CAPITOLUL 12 Alte procese de separare
CAPITOLUL 12 Alte procese de separare
CAPITOLUL 12 Alte procese de separare
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
CO2<br />
lichid<br />
Pompă<br />
Modificator<br />
<strong>CAPITOLUL</strong> <strong>12</strong><br />
<strong>Alte</strong> <strong>procese</strong> <strong>de</strong> <strong>separare</strong><br />
<strong>12</strong>.1. Cromatografia în flui<strong>de</strong> supercritice<br />
Până spre anii 1980 cromatografia în flui<strong>de</strong> supercritice (SFC) s-a <strong>de</strong>zvoltat ca o<br />
tehnică similară cromatografiei <strong>de</strong> lichi<strong>de</strong>, prin utilizarea coloanelor umplute, singura<br />
<strong>de</strong>osebire faţă <strong>de</strong> LC fiind natura fazei mobile, dată <strong>de</strong> un fluid supercritic. Prin<br />
introducerea coloanelor capilare SFC a cunoscut o nouă <strong>de</strong>zvoltare, ca tehnică <strong>de</strong><br />
<strong>separare</strong> similară cromatografiei <strong>de</strong> gaze. Intr-a<strong>de</strong>văr, în prezent tehnica SFC prezintă<br />
asemănări ambelor tehnici cromatografice, atât din punct <strong>de</strong> ve<strong>de</strong>re al separării, cât şi al<br />
<strong>de</strong>tecţiei. Mecanismul <strong>de</strong> <strong>separare</strong> SFC se bazează pe diferenţa dintre constantele <strong>de</strong><br />
repartiţie fază mobilă/fază staţionară ale analiţilor din probă, care la rândul lor <strong>de</strong>pind <strong>de</strong><br />
raportul dintre solubilitatea analiţilor în fluidul supercritic şi afinitatea acestora faţă <strong>de</strong> faza<br />
staţionară. Elementele componente ale unui cromatograf în care faza mobilă este un fluid<br />
supercritic sunt redate în figura <strong>de</strong> mai jos.<br />
Mixer<br />
Pompă<br />
218<br />
Proba<br />
Valva <strong>de</strong><br />
injecţie<br />
Coloana<br />
Sistem <strong>de</strong><br />
termostatare<br />
Restrictor<br />
Fig. <strong>12</strong>.1. Configuraţia unui sistem cromatografic cu flui<strong>de</strong> supercritice.<br />
Detector<br />
Achiziţie/<br />
prelucrare<br />
date<br />
CO2 este stocat într-un cilindru, iar înainte <strong>de</strong> a intra în pompă acesta trebuie<br />
răcit pentru creşterea <strong>de</strong>nsităţii sale. Deşi sunt utilizate şi pompe <strong>de</strong> înaltă presiune, sunt<br />
preferate pompele tip seringă, pentru eliminarea pulsurilor şi a controlului presiunii<br />
fluidului. Modificatorul polar (cum ar fi metanolul) este adus în sistem cu ajutorul altei<br />
pompe, similar procesului SFE (cap. 7.4). Aceste două componente ale fazei mobile sunt<br />
apoi amestecate in-line cu ajutorul unui mixer.<br />
Introducerea probei se face cu ajutorul unui valve <strong>de</strong> injecţie folosită în HPLC.<br />
Dacă proba este rezultatul unei prelucrări bazată pe extracţie în flui<strong>de</strong> supercritice (SFE),<br />
atunci se asigură compatibilitatea dintre compoziţia solventului probei (CO2 cu sau fără<br />
modificator polar) şi cea a fazei mobile.
