100x. Imaginile în
format TIFF au fost achiziţionate cu o cameră PixeLINK PL-
A622C/622000227 (Aegis Electronic Group, Inc.) prin capturarea mai
multor expuneri utilizând filtre pentru achiziţia fluorescenţelor FITC, Texas
Red, Alexa Fluor 633 şi DAPI, folosindu-se un obiectiv Plan Apochromat
100x.
Analiza şi cuantificarea intensităţii semnalului imunofluorescent a fost
realizată cu ajutorul programului ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Cinci câmpuri reprezentative au fost analizate per filtru şi per lamă.
Datele înregistrate pentru 25 de celule au fost exportate în Excel
(Microsoft) pentru analize statistice ulterioare.
Analiza colocalizarii:
38

Procentele de colocalizare între proteinele analizate pentru 10 celule
fuziforme şi 10 celule poligonale-mari, per caz şi per grup de cazuri sunt
prezentate sub formă de grafice care au fost generate din programul Origin
7.0 (Microcal Software). Scatter plot-urile şi hărţile de colocalizare au fost
generate din programul ImageJ.
Gradul de colocalizare a fost evaluat de asemenea utilizându-se variaţi
coeficienţi de colocalizare, iar apartenenţa proteinelor la complexe a fost
evaluată pe baza valorii coeficientului ICQ (Intensity Correlation Quotient)
şi ploturilor ICA (intensity correlation plots), conform analizelor de
fluorescenţă descrise de publicaţii anterioare [33], [34], [35].
S-au observat trei tipuri (pattern-uri) de marcare: random, atunci când
valoarea ICQ~0 (-0.1

-dezorganizarea arhitecturii coloniilor cu formarea de clustere de
proliferare aberantă şi
-prezenţa unor depozite gigantice de substanţe amorfe în cultură.
Înaintea noastră şi alţi autori au remarcat aceste depozite în variate boli
hematologice sau în metastazele medulare. Ele au fost descrise ca reţele
fine de fibre de reticulină, colagen de tip III, elastină [35], ori de tenascină
[36]. Prezenţa tenascinei a fost considerată amprenta unor reale stări
patologice ale micromediului medular [36].
Modificările macroscopice s-au însoţit şi de anomalii microscopice.
CSM din AREB prezentând modificări displazice foarte asemănătoare celor
întâlnite în compartimentul hematopoietic, precum şi anomalii considerate
a fi secundare dezorganizării filamentelor de actină.
D.II.2. Evaluarea funcţională a CSM CD73 + selectate din culturile
pacienţilor cu SMD vs. omoloagele normale (corelaţii cu expresia
proteinelor de adeziune focală)
În cazul straturilor de celule stromale din SMD, anomaliile morfologice s-
au asociat celor funcţionale.
Pentru a pune în evidenţă aceste disfuncţii, celulele CSM CD73 + selectate
de la pacienţii cu SMD şi celulele normale au fost testate din punct de
vedere al capacităţilor lor proliferative.
Astfel producţia de CSM CD73 + s-a dovedit a fi deficientă în cazul
celulelor selectate de la pacienţii cu CR (Figura 8). Media indicilor de
proliferare ale CSM selectate de la aceşti pacienţi, după două săptămâni de
cultură, fiind de 2 ori mai mică comparativ cu mediile obţinute în cazul
celulelor normale (40±6.4 vs. 83±12.1, p

Figura 8 Indicii de proliferare ai celulelor CD73 + selectate de la pacienţii cu SMD
comparativ cu celulele normale
Barele reprezintă valori medii ± DS.
Diferenţele dintre grupurile studiate au fost semnificativ diferite (p

Tabelul 5. Expresia proteinelor AF la nivelul CSM CD73 + din SMD vs. celulele
normale
Marcher %
+
CSM
Normal CR AREB
P/N Raport %
+
CSM
P/N Raport %
+
CSM
P/N Raport
L S L S L S
pFAK [pY 397 ] 70 ±
4.96
3.85
±
1.19
8.25 ±
1.67
93 ±
3.97
17.04 ±
2.39
23.3 ±
4.09
97 ±
1.82
24.35 ±
4.16
31.62 ±
3.38
paxilina 96 ±
3.78
14.44
±
2.43
16.9±
4.26
92 ±
2.79
12.66 ±
5.19
14.69 ±
5.48
98 ±
1.73
19.02 ±
3.28
20.49 ±
3.54
p130CAS 73 ±
7.58
4.71
±
1.93
7.30 ±
1.41
92 ±
2.12
10.32 ±
1.18
11.29 ±
4.99
96 ±
2.98
8.98 ±
0.93
10.29 ±
1.54
HSP90α/β 89 ±
4.35
7.37
±
1.11
7.16 ±
2.92
94 ±
2.77
6.15 ±
1.21
9.42 ±
1.82
93 ±
3.86
28.15 ±
1.08
18.82 ±
0.67
Procentele de celule pozitive sunt valorile medii ± DS ale rezultatelor a n experimente
(n NBM =4, n RAEB =4, n RC =5). În medie 300 celule au fost evaluate per caz. Intensitatea
relativă a fluorescenţei sau raportul P/N (raportul dintre mean pixel intensity (MPI)
calculat la nivelul celulelor pozitive şi valoarea obţinută pentru controalele izotipice) au
fost evaluate pentru 25 de celule, per caz şi per marcher. Valorile rapoartelor P/N sunt
valori medii ± DS.
Analiza comparativă a intensităţilor relative de fluorescenţă pentru
marcherii analizaţi arată faptul că nu există diferenţe semnificative între
celulele S (small) şi cele L (large) în cadrul aceluiaşi caz sau grup de
cazuri, dar diferenţe importante s-au înregistrat pentru pFAK[Y 397 ],
paxilină şi HSP90αβ între grupurile studiate.
Celulele L din grupurile AREB şi CR se remarcă printr-un nivel crescut de
expresie (de 6 ori, şi, respectiv de 4 ori) al proteinei pFAK [Y 397 ]
comparativ cu celulele normale, iar celulele S-CSM cu o creştere de
aproape 4 şi respectiv 3 ori, comparativ cu omoloagele lor. Analiza
localizării celulare a acestor proteine a adus date surprinzatoare. O primă
constatare a fost expresia nucleară intensă a pFAK [Y 397 ] în celulele CSM
patologice, dar nu şi la nivelul contactelor focale cum ne-am fi aşteptat.
Peste 80% dintre CSM din AREB au exprimat pFAK [Y 397 ] nuclear.
În grupul AREB expresia crescută a proteinei HSP90αβ (de 2.62 ori pentru
celulele CSM-S şi de 3.82 ori pentru celulele CSM-L) s-a asociat
42

