CAPITOLUL 9 Separarea cromatografică – aspecte generale
CAPITOLUL 9 Separarea cromatografică – aspecte generale
CAPITOLUL 9 Separarea cromatografică – aspecte generale
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>CAPITOLUL</strong> 9<br />
<strong>Separarea</strong> <strong>cromatografică</strong> <strong>–</strong> <strong>aspecte</strong> <strong>generale</strong><br />
9.1. Clasificarea metodelor cromatografice<br />
Începuturile separărilor cromatografice se datorează lui Ţvet (1903), care a<br />
realizat primele separări de coloranţi vegetali pe coloană umplută cu carbonat de calciu.<br />
Termenul de eluţie <strong>cromatografică</strong> a fost introdus mai târziu, de către Reichstein şi van<br />
Euw (1938), care să descrie principial procesul cromatografic de separare a<br />
componenţilor probei la trecerea printr-o fază staţionară. Tot în acelaşi an, Izmailov şi<br />
Shraiber şi-au publicat rezultatele privind primele separări cromatografice pe strat subţire.<br />
<strong>Separarea</strong> <strong>cromatografică</strong> are la bază interacţia diferenţiată a componenţilor unei<br />
probe faţă de două faze, numite: faza staţionară şi faza mobilă (aflată în mişcare faţă de<br />
faza staţionară). Procesul se petrece într-o coloană <strong>cromatografică</strong>, sau pe suprafaţa<br />
plană a unei plăci pe care este depusă faza staţionară. Analiza <strong>cromatografică</strong> este un<br />
proces cuplat între separarea <strong>cromatografică</strong> şi determinarea (detecţia) compuşilor<br />
separaţi (proces care se bazează pe măsurarea unei proprietăţi fizice).<br />
Din această prezentare, rezultă că separările cromatografice pot fi clasificate fie<br />
din punct de vedere al naturii celor două faze (staţionară şi mobilă), fie din punct de<br />
vedere al mecanismului de separare, sau fie din punctul de vedere constructiv al<br />
ansamblului de faze.<br />
Din punct de vedere al naturii celor două faze distingem următoarele clase de<br />
separări cromatografice:<br />
- cromatografie de gaze (GC) în care faza mobilă este un gaz inert; în funcţie de natura<br />
fazei staţionare se disting următoarele tehnici gaz-cromatografice:<br />
a) separarea gaz-lichid în care faza mobilă este un gaz inert, iar faza staţionară<br />
este un „lichid”, depus pe un suport inert, sau pe peretele unei coloane<br />
cromatografice;<br />
b) separare gaz-solid (SGC), în care faza mobilă este un gaz inert, iar faza<br />
staţionară este un solid;<br />
- separare prin cromatografia de lichide (LC), în care faza mobilă este un lichid, iar faza<br />
staţionară este de regulă un solid;<br />
- cromatografie în fluide supercritice (SFC), în care faza mobilă este un fluid supercritic.<br />
Mecanismul care stă la baza de separării cromatografice se poate baza pe: 1)<br />
adsorbţie; 2) repartiţie; 3) schimb ionic; 4) excluziune sterică, etc. Adeseori, procesele<br />
cromatografice pot decurge printr-o combinaţie a acestor mecanisme.<br />
In funcţie de mecanismul de separare cromatografia de lichide (în care<br />
polaritatea şi hidrofobicitatea analiţilor, a fazei staţionare şi a fazei mobile joacă un rol<br />
determinant) se împarte în trei variante:<br />
i) cromatografia de lichide în faza normală (denumită aşa mai degrabă din punctul de<br />
vedere istoric), în care faza staţionară este polară, iar faza mobilă este nepolară;<br />
ii) cromatografia de lichide în faza inversă, în care faza staţionară este nepolară şi<br />
hidrofobă, iar faza mobilă este polară.<br />
iii) cromatografie de lichide prin mecanism de schimb ionic, în care faza staţionară<br />
133
este un schimbător de ioni, iar faza mobilă este apoasă cu pH controlat.<br />
Din punct de vedere constructiv se disting: cromatografia pe coloană şi<br />
cromatografia planară (pe hârtie sau pe strat subţire). In prezent, cromatografia pe<br />
coloană, în una din clasele menţionate anterior reprezintă una dintre cele mai importante<br />
tehnici de investigare a probelor multicomponent în chimia analitică. După cum spune şi<br />
denumirea, rolul central în separarea <strong>cromatografică</strong> îl are coloana <strong>cromatografică</strong>, în<br />
care se găseşte faza staţionară.<br />
9.2. Parametrii unei separări cromatografice<br />
