CAPITOLUL 12 Alte procese de separare

CO2
lichid
Pompă
Modificator
CAPITOLUL 12
Alte procese de separare
12.1. Cromatografia în fluide supercritice
Până spre anii 1980 cromatografia în fluide supercritice (SFC) s-a dezvoltat ca o
tehnică similară cromatografiei de lichide, prin utilizarea coloanelor umplute, singura
deosebire faţă de LC fiind natura fazei mobile, dată de un fluid supercritic. Prin
introducerea coloanelor capilare SFC a cunoscut o nouă dezvoltare, ca tehnică de
separare similară cromatografiei de gaze. Intr-adevăr, în prezent tehnica SFC prezintă
asemănări ambelor tehnici cromatografice, atât din punct de vedere al separării, cât şi al
detecţiei. Mecanismul de separare SFC se bazează pe diferenţa dintre constantele de
repartiţie fază mobilă/fază staţionară ale analiţilor din probă, care la rândul lor depind de
raportul dintre solubilitatea analiţilor în fluidul supercritic şi afinitatea acestora faţă de faza
staţionară. Elementele componente ale unui cromatograf în care faza mobilă este un fluid
supercritic sunt redate în figura de mai jos.
Mixer
Pompă
218
Proba
Valva de
injecţie
Coloana
Sistem de
termostatare
Restrictor
Fig. 12.1. Configuraţia unui sistem cromatografic cu fluide supercritice.
Detector
Achiziţie/
prelucrare
date
CO2 este stocat într-un cilindru, iar înainte de a intra în pompă acesta trebuie
răcit pentru creşterea densităţii sale. Deşi sunt utilizate şi pompe de înaltă presiune, sunt
preferate pompele tip seringă, pentru eliminarea pulsurilor şi a controlului presiunii
fluidului. Modificatorul polar (cum ar fi metanolul) este adus în sistem cu ajutorul altei
pompe, similar procesului SFE (cap. 7.4). Aceste două componente ale fazei mobile sunt
apoi amestecate in-line cu ajutorul unui mixer.
Introducerea probei se face cu ajutorul unui valve de injecţie folosită în HPLC.
Dacă proba este rezultatul unei prelucrări bazată pe extracţie în fluide supercritice (SFE),
atunci se asigură compatibilitatea dintre compoziţia solventului probei (CO2 cu sau fără
modificator polar) şi cea a fazei mobile.

Pentru a controla şi menţine temperatura fazei mobile (CO2), coloana
cromatografică (umplută sau capilară) se plasează într-o incintă de termostatare (similară
celei din HPLC sau GC), depinzând de tipul acesteia. Datorită viscozităţii mici ale fluidelor
supercritice utilizate ca faze mobile în SFC, lungimile coloanelor umplute pot fi mai mari
decât în HPLC, permiţând obţinerea unor rezoluţii mai bune prin această tehnică
cromatografică. La ieşirea din coloană şi înaintea intrării în detector se găseşte un
restrictor, care are rolul de a menţine parametrii fizici ai fazei mobile constante. Acesta
constă dintr-un tub foarte subţire, metalic sau din silice topită, cu lungimea de aproape 10
cm şi diametrul mai mic de 50 μm.
Fazele staţionare cele mai importante pentru separările SFC pe coloane umplute
sunt următoarele:
- polimeri polistiren-divinilbenzen sub formă de bile poroase care ridică unele probleme
legate, pe o parte, de unele efecte de contractare sau umflare, care conduc la lipsa de
reproductibilitate a separărilor, şi pe de altă parte de utilizarea lor la separarea de
compuşi cu caracter hidrofob;
- silicagel modificat chimic cu grupări cian, fenil, alchil, acoperit cu un polimer pentru a
masca grupările silanol reziduale ce interacţionează puternic cu grupările polare din
moleculele de analit şi conduc la forme asimetrice ale picurilor cromatografice;
- faze staţionare de tip chiral (menţionate în 11.11).
Fazele staţionare menţionate la separarea prin cromatografie de gaze pe coloană
capilară pot fi utilizate şi în cazul SFC pe acelaşi tip de coloană.