supraexpresiei pFAK [Y 397 ]. Analiza marcajului celulelor CD73 + pentru
HSP90αβ a evidenţiat faptul că această proteină chaperon este abundent
exprimată în citoplasmă, o parte dintre celule prezintând şi expresie
nucleară. Astfel, în aproximativ 30% dintre CSM normale s-a observat
această expresie particulară, nucleară a HSP90αβ.
Spre deosebire de normal, celulele din AREB se remarcă printr-o
intensitate global crescută a marcajului citoplasmatic, precum şi prin
prezenţa unui procent ridicat de celule cu marcaj nuclear de HSP90αβ
(aproximativ 80%).
Procente similare de celule paxilină pozitive au fost înregistrate în cele trei
grupuri de studiu. Însă diferenţele dintre grupuri rezidă de asemenea din
particularităţile de distribuţie între marcajul difuz citoplasmatic şi cel
nuclear al fiecărui grup în parte. Astfel, 97-98% dintre CSM din AREB au
prezentat expresie nucleară de paxilină; celulele L din AREB prezentând şi
marcaj paranuclear. În celulele normale se remarcă aceleaşi patternuri de
marcare citoplasmatic şi nuclear, însă, doar 70% dintre celulele paxilinăpozitive
au prezentat şi expresie nucleară. În grupul CR în schimb, doar 14-
15% din celulele paxilină-pozitive au prezentat şi reactivitate nucleară.
În cazul marcajului pentru p130CAS, în toate grupurile studiate s-a
observat o reactivitate difuză citoplasmatică, cu intensitate scăzută a CSM
pentru acest marcher; o uşoară creştere a numărului de celule p130CAS
pozitive înregistrându-se în celulele din SMD (atât în CR cât şi în AREB)
comparativ cu controalele normale (92% şi 96% vs. 73%).
D.II.4. Analiza colocalizării proteinelor de adeziune focală în celulele
CD73 + din SMD vs. omoloagele normale
Datorită limitărilor programului de analiză, colocalizarea proteinelor a fost
evaluată pe perechi câte două de proteine, pentru fiecare tip de celule şi
grup de cazuri, prin comparaţie cu celulele normale.
HSP90α/β formează complexe cu paxilina în CSM-S din AREB şi într-o
parte dintre celulele normale
Rezultatele analizei de colocalizare au dovedit asocierea HSP90αβ la
paxilină în 20-30% dintre celulele CSM-S normale (Figura 9 B.1) şi în 80-
90% dintre celulele CSM-S din AREB (Figura 9 C.1). Cu privire la
procentele de colocalizare ale celor două proteine raportat la aria celulară
(Figura 9 D), am constatat o medie de suprapunere de 3% (cu un interval de
43

1 până la 4%) în cazul celulelor normale şi o medie de 4% (1-7%) în cazul
celulelor din AREB. Această superpoziţie s-a observat în special în aria
nucleară.
Coeficienţii Manders calculaţi pentru evaluarea gradului de suprapunere au
arătat o intensă asociere a acestor proteine atât în cazul celulelor normale
(30% dintre celule), cât şi în cazul celulelor din AREB
(M Pax/HSP90 =0.975±0.002, M HSP90/Pax =0.964±0.006 şi Rr=0.958±0.005 pentru
CSM-S normale şi, respectiv, M Pax/HSP90 =0.973±0.002,
M HSP90/Pax =0.978±0.001, Rr=0.967±0.001, pentru CSM-S din AREB).
În plus, ploturile ICA utilizate pentru a testa relaţia de expresie dintre
aceste proteine au reflectat un pattern de marcare dependent care sprijină
ideea că aceste proteine formează complexe cu localizare îndeosebi
nucleară, atât în celulele izolate din AREB cat şi în celulele normale unde
ele colocalizează (30%). Mai mult, şi indicii ICQ calculaţi pentru celulele
CSM-S din AREB au fost pozitivi şi au avut valori crescute, sprijinind
patternul de marcare « dependent » reflectat de ploturile ICA (+0.14±0.09;
p

7%, cu o medie de 4% în celulele din AREB, iar coeficienţii Manders au
avut valori foarte apropiate de 1, M Pax/pFAK =0.993±0.009 şi
M pFAK/Pax =0.911±0.008, Rr=0.994±0.003). În plus, un pattern de marcare
dependent a acestor proteine este susţinut şi de ploturile ICA (Figura 9 C.2)
dar şi de valorile ICQ pozitive (+0.16±0.04; pp>0.05; N=16). Scatter ploturile reflectă o imagine corespunzatoare
unui marcaj exclusiv.
Un marcaj segregat a fost observat pentru celulele CSM-S din CR, ceea ce
sprijină faptul că cele două proteine nu co-precipită în celulele izolate din
acest grup. În 4 dintre cele 50 de celule studiate pentru acest grup s-au
obţinut procente extrem de reduse de colocalizare (0.08±0.01%) cu valori
ICQ negative -0.27±0.08, p=0.05; N=46.
Dublul marcaj pFAK [Y 397 ]-HSP90αβ în celulele CSM-S din AREB a
relevat un pattern de colocalizare nuclear, similar celui dintre pFAK [Y 397 ]
şi paxilină (Figura 9 C.3). Procentele de colocalizare au fost cuprinse între
1-9 cu o medie de 6%, coeficienţii Manders fiind M pFAK/HSP90 =0.877±0.006,
M pHSP90/FAK =0.996±0.001, Rr=0.959±0.014. Scatter ploturile relevă un
marcaj « dependent ». Valorile ICQ au fost constant pozitive, sprijinind
puternic colocalizarea celor două proteine (+0.16±0.04, p>0.001) (Figura 9
C.3).
Un pattern de marcare « excluziv » a fost remarcat în cazul celor două
proteine în celulele CSM-S normale, corespunzator imaginilor prezentate
de scatter ploturi (Figura 9 B.3). Valori pozitive ICQ au fost obţinute doar
în 9 dintre cele 40 de celule analizate (+0.07±0.02, 0.1>p>0.05; N=9), pe
când pentru toate celelalte celule ICQ au avut valori negative,
corespunzătoare unor pattern-uri « segregat » (-0.28±0.08, p