Cromatograma reprezintă dependenţa în timp a proprietăţii măsurate de<br />
detectorul sistemul cromatografic. Intr-o cromatogramă întâlnim picuri cromatografice şi o<br />
linie de bază (constantă sau variabilă). O separare <strong>cromatografică</strong> a unui amestec de n<br />
componenţi trebuie să conducă la o cromatogramă cu n picuri cromatografice. De<br />
exemplu, în figura 9.1 este redată cromatograma HPLC a unei probe conţinând 14<br />
hidrocarburi aromatice polinucleare în acetonitril. După cum se poate observa, numărul<br />
de picuri cromatografice este egal cu 14; dintre acestea doar picurile 10 şi 11 nu sunt<br />
perfect separate în linia de bază.<br />
Absorbanta (mAU)<br />
60<br />
55<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
6<br />
5<br />
7<br />
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32<br />
Timp (min)<br />
Fig. 9.1. Cromatograma unui amestec de 14 compuşi.<br />
(amestec de 14 hidrocarburi aromatice polinucleare separate prin HPLC<br />
în fază inversă şi detecţie prin spectrometrie de absorbţie moleculară UV).<br />
Semnalul cromatografic este numit pic cromatografic, a cărui formă redă de fapt o<br />
imagine a echilibrelor de distribuţie ale moleculelor de analit între faza mobilă şi faza<br />
staţionară, care se petrec în coloana <strong>cromatografică</strong>. Parametrii matematici ai unui pic<br />
cromatografic ideal (picul 5 din Fig. 9.1, apropiat de forma Gauss) sunt daţi în figura de<br />
mai jos, care la rândul lor sunt utilizaţi la determinarea aşa-numiţilor parametri<br />
cromatografici ai unei separări. [85]<br />
8<br />
134<br />
9<br />
10<br />
11<br />
12<br />
13<br />
14
Semnal<br />
15<br />
14<br />
13<br />
12<br />
11<br />
10<br />
9<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
Y 0<br />
Y 0/10<br />
Y0/2<br />
σ σ<br />
w1/2<br />
w10%<br />
7.2 7.3 7.4 7.5 tR 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 min<br />
w<br />
135<br />
Punct de inflexiune<br />
Fig. 9.2. Parametrii unui pic cromatografic ideal (de formă Gauss).<br />
Linia de bază<br />
Forma ideală a picului cromatografic este descrisă de ecuaţia de tip Gauss, în<br />
forma următoare:<br />
2<br />
4(<br />
t−<br />
t R )<br />
− ⋅ln<br />
2<br />
w<br />
Y = Y<br />
1/<br />
2<br />
0 ⋅ e<br />
(9.1)<br />
, în care Yo este înălţimea maximă a picului cromatografic, măsurată la valoarea timpului,<br />
numit timp de retenţie (tR), w1/2 este semi-lăţimea picului (lăţimea picului măsurată la<br />
jumătatea înălţimii); ln 2 = 0,693.<br />
Forma unui picul cromatografic simetric, dar mai larg în bază poate fi descrisă la<br />
fel de bine şi de funcţia Cauchy:<br />
Y0<br />
Y = (9.2)<br />
2(<br />
t − tR<br />
) 2<br />
1+<br />
[ ]<br />
w1/<br />
2<br />
unde, de asemenea: Y0 este înălţimea picului pentru t = tR, iar w1/2 este lăţimea picului la<br />
jumătatea înălţimii (semi-lăţime). [87] Forma celor două funcţii nu diferă foarte mult, aşa<br />
după cum se poate observa din regresiile respective aplicate unui pic real în figura<br />
următoare, prelucrat din cele redate în Fig 9.1.
Semnal<br />
65<br />
60<br />
55<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5<br />
Timp de retentie (min)<br />
Gauss Cauchy<br />
136<br />
Semnal<br />
65<br />
60<br />
55<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5<br />
Timp de retentie (min)<br />
Fig. 9.3. Modelarea unui pic cromatografic real (punctat gros) prin<br />
funcţia Gauss, respectiv prin funcţia Cauchy (linie continuă).<br />
Pentru un pic simetric de tip Gauss, lăţimea acestuia măsurată între punctele de<br />
inflexiune este 2σ. Cum punctele de inflexiune sunt mai dificil de evidenţiat, se preferă a<br />
se măsura lăţimea picului la jumătatea înălţimii acestuia, notată mai sus cu w1/2. Intre w1/2<br />
şi σ exista relaţia simplă:<br />
w1/2 = 2,35·σ (9.3)<br />
Aria picului (A) care este o mărime cantitativă, ce depinde de cantitatea de analit<br />
injectată în coloana <strong>cromatografică</strong>, se obţine din integrarea funcţiei Gauss: [88]<br />
1<br />
π<br />
A = Y0<br />
⋅ w1/<br />
2 ⋅<br />
(9.4)<br />
2<br />
ln 2<br />
sau a funcţiei Cauchy:<br />
0 1/<br />
2 w Y<br />
π<br />
A = ⋅<br />
(9.5)<br />
2<br />
In practică, integrarea picurilor se face în mod automat cu ajutorul soft-ul sistemului de<br />
