CAPITOLUL 1 Generalităţi privind separarea în chimia analitică

CAPITOLUL 1
Generalităţi privind separarea în chimia analitică
1.1. Rolul separării în procesul analitic de măsură
Probele investigate în diversele domenii sunt de cele mai multe ori foarte
complexe, astfel încât determinarea unor anumite specii (analiţi) din probe nu este
posibilă din cauza interferenţelor restului componentelor din probă în procesul de analiză.
Metodele de separare au tocmai rolul de a transfera analiţii de interes într-un nou mediu,
mult mai simplificat din punct de vedere a compoziţiei chimice decât cel al probei iniţiale.
De asemenea, prin acest transfer se poate realiza, în una sau mai multe etape, o
creştere a concentraţiei analiţilor din probe, astfel încât valoarea acesteia să se situeze
peste limita de detecţie a metodei fizice de analiză, utilizată în final. Proba rezultată prin
operaţii mai mult sau mai puţin complexe, de separare şi concentrare, numită probă
finală, trebuie să fie compatibilă cu metoda fizică de analiză şi să permită obţinerea de
informaţie analitică (calitativă sau cantitativă) din procesul de măsurare a unei proprietăţi
fizice. Aşadar, separarea şi/sau concentrarea sunt modalităţi de prelucrare a probelor şi
se includ în schema generală a unui proces analitic de măsură.
Prelucrarea probelor prin proceduri de separare este precedată şi influenţată de
prelevarea acestora şi urmată de analiza propriu-zisă, aşa după cum se poate observa şi
din reprezentarea generală dată unui proces analitic în Fig. 1.1. Un rol important, în
dezvoltarea şi optimizarea acestui proces îl au dependenţele dintre parametrii unei etape
şi informaţia obţinută din proces (liniile punctate).
SISTEM
INVESTIGAT
DECIZII
PRELEVARE
PROBE
Fig. 1.1. Reprezentarea etapelor unui proces analitic de măsură.
In general, separarea şi concentrarea ca etape importante în prelucrarea
probelor, constau dintr-o serie de operaţii analitice, mai mult sau mai puţin complexe,
având unul sau mai multe din scopurile următoare:
- izolarea unuia sau mai multor analiţi de interes dintr-un mediu (probă) având o anumită
compoziţie (numită matrice), în vederea eliminării interferenţelor acesteia;
- concentrarea analiţilor de interes, astfel încât în proba finală obţinută, concentraţia
acestora să fie peste limita de detecţie a procesului de determinare (preferabil în
7
INFORMATII
ANALITICE
PREPARARE
PROBE
PROBA
FINALA
ANALIZA:
MASURARE
PROPRIETATI FIZICE

intervalul de linearitate al măsurătorilor);
- eliminarea unei părţi grosiere a matricei complexe interferente (etapă cunoscută şi sub
numele de „clean-up”);
- modificarea structurii analiţilor de interes în vederea îmbunătăţirii unor parametrii
analitici importanţi (detectabilitate UV-VIZ prin introducerea unor cromofori, inducerea
unei proprietăţi fluorescente, îmbunătăţirea selectivităţii unui proces cromatografic, etc);
- schimbarea stării de agregare a analitului sau a matricei în care se găsesc analiţii;
- schimbarea solventului probei, proces care are loc de obicei concomitent cu izolarea şi
concentrarea analiţilor din probă.
De menţionat că, de regulă, o probă de analizat cu cât este mai complexă, cu
atât şi procedura de prelucrare este mai complexă, cu o durată de timp mai mare, iar
influenţa erorilor (sistematice şi/sau întâmplătoare) este mai mare. Astfel, probele
biologice, probele legate de controlul poluanţilor din mediul ambiant (aer, apă, sol),
probele alimentare, matricile organice complexe, etc., necesită de cele mai multe ori
proceduri de prelucrare, extrem de laborioase şi cu o durată mare de timp. In cadrul
procedurilor de prelucrare a acestor probe, concentrarea şi/sau izolarea anumitor specii
de interes reprezintă principalul scop, iar aceasta se poate realiza convenabil prin una
sau mai multe operaţii de extracţie.
1.2. Funcţia de răspuns a procesului analitic de măsură
Purtătorul informaţiei analitice rezultate dintr-un proces de măsurare cu ajutorul
unui instrument analitic este semnalul analitic. In general, un semnal este definit ca o
informaţie relativă la schimbarea stării unui fenomen, sau ca o manifestare fizică care se
poate propaga printr-un mediu dat. Majoritatea proceselor analitice de măsură produc
informaţie analitică sub forma unui semnal electric.
Practic, un semnal analitic este o reprezentare bidimensională a informaţiei
analitice produsă de către instrumentul analitic prin dependenţa mărimii fizice măsurate,
notată cu Y, funcţie de un parametru fizic, notat cu λ. Există, însă, situaţii în care
informaţia analitică poate apare într-o reprezentare tridimensională, cum ar fi exemplul
unei cromatograme produse de un sistem analitic HPLC cu detecţie DAD, în care pe axa
Ox este reprezentat timpul de eluţie, pe axa Oz – absorbanţa, iar pe axa Oy – lungimea
de undă, astfel că în orice moment al cromatogramei poate fi vizualizat spectrul
componenţilor separaţi. In cazul sistemului GC-MS pe axa Ox rămâne timpul de eluţie, pe
axa Oz - abundenţa ionilor rezultaţi din fragmentare, iar pe axa Oy – raportul m/sarcină.
In condiţii reale, mărimea semnalului Y(λ) are un caracter aleator, datorită
prezenţei perturbaţiilor care afectează procesul de măsurare. Acest caracter aleator se
manifestă atât asupra valorii amplitudinii semnalului Y (datorat sistemului de detecţie), cât
şi a valorii parametrului λ. Caracterul aleator al semnalului se poate constata prin
efectuarea repetată a experimentului asupra aceleiaşi probe (prelucrarea statistică este
prezentată în cap. 1.4).
Valoarea semnalului Y(λ) este însă dependentă de conţinuturile (concentraţiile)
Ci, i=1,n ale componenţilor (X1, X2, ..., Xn) din proba finală de analizat. Această
dependenţă reprezintă funcţia de răspuns (calibrare) a procesului de măsură (analiză):
Y( λ)
= f(
C1,
C2,...,
Cn
)
(1.1)
8