Detectorii specifici ambelor tehnici cromatografice pot fi folosiţi, dar alegerea
acestora depinde de natura analiţilor din probe (vezi cap. 10.10 şi 11.13). O dezvoltare a
tehnicii tandem SFC-MS utilizând surse de ionizare la presiune atmosferică s-a înregistrat
în ultimii ani, datorită avantajului dat de CO2 supercritic de a se „auto-volatiliza” prin
destinderea sa în compartimentul de nebulizare al sistemului MS.
Aplicaţii
Practic prin această tehnică cromatografică se pot separa compuşi organici
volatili şi nevolatili, nepolari sau slab polari. Astfel, SFE este aplicată cu succes la analiza
probelor de mediu, controlul alimentelor sau al produselor farmaceutice, precum şi în
analiza oligomerilor din matrici polimerice. In schimb, cromatografia în fluide supercritice
poate fi cu greu substituită în separarea şi determinarea compuşilor labili termic sau
compuşilor cu caracter exploziv din diverse probe multi-component. De exemplu,
determinarea trinitrotoluenului şi a compuşilor înrudiţi poate fi realizată prin SFC-MS,
utilizând coloane capilare cu fenilmetilpolisiloxan. Analiza carburanţilor pentru motoare cu
reacţie este un alt exemplu de aplicaţie importantă a tehnicii SFC. De obicei, în aceste
amestecuri se adaugă difenilamina ca stabilizator, cu scopul combinării acesteia cu oxizii
de azot formaţi în procesul de descompunere a carburantului, când se formează derivaţi
nitrozo- şi nitro-. Aceşti derivaţi nu pot fi determinaţi prin analiza GC, deoarece se
descompun la rândul lor în difenilamina, dar pot fi determinaţi prin SFC cu detecţie NPD.
Un alt exemplu, este determinarea nitroglicerinei din amestecuri carburante, care poate fi
mai greu realizată prin GC, datorită degradării sale cu temperatura, sau prin HPLC cu
detecţie spectrometrică UV, deoarece acest compus nu absoarbe în ultraviolet. Ori
utilizarea SFC pe coloana capilară şi detecţie FID poate fi utilizată la determinarea
acestor compuşi cu caracter exploziv.
Cuplajul acestei tehnici analitice de separare şi determinare cu SPE, dar mai ales
219

cu SFE, a condus la realizarea şi comercializarea unor sisteme total automatizate,
capabile să analizeze un număr mare de probe.
12.2. Electroforeza
Electroforeza este un proces de separare bazat pe viteza diferită a speciilor
încărcate electric (ioni, macromolecule cu sarcină electrică, coloizi, unele celule, precum
bacterii sau eritrocite) plasate într-un câmp electric. Acest principiu a fost utilizat pentru
prima dată de Tiselius la separarea a patru componente majore din serului proteic. [62]
După mediul în care se deplasează speciile încărcate electric, metodele
electroforetice se pot împărţi în două mari clase: 1) electroforeza într-un mediu liber
nelegat (pe o coloană de lichid); 2) electroforeza într-un mediu fixat (pe suport poros).
O specie ionică cu sarcina q, aflată într-un câmp electric de intensitate E
(măsurată în volţi/cm) va interacţiona cu acesta prin forţa electrică FE, dată de relaţia
simplă:
FE = q ⋅ E
(12.1)
Deplasarea speciei ionice sub acţiunea câmpului electric E are loc într-un mediu lichid.
Acestei deplasări i se opune forţa de frecare Stokes dintre ion şi mediul lichid (Ff):
Ff = −6
⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ ve
(12.2)
, în care η este vâscozitatea mediului lichid în care sarcina se deplasează, r este raza
speciei ionice (considerată sferică), iar ve este viteza de deplasare. Conform acestei
relaţii forţa de frecare creşte proporţional cu creşterea razei speciei ionice, viscozităţii
mediului în care se deplasează şi viteza de deplasare.