achiziţie şi prelucrare a datelor cu care este dotat sistemul cromatografic. Analistul<br />
trebuie să precizeze aria minimă de pic care poate fi măsurată. Sub această limită<br />
picurile cromatografice din cromatograma înregistrată nu vor fi raportate de către soft-ul<br />
sistemului de achiziţie şi prelucrare a datelor. Integrarea se poate face şi manual de către<br />
analist. Problema alegerii liniei de bază („baseline”), faţă de care se va face integrarea,<br />
este dificilă atunci când picurile cromatografice se apropie ca mărime de semnalele din<br />
linia de bază (analitul se găseşte în proba injectată la limita de detecţie a detectorului<br />
cromatografic). In acest caz, analistul trebuie într-o bună aproximaţie vizuală să<br />
stabilească media semnalului de bază faţă de care vor alege punctele X şi Y în care se
va integra picul cromatografic. Această situaţie este ilustrată în figura de mai jos, cu<br />
alegerea greşită şi corectă a punctelor de integrare.<br />
Semnal<br />
Linia medie<br />
de bază<br />
Pic<br />
cromatografic<br />
de integrat<br />
X Y<br />
Linie de bază greşită<br />
137<br />
tR (min)<br />
Fig. 9.4. Fereastra unei porţiuni dintr-o cromatogramă în care picul cromatografic<br />
este corect integrat prin alegerea punctelor X şi Y în linia media a semnalului de bază<br />
(ales neconstant <strong>–</strong> cu drift).<br />
In general, între aria picului (Apic) şi cantitatea de analit injectată în coloană<br />
injectat<br />
( Q analit , exprimată în µg, sau în ng, sau în pg, etc) există o relaţie de linearitate în<br />
conformitate cu funcţia de răspuns 1.3 şi a discuţiei asupra domeniului de linearitate din<br />
cap. 1.2:<br />
injectat<br />
Apic = a + b ⋅ Qanalit<br />
(9.6)<br />
Mărimea Q poate fi substituită şi prin concentraţia probei injectate, cu condiţia ca în<br />
procedura de calibrare şi cea de analiză, volumele de soluţii standard, respectiv de probă<br />
analizată, să fie identice.<br />
Factorul de răspuns (Fi) al unui detector faţă de un anumit analit i detectat la<br />
ieşirea din coloana <strong>cromatografică</strong> este dat de raportul dintre aria picului corespunzător<br />
analitului i şi cantitatea de analit (unităţi de masă) injectată în coloană:<br />
Apic,<br />
i<br />
F i = (9.7)<br />
injectat<br />
Qanalit,<br />
i
Atunci când picul cromatografic creşte ca arie, porţiunea de arie rezultată prin<br />
integrarea mai puţin corectă, ilustrată în figura de mai sus, devine nesemnificativă în<br />
raport cu aria acestuia, astfel că în practică nu se mai măreşte imaginea semnalului de<br />
fond pentru a găsi punctele corecte de integrare.<br />
De foarte multe ori, forma picurilor este asimetrică. In acest caz, alegerea unei<br />
funcţii utile în descrierea formei picului cromatografic este mai dificilă. De regulă,<br />
asimetria se datorează unei aşa-zise cozi („tailing”) a picului cromatografic, care poate fi<br />
în faţa picului („pre-tailing”) sau în spatele picului (post-tailing”). [89]<br />
Simetria unui pic cromatografic (notată cu Sim) poate fi exprimată în mai multe<br />
moduri. Dacă aceasta se măsoară în punctele de inflexiune a curbei picului redat în Fig.<br />
9.2, Sim devine:<br />
σ'<br />
Sim = (9.8)<br />
σ<br />
Simetria poate fi măsurată mai exact la jumătatea înălţimii picului cromatografic, atunci<br />
când w1/2 este împărţită de verticala din maximul picului în două părţi: B în partea dreaptă<br />
şi C în partea stângă. In acest caz simetria devine:<br />
B<br />
Sim = (9.9)<br />
C<br />
In mod practic, cozile picurilor cromatografice se evidenţiază după jumătatea<br />
înălţimii maxime a picului cromatografic. In acest caz simetriile redate de ec. 9.8 sau 9.9<br />
nu mai sunt corecte. De aceea, se preferă măsurarea lui B şi C, la o înălţime a picului<br />
cromatografic cât mai aproape de linia de bază, dar suficient de mare ca să se evite<br />
erorile legate delimitarea picului (măsurarea lui w este afectată de erori). In acest caz,<br />
cea mai recomandată măsurare este la 10% din maximul înălţimii picului, când parametrii<br />
B şi C sunt notaţi cu B10%, respectiv C10%, iar simetria are expresia:<br />
B10%<br />
Sim = (9.10)<br />
C10%<br />
Un parametru important a unei separări cromatografice este timpul mort (notat cu<br />