Pentru a controla şi menţine temperatura fazei mobile (CO2), coloana<br />
cromatografică (umplută sau capilară) se plasează într-o incintă <strong>de</strong> termostatare (similară<br />
celei din HPLC sau GC), <strong>de</strong>pinzând <strong>de</strong> tipul acesteia. Datorită viscozităţii mici ale flui<strong>de</strong>lor<br />
supercritice utilizate ca faze mobile în SFC, lungimile coloanelor umplute pot fi mai mari<br />
<strong>de</strong>cât în HPLC, permiţând obţinerea unor rezoluţii mai bune prin această tehnică<br />
cromatografică. La ieşirea din coloană şi înaintea intrării în <strong>de</strong>tector se găseşte un<br />
restrictor, care are rolul <strong>de</strong> a menţine parametrii fizici ai fazei mobile constante. Acesta<br />
constă dintr-un tub foarte subţire, metalic sau din silice topită, cu lungimea <strong>de</strong> aproape 10<br />
cm şi diametrul mai mic <strong>de</strong> 50 μm.<br />
Fazele staţionare cele mai importante pentru separările SFC pe coloane umplute<br />
sunt următoarele:<br />
- polimeri polistiren-divinilbenzen sub formă <strong>de</strong> bile poroase care ridică unele probleme<br />
legate, pe o parte, <strong>de</strong> unele efecte <strong>de</strong> contractare sau umflare, care conduc la lipsa <strong>de</strong><br />
reproductibilitate a separărilor, şi pe <strong>de</strong> altă parte <strong>de</strong> utilizarea lor la <strong>separare</strong>a <strong>de</strong><br />
compuşi cu caracter hidrofob;<br />
- silicagel modificat chimic cu grupări cian, fenil, alchil, acoperit cu un polimer pentru a<br />
masca grupările silanol reziduale ce interacţionează puternic cu grupările polare din<br />
moleculele <strong>de</strong> analit şi conduc la forme asimetrice ale picurilor cromatografice;<br />
- faze staţionare <strong>de</strong> tip chiral (menţionate în 11.11).<br />
Fazele staţionare menţionate la <strong>separare</strong>a prin cromatografie <strong>de</strong> gaze pe coloană<br />
capilară pot fi utilizate şi în cazul SFC pe acelaşi tip <strong>de</strong> coloană.<br />
Detectorii specifici ambelor tehnici cromatografice pot fi folosiţi, dar alegerea<br />
acestora <strong>de</strong>pin<strong>de</strong> <strong>de</strong> natura analiţilor din probe (vezi cap. 10.10 şi 11.13). O <strong>de</strong>zvoltare a<br />
tehnicii tan<strong>de</strong>m SFC-MS utilizând surse <strong>de</strong> ionizare la presiune atmosferică s-a înregistrat<br />
în ultimii ani, datorită avantajului dat <strong>de</strong> CO2 supercritic <strong>de</strong> a se „auto-volatiliza” prin<br />
<strong>de</strong>stin<strong>de</strong>rea sa în compartimentul <strong>de</strong> nebulizare al sistemului MS.<br />
Aplicaţii<br />
Practic prin această tehnică cromatografică se pot separa compuşi organici<br />
volatili şi nevolatili, nepolari sau slab polari. Astfel, SFE este aplicată cu succes la analiza<br />
probelor <strong>de</strong> mediu, controlul alimentelor sau al produselor farmaceutice, precum şi în<br />
analiza oligomerilor din matrici polimerice. In schimb, cromatografia în flui<strong>de</strong> supercritice<br />
poate fi cu greu substituită în <strong>separare</strong>a şi <strong>de</strong>terminarea compuşilor labili termic sau<br />
compuşilor cu caracter exploziv din diverse probe multi-component. De exemplu,<br />
<strong>de</strong>terminarea trinitrotoluenului şi a compuşilor înrudiţi poate fi realizată prin SFC-MS,<br />
utilizând coloane capilare cu fenilmetilpolisiloxan. Analiza carburanţilor pentru motoare cu<br />
reacţie este un alt exemplu <strong>de</strong> aplicaţie importantă a tehnicii SFC. De obicei, în aceste<br />
amestecuri se adaugă difenilamina ca stabilizator, cu scopul combinării acesteia cu oxizii<br />
<strong>de</strong> azot formaţi în procesul <strong>de</strong> <strong>de</strong>scompunere a carburantului, când se formează <strong>de</strong>rivaţi<br />
nitrozo- şi nitro-. Aceşti <strong>de</strong>rivaţi nu pot fi <strong>de</strong>terminaţi prin analiza GC, <strong>de</strong>oarece se<br />
<strong>de</strong>scompun la rândul lor în difenilamina, dar pot fi <strong>de</strong>terminaţi prin SFC cu <strong>de</strong>tecţie NPD.<br />
Un alt exemplu, este <strong>de</strong>terminarea nitroglicerinei din amestecuri carburante, care poate fi<br />
mai greu realizată prin GC, datorită <strong>de</strong>gradării sale cu temperatura, sau prin HPLC cu<br />
<strong>de</strong>tecţie spectrometrică UV, <strong>de</strong>oarece acest compus nu absoarbe în ultraviolet. Ori<br />