În concluzie, am constatat o strânsă colocalizare a celor trei proteine în
cazul celulelor CSM-S selectate din AREB, spre deosebire de omoloagele
lor normale care prezintă doar o slabă colocalizare între paxilină şi
HSP90αβ în aproximativ 30-40 % dintre celulele studiate şi nici o
colocalizare între paxilină şi pFAK [Y 397 ] sau pFAK [Y 397 ]-HSP90αβ.
Figura 9. Analiza colocalizării proteinelor AF la HSP90αβ în celulele CSM-S Imagini
reprezentative pentru asocierile Paxilină-HSP90αβ (B.1), Paxilină-pFAK [Y 397 ] (B.2) şi HSP90αβ-pFAK
[Y 397 ] (B.3) în celulele normale şi omoloagele lor din AREB (C.1, C.2, C.3, imaginile din stânga ale fiecărui
panel). Controalele izotipice sunt prezentate în imaginile A. Analiza corelaţiilor de expresie. Scatter
ploturile pentru marcarea HSP90αβ vs Paxilină, Paxilină vs pFAK [Y 397 ] şi HSP90αβ vs pFAK [Y 397 ] în
celulele CSM-S normale (B.1-B.3, ploturile din mijloc) şi AREB (C.1-C.3, ploturile din mijloc). Panelele din
dreapta prezintă ploturile ICA (ploturi care reflectă variaţia 46 semnalelor fluorescente faţă de valorile medii
(A-a)(B-b) (B.1-B.3 pentru celulele CSM-S normale şi C.1-C.3 pentru AREB). Evaluarea punctelor de
colocalizare per perechi de proteine analizate. Cercurile corespund valorilor procentuale ale punctelor de
contact per celulă analizată. Barele orizontale reprezintă valorile medii şi DS pentru 10 celule examinate
per caz. N=normal CSM, M=CR CSM, R=AREB CSM (D).

Celulele CSM-L din AREB reţin caracteristicile de expresie ale celulelor S
reflectând o puternică colocalizare a celor trei proteine în ariile nucleare
şi paranucleare
Spre deosebire de celulele CSM-L normale, celulele “large” din grupul
AREB au dovedit un nivel crescut de expresie pentru pFAK [Y 397 ] (Tabelul
5) şi o înaltă colocalizare a acestei proteine la paxilină şi HSP90αβ (Figura
10). Procentele de colocalizare calculate pentru cele trei proteine la nivelul
celulelor CSM-L din AREB relevă faptul ca intensităţile lor de expresie
variază sincron şi în consecinţă aceste proteine sunt părţi ale aceluiaşi
complex (o medie de 8% puncte de colocalizare a fost obţinută în cazul
marcajului paxilină-HSP90αβ, 14% pentru paxilină-pFAK [Y 397 ] şi 9%
pentru perechea pFAK [Y 397 ]-HSP90αβ (Figura 10). Harţile de colocalizare
ilustrează o suprapunere puternică a acestor proteine în regiunile nucleare şi
paranucleare. Scatter ploturile reflectă patternuri de marcare înalt
dependente (Figura 10), iar valorile ICQ au avut valori pozitive
(+0.28±0.06, p

Figura 10 Paxilina, HSP90αβ şi pFAK [Y 397 ] formează complexe în CSM-L din AREB.
Imaginile prezintă celule CSM-L dublu marcate pentru paxilină-FITC şi HSP90α/β-PE (panel B), paxilină-
FITC şi pFAK-Alexa633 (panel C), pFAK-FITC şi HSP90α/β-PE (panel D) comparativ cu controalele
izotipice (panel A). Fiecare panel prezintă (de la stânga la dreapta şi de sus în jos) imaginile IF pentru
canalele verde / roşu, imaginile suprapuse ale celor două canale, harta colocalizării, o 2-D fluorogramă de
colocalizare generată între intensităţile marcajului verde / roşu în imaginile compuse, ploturile ICA pentru
fiecare panel. Ultimul grafic al fiecărui panel prezintă analiza colocalizării pentru paxilină-HSP90αβ-pFAK
[Y 397 ] pentru celulele CSM-L din AREB. Cercurile corespund valorilor procentuale ale punctelor de contact
48
per celulă analizată. Barele orizontale reprezintă valorile medii şi DS pentru 10 celule examinate per caz.
N=normal CSM, M=CR CSM, R=AREB CSM.

Capitolul E – Rolul căii de semnalizare Paxilină-pFAK [Y 397 ]-HSP90 în
proliferarea celulelor CSM CD73 +
E.I. Rezultate
Marcajul nuclear intens pentru paxilină şi puternica ei complexare la pFAK
[Y 397 ] şi HSP90αβ în celulele CSM izolate din AREB s-au corelat cu un
avantaj proliferativ important atât în cazul celulelor CSM-S (p