t0). Acesta semnifică durata de timp în care faza mobilă parcurge coloana <strong>cromatografică</strong>.<br />
Acest parametru se poate măsura cunoscând debitul fazei mobile şi lungimea coloanei<br />
(în cromatografia de gaze) sau introducând în proba injectată un component total inert<br />
faţă de faza staţionară (în cromatografia de lichide), care va elua astfel din coloana<br />
<strong>cromatografică</strong> la timpul de retenţie notat cu t0. Cu ajutorul acestui parametru se pot<br />
calcula alţi doi parametrii foarte importanţi ai unei separări cromatografice: timpul de<br />
retenţie ajustat, numit şi timp de retenţie net (t’R) şi factorul de capacitate (k’), definiţi prin<br />
relaţiile:<br />
t'R = tR<br />
− t0<br />
(9.11)<br />
tR<br />
− t0<br />
t'<br />
k '=<br />
= R<br />
(9.12)<br />
t0<br />
t0<br />
138
Din punct de vedere practic, minimul separării cromatografice a doi compuşi<br />
injectaţi (notaţi în ordinea eluţiei crescătoare cu i şi j) în coloana <strong>cromatografică</strong> se obţine<br />
atunci când picurile lor cromatografice ajung în semnalul liniei de bază. Gradul de<br />
separare <strong>cromatografică</strong> este exprimată prin rezoluţia <strong>cromatografică</strong> (Rs). Pentru picuri<br />
simetrice formula de calcul a acestui parametru este dată de expresia:<br />
( tR,<br />
j − tR<br />
, i)<br />
( tR,<br />
j − tR,<br />
i)<br />
Rs<br />
= = 2 ⋅<br />
(9.13)<br />
0,<br />
5⋅<br />
( wi<br />
+ w j)<br />
( w1<br />
+ w2<br />
)<br />
In felul acesta se poate deduce că minimul lui Rs pentru ca cele două picuri<br />
cromatografice i şi j să fie separare în linia de bază este 1. Dacă picurile nu sunt<br />
separate, măsurarea pentru wi şi wj nu poate avea loc. Ţinând cont că: wi = 2·w1/2,i şi wj =<br />
2·w1/2,j, formula rezoluţiei devine:<br />
tR,<br />
j − tR,<br />
i<br />
Rs<br />
= (9.14)<br />
w1/<br />
2,<br />
i + w1/<br />
2,<br />
j<br />
O măsură a selectivităţii cromatografice este dată de factorul de separare (notat<br />
cu αij) a doi compuşi i şi j (eluând în această ordine), care este definit prin relaţia: [90]<br />
t'R,<br />
j k'<br />
j<br />
αij<br />
= = ≥ 1<br />
(9.15)<br />
t'R,<br />
i k'i<br />
Eficienţa unei separări cromatografice se reflectă în lărgimea picului<br />
cromatografic: cu cât picul cromatografic este mai îngust, cu atât mai mare este eficienţa<br />
separării cromatografice. Cantitativ, eficienţa unui proces de separare se exprimă prin<br />
numărul de talere teoretice (notat cu N). Conceptul de taler teoretic este împrumutat din<br />
teoria distilării, care în cazul unei separări cromatografice s-ar traduce prin porţiunea din<br />
coloana <strong>cromatografică</strong> în care se stabileşte echilibrul de distribuţie al analitului între faza<br />
mobilă şi faza staţionară. Formula de calcul a numărului de talere teoretice Ni<br />
corespunzător unui analit i este următoarea: [90]<br />
tR,<br />
i 2<br />
N i = ( )<br />
(9.16)<br />
σi<br />
Ţinând cont de relaţia 9.3, formula de calcul a parametrului N devine:<br />
tR,<br />
i 2<br />
Ni = 5,<br />
54⋅<br />
( )<br />
(9.17)<br />
w1/<br />
2,<br />
i<br />
Înălţimea talerului teoretic (notată cu h) se poate calcula cunoscând lungimea<br />
coloanei cromatografice L: h = L/N.<br />
Cu aceste ultime noţiuni, se poate reveni la formula de calcul a rezoluţiei. Ţinând<br />
cont de relaţiile anterioare se poate deduce formula de calcul a rezoluţiei, pentru picuri<br />
cromatografice de arii aproximativ egale şi caracterizate într-o bună aproximaţie de<br />
aceiaşi eficienţă (N):<br />
139
N k'<br />
R i<br />
s = ⋅ ⋅ ( αij<br />
−1)<br />
(9.18)<br />
4,<br />
7 k'i<br />
+ 1<br />
Ecuaţia de bază pentru rezoluţia între 2 picuri cromatografice inegale ca arie, notate cu i<br />
şi j poate fi propusă prin modificarea celei de mai sus, în forma:<br />
N k'<br />
Rs = ⋅ ⋅ ( αij<br />
−1)<br />
(9.19)<br />
4,<br />
7 k'+<br />
1<br />
, unde k ' este media aritmetică a celor doi factori de capacitate pentru analiţii i şi j, k’i şi<br />
respectiv k’j. Cu aceste precizări, rezoluţia dintre cele două picuri cromatografice devine:<br />
N k'<br />
j−k'i<br />
k'i<br />
+ k'<br />
j<br />
Rs<br />
= ⋅ ⋅<br />
(9.20)<br />
4,<br />
7 k'i<br />
k'i<br />
+ k'<br />
j+<br />