utilizarea SFC pe coloana capilară şi <strong>de</strong>tecţie FID poate fi utilizată la <strong>de</strong>terminarea<br />
acestor compuşi cu caracter exploziv.<br />
Cuplajul acestei tehnici analitice <strong>de</strong> <strong>separare</strong> şi <strong>de</strong>terminare cu SPE, dar mai ales<br />
219
cu SFE, a condus la realizarea şi comercializarea unor sisteme total automatizate,<br />
capabile să analizeze un număr mare <strong>de</strong> probe.<br />
<strong>12</strong>.2. Electroforeza<br />
Electroforeza este un proces <strong>de</strong> <strong>separare</strong> bazat pe viteza diferită a speciilor<br />
încărcate electric (ioni, macromolecule cu sarcină electrică, coloizi, unele celule, precum<br />
bacterii sau eritrocite) plasate într-un câmp electric. Acest principiu a fost utilizat pentru<br />
prima dată <strong>de</strong> Tiselius la <strong>separare</strong>a a patru componente majore din serului proteic. [62]<br />
După mediul în care se <strong>de</strong>plasează speciile încărcate electric, meto<strong>de</strong>le<br />
electroforetice se pot împărţi în două mari clase: 1) electroforeza într-un mediu liber<br />
nelegat (pe o coloană <strong>de</strong> lichid); 2) electroforeza într-un mediu fixat (pe suport poros).<br />
O specie ionică cu sarcina q, aflată într-un câmp electric <strong>de</strong> intensitate E<br />
(măsurată în volţi/cm) va interacţiona cu acesta prin forţa electrică FE, dată <strong>de</strong> relaţia<br />
simplă:<br />
FE = q ⋅ E<br />
(<strong>12</strong>.1)<br />
Deplasarea speciei ionice sub acţiunea câmpului electric E are loc într-un mediu lichid.<br />
Acestei <strong>de</strong>plasări i se opune forţa <strong>de</strong> frecare Stokes dintre ion şi mediul lichid (Ff):<br />
Ff = −6<br />
⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ ve<br />
(<strong>12</strong>.2)<br />
, în care η este vâscozitatea mediului lichid în care sarcina se <strong>de</strong>plasează, r este raza<br />
speciei ionice (consi<strong>de</strong>rată sferică), iar ve este viteza <strong>de</strong> <strong>de</strong>plasare. Conform acestei<br />
relaţii forţa <strong>de</strong> frecare creşte proporţional cu creşterea razei speciei ionice, viscozităţii<br />
mediului în care se <strong>de</strong>plasează şi viteza <strong>de</strong> <strong>de</strong>plasare.<br />
La o <strong>de</strong>plasare cu o viteză constantă, cele două forţe sunt egale (FE = -Ff). Viteza<br />
<strong>de</strong> <strong>de</strong>plasare va <strong>de</strong>pin<strong>de</strong> astfel <strong>de</strong> parametrii menţionaţi anterior, conform relaţiei:<br />
q<br />
ve = ⋅ E<br />
(<strong>12</strong>.3)<br />
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r<br />
Primul termen din relaţia <strong>de</strong> mai sus este <strong>de</strong>finit ca mobilitate electroforetică (μe):<br />
q<br />
μe = (<strong>12</strong>.4)<br />
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r<br />
Aşadar, relaţia care stă la baza separărilor electroforetice este următoarea:<br />
ve = μe<br />
⋅ E<br />
(<strong>12</strong>.5)<br />
Pe baza acestor relaţii se poate <strong>de</strong>duce că viteza <strong>de</strong> <strong>de</strong>plasare într-un câmp<br />
electric este direct proporţională cu sarcina electrică a speciei încărcate şi invers<br />
proporţională cu raza sa. Mediul în care are loc <strong>de</strong>plasarea influenţează viteza <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>plasare prin viscozitatea sa, viteza crescând cu scă<strong>de</strong>rea viscozităţii acestuia. Un<br />
parametru care influenţează procesul electroforetic este şi pH-ul mediului în care are loc<br />
<strong>de</strong>plasarea componenţilor probei: la pH acid speciile bazice neutre se încarcă cu sarcină<br />
220
pozitivă, iar la un pH bazic speciile cu caracter acid se încarcă cu sarcină negativă.<br />
Modalitatea cea mai cunoscută <strong>de</strong> efectuare a separărilor electroforetice este pe<br />
coloană umplută cu soluţie tampon (aşa-numita celulă <strong>de</strong> electroforeză <strong>de</strong> tip Tiselius).<br />
La cele două capete se montează cei doi electrozi pentru a realiza câmpul electric<br />
necesar <strong>de</strong>plasării electroforetice, iar în dreptul unuia dintre capete se plasează<br />
<strong>de</strong>tectorul sistemului. Sistemele mo<strong>de</strong>rne utilizează o capilară pentru <strong>separare</strong>a<br />
electroforetica, aşa după cum se sunt prezentate în continuare.<br />