Cea mai cunoscută dependenţă dintre valoarea semnalului Y şi concentraţiile de
analiţi din probă (Ci) este cea lineară:
Y( λ)
= a0
+ b1
⋅C1
+ b2
⋅C
2 + .... + bn
⋅C
n
(1.2)
In general, funcţia de răspuns de mai sus este lineară pentru un anumit interval
de concentraţie [Cmin, Cmax], în afara căruia dependenţa putând fi nelineară sau puternic
afectată de erori (domeniul limitei de detecţie). Cele trei domenii (al limitei de detecţie, de
linearitate şi nelinearitate, reprezentate grafic în Fig. 1.2) constituie aşa-numitul domeniu
dinamic de răspuns al instrumentului analitic (există dependenţă între Y şi C). Dincolo de
o valoare, notată cu Ymax, semnalul analitic nu se mai modifică; acestuia îi corespunde o
valoare maximă de concentraţie, Cmax, ce poate fi sesizată de către instrumentul analitic.
Y
Ymax
Domeniul
limitei
de detecţie
0 Domeniul de linearitate
Cmax
C
Domeniul dinamic de răspuns
Fig. 1.2. Domeniile principale ale funcţiei de răspuns a unui proces analitic.
Domeniul de linearitate al funcţiei de răspuns specifice pentru un singur analit
este redat prin relaţia:
Y = a + b ⋅ C
(1.3)
, în care parametrii de regresie a şi b se stabilesc din setul de valori experimentale prin
metoda regresiei lineare (metoda celor mai mici pătrate):
C1, C2, C3, …, Cn
Y1, Y2, Y3, …, Yn
9
experimental
Parametrii de regresie a (intercepţia la axa Y) şi b (panta, numită şi sensibilitatea
procesului) stabiliţi prin metoda celor mai mici pătrate au expresiile:

n
n
∑YiCi−∑Yi∑ i=
1
i=
1 i=
1
= c
n
2
2
n∑Ci−(
∑Ci)
i=
1 i=
1
n
n
C
i
10
(1.4)
1
a = ( ∑ Yi
− b∑
Ci)
(1.5)
n
i
i
Regresia lineară de mai sus este caracterizată de coeficientul de corelaţie al
datelor (notat cu r), dat de expresia:
[ ∑(
Ci
− C)(
Yi
i
2
∑( Ci
− C)
⋅∑
2
r =
− Y)
]
2
( Y − Y)
(1.6)
i i
i
2
Pentru ca o procedură de calibrare, bazată pe o regresie lineară, să fie acceptată
ca valabilă, valoarea parametrului r 2 trebuie să fie mai mare de 0,9900.
1.3. Parametri analitici ai procesului analitic de măsură
Sensibilitatea procesului de măsurare (Si) caracterizează schimbarea răspunsului
semnalului analitic produs de către instrumentul analitic, ΔY(λ), raportată la variaţia
concentraţiei componentului i din proba finală, ΔCi:
ΔY(
λ)
df(
Ci
)
S i = =
(1.7)
ΔCi
dCi
In cazul dependenţei lineare date de relaţia 1.7 sensibilitatea procesului analitic
în raport cu fiecare analit i este dată de panta bi.
De aici vor rezulta definiţiile pentru doi parametri analitici extrem de importanţi ai
procesului analitic de măsură, ca proces producător de informaţie analitică.
Specificitatea procesului producător de informaţie analitică reprezintă
proprietatea sa de a i se aplica relaţia (1.7), numai şi numai unui singur component i din
proba analizată.
Selectivitatea procesului producător de informaţie analitică reprezintă
proprietatea sa pentru care relaţia (1.7) se poate aplica pentru toţi componenţii probei
analitice, dar parametrul λ ia valori specifice fiecărui component chimic din probă: λi ∈ Ai.
De exemplu, în spectrometria de absorbţie moleculară UV-VIZ sau în spectrometria de
absorbţie atomică (AAS), funcţia de răspuns este redată de legea Lambert-Beer:
Aλ = ε(λ)⋅l⋅Ci (1.8)
, unde: Aλ = absorbanţa probei măsurată la lungimea de undă λ, într-o cuvă cu grosimea
de strat l (în cm) şi C este concentraţia speciei active în domeniul UV-VIZ. Selectivitatea
determinărilor prin această metodă este asigurată dacă relaţia 1.7 se aplică mai multor
analiţi din probă, dar la valori ale lungimii de undă specifice fiecărui analit.
In cadrul proceselor de determinare prin intermediul metodelor cromatografice,