2<br />
k'<br />
Maximul raportului i + k'<br />
j este 1, atunci când k’i şi k’j sunt foarte mari. Pe de altă parte,<br />
k'i<br />
+ k'<br />
j+<br />
2<br />
pentru k’ mare, picurile cromatografice devin foarte largi, cu timp de retenţie foarte mare,<br />
uneori greu de integrat. De aceea, valoarea lui k’ între 1 şi 20 este considerată ca<br />
acceptabilă.<br />
9.3. Teoria talerelor<br />
Aceasta teorie este una dintre cele mai importante teorii în modelarea procesului<br />
cromatografic, iniţiată de Martin şi Singh şi apoi dezvoltată de Said. [91] Teoria talerelor<br />
descrie practic curba de eluţie (cromatograma) unui anumit compus chimic. Această<br />
teorie propune că un analit participant la un proces cromatografic participă la un echilibru<br />
de repartiţie (distribuţie) între faza mobilă şi faza staţionară, pe o porţiune mai mult sau<br />
mai puţin îngustă din coloana <strong>cromatografică</strong>. Această imagine (modelare) conduce<br />
imediat la o conexiune cu teoria distilării, care consideră că o coloană este structurată<br />
într-un număr de celule sau talere, numite în cazul procesului cromatografic talere<br />
teoretice. Fiecare taler are o lungime finită, în care analitul se găseşte (staţionează) un<br />
anumit interval de timp. Cu cât un taler are dimensiunea mai mică, cu atât mai eficient<br />
este procesul de partiţie al analitului între cele două faze; cu micşorarea dimensiunii unui<br />
taler, numărul acestora atribuit unei coloane cromatografice creşte. Ca urmare, numărul<br />
de talere teoretice atribuit unei coloane cromatografice a fost identificat cu eficienţa<br />
coloanei.<br />
Teoria talerelor arată că lăţimea unui pic cromatografic (dispersia unui pic<br />
cromatografic) este invers proporţională cu rădăcina pătrată a eficienţei, sau altfel spus:<br />
cu cât eficienţa este mai mare, cu atât picul cromatografic este mai îngust.<br />
Pentru aceasta să considerăm echilibrul de repartiţie <strong>cromatografică</strong> a unui analit<br />
X, între o fază mobilă (notată cu indicele m) şi o fază staţionară (s):<br />
Xm → ← Xs (9.21)<br />
140
Acest echilibru este caracterizat de constanta respectivă de echilibru (K), dată de ecuaţia:<br />
Taler (p-1) Taler p Taler (p+1)<br />
Faza<br />
staţionară<br />
v s<br />
[X] s,p-1<br />
Faza<br />
mobilă<br />
v m<br />
[X] m,p-1<br />
[ X]<br />
s<br />
K = (9.22)<br />
[ X]<br />
m<br />
Prin [X] este notată concentraţia analitului X în faza staţionară sau mobilă indicată prin<br />
indicele respectiv. Prin diferenţierea ecuaţiei 9.22 se va obţine următoarea relaţie:<br />
d[ X]<br />
s = K ⋅d[<br />
X]<br />
m<br />
(9.23)<br />
Teoria talerelor îşi propune să stabilească o relaţie între concentraţia analitului X în faza<br />
mobilă după parcurgerea a n talere din coloana <strong>cromatografică</strong>. Pentru aceasta să<br />
considerăm 3 talere „teoretice” consecutive, notate cu (p <strong>–</strong> 1), p şi (p + 1), iar parametrii<br />
eluţiei cromatografice în aceste talere redaţi în Fig. 9.5.<br />
Faza<br />
staţionară<br />
v s<br />
[X] s,p<br />
Faza<br />
mobilă<br />
v m<br />
[X] m,p<br />
Faza<br />
staţionară<br />
v s<br />
[X] s,p+1<br />
Faza<br />
mobilă<br />
v m<br />
[X] s,p+1<br />
141<br />
Fig. 9.5. Reprezentarea a trei talere teoretice<br />
succesive dintr-o coloană <strong>cromatografică</strong>.<br />
Prin dv se notează variaţia de volum de faza mobilă ce trece din talerul (p <strong>–</strong> 1) în talerul<br />
p, iar dm reprezintă variaţia de masă de analit din talerul p. Variaţia dm reprezintă<br />
diferenţa de masă de analit X, atunci când volumul dv de fază mobilă iese din talerul (p <strong>–</strong><br />
1) şi intră în talerul p. In acest caz se poate scrie:<br />
dm = ([ X]<br />
m,<br />
p−<br />
1 −[<br />
X]<br />
m,<br />
p)<br />
dv<br />
(9.24)<br />
In condiţii de echilibru de distribuţie a analitului X între faza mobilă şi faza staţionară<br />
valoarea lui dm poate fi scrisă:<br />
dm = vs<br />
d[<br />
X]<br />
s,<br />
p + vmd[<br />
X]<br />
m,<br />
p<br />
(9.25)<br />
Substituind pe d[X]s,p din ec. 9.23 se va obţine:<br />
dm = ( vm<br />
+ Kvs<br />
) ⋅ d[<br />
X]<br />
m,<br />
p<br />
(9.26)<br />
Din ec. 9.24 şi 9.26 se obţine următoarea ecuaţie:
d[<br />
X]<br />
m,<br />