<strong>12</strong>.3. Electroforeza capilară<br />
Electroforeza capilară, numită datorită performanţelor sale şi electroforeză<br />
capilară <strong>de</strong> mare performanţă (HPCE – high performance capillary electrophoresis),<br />
realizează <strong>separare</strong>a electroforetică pe o capilară foarte îngustă (din silice sau teflon, cu<br />
diametrul între 25 şi 75 μm, iar lungimea cuprinsă între 10 şi 80 cm), în care se găseşte o<br />
soluţie tampon. Utilizarea capilarei are multe avantaje, dar primul şi cel mai important<br />
este înlăturarea efectului Joule <strong>de</strong> încălzire. Rezistenţa electrică mare a capilarei permite<br />
aplicarea unui potenţial electric foarte mare (între 100 şi 500 V/cm), cu generarea unei<br />
cantităţi minime <strong>de</strong> căldură. In plus, datorită raportului mare suprafaţă/volum în cazul<br />
capilarei, are loc o disipare eficientă a căldurii care este generată la transportul speciilor<br />
încărcate prin mediul lichid.<br />
Este cunoscut faptul că, la nivel periferic, cuarţul prezintă din loc în loc grupări<br />
hidroxilice reziduale (grupări silanol, cu caracter acid). Dacă electrolitul suport introdus în<br />
capilare <strong>de</strong> cuarţ se găseşte la un pH suficient <strong>de</strong> mare (≥ 4), grupările hidroxilice<br />
reziduale vor disocia, generând sarcini negative distribuite la nivelul peretelui intern. In<br />
acest mod se va forma la nivelul peretelui un strat dublu electric (vezi Fig. <strong>12</strong>.2).<br />
Contraionii, dispuşi în straturi lângă suprafaţa internă a capilarei <strong>de</strong> cuarţ, pentru<br />
a egaliza sarcina suprafeţei, vor genera un potenţial, <strong>de</strong>numit potenţial zeta ξ. Contraionii<br />
din stratul rigid (Stern), la aplicarea potenţialului E, se vor <strong>de</strong>plasa către catod. Această<br />
migrare în câmp electric va atrage după sine <strong>de</strong>plasarea ionilor electrolitului, din straturile<br />
difuze, dar şi a moleculelor <strong>de</strong> apă care hidratează ionii. In consecinţă, va apărea în<br />
interiorul coloanei o <strong>de</strong>plasare <strong>de</strong> la anod către catod, cunoscută sub numele <strong>de</strong> migrare<br />
electroosmotică, sau electroendosmotică. Viteza <strong>de</strong> <strong>de</strong>plasare electroosmotică vEOF este<br />
<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ntă <strong>de</strong> mobilitatea electroosmotică a ionilor din electrolitul suport, potenţialul zeta<br />
ξ generat la interfaţa capilară/electrolit suport, constanta dielectrică ε, vâscozitatea<br />
electrolitului suport η şi câmpul aplicat:<br />
v<br />
EOF<br />
⎛ ε ⋅ξ<br />
⎞<br />
= ⎜ ⋅ E<br />
η<br />
⎟<br />
⎝ ⎠<br />
Conform acestei relaţii, mobilitatea electroosmotică este:<br />
ε ⋅ξ<br />
μEOF =<br />
η<br />
221<br />
(<strong>12</strong>.6)<br />
(<strong>12</strong>.7)<br />
De remarcat, însă, că această mobilitate este in<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ntă <strong>de</strong> câmpul aplicat.<br />
Sensul componentei <strong>de</strong> <strong>de</strong>plasare electroosmotică <strong>de</strong>pin<strong>de</strong> <strong>de</strong> modul în care se<br />
ionizează suprafaţa internă a capilarei.
Chiar în cazul în care materialul din care este confecţionată capilara nu prezintă<br />
tendinţă <strong>de</strong> ionizare la interfaţa cu electrolitul suport, componenta electroosmotică apare<br />
datorită adsorbţiei ionice, specifice la nivelul acestei suprafeţe. pH-ul electrolitului suport<br />
influenţează în cea mai mare măsură mobilitatea electroosmotică. Fig. <strong>12</strong>.3 prezintă o<br />
astfel <strong>de</strong> <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nţă în raport cu materialul din care este confecţionată capilara şi cu pHul<br />
electrolitului suport.<br />
Peretele<br />
capilarei<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
Strat<br />
rigid<br />
222<br />
+<br />
-<br />
+<br />
+<br />
+<br />
-<br />
+<br />
-<br />
-<br />
+<br />
+<br />
Strat<br />
difuz<br />
Fig <strong>12</strong>.2. Reprezentarea dublului strat format la nivelul peretelui interior al capilarei.<br />
μEOFx10<br />
5<br />
-4 (cm 2 /V.s)<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
Fig. <strong>12</strong>.3. Depen<strong>de</strong>nţa mobilităţii electroosmotice (μEOF) în raport cu pH-ul electrolitului suport,<br />
pentru trei materiale din care sunt <strong>de</strong>s confecţionate capilarele in HPCE.<br />
Pyrex<br />
Cuart<br />
+<br />
+<br />
Teflon<br />