La o deplasare cu o viteză constantă, cele două forţe sunt egale (FE = -Ff). Viteza
de deplasare va depinde astfel de parametrii menţionaţi anterior, conform relaţiei:
q
ve = ⋅ E
(12.3)
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r
Primul termen din relaţia de mai sus este definit ca mobilitate electroforetică (μe):
q
μe = (12.4)
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r
Aşadar, relaţia care stă la baza separărilor electroforetice este următoarea:
ve = μe
⋅ E
(12.5)
Pe baza acestor relaţii se poate deduce că viteza de deplasare într-un câmp
electric este direct proporţională cu sarcina electrică a speciei încărcate şi invers
proporţională cu raza sa. Mediul în care are loc deplasarea influenţează viteza de
deplasare prin viscozitatea sa, viteza crescând cu scăderea viscozităţii acestuia. Un
parametru care influenţează procesul electroforetic este şi pH-ul mediului în care are loc
deplasarea componenţilor probei: la pH acid speciile bazice neutre se încarcă cu sarcină
220

pozitivă, iar la un pH bazic speciile cu caracter acid se încarcă cu sarcină negativă.
Modalitatea cea mai cunoscută de efectuare a separărilor electroforetice este pe
coloană umplută cu soluţie tampon (aşa-numita celulă de electroforeză de tip Tiselius).
La cele două capete se montează cei doi electrozi pentru a realiza câmpul electric
necesar deplasării electroforetice, iar în dreptul unuia dintre capete se plasează
detectorul sistemului. Sistemele moderne utilizează o capilară pentru separarea
electroforetica, aşa după cum se sunt prezentate în continuare.
12.3. Electroforeza capilară
Electroforeza capilară, numită datorită performanţelor sale şi electroforeză
capilară de mare performanţă (HPCE – high performance capillary electrophoresis),
realizează separarea electroforetică pe o capilară foarte îngustă (din silice sau teflon, cu
diametrul între 25 şi 75 μm, iar lungimea cuprinsă între 10 şi 80 cm), în care se găseşte o
soluţie tampon. Utilizarea capilarei are multe avantaje, dar primul şi cel mai important
este înlăturarea efectului Joule de încălzire. Rezistenţa electrică mare a capilarei permite
aplicarea unui potenţial electric foarte mare (între 100 şi 500 V/cm), cu generarea unei
cantităţi minime de căldură. In plus, datorită raportului mare suprafaţă/volum în cazul
capilarei, are loc o disipare eficientă a căldurii care este generată la transportul speciilor
încărcate prin mediul lichid.
Este cunoscut faptul că, la nivel periferic, cuarţul prezintă din loc în loc grupări
hidroxilice reziduale (grupări silanol, cu caracter acid). Dacă electrolitul suport introdus în
capilare de cuarţ se găseşte la un pH suficient de mare (≥ 4), grupările hidroxilice
reziduale vor disocia, generând sarcini negative distribuite la nivelul peretelui intern. In
acest mod se va forma la nivelul peretelui un strat dublu electric (vezi Fig. 12.2).
Contraionii, dispuşi în straturi lângă suprafaţa internă a capilarei de cuarţ, pentru
a egaliza sarcina suprafeţei, vor genera un potenţial, denumit potenţial zeta ξ. Contraionii
din stratul rigid (Stern), la aplicarea potenţialului E, se vor deplasa către catod. Această
migrare în câmp electric va atrage după sine deplasarea ionilor electrolitului, din straturile
difuze, dar şi a moleculelor de apă care hidratează ionii. In consecinţă, va apărea în
interiorul coloanei o deplasare de la anod către catod, cunoscută sub numele de migrare
electroosmotică, sau electroendosmotică. Viteza de deplasare electroosmotică vEOF este
dependentă de mobilitatea electroosmotică a ionilor din electrolitul suport, potenţialul zeta
ξ generat la interfaţa capilară/electrolit suport, constanta dielectrică ε, vâscozitatea
electrolitului suport η şi câmpul aplicat:
v
EOF
⎛ ε ⋅ξ
⎞
= ⎜ ⋅ E
η
⎟
⎝ ⎠
Conform acestei relaţii, mobilitatea electroosmotică este:
ε ⋅ξ
μEOF =
η
221
(12.6)
(12.7)
De remarcat, însă, că această mobilitate este independentă de câmpul aplicat.
Sensul componentei de deplasare electroosmotică depinde de modul în care se
ionizează suprafaţa internă a capilarei.