Capitolul F – Impactul defectelor de adeziune ale CSM CD73 + în SMD
asupra capacităţii proliferative a precursorilor hematopoietici
F.I. Rezultate
Nivele crescute de expresie ale proteinei pFAK [Y 397 ] la nivelul celulelor
CSM CD73+ s-au corelat direct cu scăderea capacităţii clonogenice a
celulelor precursoare hematopoietice izolate de la aceiaşi pacienţi (o
reducere de 4 ori a numărului de colonii BFU-E şi CFU-GM faţă de normal
s-a înregistrat în grupul AREB şi de 1.5 ori în grupul CR. Această
disfuncţionalitate observată în compartimentul hematopoietic s-a corelat
mai degrabă cu nivelul de expresie al pFAK [Y 397 ] în celulele stromale
mezenchimale decât cu procentul de celule pozitive pentru acest marcher
(Figura 12).
Această observaţie este sprijinită de faptul că procente similare de celule
pozitive pentru pFAK [Y 397 ] în AREB şi CR (97% vs. 93%) nu au avut
acelaşi impact asupra potenţialului clonogenic al CPH. Intensităţile relative
de expresie a pFAK [Y 397 ] la nivelul CSM s-au corelat invers cu numărul de
CFC (colony-forming cells) în compartimentul hematopoietic (p

ARTICOL III – Supraexpresia proteinei Heat-Shock-Protein (HSP)-90
în Sindroamele mielodisplazice cu risc înalt se însoţeşte de expresia
crescută şi activarea kinazei Focal Adhesion Kinase (FAK)
Introducere: Sindroamele mielodisplazice sunt maladii caracterizate
printr-un risc crescut de leucemizare. Etiopatogenia acestor boli rămâne
încă nedescifrată. Anumite studii indică faptul că activarea aberantă a unor
căi de semnalizare implicate în supravieţuirea celulară ar putea contribui la
patogenia acestor boli.
Proteina 90-kDa heat shock protein (HSP90) este implicată în maturarea
conformaţională, stabilizarea şi degradarea diferitelor tirozin kinase cu rol
cheie în transmiterea semnalelor. Focal Adhesion Kinase (FAK), este o
tirozin kinase implicată în căile de semnalizare integrin-dependente.
Obiectiv: Scopul studiului a fost investigarea rolului HSP90 în patogenia şi
evoluţia SMD, precum şi a rolului său potenţial în activarea căii FAK,
integrin-dependente.
Metoda: Expresia proteinelor HSP90, Akt fosforilat (pAkt), FAK şi FAK
fosforilat (pFAK) a fost evaluată prin citometrie în flux la nivelul celulelor
mononucleare medulare (MNC) şi la nivelul celulelor CD34-pozitive
(CD34 + ), pe un lot de 177 de cazuri, în momentul diagnosticului.
De asemenea au fost evaluate efectele inhibitorilor de HSP90, ex. 17-AAG
asupra acestor căi de semnalizare, prin incubarea celulelor selectate de la
25 pacienţi cu AREB timp de 12 ore în prezenţa acestui drog. O scădere
importantă a nivelelor de HSP90, pFAK şi pAKT a fost observată atât la
nivelul MNC cât şi a celulelor CD34 + după acest interval, iar aceste
modificări s-au corelat cu o creştere a ratei lor de apoptoză (evaluată pe
baza expresiei caspazei 3 şi anexinei V).
Rezultate: Nivelele tuturor acestor proteine au fost semnificativ crescute la
nivelul MNC selectate de la pacienţii cu refractory anaemia with excess of
blasts (AREB) faţă de MNC pacienţilor cu refractory anaemia (RA) sau
chronic myelomonocytic leukemia (CMML). Aceleaşi diferenţe au fost
înregistrate şi în cazul celulelor CD34 + . Nivele crescute de expresie pentru
HSP90, FAK, pFAK şi pAKT s-au corelat cu diminuarea ratei de
supravieţuire în rândul pacienţilor şi cu un risc crescut de progresie către
leucemizare.
Scăderea expresiei proteinelor HSP90, pFAK şi pAKT a fost constatată în
MNC şi celulele CD34 + din AREB după expunerea la 17-AAG; iar această
scădere s-a însoţit de asemenea şi de o rată crescută de apoptoză celulară.
51

Concluzii: Datele noastre sugerează implicarea HSP90 în patogenia SMD.
Nivelul crescut de expresie al acestei proteine în celulele hematopoietice
selectate de la pacienţii cu SMD s-a corelat cu progresia bolii (procente
crescute de blaşti, risc crescut de leucemizare şi cu activarea FAK şi Akt).
Această cale de semnalizare ar putea fi folosită drept ţintă terapeutică şi
sprijină utilizarea inhibitorilor de HSP90 ca terapie adjuvantă în SMD.
52

PERSPECTIVE
Alte studii rămân necesare pentru completarea acestor rezultate:
În primul rând, în scopul de a stabili o posibilă ierarhie a subpopulaţiilor de
CSM (STRO-1 + CD73 - şi STRO-1 - CD73 + ), ar fi necesară evaluarea
patternurilor de expresie ale unor gene, cum ar fi Oct-4 (caracteristică
celulelor embrionare) şi DKK-1 (un inhibitor al căii de semnalizare Wnt).
În plus, ar trebui evaluată şi expresia altor epitopi de suprafaţă consideraţi
ca fiind “anti-cell adhesion proteins,” cum ar fi α 6 -integrină şi podocalyxinlike
protein (PODXL), dupa cum D J Prockop a sugerat într-un articol
anterior [38].
Evaluarea capacităţilor de diferenţiere ale acestor subpopulaţii celulare
selectate de la pacienţii cu SMD prin comparaţie cu controalele normale ar
putea ridica noi posibile ipoteze legate de implicarea unui anumit tip celular
în patogenia acestor maladii.
Apoi, pentru a clarifica dacă aceste difuncţionalităţi sunt rezultatul unor
anomalii de transdiferenţiere sau ar putea fi disfuncţii ale unui precursor
comun pentru liniajele hematopoietic şi mezenchimal, ar trebui efectuate
teste care să vizeze evaluarea lor citogenetică, precum şi teste în vederea
decriptării lor genomice. Analizarea genomului acestor celule izolate de la
pacienţii cu SMD prin comparaţie cu celulele normale ar putea identifica şi
substratele moleculare responsabile de producerea acestor deficienţe.
De asemenea, pentru a confirma rolul α5-integrinei asupra destinului
celulelor CPH (cum ar fi asupra potenţialului clonogenic, capacităţilor de
diviziune şi autoregenerative) ar fi necesară imaginarea unui model surogat
de nişă hematopoietică prin co-cultivarea fracţiilor de CSM cu precursori
CD34 + CD133 + , în absenţa sau prezenţa unui blocant pentru anti-α5-
integrină şi efectuarea ulterioară a unor teste de evaluare a diviziunilor
simetrice, precum şi teste de evaluare a clonogenicităţii CPH pe termen
lung (LTC-IC assays).
În plus, stabilirea unor corelaţii între anomaliile prezentate de CSM
selectate de la pacienţii cu SMD (ex. deficienţele de adezivitate,
disfuncţionalităţile de creştere, expresia anormală a proteinelor de adeziune
focală) cu parametrii prognostici ai SMD şi cu chimiorezistenţa acestor
cazuri ar putea conduce la imaginarea unei noi clasificări a grupului de boli
SMD care să includă şi factorii de risc din micromediu.
53