3 4 5 6 7 8<br />
pH<br />
+<br />
+<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
+<br />
+<br />
-<br />
+<br />
-<br />
-<br />
-
Modalităţile <strong>de</strong> influenţare a câmpului electroosmotic prin diverşi parametri<br />
experimentali sunt prezentate schematic în tabelul următor.<br />
Tabel <strong>12</strong>.1. Modalităţi <strong>de</strong> control a câmpului electroosmotic.<br />
Variabila Rezultat Observaţii<br />
- poate conduce la<br />
Câmpul electric aplicat<br />
creştere proporţională a câmpului<br />
EOF<br />
scă<strong>de</strong>rea rezoluţiei;<br />
- produce încălzire prin<br />
efect Joule.<br />
pH-ul electrolitului suport<br />
EOF sca<strong>de</strong> la pH jos<br />
EOF creşte la pentru pH ridicat<br />
- modul cel mai eficient <strong>de</strong><br />
control al EOF;<br />
- poate ioniza analiţii <strong>de</strong><br />
interes.<br />
- I înalt şi încălzire prin<br />
Tăria ionică (concentraţia<br />
electrolitului suport)<br />
Potenţialul zeta şi EOF scad la<br />
creşterea tăriei ionice<br />
efect Joule;<br />
- <strong>procese</strong> <strong>de</strong> adsorbţie;<br />
- variaţii ale conductibilităţii<br />
şi picuri asimetrice.<br />
Temperatura Modificări ale η (2-3% η/1°C) - controlată instrumental.<br />
Prezenţa unui modificator<br />
organic în electrolit<br />
ξ,η = f(cmod.org.) - poate altera selectivitatea.<br />
- cei anionici măresc EOF;<br />
Agent tensioactiv<br />
(surfactant)<br />
Poate schimba sensul EOF<br />
- cei cationici scad EOF<br />
sau îi schimbă sensul;<br />
- poate influenţa<br />
selectivitatea.<br />
Modificarea chimică a<br />
suprafeţei interne a capilarei<br />
Modificarea structurii suprafeţei<br />
-multiple posibilităţi<br />
- probleme <strong>de</strong> stabilitate.<br />
In condiţii bine <strong>de</strong>terminate, fluxul electroosmotic poate anula câmpul<br />
electroforetic. In cazul în care e v v EOF > , speciile anionice vor migra către catod, în cazul<br />
operării cu capilare din cuarţ. In consecinţă, mobilitatea analitului (μa) se poate calcula<br />
după relaţia:<br />
l ⋅ L l<br />
μa = μe<br />
+ μEOF<br />
= =<br />
t ⋅ V l ⋅ E<br />
un<strong>de</strong>: V reprezintă voltajul aplicat;<br />
l reprezintă lungimea efectivă a capilarei (până în zona <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecţie);<br />
L reprezintă lungimea totală a capilarei;<br />
t reprezintă timpul <strong>de</strong> migrare;<br />
E reprezintă câmpul electric.<br />
Eficienţa globală a separărilor HPCE este condiţionată <strong>de</strong> următorii factori:<br />
• difuzie;<br />
• injecţie;<br />
• temperatură;<br />
• adsorbţie selectivă;<br />
223<br />
(<strong>12</strong>.8)
• volumul zonei <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecţie;<br />
• electrodispersie.<br />
Abaterea standard pentru picul unui analit va fi, în consecinţă, condiţionată <strong>de</strong><br />
<strong>procese</strong>le <strong>de</strong> lărgire a frontului acestuia prin fenomenele amintite anterior:<br />
2 2 2 2 2 2<br />
σ T = σDif<br />
+ σinj<br />
+ σT<br />
+ σads<br />
+ σelectrodisp<br />
(<strong>12</strong>.9)<br />
Instrumentaţie<br />
Componentele unui sistem electroforeză capilară <strong>de</strong> mare performanţă sunt<br />
redate schematic în figura următoare.<br />
Catod<br />
Sistem <strong>de</strong><br />
achiziţie date<br />
- +<br />
Detector<br />
Soluţii<br />
tampon<br />
Sursa <strong>de</strong><br />
tensiune<br />
224<br />
Capilară<br />
Fig. <strong>12</strong>.4. Schema-bloc a unui sistem <strong>de</strong> electroforeză capilară.<br />
Conform datelor conţinute în Tabelul <strong>12</strong>.2 rezultă că volumele <strong>de</strong> injecţie trebuie<br />
să fie foarte reduse. De aceea, este important ca porţiunea din capilară în care proba<br />
este introdusă în momentul injecţiei să fie cât mai redusă ca lungime, pentru a nu<br />
influenţa eficienţa globală a separării. Cele mai importante modalităţi <strong>de</strong> injecţie în HPCE<br />
sunt prezentate schematic în Fig. <strong>12</strong>.5 şi <strong>de</strong>scrise parametric în continuare. [22]<br />
Injecţia hidrodinamică constă fie în aplicarea unui regim <strong>de</strong> presiune, fie a unui<br />
regim <strong>de</strong> vacuum, în unul dintre rezervoarele în care se găseşte probă sau electrolit, fie<br />
se apelează la sifonare între cele două rezervoare, prin intermediul capilarei. In<br />
conformitate cu ecuaţia Hagen-Poiseuille, volumul <strong>de</strong> probă injectat este dat <strong>de</strong> relaţia:<br />