selectivitatea este asigurată prin separarea picurilor cromatografice la bază, iar astfel
funcţia de răspuns devine o relaţie lineară dintre aria semnalului (picului) cromatografic,
notată cu Apic,i, şi cantitatea de analit (Qi), aflată în proba injectată în coloana
cromatografică:
Apic,i = k⋅Qi (1.9)
Orice metodă fizică de analiză este caracterizată analitic prin limita de detecţie, [1,2]
care reprezintă conţinutul minim sigur detectabil din proba finală şi notat prin Cmin (sau
LOD – „limit of detection”). Orice procedură analitică aplicată unei probe de analizat, care
este prelucrată în vederea analizei printr-o metodă fizică, este caracterizată prin limita de
determinare sau cuantificare (LOQ). Asupra acestor noţiuni există mai multe puncte de
vedere statistice dintre care mai importante sunt următoarele două:
a) după Kaiser limita de detecţie este dată de valoarea concentraţiei (conţinutului)
în analit determinabil pentru care valoarea semnalului său analitic obţinut (Ymin) respectă
inegalitatea:
Ymin > 3⋅σy (1.10)
, unde σy reprezintă deviaţia standard a determinărilor într-un număr foarte mare
efectuate pentru o probă blanc (proba care conţine întreaga matrice a probei de
determinat, mai puţin analitul de interes). Probabilitatea acestui eveniment este de
99,87%.
b) după Liteanu această inegalitate va fi:
Ymin > 6⋅σy (1.11)
, deoarece limita de detecţie este la rândul său un parametru statistic, care are un interval
de încredere, ce depinde de deviaţia standard a determinărilor.
Conţinutul minim sigur detectabil din proba iniţială (care suportă mai multe etape
de pregătire înaintea analizei propriu-zise) reprezintă limita de determinare (LOQ – „limit
of quantitation”). Această mărime poate fi estimată statistic în aceleaşi două moduri
prezentate anterior, cu deosebirea că σy va reprezenta deviaţia standard a întregului
proces analitic. Dacă procesul de preparare a probelor are ca scop concentrarea
analiţilor în proba finală (analitică), atunci: LOQ < LOD, deşi întotdeauna se respectă
σLOQ > σLOD (a se vedea propagarea erorilor). Cu alte cuvinte, putem determina
concentraţii de analit dintr-o probă sub limita de detecţie a metodei fizice de analiză, dacă
această probă este supusă unor operaţii de concentrare.
1.4. Parametrii statistici ai unui proces analitic de măsură
Erorile care pot fi întâlnite în cadrul unui proces analitic sunt de două feluri: erori
întâmplătoare şi erori sistematice. Acestea pot fi stabilite prin repetarea procesului de
măsură şi afectează precizia, respectiv exactitatea determinărilor. Prin repetarea
procesului se obţine o mulţime de rezultate analitice (numită selecţie), notate cu: Y1, Y2,
Y3, …., Yn (n fiind numărul de rezultate analitice).
Media celor n determinări, Y , este dată de formula:
11

n
∑ Yi
Y1
+ Y2
+ Y3
+ ... + Yn
i=
1
Y = =
(1.12)
n
n
Exactitatea (sau abaterea sistematică, notată cu εsist) unui proces analitic este
dată de diferenţa dintre media de mai sus şi valoarea reală a mărimii măsurate (notată cu
Yreal) şi poate fi pozitivă sau negativă:
εsist = ( Yreal
− Y)
(1.13)
Precizia este dată de diferenţele individuale Yi şi media Y . Din punct de vedere
statistic aceasta este evaluată prin abaterea standard, notat cu s, şi dată de relaţia:
n
1
2 1/
2
s = [ ∑ ( Yi
− Y)
]
(1.14)
n −1
i=
1
Diferenţa conceptuală între abaterea standard s şi deviaţia standard σ poate fi
dedusă din formula ultimei mărimi, exprimată prin relaţia:
n
1
2 1/
2
σ [ ∑( Yi
Y)
]
n i 1
∞ →
= −
(1.15)
=
In absenţa erorilor sistematice, pentru n → ∞, s-ar putea obţine valoarea reală a
mărimii măsurate, Y → Yreal
. Cum această situaţie nu poate fi realizată practic, valorii
medie a unei serii de n determinări i se atribuie un interval de încredere în care se
situează valoarea reală, Yreal, pentru o anumită probabilitate (certitudine, notată cu P%),
Y ± ΔY
, cu atâta mai mare cu cât erorile întâmplătoare sunt mai mari. Acesta poate fi
dedus pornind de funcţia de distribuţie a rezultatelor Yi; de regulă, pentru un număr mare
de determinări şi în absenţa erorilor sistematice, această funcţie poate fi dată de
distribuţia Gauss, care dă densitatea de probabilitate p(Yi) ca un rezultat analitic Yi să se
abată de la valoarea medie Y :
2
( Yi
−Y)
−
1
2
p(
Y
2σ
i ) = e
(1.16)
σ 2π
Dacă mărimea intervalului de încredere de mai sus, notată cu ΔY, este exprimată
în unităţi de deviaţie standard, nσ, atunci probabilitatea ca intervalul de încredere să fie
Y ± nσ
(sau probabilitatea P ca valoarea reală Yreal să fie între Y − nσ
şi Y + nσ
) poate fi
calculată prin integrarea densităţii de probabilitate de mai sus:
P(
Y
Y+
nσ
− nσ
< Yreal
< Y + nσ)
= ∫ p(
Y)
⋅ dY = 2 ⋅ Φ(
n)
Y−
nσ
12
(1.17)