p [ X]<br />
m,<br />
p−1<br />
−[<br />
X]<br />
m,<br />
p<br />
=<br />
dv vm<br />
+ vsK<br />
142<br />
(9.27)<br />
Numitorul din această ecuaţie este definit ca volumul talerului şi este notat cu vt. Numărul<br />
de talere (ν) din coloana <strong>cromatografică</strong> având volumul V devine:<br />
V V<br />
ν = =<br />
(9.28)<br />
vt<br />
vm<br />
+ K ⋅ vs<br />
De unde prin diferenţiere se va obţine:<br />
dν<br />
dV<br />
= (9.29)<br />
vm<br />
+ K ⋅ vs<br />
Cu aceasta, ecuaţia 9.27 devine:<br />
d[<br />
X]<br />
m,<br />
p<br />
= [ X]<br />
m,<br />
p−<br />
1 − [ X]<br />
m,<br />
p<br />
(9.30)<br />
dν<br />
Aceasta ecuaţie diferenţială descrie viteza de modificare a concentraţiei unui analit în<br />
faza mobilă din talerul notat cu p, la trecerea fazei mobile prin el. Soluţia acestei ecuaţii<br />
redă concentraţia analitului X în faza mobilă din talerul notat cu p, pentru un număr de<br />
talere teoretice din coloana <strong>cromatografică</strong> notat cu ν:<br />
−ν<br />
p<br />
[ X]<br />
e ν<br />
[ X]<br />
0 ⋅ ⋅<br />
m,<br />
p =<br />
p!<br />
(9.31)<br />
, unde [X]0 reprezintă concentraţia iniţială a analitului X, la injectarea sa în coloana<br />
<strong>cromatografică</strong>, care se găseşte în faza mobilă. Ecuaţia (9.31) arată că modelul<br />
distribuţiei continue între faza mobilă şi faza staţionară este unul de tip Poisson. Pentru<br />
valori mici ale lui ν distribuţia este asimetrică, devenind simetrică pentru valori mari ale lui<br />
ν. In practică ν este mult mai mare decât 100, iar distribuţia de mai sus devine una<br />
Gauss, în acord cu forma experimentală obţinută pentru picurile cromatografice.<br />
Înălţimea unui taler teoretic este notată cu H. Numărul de talere teoretice dintr-o<br />
coloană cu lungimea L fiind notat cu N, rezultă că H va fi:<br />
L<br />
H = (9.32)<br />
N<br />
Înălţimea redusă a talerului teoretic este dat de raportul H/dp, unde dp este<br />
diametrul particulelor fazei staţionare.<br />
9.4. Ecuaţia van Deemter<br />
Teoria talerelor redă din punct de vedere cantitativ o imagine asupra proceselor<br />
care au loc în coloană şi exprimă calitatea unei coloane prin numărul de talere teoretice
atribuite procesului cromatografic pentru un anumit analit injectat în coloană. Cu toate<br />
acestea, această teorie nu redă şi o explicaţie asupra mecanismelor şi fenomenelor care<br />
stau la baza echilibrelor de distribuţie ale analiţilor între faza mobilă şi faza staţionară.<br />
Teoria dispersiei frontului de analit în coloana <strong>cromatografică</strong> studiază<br />
fenomenele care au loc la transferul probei în coloana <strong>cromatografică</strong>. Aceasta se<br />
bazează pe viteza fazei mobile şi a parametrilor procesului, precum viteza transferului de<br />
masă între cele două faze participante la procesul cromatografic, viteza de difuziune a<br />
moleculelor de analit (solut) de-a lungul coloanei şi hidrodinamica fazei mobile. O<br />
reprezentare a acestui fenomen este redată în figura următoare.<br />
Fig. 9.6. Reprezentarea lărgirii frontului de analit la trecerea prin coloana <strong>cromatografică</strong>.<br />
Glueckauf a studiat efectele a trei factori asupra procesului cromatografic,<br />
descrişi în continuare: [92]<br />
1) difuzia obişnuită în faza mobilă în direcţia de deplasare a acesteia; acest proces are<br />
loc de regulă atunci când există o regiune de concentraţie mare şi una de concentraţie<br />
mică, în acord cu legea lui Fick;<br />
2) difuzia longitudinală în faza mobilă, în special datorită ciocnirilor moleculelor de analit<br />
cu particulele fazei staţionare (pentru coloane umplute) şi între moleculele de analit şi<br />
cele ale fazei mobile;<br />
3) mărimea particulelor fazei staţionare.<br />
Măsura împrăştierii zonei după o distribuţie normală Gauss este dată de deviaţia<br />
standard. Această împrăştiere este definită de modelul deplasării aleatoare ale<br />
moleculelor de analit prin numărul de paşi efectuaţi (n) şi lungimea fiecăruia (notată cu l):<br />
σ = l ⋅ n<br />
(9.33)<br />
Această relaţie simplă arată că împrăştierea zonei este proporţională cu lungimea porilor<br />
şi rădăcina pătrată a numărului acestora.<br />
Din teoria statistică se ştie că deviaţia standard nu este o mărime aditivă, în cazul<br />