4<br />
ΔP<br />
⋅d<br />
⋅ π ⋅ t<br />
vinj<br />
=<br />
<strong>12</strong>8⋅<br />
η⋅<br />
L<br />
un<strong>de</strong>: ΔP reprezintă diferenţa <strong>de</strong> presiune;<br />
Anod<br />
(<strong>12</strong>.10)
d reprezintă diametrul intern al capilarei;<br />
t reprezintă timpul <strong>de</strong> injecţie;<br />
η reprezintă vâscozitatea tamponului;<br />
L reprezintă lungimea totală a capilarei.<br />
In cazul sifonării ca modalitate <strong>de</strong> injecţie:<br />
ΔP = ρ ⋅ g ⋅Δh<br />
(<strong>12</strong>.11)<br />
un<strong>de</strong>: ρ reprezintă <strong>de</strong>nsitatea tamponului;<br />
g reprezintă constanta gravitaţională;<br />
Δh reprezintă diferenţa <strong>de</strong> înălţime între rezervoare.<br />
Cantitatea <strong>de</strong> probă injectată se poate calcula în conformitate cu relaţia:<br />
2<br />
2<br />
πd<br />
πd<br />
Qinj<br />
= linj<br />
⋅ Cinj<br />
⋅ = Vinj<br />
⋅ tinj<br />
⋅Cinj<br />
⋅<br />
(<strong>12</strong>.<strong>12</strong>)<br />
4<br />
4<br />
Tabelul următor corelează parametrii <strong>de</strong> calcul ai volumului <strong>de</strong> injecţie cu<br />
caracteristicile coloanei.<br />
Tabelul <strong>12</strong>.2. Depen<strong>de</strong>nţa volumului <strong>de</strong> injecţie <strong>de</strong> parametrii capilarei şi presiunea aplicată.<br />
d = 10μm d = 25μm d = 50μm d = 100μm<br />
P × t Vinj linj Vinj linj Vinj linj Vinj linj<br />
(mbar×s) (nL) (mm) (nL) (mm) (nL) (mm) (nL) (mm)<br />
25 0,0008 0,01 0,03 0,06 0,5 0,25 8,2 1,04<br />
50 0,0016 0,02 0,06 0,<strong>12</strong> 1,0 0,50 16,4 2,08<br />
75 0,0024 0,03 0,09 0,18 1,5 0,75 24,6 3,13<br />
100 0,0032 0,04 0,<strong>12</strong> 0,24 2,0 1,00 32,8 4,16<br />
L = 75 cm; T = 25°C; η = 1.<br />
S-a putut <strong>de</strong>monstra că proba poate penetra în coloană în momentul imersiei<br />
capătului capilarei, fără aplicarea <strong>de</strong> presiune, vacuum sau sifonare. O lungime a<br />
frontului <strong>de</strong> probă în astfel <strong>de</strong> condiţii a şi fost <strong>de</strong>terminată. Efectul este mai însemnat în<br />
cazul capilarelor cu diametru interior mai mare.<br />
S-a mai luat în consi<strong>de</strong>rare şi faptul că imersia capătului capilarei în rezervorul <strong>de</strong><br />
probă poate conduce la adsorbţia <strong>de</strong> analiţi pe suprafaţa exterioară a acesteia, ceea ce<br />
poate afecta ulterior, în mod serios, eficienţa separării. S-a <strong>de</strong>monstrat experimental că<br />
spălarea suprafeţei externe a capilarei are ca efect creşterea simetriei picurilor şi<br />
reducerea efectelor <strong>de</strong> trenă. Totodată, modul <strong>de</strong> tăiere a capătului capilarei prezintă un<br />
rol important. O secţiune oblică <strong>de</strong> tăiere poate scă<strong>de</strong>a eficienţa globală a separării la<br />
jumătate.<br />
Injecţia electrocinetică se realizează prin imersarea capătului coloanei capilare în<br />
soluţia <strong>de</strong> probă şi aplicarea unui câmp electric (în general <strong>de</strong> 3 - 5 ori mai scăzut <strong>de</strong>cât<br />
cel folosit pe durata separării). Pe durata injecţiei electrocinetice analitul pătrun<strong>de</strong> în<br />
capilară atât prin migrare, cât şi prin efectul <strong>de</strong> pompare al câmpului electroosmotic.<br />
In cazul injecţiei electrocinetice apare o discriminare generată <strong>de</strong> mobilităţile<br />
caracteristice fiecărui analit.<br />
Cantitatea <strong>de</strong> analit injectată este dată <strong>de</strong> relaţia:<br />
225
( μ<br />
Q =<br />
2<br />
e + μEOF)<br />
⋅ V ⋅ π ⋅ r ⋅C<br />
⋅ t<br />
L<br />
un<strong>de</strong>: μe reprezintă mobilitatea electroforetică a analitului;<br />
μEOF reprezintă mobilitatea electroosmotică;<br />
V reprezintă voltajul aplicat;<br />
r reprezintă raza capilarei;<br />
C reprezintă concentraţia analitului;<br />
t reprezintă timpul <strong>de</strong> injecţie;<br />
L reprezintă lungimea totală a capilarei.<br />
Presiune<br />
Proba<br />
Proba<br />
Proba<br />
Proba<br />
Hidrodinamic<br />
Hidrodinamic<br />
Hidrodinamic<br />
Electrocinetic<br />
+ -<br />
226<br />
vacuum<br />
Sifonare<br />
Fig. <strong>12</strong>.5. Modalităţi <strong>de</strong> injecţie a probei în HPCE.<br />
(<strong>12</strong>.13)
Detecţia cea mai utilizată în HPCE se bazează pe absorbţia radiaţiei în ultraviolet<br />
şi vizibil, prezentând asemănări cu <strong>de</strong>tecţia în cromatografia <strong>de</strong> lichi<strong>de</strong> (vezi tabelul<br />