, unde Φ(n) este funcţia Laplace care este tabelată în funcţie de valoarea lui n. Prin
urmare, intervalul de încredere al mărimii determinate Y ± nσ
este caracterizat de
probabilitatea de încredere P, stabilită în funcţie de valoarea parametrului n.
De exemplu probabilităţile de 95% şi 99% corespund intervalelor de încredere
corespunzătoare:
Y − 1,
96 ⋅ σ < Yreal
< Y + 1,
96 ⋅ σ (cu probabilitate de 95%) (1.18)
Y − 2,
58⋅
σ < Yreal
< Y + 2,
58⋅
σ (cu probabilitate de 99%) (1.19)
Pentru intervalul de încredere Y − 3⋅
σ < Yreal
< Y + 3⋅
σ (utilizat la estimarea
limitei de detecţie), probabilitatea de încredere este de 99,87%.
In cazul în care rezultatele analitice se supun unei distribuţii Student, intervalul de
încredere este redat de inegalitatea: [1]
t(
P,
n −1)
⋅ s
t(
P,
n −1)
⋅ s
Y − < Yreal
< Y +
(1.20)
n
n
, în care parametrul Student notat cu t depinde de probabilitatea P şi numărul gradelor de
libertate ale seriei de determinări (n – 1). In acest caz deviaţia standard este înlocuită de
parametrul statistic estimat experimental s (abaterea standard).
1.5. Propagarea erorilor într-un proces analitic
Incertitudinea rezultatelor analitice derivă din toate sursele de erori întâmplătoare
şi sistematice ce afectează etapele unui proces analitic:
- erori de prelevare (determinante);
- erori în procesul de preparare a probelor (consistente);
- erori de calibrare (importante);
- erori ale instrumentului analitic (semnificative);
- impurităţi în reactanţi (posibile);
- fluctuaţii ale condiţiilor de laborator (temperatură, umiditate, etc);
- efecte de interferenţe ale matricei probei sau alţi analiţi de interes;
- stabilitatea analiţilor;
- contaminare; etc.
Estimarea contribuţiei fiecărei surse de erori este tratată de teoria propagării erorilor
într-un proces de măsură, în care intervin m etape, afectate de erori întâmplătoare.
Pentru aceasta să considerăm la general prin Y – mărimea măsurată dintr-un proces
analitic, iar xi – factorii (variabilele) de care depinde Y, limitaţi la un număr m. Rezultă:
Y = f(x1, x2, …, xm) (1.21)
Incertitudinea se referă la deviaţia mărimii Y faţă de variaţiile diferiţilor parametri xi şi
poate fi exprimată prin diferenţiala:
dY = df(x1, x2, …, xm) (1.22)
Metoda aproximaţiei locale conduce la scrierea derivatei în forma: [3]
13

∂Y
∂Y
∂Y
dY = ( ) x ,.. x const dx1
( ) x ,.. x const dx 2 ... ( ) x ,.. x const dx
2 m = +
1 m = + +
1 m−1
= m (1.23)
∂x1
∂x
2
∂x
m
Această ecuaţie prin ridicare la pătrat conduce la:
2 ∂Y
∂Y
∂Y
2
( dY)
= [( ) x ,.. x const dx1
( ) x ,.. x const dx2
... ( ) x ,.. x const dxm
]
2 m = +
1 m = + +
1 m−1
=
(1.24)
∂x1
∂x
2
∂x
m
In expresia de mai sus se va ţine cont de faptul că:
∂Y
2 2
( ) dxi
> 0,
∂xi
∂Y
∂Y
∑∑ ⋅ → 0
i j ≠ i∂xi∂x
j
i = 1,
2,...
m
14
(1.25)
(1.26)
(Ultima aproximaţie se datorează faptului că fluctuaţiile întâmplătoare pot fi pozitive sau
negative, astfel că, per total, suma lor se anulează).
După împărţire la (n – 1), care reprezintă numărul gradelor de libertate (n fiind numărul
de determinări), rezultă următoarea ecuaţie:
2
2
2
2
( dY)
∂Y
2 dx Y dx Y dx
( ) 1 ∂ 2
( ) 2 ∂ 2
= ⋅ + ⋅ + ....( ) ⋅ m
n −1
∂x1
n −1
∂x2
n −1
∂xm
n −1
(1.27)
Fiecare termen dx 2 din ecuaţia 1.27 reprezintă deviaţia standard corespunzătoare
parametrului respectiv, astfel că va rezulta:
m
2 ∂Y
2 2 ∂Y
2 2 ∂Y
2 2 ∂Y
2
sY = ( ) ⋅ s + ( ) ⋅ s + ... + ( ) ⋅s
= ( ) ⋅ s
x x1
x 2
x ∑ ∂
m
x j
1 ∂x2
∂xm
j=
1 ∂x
j
(1.28)
Aceasta reprezintă ecuaţia fundamentală în explicarea propagării erorilor în cadrul unui
proces analitic, datorate surselor de erori în număr de m. Prin urmare, pentru stabilirea
abaterii standard totale ( 2
s Y ), trebuie cunoscute sau estimate abaterile standard
corespunzătoare tuturor factorilor ce afectează procesul analitic de măsurare, dar şi a
variaţiilor mărimii măsurate Y faţă de variaţia parametrilor dependenţi, ∂ Y / ∂x
m .
Exemple
A) Dacă dependenţa este de tip aditiv se poate scrie în cazul a doi factori, x1 şi x2,
următoarea relaţie simplă:
Y = x1 + x2
sau, Y = x1 – x2
Ţinând cont că:

Se va obţine:
∂Y
= 1
∂x1
∂Y
= ± 1
∂x2
2 2 2
Y = s x s
1 x2
s +
B) Dacă dependenţa de doi factori are expresia:
Y = α ⋅ x1
+ β ⋅ x2
∂Y
= α
∂x1
iar:
∂Y
= β
∂x2
Se va obţine următoarea dependenţă:
2 2 2 2 2
sY = α ⋅ s + β ⋅ s
x1
x 2
C) In cazul dependenţei multiplicative (mai rar întâlnită), de forma:
Y = x1 ⋅x2
Derivatele parţiale vor fi:
In final se va obţine:
sau:
∂Y
= x2
∂x1
∂Y
= x1
∂x2
2 2 2 2 2
sY = x2
⋅ s + x
x 1 ⋅ s
1 x 2
2
2 2
s s s
Y x1
x 2 = +
2 2 2
Y x1
x2
In acest caz parametrii de sensibilitate sunt înlocuiţi cu valori ale parametrilor xi.
Ţinând cont de etapele principale ale unui proces analitic, ecuaţia 1.28 poate fi
simplificată în următoarea formă:
2 2
2
2
s total = sprele
var e + spreparare
+ sanaliza
(1.29)
Variaţiilor mărimii măsurate Y, ∂ Y / ∂x
, devin în acest caz egale cu 1. In concluzie,
15

abaterea standard a unui proces analitic de măsură este o mărime aditivă, a pătratelor
abaterilor standard pentru fiecare etapă în parte. Estimarea fiecărei contribuţii în parte
este destul de dificilă, şi ţine cont de fiecare parametru (factor, notat anterior cu xi) care
intervine în etapa respectivă. In practică, etapele premergătoare analizei, prelevarea şi
prepararea probelor, au cea mai mare contribuţie la erorile rezultatelor analitice.
1.6. Calibrarea procesului analitic global
In principiu, calibrarea procesului analitic trebuie efectuată în acelaşi mod cu cel
aplicat probelor reale. Pentru aceasta, este necesară prepararea amestecurilor standard
de analit în matricea probei reale de analizat. Prepararea lor necesită probe blanc
(definite în 1.3), care să fie „impurificate” controlat cu analitul sau analiţii de determinat.
De exemplu, adăugarea a 10 μL soluţie standard de concentraţie 100 ng/μL (100 ppm)
analit X în apă peste 1 mL urină, conduce la o probă standard de urină de concentraţie 1
ng/μL (1 ppm) analit X, fără a modifica semnificativ compoziţia de fond (matricea probei).
Realizarea (procurarea) blancurilor ridică unele probleme, depinzând de natura
acestora. Blancurile unor probe biologice (urină, sânge, plasma sanguină, transpiraţie) în
cazul unor analiţi care nu fac parte din compoziţia normală a acestora (compuşi exogeni)
pot fi uşor realizate. In schimb, dacă analiţii sunt compuşi endogeni, realizarea probelor
blanc este foarte dificilă.
Determinarea unor poluanţi din probe de sol, apă sau aer se bazează pe
calibrarea procesului analitic de măsură cu probe standard, impurificate controlat. Pentru
acesta sunt necesare probe nepoluate de sol, apă sau aer. Şi în acest caz apar unele
paradoxuri, cum ar fi următorul: dacă se doreşte determinarea fenolului din probe de ape
reziduale (cu un conţinut mare de alţi compuşi organici şi/sau anorganici), realizarea unui
astfel de blanc de apă reziduală fără conţinut de fenol este dificilă.
Determinarea unor poluanţi gazoşi sau volatili din aer se bazează pe calibrarea
procesului analitic de măsură cu ajutorul amestecurilor standard gazoase, în care blancul
de aer poate fi substituit cu un amestec 20% O2 şi 80% N2. In schimb, măsurarea
volumului pentru compuşii gazoşi este în acest caz mai dificilă. [4,5]
Atunci când nu sunt disponibile probe blanc pentru ca procesul analitic să fie
calibrat cu amestecuri standard în matricea probei de analizat, se pot utiliza soluţii
simplificate, în care analiţii să se găsească în solventul probei finale. In acest caz trebuie
estimate pierderile de analit în fiecare dintre etapele procesului analitic, începând cu
prelevarea probei şi prepararea lor în vederea analizei probei finale. Parametrul care
redă aceste pierderi este randamentul de regăsire al analitului în proba finală (η).
Randamentul de regăsire este un parametru cantitativ care caracterizează gradul
în care analitul de determinat este regăsit în proba finală, supusă procesului de măsură:
mfinal
Cfinal
⋅ Vfinal
η = =
(1.30)
minitial
Cinitial
⋅ Vinitial
, în care minitial şi mfinal sunt cantităţile de analit din proba iniţială (având volumul Vinitial),
respectiv finală (având volumul final Vfinal), corelate cu concentraţia (C) de analit iniţială,
respectiv din proba finală. In cazul probelor analizate în stare solidă, parametrul V este
substituit cu masa de probă, notată cu Qinitial. Pentru exprimarea procentuală a
randamentului, expresia se multiplică cu 100. Din această relaţie rezultă că:
16