DISCUŢII
Subiectul abordat de această teză adresează întrebări celulelor stromale
mezenchimale izolate de la pacienţii cu SMD, prin comparaţie cu celulele
normale, cu scopul de a identifica posibile disfuncţionalităţii ale acestora şi
de a stabili eventualul lor impact asupra dezvoltării normale a precursorilor
hematopoietici.
În acord cu datele publicate anterior [1], [26], [39], studiul nostru a
evidenţiat prezenţa disfuncţionalităţilor de creştere şi liza spontană în
culturile de CSM selectate de la pacienţii cu SMD, aceste anomalii fiind
mult mai evidente în citopeniile refractare.
În plus evaluarea morfologică a culturilor primare de CSM izolate din
AREB reflectă prezenţa unor modificări displazice la nivelul celulelor
stromale, foarte asemănătoare celor întâlnite în compartimentul
hematopoietic, precum şi modificări legate de dezorganizarea filamentelor
de actină.
Evaluarea morfometrică a relevat o distribuţie diferită a principalelor
morfotipuri de CSM în compoziţia straturilor generate în culturi primare de
la pacienţii cu SMD comparativ cu normalul, precum şi diferenţe de
mărime între celulele celor două grupuri care ar putea indica existenţa unor
defecte de maturaţie ale acestor celule.
Pornind de la aceste prime constatări am fost interesaţi să aflăm dacă aceste
anomalii morfologice-morfometrice ale compartimentului de celule CSM
au impact asupra funcţionalităţii compartimentului hematopoietic. În acest
scop am evaluat procesele dependente de adeziune, cum ar fi proliferarea
celulară, potenţialul clonogenic şi capacitatea de menţinere a culturilor in
vitro.
Astfel, mai întâi am imaginat un protocol de selecţie al acestor celule care
să ne permită obţinerea unor preparate celulare care să răspundă rigorilor
impuse de standardul în vigoare [30], pornind de la cantităţi mici de
aspirate medulare şi utilizând celule care prezintă deficienţe de creştere
cum am arătat mai înainte. Am realizat o selecţie în două etape, o primă
selecţie bazată pe abilitatea celulelor de a adera la suprafeţele de plastic,
care a servit şi ca fază de îmbogăţire a celulelor CSM în cultură şi o a doua
etapă bazată pe selecţia pozitivă a celulelor utilizându-se doi marcheri
specifici, STRO-1 şi CD73.
În urma selecţiei am obţinut două subpopulaţii de CSM care din punct de
vedere tehnic le-am exploatat diferit, o fracţie de celule STRO-1 + care s-a
54

dovedit mai robustă în dezvoltarea testelor funcţionale şi o fracţie de celule
CD73 + care şi-a dovedit utilitatea în evaluarea marcherilor de adeziune.
Notabil este şi faptul că în culturile din SMD am remarcat un număr crescut
de celule STRO-1 + care co-exprimau doi marcheri specifici pentru celulele
endoteliale, CD106 şi CD31, între zilele 20-30 de cultură şi care persistau
până către sfârşitul culturilor (a 60-a zi) când se instala liza sponatană.
Două ipoteze ar putea explica acest fapt, care se leagă de patogenia SMD:
prima explicaţie ar fi inducerea expresiei marcherului CD106 sub acţiunea
TNFα [22] şi a doua ar putea fi legată de funcţia acestei molecule, CD106
intervenind în contactele directe mediate de molecula CD29 dintre CSM şi
precursorii hematopoietici (CPH). Aceasta din urmă ipoteză ar putea
susţine implicarea directă a celulelor CSM în controlul ratei mitotice şi
cineticii de diviziune a CPH [40].
Se ştie deja că în SMD există nivele crescute de TNFα [41] şi că CSM
însele ar putea fi responsabile de sinteza acestei citokine, chiar în absenţa
stimulărilor din partea compartimentului hematopoietic. În patologia SMD
această citokină ar putea fi implicată de asemenea şi în inducerea unor
semnale proliferative interne [42].
Proporţia crescută de celule care exprimă CD31 + în culturile pacienţilor cu
SMD ar putea fi amprenta unui proces de neovascularizaţie, aceast fapt
fiind notat şi de studii anterioare (ex. Boudard D et al.) [1].
Testele funcţionale efectuate pe celulele selectate din SMD reflectă
prezenţa anomalilor de creştere (în absenţa oricărui contact direct cu CPH
sau stimulări prin factori solubili) susţinând caracterul intrinsec patologic al
acestor celule.
Astfel producţia de CSM în fracţiile STRO-1 + şi CD73 + selectate de la
pacienţii cu RCUD (refractory cytopenia with unilineage dysplasia) şi
RCMD (refractory dysplasia with multilineage dysplasia) a fost deficitară,
şi, în plus, abilităţile clonogenice ale acestor celule au fost puternic
diminuate prin comparaţie cu omoloagele lor normale. În concluzie
proliferarea relativă observată în culturile de CSM selectate de la pacienţii
cu RCUD şi RCMD este rezultatul unui proces de diviziune continuu, cu
rată scăzută şi fără a genera progenitori capabili să formeze colonii. Spre
deosebire de acestea, celulele din AREB (refractory anaemia with excess of
blasts) prezintă o rată de proliferare moderat îmbunătăţită în special pe
seama reducerii timpului de dedublare a celulelor STRO-1 + . Oricum chiar
şi în aceste cazuri această relativă proliferare nu este acompaniată în final
de maturitatea funcţională reflectată prin numărul de CFU-F.
55