influenţei mai multor factori. In schimb, pătratul deviaţiei standard este aditiv şi este<br />
demonstrat de teoria propagării erorilor (vezi cap. 1.5):<br />
2<br />
∑<br />
σ = σ<br />
(9.34)<br />
i<br />
2<br />
i<br />
143
, unde σi reprezintă deviaţia standard pentru fiecare din cele 3 procese discutate ca<br />
influenţând lărgirea zonei moleculelor de analit.<br />
Termenul procesului de difuziune obişnuită (σd) este definit prin ecuaţia de<br />
difuziune a lui Einstein:<br />
σ 2 D t<br />
2 d = ⋅ ⋅<br />
(9.35)<br />
, în care D este coeficientul de difuziune, iar t reprezintă intervalul de timp în care o<br />
moleculă de analit o petrece în faza mobilă şi este dat de relaţia:<br />
L<br />
t = (9.36)<br />
u<br />
(L <strong>–</strong> lungimea totală a deplasării, u <strong>–</strong> viteza fazei mobile).<br />
De aici rezultă că:<br />
2 D L<br />
σ<br />
u<br />
2 ⋅ ⋅<br />
d = (9.37)<br />
Difuzia turbulentă descrie modificarea traseelor (canalelor) şi a vitezei moleculelor de<br />
solut în raport cu zona centrală. Aceasta poate fi imaginată prin traseele dintre particulele<br />
fazei staţionare prin care se pot mişca moleculele de solut. Dacă o moleculă se găseşte<br />
într-un canal „rapid” aceasta va migra în faţa frontului, iar dacă aceasta se găseşte pe un<br />
canal „încet”, atunci molecula va rămâne în spatele zonei centrale a frontului. Numărul<br />
paşilor (notat cu n) pe care molecula îi străbate prin parcurgerea coloanei de lungime L<br />
va depinde de diametrul particulelor (notat cu dp):<br />
L<br />
n = (9.38)<br />
dp<br />
Deviaţia standard atribuită acestui proces (σE) poate fi derivată din ec. 9.33:<br />
L 1/<br />
2 1/<br />
2<br />
σE = dp<br />
⋅(<br />
) = ( L ⋅ dp<br />
)<br />
(9.39)<br />
dp<br />
Pentru a evalua efectele de ne-echilibru, referitoare la intervalele de timp în care<br />
moleculele de solut se află în una din cele două faze, să considerăm următoarele mărimi<br />
cinetice necesare:<br />
k1 <strong>–</strong> viteza de tranziţie a unei molecule de solut din faza mobilă în faza staţionară<br />
(adsorbţie);<br />
1/k1 <strong>–</strong> intervalul de timp pentru ca adsorbţia să aibă loc;<br />
k2 <strong>–</strong> viteza de tranziţie a unei molecule de solut din faza staţionară în faza mobilă<br />
(desorbţie);<br />
1/k2 <strong>–</strong> intervalul de timp pentru ca desorbţia să aibă loc.<br />
O moleculă de solut în faza mobilă se mişcă mai repede decât centrul zonei.<br />
Viteza zonei va fi δu, n care δ este fracţia de molecule de solut în faza mobilă, iar u este<br />
viteza fazei mobile. Prin urmare, (1 - δ) va fi fracţia de molecule din faza staţionară cu o<br />
144
viteză de deplasare 0. Astfel, moleculele de solut se deplasează în faţă sau în spatele<br />
zonei centrale la fiecare transfer între faze. Intervalul de timp necesar zonei solutului să<br />
se deplaseze prin coloana de lungime L la o viteză δu este:<br />
L<br />
t = (9.40)<br />
δ ⋅ u<br />
Intervalul de timp în care fracţia (1 - δ) de molecule se găseşte în faza staţionară va fi:<br />
( 1−<br />
δ)<br />
⋅ L<br />
t = (9.41)<br />
δ⋅<br />
u<br />
Numărul de desorbţii (ndes) care au loc în acest interval de timp va fi dat de intervalul de<br />
timp, dat de relaţia 9.41, împărţit la 1/k2:<br />
( 1−<br />
δ)<br />
⋅ L 1<br />
ndes = ⋅<br />
(9.42)<br />
δ ⋅ u k2<br />
Numărul de transferuri interfazic (n) va fi dublu celui de desorbţie:<br />
2⋅<br />
( 1−<br />
δ)<br />
⋅ L 1<br />
ndes = ⋅<br />
(9.43)<br />
δ ⋅ u k2<br />
In intervalul de timp în care o moleculă de solut este în faza staţionară, zona centrală a<br />
frontului solutului se deplasează în faţă cu lungimea de δ⋅u/k2. Folosind ec. 9.33 prin<br />
substituţia lui l cu δ⋅u/k2 şi n cu expresia de mai sus, se va obţine deviaţia standard (σk)<br />
caracteristică procesului de transfer de masă între cele două faze (contribuţia de neechilibru):<br />
2 ⋅ δ ⋅ ( 1−<br />
δ)<br />
⋅ L ⋅ u 1/<br />
2<br />
σk<br />
= [<br />
]<br />
(9.44)<br />
k 2<br />
Această ecuaţie arată că prin creşterea vitezei de curgere u (imprimată de faza mobilă),<br />
efectele de ne-echilibru cresc, măsura acestei creşteri fiind dată de σk.<br />
Introducând expresiile lui σd, σE şi σk în rel. 9.34 se obţine expresia:<br />
2 2⋅<br />
δ ⋅(<br />