Vinitial
Cfinal = η⋅
Cinitial
⋅
(1.31)
Vfinal
Dacă randamentul η nu depinde de concentraţia iniţială de analit (Cinitial), iar în procesul
analitic Vinitial şi Vfinal (sau chiar raportul lor Vinitial/Vfinal = rC, numit raport de concentrare)
sunt menţinute constante pentru toate probele standard utilizate în calibrare, rezultă că:
Cfinal = η ⋅ rC
⋅ Cinitial
(1.32)
Dacă se introduce Cfinal în ecuaţia de calibrare (Y = a + b⋅C) se va obţine:
Y = a + b ⋅ η ⋅ rC
⋅ Cinitial
(1.33)
Prin compararea pantelor celor două ecuaţii (b cu b⋅η⋅rC) rezultă următoarele situaţii:
- sensibilitatea determinărilor nu se modifică decât dacă produsul η⋅rC = 1;
- pentru randamente de regăsire mari (η → 1) şi procedee de concentrare (rC > 1),
sensibilitatea determinărilor creşte; în felul acesta concentraţia minimă din proba iniţială
(limita de determinare) va scădea corespunzător raportului:
minim
Yminim
− a
Cinitial
= (1.34)
b ⋅ η ⋅ rC
, în care Ymin este valoarea minimă a semnalului măsurat în final, care poate fi atribuit cu
o anumită certitudine (sau probabilitate, P) analitului determinat. Această valoare este
discutabilă: conform teoriei statistice a detecţiei, [1] ea este dată de ( Y blanc + 6σblanc
), în
care valoarea medie de semnal a blancului este notată cu Y blanc , iar σblanc este estimat pe
un număr apreciabil de probe iniţiale blanc. In felul acesta, erorile întâmplătoare care
afectează procesul analitic global influenţează limita de determinare a unui analit dintr-o
probă: cu cât erorile întâmplătoare sunt mai mari, cu atât limita de determinare va creşte
către valori mai mari.
1.7. Rolul standardului intern în procesele de separare
Standardul intern are rolul de control al erorilor care afectează procesul de
preparare a probelor (în special în cadrul procedurilor bazate pe extracţii), dar şi în unele
situaţii de analiză (exemplul cel mai cunoscut fiind spectrometria de masă). Acesta se
adaugă într-o concentraţie (cantitate) cunoscută în proba iniţială, care este supusă unei
proceduri de preparare, în care pot interveni erori necontrolate. De exemplu, erorile la
extracţia lichid-lichid pot fi datorate următoarelor cauze:
- volatilitatea solventului organic (la măsurarea volumului iniţial, evaporarea în timpul
extracţiei, evaporarea la prelevarea stratului organic);
- separarea incompletă a celor două straturi;
- aderarea solventului pe pereţii vasului de extracţie;
- pierderi la prelevarea unuia dintre straturi;
- pierderi datorită saturării stratului apos cu solventul organic nemiscibil, etc.
17

analit
Datorită acestor erori, semnalul analitic măsurat ( Y masurat ) pentru proba finală va
analit
fi mai mic decât cel real ( Y real ), printr-un coeficient δ < 1 (pierderi de analit), sau va fi
mai mare, δ > 1 (pierderi de solvent), datorat erorilor din procedura de preparare:
analit analit
Ymasurat = δ ⋅ Yreal
(1.35)
Deoarece aceste erori afectează în aceiaşi măsură şi standardul intern (S.I.), adăugat
probei, se poate scrie aceiaşi relaţie pentru semnalul analitic corespunzător acestuia:
S.
I.
S.
I.
Ymasurat = δ ⋅ Yreal
(1.36)
Dacă se face raportul între mărimile măsurate Y pentru cele două specii (analit şi
S.I.) se observă că:
analit analit
Ymasurat
Yreal
= (1.37)
S.
I.
S.
I.
Ymasurat
Yreal
La rându-i, acest raport va depinde doar de concentraţia analitului de interes,
păstrând constantă concentraţia de standard intern în toate probele standard utilizate în
calibrare/determinare. Concentraţia în care se adaugă standardul intern trebuie să se
situeze în domeniul său de linearitate, preferabil la mijlocul acestuia, unde erorile sunt
minime. Prin urmare, graficul de calibrare în acest caz va fi reprezentat de dependenţa
analit S.
I.
raportului y i = Ymasurat
/ Ymasurat
funcţie de concentraţia de analit din probele standard (un
model de grafic de calibrare pentru această metodă fiind redat în figura următoare).
Regresia lineară aplicată în acest caz va fi dată de ecuaţia y = a + bCanalit.
Semnal Analit/Semnal S.I.
1Y
y9
y8
y7
y6
y5
y4
y3
y2
y1
0
0 C1 1 C2 2 C3 3 C4 4 C5 5 C6 6 C7 7 C8 8 C9 9
Concentratie analit
Fig. 1.3. Un model de grafic de calibrare pentru o procedură
bazată pe utilizarea unui standard intern.
18

Câteva dintre condiţiile care trebuie să le îndeplinească o substanţă utilizată ca
standard intern sunt următoarele:
1) pe cât posibil să aibă structura asemănătoare cu a analitului de interes;
2) comportarea în procesul analitic să fie asemănătoare cu a analitului de interes
(de exemplu, dacă se utilizează într-o procedură de extracţie lichid-lichid, acesta
să fie aibă randament mare de extracţie în solventul nemiscibil utilizat);
3) determinarea să fie selectivă în raport cu analiţii din probă; dacă, de exemplu,
determinarea analitului de interes se face prin spectrometrie moleculară UV-VIZ,
standardul intern să absoarbă radiaţie într-un domeniu în care analitul nu
absoarbe; dacă determinarea se va face printr-o metodă cromatografică, picul
standardului intern să fie separat în raport cu restul picurilor din cromatogramă;
4) să fie stabilă în raport cu matricea probei analizate;
5) să nu se regăsească printre componenţii matricei probei de analizat.
Câteva exemple de substanţe recomandate de Agenţia de Protecţia Mediului
SUA pentru a fi utilizate ca standard intern în proceduri de prelucrare şi analiză a
probelor de mediu sunt redate în Tabelul 1.1.
Tabel 1.1. Exemple de compuşi utilizaţi ca standard intern la determinarea unor poluanţi din
apa potabilă (recomandare US EPA). [6]
Metoda # Natura poluanţilor
502.1 Compuşi volatili halogenaţi
19
Sistem
cromatografic
GC cu detecţie
electrolitică
Standard intern
(S.I.)
2-Brom-1-clorpropan
,sau 1,4-diclorbutan
502.2 Compuşi organici volatili
GC –ECD
GC-PID
1-Clor-2-fluor benzen şi/sau
fluorbenzen, ori
2-brom-1-clorpropan
507 Pesticide cu N- sau P- GC-NPD Trifenilfosfat
508 Pesticide organo-clorurate GC-ECD Pentaclornitro-benzen
513
2,3,7,8-tetraclordibenzo-pdioxina
GC-MS
13 C12-2,3,7,8-TCDD
515.1 Acizi cloruraţi GC-ECD 4,4’-Dibromoctafluorbifenil
525.1 Diverşi compuşi organici CGC-MS
D10-Acenaftena
D10-Fenantren
D12-Crisen
531.1
N-metilcarbamoil-oxime şi
N-metil-carbamaţi
HPLC-FLD
derivatizare postcoloană
4-Brom-3,5-dimetilfenil Nmetilcarbamat
550 PAHs HPLC-DAD-FLD 4,4’-difluorbifenil
552 Acizi halogenaţi CG-ECD 1,2,3-triclorpropan