Chiar în cazul în care materialul din care este confecţionată capilara nu prezintă
tendinţă de ionizare la interfaţa cu electrolitul suport, componenta electroosmotică apare
datorită adsorbţiei ionice, specifice la nivelul acestei suprafeţe. pH-ul electrolitului suport
influenţează în cea mai mare măsură mobilitatea electroosmotică. Fig. 12.3 prezintă o
astfel de dependenţă în raport cu materialul din care este confecţionată capilara şi cu pHul
electrolitului suport.
Peretele
capilarei
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
Strat
rigid
222
+
-
+
+
+
-
+
-
-
+
+
Strat
difuz
Fig 12.2. Reprezentarea dublului strat format la nivelul peretelui interior al capilarei.
μEOFx10
5
-4 (cm 2 /V.s)
4
3
2
1
0
Fig. 12.3. Dependenţa mobilităţii electroosmotice (μEOF) în raport cu pH-ul electrolitului suport,
pentru trei materiale din care sunt des confecţionate capilarele in HPCE.
Pyrex
Cuart
+
+
Teflon
3 4 5 6 7 8
pH
+
+
-
-
-
-
+
+
-
+
-
-
-

Modalităţile de influenţare a câmpului electroosmotic prin diverşi parametri
experimentali sunt prezentate schematic în tabelul următor.
Tabel 12.1. Modalităţi de control a câmpului electroosmotic.
Variabila Rezultat Observaţii
- poate conduce la
Câmpul electric aplicat
creştere proporţională a câmpului
EOF
scăderea rezoluţiei;
- produce încălzire prin
efect Joule.
pH-ul electrolitului suport
EOF scade la pH jos
EOF creşte la pentru pH ridicat
- modul cel mai eficient de
control al EOF;
- poate ioniza analiţii de
interes.
- I înalt şi încălzire prin
Tăria ionică (concentraţia
electrolitului suport)
Potenţialul zeta şi EOF scad la
creşterea tăriei ionice
efect Joule;
- procese de adsorbţie;
- variaţii ale conductibilităţii
şi picuri asimetrice.
Temperatura Modificări ale η (2-3% η/1°C) - controlată instrumental.
Prezenţa unui modificator
organic în electrolit
ξ,η = f(cmod.org.) - poate altera selectivitatea.
- cei anionici măresc EOF;
Agent tensioactiv
(surfactant)
Poate schimba sensul EOF
- cei cationici scad EOF
sau îi schimbă sensul;
- poate influenţa
selectivitatea.
Modificarea chimică a
suprafeţei interne a capilarei
Modificarea structurii suprafeţei
-multiple posibilităţi
- probleme de stabilitate.
In condiţii bine determinate, fluxul electroosmotic poate anula câmpul
electroforetic. In cazul în care e v v EOF > , speciile anionice vor migra către catod, în cazul
operării cu capilare din cuarţ. In consecinţă, mobilitatea analitului (μa) se poate calcula
după relaţia:
l ⋅ L l
μa = μe
+ μEOF
= =
t ⋅ V l ⋅ E
unde: V reprezintă voltajul aplicat;
l reprezintă lungimea efectivă a capilarei (până în zona de detecţie);
L reprezintă lungimea totală a capilarei;
t reprezintă timpul de migrare;
E reprezintă câmpul electric.
Eficienţa globală a separărilor HPCE este condiţionată de următorii factori:
• difuzie;
• injecţie;
• temperatură;
• adsorbţie selectivă;
223
(12.8)

• volumul zonei de detecţie;
• electrodispersie.
Abaterea standard pentru picul unui analit va fi, în consecinţă, condiţionată de
procesele de lărgire a frontului acestuia prin fenomenele amintite anterior:
2 2 2 2 2 2
σ T = σDif
+ σinj
+ σT
+ σads
+ σelectrodisp
(12.9)
Instrumentaţie
Componentele unui sistem electroforeză capilară de mare performanţă sunt
redate schematic în figura următoare.
Catod
Sistem de
achiziţie date
- +
Detector
Soluţii
tampon
Sursa de
tensiune
224
Capilară
Fig. 12.4. Schema-bloc a unui sistem de electroforeză capilară.