<strong>12</strong>.3). [22] Deoarece fereastra optică a <strong>de</strong>tectorului este situată chiar pe peretele capilarei,<br />
în acest caz nu există efecte <strong>de</strong> lărgire a picului HPCE datorat volumul celulei. <strong>Alte</strong><br />
meto<strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecţie spectrometrică se bazează pe fluorescenţa analiţilor separaţi sau prin<br />
inducerea fluorescenţei cu ajutorul laserului. Meto<strong>de</strong>le amperometrice sau<br />
conductometrice sunt <strong>de</strong> asemenea utilizate în <strong>de</strong>tecţia HPCE.<br />
Tabel <strong>12</strong>.3. Performanţele tipurilor <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecţie în HPCE.<br />
Tip <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecţie Limita <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecţie Limita <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecţie<br />
Avantaje/<br />
(masă)* (concentraţie)<br />
<strong>de</strong>zavantaje<br />
Absorbţie UV-VIZ 10 -13 – 10 -16 10 -5 – 10 -8<br />
- universală;<br />
- informaţie structurală<br />
prin DAD.<br />
Fluorescenţă 10 -15 – 10 -17 10 -7 – 10 -9<br />
- sensibilitate mare;<br />
- <strong>de</strong> regulă, necesită<br />
<strong>de</strong>rivatizare.<br />
Fluorescenţă indusă<br />
prin laser<br />
10 -18 – 10 -20 10 -14 – 10 -16<br />
- sensibilitate mare;<br />
- <strong>de</strong> regulă, necesită<br />
<strong>de</strong>rivatizare;<br />
- scumpă.<br />
Amperometrie 10 -18 – 10 -19 10 -10 – 10 -11<br />
- sensibilitate mare;<br />
- selectivitate în cazul<br />
compuşilor electroactivi;<br />
- necesită componente<br />
electronice speciale şi<br />
modificări ale capilarei.<br />
Conductometrie 10 -15 – 10 -16 10 -7 – 10 -8<br />
- universală;<br />
- necesită componente<br />
electronice speciale şi<br />
modificări ale capilarei.<br />
Spectrometrie <strong>de</strong> masă 10 -16 – 10 -17 10 -8 – 10 -9<br />
- sensibilitate mare;<br />
- informaţie structurală;<br />
- interfaţa cu MS este<br />
complicată.<br />
* pentru 10 nL volum <strong>de</strong> injecţie.<br />
<strong>12</strong>.4 Cromatografia electrocinetică micelară<br />
Cromatografia electrocinetică micelară (MEKC – „Micellar Electrokinetic<br />
Chromatography”) prezintă caracteristici comune electroforezei şi cromatografiei.<br />
Introdusă în 1984 <strong>de</strong> către Terabe, MEKC reprezintă în prezent unul dintre cele mai<br />
utilizate mecanisme în electroforeza capilară <strong>de</strong> mare performanţă, impunându-se<br />
datorită aplicaţiilor sale ca o tehnică <strong>de</strong> <strong>separare</strong> <strong>de</strong> sine stătătoare. [131]<br />
In cazul cromatografiei electrocinetice micelare, în electrolitul suport se adaugă<br />
un agent tensioactiv într-o concentraţie mai mare <strong>de</strong>cât concentraţia sa micelară. De<br />
-<br />
exemplu, agentul tensioactiv poate fi anionic (R-SO3 ). In consecinţă, micelele generate<br />
vor avea o sarcină globală negativă şi vor crea în interiorul lor un spaţiu hidrofob în care<br />
vor pătrun<strong>de</strong> molecule <strong>de</strong> analit cu structura hidrofobă. Câmpul electroosmotic este<br />
227
generat în aşa fel încât să <strong>de</strong>păşească în modul pe cel electroforetic, caracteristic<br />
micelelor. Rezultanta celor două câmpuri va <strong>de</strong>termina <strong>de</strong>plasarea lentă a micelelor<br />
anionice către electrodul pozitiv, acolo un<strong>de</strong> se situează şi zona <strong>de</strong> <strong>de</strong>tecţie.<br />
Dacă proba conţine analiţi neionici aceştia se vor <strong>de</strong>plasa spre catod în baza<br />
componentei <strong>de</strong> <strong>de</strong>plasare electroosmotică. Ordinea <strong>de</strong> eluţie este dată <strong>de</strong> ordinea<br />
hidrofobicităţii lor: cu cât analiţii sunt mai hidrofobi, cu atât mai mult distribuţia acestora<br />
între micelă şi electrolitul suport va fi mai favorabilă staţionarii în interiorul micelei.<br />
Aceasta situaţie este ilustrată în Fig. <strong>12</strong>.6, în care este redat rezultatul unei separări<br />
MEKC a trei compuşi A, B şi C, având valorile log Kow crescătoare în ordinea dată.<br />
Ultimul semnal înregistrat este cel al micelelor (tm), în timp ce primul semnal (pic)<br />
înregistrat corespun<strong>de</strong> fluxului electroosmotic, fiind analog timpului mort (t0) din<br />
cromatografia <strong>de</strong> lichi<strong>de</strong>.<br />