De asemenea, în unele culturi din AREB am constatat o rată de proliferare
mult crescută faţă de normal; proliferare datorată în special celulelor
« large », cu formarea unor clustere sau colonii alcătuite exclusiv din acest
tip celular.
În plus, celulele din fracţiile CD73 + selectate de la pacienţii cu SMD au
prezentat o reducere semnificativă a marcherilor de adeziune, CD29, CD54,
CD44 şi CD49e, constatându-se o corelaţie directă între diminuarea
capacităţii CFU-F a fracţiilor CD73 + în SMD cu diminuarea expresiei
moleculei CD44. Timpii de dedublare ai fracţiilor de CSM selectate din
SMD s-au corelat invers cu nivelele de expresie ale marcherului CD49e.
În concluzie, defectele de creştere ale celulelor CSM sunt strâns legate de
nivelul de expresie al marcherilor de adeziune CD44 şi CD49e (α5-
integrină).
Rezultate preliminare indică şi faptul că potenţialul clonogenic al
compartimentului hematopoietic este controlat prin mecanisme dependente
de adeziune la stromă, iar α5-integrina este una dintre moleculele implicate
în acest proces. Acest fapt este sprijinit de datele statistice care arată că o
diminuare a expresiei moleculei α5-integrină pe suprafaţa CSM s-a corelat
semnificativ cu descreşterea potenţialului clonogenic al precursorilor
mieloizi şi eritroizi selectaţi de la aceleaşi cazuri, atât în grupul CR cât şi în
AREB.
Într-o etapă ulterioară a studiului am fost tentaţi să decodăm calea de
semnalizare care implică proteinele de adeziune focală, pentru a înţelege
dacă procesele de adeziune contribuie la transmiterea unor semnale
proliferative şi care ar fi impactul lor asupra interacţiunilor CPH-CSM.
Astfel proliferarea crescută observată în culturile din AREB s-a datorat atât
proliferării celulelor CSM-S, dar mai ales a CSM-L şi s-a corelat statistic
cu modificările calitative (diferenţele de intensitate, localizarea nucleară şi
asocierea în complexe) ale proteinelor de adeziune focală (focal adhesion
kinase [FAK] şi paxilina).
Celulele din RAEB au prezentat de asemenea o puternică colocalizare a
celor două proteine la HSP90 în special la nivelul ariei nucleare, observaţie
care sprijină şi mai mult comportamentului lor intens proliferativ.
În plus această strânsă colocalizare la HSP90 indică faptul că această
proteină-chaperon împiedică reciclarea proteasomică a acestor proteine
[43]. Această ipoteză este confirmată şi de faptul că utilizarea unor
inhibitori de HSP90 în culturile de celule CSM conduce la scăderea
semnalizării prin FAK şi la reducerea ratei lor de proliferare, în aceeaşi
manieră ca şi blocarea moleculei FAK în sine [44]. În plus, dovezi recente
56

sprijină contribuţia FAK la proliferarea celulară atât prin influenţarea
directă a ratei de proliferare cât şi a apoptozei [44-49].
O altă ipoteză a studiului nostru susţine implicarea moleculei FAK [Y 397 ] în
interacţiunile CPH-CSM intervenind în modularea capacităţii clonogenice a
precursorilor hematopoietici. Dovezi recente arată că FAK controlează
expresia integrinelor la nivelul fibroblaştilor umani [53]. În acest studiu am
observat faptul că nivele crescute de expresie a pFAK [Y 397 ] s-au corelat
invers cu expresia moleculei α 5 -integrină, la nivelul ambelor subpopulaţii
de CSM, S şi L, şi că această reducere s-a corelat semnificativ şi cu
diminuarea potenţialului clonogenic al CPH selectate de la aceleaşi cazuri.
În final, putem conclude că producţia crescută de celule CSM care exprimă
CD106 pe suprafaţă, în SMD, ar putea fi rezultatul contribuţiei FAK în
modularea transcripţiei diferitelor proteine induse de stimularea cu TNF-α,
prin intermediul activării kappa B-luciferazei [54].
În concluzie, aceste date dovedesc faptul că CSM selectate de la pacienţii
cu SMD sunt intrinsec patologice şi că ele influenţează direct
comportamentul precursorilor hematopoietici prin interacţiuni directe cu
aceştia.
57

BIBLIOGRAFIE:
1. Boudard D, A Viallet, S Piselli, D Guyotat, L Campos. In vitro
study of stromal cell defects in myelodysplastic syndromes.
Haematologica. 2003; 88:827-829.
2. Boiret N, C Rapatel, S Boisgard, S Charrier, A Tchirkov, C
Bresson, L Camilleri, J Berger, L Guillouard, JJ Guérin, P Pigeon,
J Chassagne, and MG Berger. CD43 + CDw90(Thy-l) + subset
colocated with mesenchymal progenitors in human bone marrow
hematon units is enriched in colony-forming unit megakaryocytes
and long-term culture-initiating cells. Experimental Hematology.
2003; 31:1275-1283.
3. Chunfang Liu, Zhongwei Chen, Zhihong Chen, Tao Zhang, and
Yuan Lu. Multiple Tumor Types May Originate from Bone
Marrow-Derived Cells. Neoplasia. 2006; 8:716–724.
4. David C Colter, Reiner Class, Carla M. DiGirolamo, and Darwin J.
Prockop. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of
plastic-adherent cells from human bone marrow. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America.
2000; 97: 3213-3218.
5. Lee RH, MJ Seo, AA Pulin, CA Gregory, J Ylostalo, and DJ
Prockop. The CD34-like protein PODXL and α6-integrin (CD49f)
identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and
migration to infarcted heart in mice. Blood. 2009; 113:816–826.
6. Ron Zohar, Jaro Sodek, and Christopher AG McCulloch.
Characterization of Stromal Progenitor Cells Enriched by Flow
Cytometry, Blood. 1997; 90:3471-3481.
7. Kumato M, Nishiwaki T, Matsuo N, Kimura H, Matsushima K,
Minimal cultured bone marrow mesenchymal stem cells ameliorate
fibrotic lung injury, European Respiratory Journal. 2009; 34:740-
748.
8. Shih-Chieh Hung, Nien-Jung Chen, Shie-Liang Hsieh, Hung Li,
Hsiao-Li Ma, and Wai-Hee Lo. Isolation and Characterization of
Size-Sieved Stem Cells from Human Bone Marrow. Stem Cells.
2002; 20:249–258.
9. Jaroslaw Staszkiewicz, Trivia P. Frazier, Brian G. Rowan, Bruce
A. Bunnell, Ernest S. Chiu, Jeffrey M. Gimble and Barbara
Gawronska-Kozak, Cell growth characteristics, differentiation
58