1.8. Prelevare şi implicaţii asupra procesului de măsură
Recoltarea sau prelevarea probelor dintr-un sistem investigat este esenţială
pentru calitatea informaţiilor obţinute din procesul analitic şi, implicit, pentru calitatea
deciziilor referitoare la sistemul din care acestea provin. [7] Această etapă a procesului
analitic de măsură poate fi discutată din mai multe puncte de vedere:
a) după numărul probelor prelevate astfel încât acestea să fie reprezentative
pentru sistemul investigat;
b) după cantitatea de probă prelevată care depinde de capacitatea de procesare
în etapa următoare de preparare a probelor;
c) funcţie de natura fizică a sistemului investigat (care poate fi gazos, lichid sau
solid);
d) funcţie de natura sistemului investigat din punct de vedere al omogenităţii sau
heterogenităţii sale;
e) funcţie de modalitatea de prelevare (în timp şi/sau spaţiu).
Prelevarea poate fi sistematică sau întâmplătoare, după cum pot fi luate probele
dintr-un sistem investigat. Prelevarea sistematică presupune respectarea unor reguli de
prelevare (în spaţiu şi timp), astfel încât informaţia analitică să reflecte concentraţia
(conţinutul) de analiţi în coordonatele menţionate. Prelevarea stratificată este efectuată
atunci când materialul sau sistemul investigat este distribuit în zone (straturi) aproximativ
omogene. Prelevarea întâmplătoare (aleatoare) se aplică atunci când compoziţia
sistemului investigat este constantă în timp şi spaţiu, pe o perioadă şi pe o întindere
determinate. De asemenea, probele pot fi recoltate întâmplător, atunci când scopul
analizei nu este determinarea exactă a conţinutului, ci identificarea unor specii chimice.
Prelevarea probelor poate fi uneori însoţită de operaţii de modificare a
compoziţiei acestora. De exemplu, prelevarea probelor de aer bazată pe reţinerea într-un
mediu lichid reprezintă şi începutul operaţiilor de preparare a probelor; adăugarea unui
reactiv specific în mediul de reţinere înlătură această etapă în procesul de preparare a
probelor. De aceea, unele tehnici de prelevare sunt în acelaşi timp şi tehnici de preparare
a probelor. Este cazul, în special, la domeniul prelevării probelor gazoase, unde se pun şi
cele mai dificile probleme legate de reţinerea analiţilor de interes şi măsurarea volumului
probelor gazoase. [8]
Prelevarea probelor atmosferice se poate face în două modalităţi: 1) statică,
atunci când volumul de aer prelevat se aduce într-un vas calibrat, în care apoi se introduc
reactanţi dizolvaţi în soluţie sau adsorbanţi pentru reţinerea fizică a analiţilor de interes;
2) dinamică, prin aspirarea cu ajutorul unei pompe de aspirare având debitul controlat şi
trecerea fluxului gazos printr-un mediu lichid de reţinere, sau printr-o trapă răcită ori
printr-un adsorbant faţă de care analiţii de interes au o mare afinitate. [9]
Numărul de probe prelevate dintr-un material (sistem), presupus omogen,
depinde de eroarea introdusă în etapa de prelevare (notată cu eprelevare şi egală cu
diferenţa Yreal − Y ). Conform relaţiei 1.20, mărimea intervalului de încredere pentru Yreal,
dacă erorile ar interveni doar în această etapă, este dată de expresia:
t(
n −1,
P)
⋅s
prele var e
Yreal
= Y ±
(1.38)
n prele var e
20