Compuşii puternic hidrofili, care nu interacţionează cu micelele vor elua în acelaşi<br />
timp cu fluxul electroosmotic. Compuşii puternic hidrofobi vor elua în acelaşi timp cu<br />
micelele formate. In concluzie, compuşii neutri din punct <strong>de</strong> ve<strong>de</strong>re electric vor elua în<br />
intervalul <strong>de</strong> timp [t0, tm]. Pe baza acestor parametri <strong>de</strong> retenţie se pot calcula mărimile<br />
cunoscute în cromatografie, factorul <strong>de</strong> capacitate (k’) şi constanta <strong>de</strong> distribuţie (K) a<br />
analiţilor între electrolit (faza mobilă, cu volumul Vmicele) şi micele (analog fazei staţionare<br />
în cromatografia <strong>de</strong> lichi<strong>de</strong>, cu volumul Velectrolit).<br />
tr<br />
− t0<br />
Vmicele<br />
k'= = K ⋅<br />
(<strong>12</strong>.14)<br />
tr<br />
V<br />
t<br />
electrolit<br />
0(<br />
1−<br />
)<br />
tm<br />
, în care a doua egalitate este <strong>de</strong>dusă conform relaţiei 9.50.<br />
0<br />
Flux<br />
electroosmotic<br />
A<br />
B<br />
t0 tA tB tC tm<br />
228<br />
C<br />
Micele<br />
Fig. <strong>12</strong>.6. Separarea prin MEKC a trei analiţi A, B şi C, având A B C<br />
lg Kow<br />
< lg Kow<br />
< lg Kow<br />
.<br />
Dacă în probă se vor găsi, specii anionice <strong>de</strong> analiţi sunt importante <strong>de</strong> cunoscut<br />
mobilităţile lor electroforetice. Dacă ve analit este mai mică în raport cu ve m , analitul anionic<br />
va migra mai repe<strong>de</strong> spre anod şi astfel va elua înaintea tm. Distribuţia lui în spaţiul<br />
intramicelar este puţin probabilă, <strong>de</strong>ci poate fi neglijată. Dacă ve analit este mai mare în<br />
m analit<br />
raport cu ve , dar totuşi v e < vEOF<br />
, atunci analitul anionic eluează după tm.
Selectivitatea separărilor MEKC este influenţată <strong>de</strong> natura agentului tensioactiv<br />
adăugat în electrolitul suport pentru formarea micelelor (care poate fi anionic, cationic,<br />
amfionic, neionic, sau amestecuri între aceştia), pH-ul electrolitului suport, concentraţia şi<br />
natura tamponului utilizat, temperatura, sau prezenţa unor specii modificatoare (solvent<br />
organic, uree, ioni metalici, prezenţa unor selectori chirali). Agenţii tensioactivi <strong>de</strong> tip<br />
neionic sau amfionic au câteva avantaje faţă <strong>de</strong> cei ionici, prin faptul că nu modifică<br />
drastic fluxul electroosmotic, nu modifica conductivitatea electrolitului suport şi au o<br />
influenţă mai mică asupra structurii sau activităţii în cazul separărilor <strong>de</strong> proteine.<br />
Ca exemple <strong>de</strong> aplicaţii importante ale cromatografiei electrocinetice micelare pot<br />
fi menţionate separările <strong>de</strong> amino-acizi sau nucleoti<strong>de</strong>, vitamine hidro- şi lipo-solubile,<br />
compuşi <strong>de</strong> importanţă farmaceutică, hidrocarburi aromatice, compuşi cu caracter<br />
exploziv, etc. Ca avantaje ale acestei tehnici analitice pot fi menţionate timpul mic <strong>de</strong><br />
<strong>separare</strong> pentru probe complexe sau cantitatea mică <strong>de</strong> probă necesară.<br />
<strong>12</strong>.5. Izotacoforeza<br />
In <strong>separare</strong>a prin izotacoforeză, componenţii probei aflaţi în formă ionică prezintă<br />
mobilităţi diferite într-un câmp electric. In izotacoforeza zonală obişnuită o probă este<br />
separată în zone utilizând doi electroliţi suport, având mobilităţi electroforetice diferite:<br />
unul cu o mobilitate foarte mare (<strong>de</strong> exemplu, ionul acetat) şi altul cu o mobilitate<br />
electroforetică foarte mică (<strong>de</strong> exemplu, ionul glicinat). Proba este introdusă între zonele<br />
celor doi electroliţi, după care este aplicat un câmp electric. Principiul <strong>de</strong> <strong>separare</strong> a trei<br />
anioni oarecare este ilustrat schematic în figura <strong>de</strong> mai jos.<br />
a<br />
b<br />
c<br />
B -<br />
X - , Y - , Z -<br />
Y - , Z -<br />
229<br />
A -<br />
B - A -<br />
B -<br />
X -<br />
Z - , Y - , X -<br />
Fig. <strong>12</strong>.7. Principiul <strong>de</strong> <strong>separare</strong> prin izotacoforeză:<br />
a) proba conţinând trei anioni (notaţi cu X - , Y - şi Z - ) sunt injectaţi între doi electroliţi<br />
(A - - frontal; B - - final);<br />
b) se aplică un curent electric între cei doi electrozi, iar anionii migrează spre electrodul pozitiv;<br />
c) după un timp are loc <strong>separare</strong>a celor trei anioni în trei zone distincte.<br />
A -