Conform datelor conţinute în Tabelul 12.2 rezultă că volumele de injecţie trebuie
să fie foarte reduse. De aceea, este important ca porţiunea din capilară în care proba
este introdusă în momentul injecţiei să fie cât mai redusă ca lungime, pentru a nu
influenţa eficienţa globală a separării. Cele mai importante modalităţi de injecţie în HPCE
sunt prezentate schematic în Fig. 12.5 şi descrise parametric în continuare. [22]
Injecţia hidrodinamică constă fie în aplicarea unui regim de presiune, fie a unui
regim de vacuum, în unul dintre rezervoarele în care se găseşte probă sau electrolit, fie
se apelează la sifonare între cele două rezervoare, prin intermediul capilarei. In
conformitate cu ecuaţia Hagen-Poiseuille, volumul de probă injectat este dat de relaţia:
4
ΔP
⋅d
⋅ π ⋅ t
vinj
=
128⋅
η⋅
L
unde: ΔP reprezintă diferenţa de presiune;
Anod
(12.10)

d reprezintă diametrul intern al capilarei;
t reprezintă timpul de injecţie;
η reprezintă vâscozitatea tamponului;
L reprezintă lungimea totală a capilarei.
In cazul sifonării ca modalitate de injecţie:
ΔP = ρ ⋅ g ⋅Δh
(12.11)
unde: ρ reprezintă densitatea tamponului;
g reprezintă constanta gravitaţională;
Δh reprezintă diferenţa de înălţime între rezervoare.
Cantitatea de probă injectată se poate calcula în conformitate cu relaţia:
2
2
πd
πd
Qinj
= linj
⋅ Cinj
⋅ = Vinj
⋅ tinj
⋅Cinj
⋅
(12.12)
4
4
Tabelul următor corelează parametrii de calcul ai volumului de injecţie cu
caracteristicile coloanei.
Tabelul 12.2. Dependenţa volumului de injecţie de parametrii capilarei şi presiunea aplicată.
d = 10μm d = 25μm d = 50μm d = 100μm
P × t Vinj linj Vinj linj Vinj linj Vinj linj
(mbar×s) (nL) (mm) (nL) (mm) (nL) (mm) (nL) (mm)
25 0,0008 0,01 0,03 0,06 0,5 0,25 8,2 1,04
50 0,0016 0,02 0,06 0,12 1,0 0,50 16,4 2,08
75 0,0024 0,03 0,09 0,18 1,5 0,75 24,6 3,13
100 0,0032 0,04 0,12 0,24 2,0 1,00 32,8 4,16
L = 75 cm; T = 25°C; η = 1.
S-a putut demonstra că proba poate penetra în coloană în momentul imersiei
capătului capilarei, fără aplicarea de presiune, vacuum sau sifonare. O lungime a
frontului de probă în astfel de condiţii a şi fost determinată. Efectul este mai însemnat în
cazul capilarelor cu diametru interior mai mare.
S-a mai luat în considerare şi faptul că imersia capătului capilarei în rezervorul de
probă poate conduce la adsorbţia de analiţi pe suprafaţa exterioară a acesteia, ceea ce
poate afecta ulterior, în mod serios, eficienţa separării. S-a demonstrat experimental că
spălarea suprafeţei externe a capilarei are ca efect creşterea simetriei picurilor şi
reducerea efectelor de trenă. Totodată, modul de tăiere a capătului capilarei prezintă un
rol important. O secţiune oblică de tăiere poate scădea eficienţa globală a separării la
jumătate.
Injecţia electrocinetică se realizează prin imersarea capătului coloanei capilare în
soluţia de probă şi aplicarea unui câmp electric (în general de 3 - 5 ori mai scăzut decât
cel folosit pe durata separării). Pe durata injecţiei electrocinetice analitul pătrunde în
capilară atât prin migrare, cât şi prin efectul de pompare al câmpului electroosmotic.
In cazul injecţiei electrocinetice apare o discriminare generată de mobilităţile
caracteristice fiecărui analit.
Cantitatea de analit injectată este dată de relaţia:
225

( μ
Q =
2
e + μEOF)
⋅ V ⋅ π ⋅ r ⋅C
⋅ t
L
unde: μe reprezintă mobilitatea electroforetică a analitului;
μEOF reprezintă mobilitatea electroosmotică;
V reprezintă voltajul aplicat;
r reprezintă raza capilarei;
C reprezintă concentraţia analitului;
t reprezintă timpul de injecţie;
L reprezintă lungimea totală a capilarei.