1−<br />
δ)<br />
1<br />
σ = L ⋅[<br />
dp<br />
+ ⋅ u + 2D<br />
⋅ ]<br />
(9.45)<br />
k2<br />
u<br />
Martin şi Synge au introdus înălţimea echivalentă a talerului teoretic H, dată de relaţia:<br />
2<br />
σ<br />
H = (9.46)<br />
L<br />
Cu aceasta, expresia lui H devine:<br />
145
2 ⋅ δ ⋅(<br />
1−<br />
δ)<br />
1<br />
H = dp<br />
+ ⋅ u + 2D<br />
⋅<br />
(9.47)<br />
k2<br />
u<br />
Minimul înălţimii talerului, Hmin, se stabileşte din condiţia dH/du = 0 şi conduce la expresia<br />
vitezei fazei mobile pentru care valoarea înălţimii talerului teoretic este minimă:<br />
k2<br />
⋅ D 1/<br />
2<br />
u = [ ]<br />
(9.48)<br />
δ ⋅(<br />
1−<br />
δ)<br />
Ecuaţia 9.47 este cunoscută ca ecuaţia van Deemter şi scrisă în forma simplificată:<br />
B<br />
H = A + + C ⋅ u<br />
(9.49)<br />
u<br />
Termenul A reprezintă constanta de difuziune turbulentă (datorită neomogentităţii<br />
mediului prin care curge faza mobilă), B este constanta difuziei longitudinale, iar C<br />
constanta transferului de masă al analitului în faza staţionară.<br />
H<br />
Hmin<br />
A<br />
uoptim<br />
146<br />
u (cm/s)<br />
Fig. 9.7. Reprezentarea grafică a ecuaţiei van Deemter.<br />
Reprezentarea grafică a acestei ecuaţii este dată în figura de mai sus. Din<br />
această dependenţă a înălţimii talerului teoretic (H) determinat din mărimi ale separării<br />
cromatografice funcţie de viteza fazei mobile (u) se stabileşte valoarea optimă uoptim<br />
pentru care H este minim, şi prin urmare separarea are o eficienţă maximă.<br />
9.5. Semnificaţia cinetică şi termodinamică a factorului de capacitate<br />
Factorul de capacitate pentru un compus i (ki’) este definit ca raportul cantităţilor<br />
de analit în faza staţionară şi faza mobilă, la un moment dat. Experimental valoarea sa<br />
este stabilită prin măsurarea parametrilor cromatografici de retenţie, daţi de ec. 9.12. Din<br />
punct de vedere cinetic, acesta poate fi exprimat de ecuaţia următoare, derivată din
definiţia de mai sus:<br />
, în care:<br />
ni,<br />
s [ i]<br />
s ⋅ Vf<br />
. s.<br />
k'i = = = Ki<br />
⋅φ<br />
(9.50)<br />
ni,<br />
m [ i]<br />
m ⋅ Vf<br />
. m.<br />
ni,s <strong>–</strong> numărul de moli de analit i din faza staţionară;<br />
ni,m <strong>–</strong> numărul de moli de analit i din faza mobilă;<br />
Vf.s. <strong>–</strong> volumul fazei staţionare din coloana <strong>cromatografică</strong>;<br />
Vf.m. <strong>–</strong> volumul fazei mobile din coloana <strong>cromatografică</strong>;<br />
ϕ - raportul de volume al celor două faze (Vf.s./Vf.m.);<br />
Ki <strong>–</strong> constanta de echilibru a partiţie analitului i între faza mobilă şi faza<br />
staţionară.<br />
Din punct de vedere termodinamic trebuie ţinut cont de relaţia generală a<br />
constantei de echilibru Ki:<br />
K<br />
0<br />
ΔG<br />
−<br />
RT<br />
i = e<br />
(9.51)<br />
ΔG 0 reprezintă variaţia de entalpie liberă standard Gibbs pentru transferul speciei i din<br />
faza mobilă în faza staţionară şi la rândul său poate fi scrisă în funcţie de variaţie de<br />
entalpie standard (ΔH 0 ) şi variaţia de entropie standard (ΔS 0 ):<br />
0 0 0<br />
= ΔH<br />
− T S<br />
(9.52)<br />
ΔG ⋅ Δ<br />
Prin introducerea lui Ki şi ΔG 0 în ecuaţia 9.51, urmată de logaritmare rezultă ecuaţia<br />
fundamentală în cromatografie, ce descrie dependenţa factorului de capacitate de<br />
temperatura la care are loc procesul de retenţie <strong>cromatografică</strong> (temperatura din coloana<br />
<strong>cromatografică</strong>):<br />
ΔS<br />
ΔH<br />
ln k'i<br />
= ln φ + − ⋅<br />
R R<br />
0<br />
0<br />
1<br />
T<br />
147<br />
(9.53)<br />
Prin urmare, factorul de capacitate scade prin creşterea temperaturii coloanei<br />
cromatografice. Dependenţa valorii ln k’ este lineară în raport cu inversul temperaturii<br />
absolute, iar ecuaţia de mai sus este cunoscută în literatura de specialitate din domeniu<br />
ca ecuaţia van’t Hoff. Din regresia ln k’ ~ 1/T se poate stabili variaţia de entalpie standard<br />
ΔH 0 din panta dreptei, iar din intersecţia cu ordonata (T → ∞) se poate determina cu o<br />
bună aproximaţie (cunoscând parametrul constructiv ϕ) valoarea variaţiei de entropie<br />
standard ΔS 0 a procesului de transfer al analitului din faza mobilă în faza staţionară.