De aici rezultă că numărul probelor prelevate este dat de ecuaţia:
2
2
t ( n prele var e −1,
P)
⋅s
prele var e
n prele var e =
2
eprele
var e
(1.39)
Soluţia acestei ecuaţii este ceva mai complicată, deoarece, la rându-i, parametrul t
depinde de n. De aceea, se foloseşte o metodă iterativă, considerând iniţial nprelevare = ∞
pentru care se calculează o valoare pentru t, care se reintroduce în ec. 1.39 şi se
calculează un nou nprelevare, s.a.m.d.
1.9. Clasificarea metodelor de separare
In primul rând, metodele de separare pot fi mecanice, cum ar fi filtrarea şi
centrifugarea, în care forţa motrice de separare este fizică (presiunea, sau forţa
centrifugă). Această posibilitate este aplicabilă sistemelor heterogene. Prin urmare,
selectivitatea lor ţine mai degrabă de separarea de faze, decât de specii analitice din
anumite probe dispersate.
Filtrarea este definită ca o operaţie analitică prin care se separă o fază solidă
dispersată într-un mediu lichid, utilizând în acest scop un material poros. Teoria filtrării se
bazează pe un model teoretic al curgerii unui lichid printr-o capilară, în acord cu legea lui
Poiseuville. Relaţia care descrie fluxul (Φ) de filtrant (reprezentat de mediul lichid având
viscozitatea η) ce trece printr-o capilară cu raza r şi lungimea L este următoarea:
4
dV π ⋅ r ⋅ P
Φl
= =
(1.40)
dt 8⋅
η ⋅ L
, în care: V este volumul de lichid, t este timpul, iar P este presiunea aplicată, care
reprezintă forţa motrice a acestei separări. Aceasta este necesară având în vedere
rezistenţa filtrului, precum şi posibilitatea de acumulare a precipitatului pe filtru, blocând
curgerea lichidului prin porii materialului filtrant. In plus, pot avea loc anumite efecte de
hidratare în porii filtrului, sau fenomene de adsorbţie şi electrocinetice, ceea ce înseamnă
că această simplă operaţie analitică nu este una pur mecanică în multe situaţii.
Cele mai simple materiale de filtrare sunt pe bază de hârtie de filtru, cu diferite
porozităţi, care influenţează curgerea lichidului, în acord cu relaţia de mai sus. Filtre de
sticlă sau de porţelan sunt de asemenea foarte utilizate în aceste operaţii. De regulă,
după filtrare se aplică o operaţie de spălare, în vederea îndepărtării complete a părţii de
matrice lichidă din proba filtrată.
In funcţie de dimensiunea particulelor solide în suspensie, filtrarea poate fi
clasificată în trei grupe:
- filtrarea simplă are loc atunci când particulele în suspensie au dimensiunea mai mare
decât 10 μm;
- se consideră microfiltrare atunci când particulele reţinute au dimensiunile între 0,02 şi
10 μm;
- prin ultrafiltrare se separă particule cu diametrul sub 0,02 μm.
In cromatografia de lichide probele care sunt injectate, chiar dacă au fost filtrate
anterior, înainte de a intra efectiv în coloana cromatografică, trec în capătul coloanei
21

printr-o frită (cu pori având diametrul de până la 0,2 μm), care are rolul de a bloca (filtra)
eventualele particule rămase în suspensie în probă. Odată ajunse în coloană ele s-ar
acumula, blocând spaţiul dintre particulele ce constituie faza staţionară, modificând astfel
curgerea prin coloană, precum şi interacţia analiţilor cu faza staţionară.
Centrifugarea este o operaţie analitică utilizată la separarea probelor heterogene.
In timpul centrifugării două forţe acţionează asupra particulelor disperse din mediul
heterogen: forţa gravitaţională şi forţa centrifugă, datorită rotaţiei aplicate. Prima este
neglijabilă în raport cu cea de a doua, mai ales când se aplică viteze mari de rotaţie;
acceleraţia centrifugă (ac) este dată de relaţia:
2
2
ac
= ω r = ( 2⋅
π ⋅ n)
⋅ r
(1.41)
. în care ω este viteza angulară (în radiani per sec); n – viteza de turaţie (rotaţii / min, sau
rpm), iar r este raza în mm. Forţa centrifugă relativă (RCF) este dată de raportul dintre
acceleraţia centrifugă şi cea gravitaţională:
2 2
a c 4π
n r
6 2
RCF = = = 1,
12 ⋅10
⋅ r ⋅ n
g g
− (1.42)
Instrumentele cu care se efectuează această operaţie se numesc centrifuge şi au fost
construite pentru prima dată de către Svedberg. In funcţie de valoarea lui RCF,
centrifugele pot fi clasificate în trei grupe: [10]
- centrifuge normale, având RCF < 3.000;
- supercentrifuge, având RCF > 3.000;
- ultracentrifuge, având RCF între 10 6 - 10 8 .
Aplicarea simultană de centrifugare şi ultrafiltrare cunoaşte aplicaţii în biochimie, cum
ar fi concentrarea soluţiilor de proteine. In acest caz se utilizează membrane din
materiale cu pori controlaţi, cum ar fi din: nitrat de celuloză, acetat de celuloză, policlorură
de vinil, poliamide, polietersulfonă, etc.
Procesele fizice bazate pe transfer de fază sunt considerate: distilarea,
vaporizarea, sublimarea, condensarea, uscarea sau cristalizarea. Aceste metode se
bazează pe proprietăţile diferite ale componenţilor unei probe de a trece în altă stare de
agregare decât cea în care se găseşte proba. Altfel spus, în cadrul acestor metode
principiul de separare ale componentelor unei probe se bazează pe punctele lor diferite
de topire, evaporare sau chiar sublimare. Chiar dacă ele sunt utilizate mai degrabă în
scopuri preparative, unele aplicaţii cu scopuri analitice pot fi totuşi întâlnite.
Tot procese de transfer de fază pot fi considerate şi solubilizarea sau
precipitarea, numai că în acest caz pe lângă intervenţia unui parametru fizic (cum este
temperatura) au loc şi procese de natură chimică (reacţii de precipitare, efecte de
hidratare/solvatare sau complexare).
Procesele de separare între faze nemiscibile se bazează pe transportul diferit al
speciilor de separat în care forţa motrice poate fi: potenţialul chimic diferit al speciilor de
separat, potenţialul electric aplicat asupra probei, reactivitate chimică, etc. Intervenţia cu
un parametru extern conduce la clasificarea metodelor de separare în două mari clase:
statice şi dinamice. In capitolele următoare, o parte a acestor metode de separare cu cele
mai largi aplicaţii în chimia analitică vor fi discutate atât din punct de vedere al principiilor
teoretice, cât şi din punct de vedere al aspectelor instrumentale.
22