Presiune
Proba
Proba
Proba
Proba
Hidrodinamic
Hidrodinamic
Hidrodinamic
Electrocinetic
+ -
226
vacuum
Sifonare
Fig. 12.5. Modalităţi de injecţie a probei în HPCE.
(12.13)

Detecţia cea mai utilizată în HPCE se bazează pe absorbţia radiaţiei în ultraviolet
şi vizibil, prezentând asemănări cu detecţia în cromatografia de lichide (vezi tabelul
12.3). [22] Deoarece fereastra optică a detectorului este situată chiar pe peretele capilarei,
în acest caz nu există efecte de lărgire a picului HPCE datorat volumul celulei. Alte
metode de detecţie spectrometrică se bazează pe fluorescenţa analiţilor separaţi sau prin
inducerea fluorescenţei cu ajutorul laserului. Metodele amperometrice sau
conductometrice sunt de asemenea utilizate în detecţia HPCE.
Tabel 12.3. Performanţele tipurilor de detecţie în HPCE.
Tip de detecţie Limita de detecţie Limita de detecţie
Avantaje/
(masă)* (concentraţie)
dezavantaje
Absorbţie UV-VIZ 10 -13 – 10 -16 10 -5 – 10 -8
- universală;
- informaţie structurală
prin DAD.
Fluorescenţă 10 -15 – 10 -17 10 -7 – 10 -9
- sensibilitate mare;
- de regulă, necesită
derivatizare.
Fluorescenţă indusă
prin laser
10 -18 – 10 -20 10 -14 – 10 -16
- sensibilitate mare;
- de regulă, necesită
derivatizare;
- scumpă.
Amperometrie 10 -18 – 10 -19 10 -10 – 10 -11
- sensibilitate mare;
- selectivitate în cazul
compuşilor electroactivi;
- necesită componente
electronice speciale şi
modificări ale capilarei.
Conductometrie 10 -15 – 10 -16 10 -7 – 10 -8
- universală;
- necesită componente
electronice speciale şi
modificări ale capilarei.
Spectrometrie de masă 10 -16 – 10 -17 10 -8 – 10 -9
- sensibilitate mare;
- informaţie structurală;
- interfaţa cu MS este
complicată.
* pentru 10 nL volum de injecţie.
12.4 Cromatografia electrocinetică micelară
Cromatografia electrocinetică micelară (MEKC – „Micellar Electrokinetic
Chromatography”) prezintă caracteristici comune electroforezei şi cromatografiei.
Introdusă în 1984 de către Terabe, MEKC reprezintă în prezent unul dintre cele mai
utilizate mecanisme în electroforeza capilară de mare performanţă, impunându-se
datorită aplicaţiilor sale ca o tehnică de separare de sine stătătoare. [131]
In cazul cromatografiei electrocinetice micelare, în electrolitul suport se adaugă
un agent tensioactiv într-o concentraţie mai mare decât concentraţia sa micelară. De
-
exemplu, agentul tensioactiv poate fi anionic (R-SO3 ). In consecinţă, micelele generate
vor avea o sarcină globală negativă şi vor crea în interiorul lor un spaţiu hidrofob în care
vor pătrunde molecule de analit cu structura hidrofobă. Câmpul electroosmotic este
227

generat în aşa fel încât să depăşească în modul pe cel electroforetic, caracteristic
micelelor. Rezultanta celor două câmpuri va determina deplasarea lentă a micelelor
anionice către electrodul pozitiv, acolo unde se situează şi zona de detecţie.
Dacă proba conţine analiţi neionici aceştia se vor deplasa spre catod în baza
componentei de deplasare electroosmotică. Ordinea de eluţie este dată de ordinea
hidrofobicităţii lor: cu cât analiţii sunt mai hidrofobi, cu atât mai mult distribuţia acestora
între micelă şi electrolitul suport va fi mai favorabilă staţionarii în interiorul micelei.
Aceasta situaţie este ilustrată în Fig. 12.6, în care este redat rezultatul unei separări
MEKC a trei compuşi A, B şi C, având valorile log Kow crescătoare în ordinea dată.