frequency, and immunophenotype of adult ear mesenchymal stem
cells. Stem Cells and Development. 2010; 19:83-92.
10. Simmons PJ and B Torok-Storb. Identification of stromal cell
precursor in human bone marrow by a novel monoclonal antibody,
STRO-1. Blood. 1991; 78:55-62.
11. Jones E and D McGonagle. Human bone marrow mesenchymal
stem cells in vivo. Rheumatology. 2008; 47:136-131.
12. Stan Gronthos, E Graves, S Ohta, and PJ Simmons. The STRO-1 +
fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic
precursors. Blood. 1994; 84:4164-4173.
13. Psaltis PJ, S Paton, F See, A Arthur, S Martin, S Itescu, SG
Worthley, Stan Gronthos, and AC Zannettino. Enrichment for
STRO-1 expression enhances the cardiovascular paracrine activity
of human bone marrow-derived mesenchymal cell populations.
Journal of Cellular Physiology. 2010; 223:530-540.
14. Colgan SP, HK Eltzschig HK, T Eckle T, and LF Thompson.
Physiological roles for ecto-5'-nucleotidase (CD73). Purinergic
Signalling. 2006; 2:351-360.
15. Airas L, J Niemelä, M Salmi, T Puurunen, DJ Smith, and S
Jalkanen. Differential Regulation and Function of CD73, a
Glycosyl-Phosphatidylinositol–linked 70-kD Adhesion Molecule,
on Lymphocytes and Endothelial Cells. The Journal of Cell
Biology. 1997; 136:421-431.
16. Gao X, P Kouklis, N Xu, RD Minshall, R Sandoval, SM Vogel,
AB Malik. Reversibility of increased microvessel permeability in
response to VE-cadherin disassembly. American Journal of
Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 2000;
279:L1218–L1225.
17. Kern S, H Eichler, J Stoeve, H Klüter and K Bieback. Comparative
analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical
cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 2006; 24:1294-1301;
18. Frederic Deschaseaux, Florelle Gindraux, Rafika Saadi, Laurent
Obert, David Chalmers, and Patrik Herve. Direct selection of
human bone marrow mesenchymal stem cells using an anti-CD49a
antibody reveals their CD45 med, low phenotype. British Journal of
Haematology. 2003; 122:506-517.
19. Moubarak Mouiseddine, Noëlle Mathiru, Johanna Stefani,
Christelle Demarquay, and Jean-Marc Bertho. Characterization and
Histological Localization of Multipotent Mesenchymal Stromal
59

Cells in the Human Postnatal Thymus. Stem Cells and
Development. 2008; 17:1165-1174.
20. Simmons PJ, Stan Gronthos, A Zannettino, S Ohta, S Graves.
Isolation, characterization and functional activity of human marrow
stromal progenitors in hemopoiesis. Progress in Clinical and
Biological Research. 1994; 389:271-280.
21. Stan Gronthos and PJ Simmons. The Biology and Application of
Human Bone Marrow Stromal Cell Precursors. Journal of
Hematotherapy. 1996; 5:15-23.
22. Halfon S, N Abramov, B Grinblat, and I Ginis. (2011). Markers
distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are
downregulated with passaging. Stem cells and development. 2011;
20:53-66;
23. Chevallier N, F Anagnostou, S Zilber, G Bodivit, S Maurin, A
Barrault, P Bierling, P Hernigou, P Layrolle and H Rouard.
Osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells with
platelet lysate. Biomaterials. 2010; 31:270-278.
24. Cristofalo VJ, RG Allen, RJ Pignolo, BG Martin, and JC Beck.
Relationship between donor age and the replicative lifespan of
human cells in culture: a reevaluation. The Proceedings of the
National Academy of Sciences of the USA. 1998; 95:10614-10619.
25. Nicolaas Franken APN, HM Rodermond, J Stap, J Haveman, and C
van Bree. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols.
2006; 1:2315-2319.
26. Lopez-Villar O, JL Garcia, FM Sanchez-Guijo, C Robledo, EM
Villaron, P Hernández-Campo, N Lopez-Holgado, M Diez-
Campelo, MV Barbado, JA Perez-Simon, JM Hernández-Rivas, JF
San-Miguel, MC del Cañizo. Both expanded and uncultured
mesenchymal stem cells from MDS patients are genomically
abnormal, showing a specific genetic profile for the 5q- syndrome.
Leukemia. 2009; 23:664-672.
27. Agematsu K, Nakahori Y. Recipient origin of bone marrowderived
fibroblastic stromal cells during all periods following bone
marrow transplantation in humans. British Journal of
Haematology. 1991; 79:359-365.
28. Enumeration, expansion, and differentiation of human
mesenchymal stem cells using Mesencult ® , StemCell Technologies
technical manual, catalog # 28453, 2007.
60