Ultimul semnal înregistrat este cel al micelelor (tm), în timp ce primul semnal (pic)
înregistrat corespunde fluxului electroosmotic, fiind analog timpului mort (t0) din
cromatografia de lichide.
Compuşii puternic hidrofili, care nu interacţionează cu micelele vor elua în acelaşi
timp cu fluxul electroosmotic. Compuşii puternic hidrofobi vor elua în acelaşi timp cu
micelele formate. In concluzie, compuşii neutri din punct de vedere electric vor elua în
intervalul de timp [t0, tm]. Pe baza acestor parametri de retenţie se pot calcula mărimile
cunoscute în cromatografie, factorul de capacitate (k’) şi constanta de distribuţie (K) a
analiţilor între electrolit (faza mobilă, cu volumul Vmicele) şi micele (analog fazei staţionare
în cromatografia de lichide, cu volumul Velectrolit).
tr
− t0
Vmicele
k'= = K ⋅
(12.14)
tr
V
t
electrolit
0(
1−
)
tm
, în care a doua egalitate este dedusă conform relaţiei 9.50.
0
Flux
electroosmotic
A
B
t0 tA tB tC tm
228
C
Micele
Fig. 12.6. Separarea prin MEKC a trei analiţi A, B şi C, având A B C
lg Kow
< lg Kow
< lg Kow
.
Dacă în probă se vor găsi, specii anionice de analiţi sunt importante de cunoscut
mobilităţile lor electroforetice. Dacă ve analit este mai mică în raport cu ve m , analitul anionic
va migra mai repede spre anod şi astfel va elua înaintea tm. Distribuţia lui în spaţiul
intramicelar este puţin probabilă, deci poate fi neglijată. Dacă ve analit este mai mare în
m analit
raport cu ve , dar totuşi v e < vEOF
, atunci analitul anionic eluează după tm.

Selectivitatea separărilor MEKC este influenţată de natura agentului tensioactiv
adăugat în electrolitul suport pentru formarea micelelor (care poate fi anionic, cationic,
amfionic, neionic, sau amestecuri între aceştia), pH-ul electrolitului suport, concentraţia şi
natura tamponului utilizat, temperatura, sau prezenţa unor specii modificatoare (solvent
organic, uree, ioni metalici, prezenţa unor selectori chirali). Agenţii tensioactivi de tip
neionic sau amfionic au câteva avantaje faţă de cei ionici, prin faptul că nu modifică
drastic fluxul electroosmotic, nu modifica conductivitatea electrolitului suport şi au o
influenţă mai mică asupra structurii sau activităţii în cazul separărilor de proteine.
Ca exemple de aplicaţii importante ale cromatografiei electrocinetice micelare pot
fi menţionate separările de amino-acizi sau nucleotide, vitamine hidro- şi lipo-solubile,
compuşi de importanţă farmaceutică, hidrocarburi aromatice, compuşi cu caracter
exploziv, etc. Ca avantaje ale acestei tehnici analitice pot fi menţionate timpul mic de
separare pentru probe complexe sau cantitatea mică de probă necesară.
12.5. Izotacoforeza
In separarea prin izotacoforeză, componenţii probei aflaţi în formă ionică prezintă
mobilităţi diferite într-un câmp electric. In izotacoforeza zonală obişnuită o probă este
separată în zone utilizând doi electroliţi suport, având mobilităţi electroforetice diferite:
unul cu o mobilitate foarte mare (de exemplu, ionul acetat) şi altul cu o mobilitate
electroforetică foarte mică (de exemplu, ionul glicinat). Proba este introdusă între zonele
celor doi electroliţi, după care este aplicat un câmp electric. Principiul de separare a trei
anioni oarecare este ilustrat schematic în figura de mai jos.
a
b
c
B -
X - , Y - , Z -
Y - , Z -
229
A -
B - A -
B -
X -
Z - , Y - , X -
Fig. 12.7. Principiul de separare prin izotacoforeză:
a) proba conţinând trei anioni (notaţi cu X - , Y - şi Z - ) sunt injectaţi între doi electroliţi
(A - - frontal; B - - final);
b) se aplică un curent electric între cei doi electrozi, iar anionii migrează spre electrodul pozitiv;
c) după un timp are loc separarea celor trei anioni în trei zone distincte.
A -