29. Dexter TM, TD Allen, LG Lajtha. Conditions controlling the
proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. Journal of
Cellular Physiology. 1977; 91:335-44.
30. Prockop DJ. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells
(MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Am Soc
Gene Ther 2009; 17:939–946.
31. Potapova AI, PR Brink, IS Cohen, SV Doronin. Culturing of
Human Mesenchymal Stem Cells as Three-dimensional Aggregates
Induces Functional Expression of CXCR4 That Regulates
Adhesion to Endothelial Cells. Journal of Biological Chemistry.
2008; 283:13100-13107.
32. Gray DHD, AP Chidgey, RL Boyd. Analysis of thymic stromal cell
populations using flow cytometry. Journal of Immunological
Methods. 2002; 260:15-28.
33. Li Q, A Lau, TJ Morris, L Guo, CB Fordyce, EF Stanley. A
Syntaxin 1, Gα o , and N-Type Calcium Channel Complex at a
Presynaptic Nerve Terminal: Analysis by Quantitative
Immunocolocalization. The Journal of Neuroscience. 2004;
24:4070-4081.
34. Ramírez O, A Ggarcía, R Rojas, A Couve, S Härtel. Confined
displacement algorithm determines true and random colocalization
in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 2009;
239:173–183.
35. Bolte S and F Cordelières. A guided tour into subcellular
colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy.
2006; 224:213-232.
36. William Bloom and Don W. Fawcett. A Textbook of Histology.
Publisher: W. B. Saunders. 10 th edition. 1975.
37. Soini Y, D Kamel, M Apaja-Sarkkinen, I Virtanen, V-P Lehto.
Tenascin immunoreactivity in normal and pathological bone
marrow. Journal of Clinical Pathology. 1993; 46:218-221.
38. Darwin J. Prockop. Repair of Tissues by Adult Stem/Progenitor
Cells (MSCs): Controversies, Myths, and Changing Paradigms.
Molecular Therapy. 2009; 6:939-946.
39. Tennant GB, V Walsh, LN Truran, P Edwards, KI Mills, AK
Burnett. Abnormalities of adherent layers grown from bone
marrow of patients with myelodysplasia. British Journal of
Haematology. 2000; 111:853-862.
61

40. Gottschling S, R Saffrich, A Seckinger, U Krause, K Horsch, K
Miesala K, and AD Ho. Human mesenchymal stromal cells
regulate initial self-renewing divisions of hematopoietic progenitor
cells by a beta1-integrin-dependent mechanism. Stem Cells. 2007;
25:798-806.
41. Stan Gronthos, Andrew C.W. Zannettino, Shelley J. Hay, Songtao
Shi, Stephen E. Graves, Angela Kortesidis, and Paul J. Simmons.
Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal
stem cells derived from human bone marrow. Journal of Cell
Science. 2003; 116:1827-1835.
42. Kohase M, D Henriksen-Destefano, LT May, J Vilček, PB Seghal.
Induction of β2-interferon by tumor necrosis factor: a homeostatic
mechanism in the control of cell proliferation. Cell. 1986; 45:659-
666.
43. Ochel HJ, Gademann G, Heat-shock protein 90: potential
involvement in the pathogenesis of malignancy and
pharmacological intervention, Onkologie. 2002; 25(5): 466-473.
44. Schwock J, Neesha Dhani, Mary Ping-Jiang Cao, Jinzi Zheng,
Richard Clarkson, Nikolina Radulovich, Roya Navab, Lars-
Christian Horn, David W Hedley. Targeting Focal Adhesion
Kinase with Dominant-Negative FRNK or Hsp90 Inhibitor 17-
DMAG Suppresses Tumor Growth and Metastasis of SiHa
Cervical Xenografts. Cancer Research. 2009; 69:4750-4759.
45. Golubovskaya V and W Cance. Focal adhesion kinase signaling
cancer. International Review of Cytology. 2007; 263:103-153.
46. McLean GW, NO Carragher, E Avizienyte, J Evans, VG Brunton,
and MC Frame. The role of focal-adhesion kinase in cancer. A ew
therapeutic opportunity. Nature Reviews Cancer. 2005; 5:505-515.
47. MJ van Nimwegen, M Huigsloot, A Camier, I B Tijdens, B van de
Water. Focal adhesion kinase and protein kinase B cooperate to
suppress doxorubicin-induced apoptosis of breast tumor cells.
Molecular Pharmacology. 2006; 70:1330-1339.
48. Dong JM, LS Lau, YW Ng, L Lim, E Manser. Paxillin nuclearcytoplasmic
localization is regulated by phosphorylation of the
LD4 motif: evidence that nuclear paxillin promotes cell
proliferation. Biochemical Journal. 2009; 418:173–184.
49. Kasai M, J Guerrero-Santoro, R Friedman, ES Leman, RH
Getzenberg, DB DeFranco. The Group 3 LIM Domain Protein
62

Paxillin Potentiates Androgen Receptor Transactivation in Prostate
Cancer Cell Lines 1. Cancer Research. 2003; 63:4927-4935.
50. Lim ST, D Mikolon, DG Stupack, D Schlaepfer. FERM Control of
FAK Function: Implications for Cancer Therapy. Cell Cycle. 2008;
7:2306-2314.
51. McLean WG, Noboru H Komiyama, Bryan Serrels, Hidefumi
Asano, Louise Reynolds, Francesco Conti, Kairbaan Hodivala-
Dilke, Daniel Metzger, Pierre Chambon, Seth GN Grant, Margaret
C Frame. Specific deletion of focal adhesion kinase suppresses
tumor formation and blocks malignant progression. Genes &
Development. 2004:2998-3003.
52. Utsubo R, Y Sonoda, R Takahashi, S Iijima, E Aizu-Yokota, T
Kasahara. Proteome Analysis of Focal Adhesion Kinase (FAK)-
Overexpressing Cells. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2004;
27:1735-1741.
53. LeBoeuf F, F Houle, J Huot. Regulation of Vascular Endothelial
Growth Factor Receptor 2-mediated phosphorylation of Focal
Adhesion Kinase by Heat Shock Protein 90 and Src Kinase
activities. The Journal of Biological Chemistry. 2004; 279:39175-
39185.
54. Tseng WP, CM Su, CH Tang. FAK activation is required for TNFalpha-induced
IL-6 production in myoblasts. Journal of Cellular
Physiology. 2010; 223:389-396.
63