teoria şi practica crioconservării spermei de cocoş în tehnologia ...

ACADEMIA DE ŞTIINŢE A MOLDOVEI
INSTITUTUL DE FIZIOLOGIE ŞI SANOCREATOLOGIE
BALAN ION
Cu titlu de manuscris
C.Z.U.: 591.963.12:589.6(478)(043.2)
TEORIA ŞI PRACTICA CRIOCONSERVĂRII SPERMEI DE
COCOŞ ÎN TEHNOLOGIA REPRODUCERII
DESCENDENŢILOR SĂNĂTOŞI
03.00.13 – FIZIOLOGIA OMULUI ŞI ANIMALELOR
Teză de doctor habilitat în biologie
Consultant ştiinţific _________________________ Teodor FURDUI,
doctor habilitat în biologie,
profesor universitar,
academician AŞM
Autor __________________________
CHIŞINĂU, 2013

© Balan Ion, 2012
2

CUPRINS
ADNOTARE (în română, rusă şi engleză) ......................................................................... 5
LISTA ABREVIERILOR .................................................................................................... 8
INTRODUCERE ................................................................................................................... 9
1. CRIOCONSERVAREA SPERMEI, REALIZĂRI ŞI PERSPECTIVE
1.1. Starea actuală a studiului mecanismelor de criodistrucţie şi crioprotecţie a
materialului seminal .............................................................................................................. 17
1.2. Rolul lipidelor şi proteinelor la derularea procesului de crioconservare a spermei ....... 26
1.3. Analiza tehnologiei de menţinere şi stabilizare a indicilor vitali ai spermatozoizilor
de cocoş în procesul de conservare ........................................................................................ 29
1.4. Factorii care influenţează calitatea materialului seminal ................................................ 38
1.5. Evoluţia şi perspectiva cercetărilor în domeniul conservării, păstrării
şi utilizării spermei de cocoş .................................................................................................. 48
1.6. Concluzii la capitolul 1 .................................................................................................... 51
2. CARACTERISTICA MATERIALULUI EXPERIMENTAL ŞI A METODELOR
DE INVESTIGAŢIE
2.1. Aspecte metodice generale ............................................................................................. 53
2.2. Metode de cercetare a membranelor plasmatice ............................................................ 53
2.3. Metode de cercetare a proteinelor .................................................................................. 55
2.4. Metode de cercetare a lipidelor ...................................................................................... 57
2.5. Metode de cercetare a spermatozoizilor şi de crioconservare a spermei ....................... 60
2.6. Micrometoda de determinare a fosforului după Vasilicovschii ..................................... 66
2.7. Determinarea conţinutului ionilor prin metoda fotometriei în flacără ...........................
2.8. Metoda folosirii preparatelor coordinative pentru menţinerea şi
66
fortificarea spermatogenezei la cocoş ................................................................................... 67
2.9. Metoda de efectuare a experienţei ştiinţifico-practice de însămînţare a găinilor 67
2.10. Prelucrarea statistică a materialului cifrologic ............................................................. 68
2.11. Concluzii la capitolul 2 ................................................................................................. 69
3. SPECIFICUL MODIFICĂRILOR MORFO-FUNCŢIONALE ŞI BIOCHIMICE
ALE MATERIALULUI SEMINAL DE COCOŞ LA CRIOCONSERVARE
3.1. Starea morfo-funcţională a spermatozoizilor de cocoş la crioconservare ....................... 70
3.2. Modificarea biochimică a componenţilor membranelor plasmatice, spermatozoizilor
şi plasmei spermei de cocoş sub influenţa factorilor de crioconservare................................. 88
3.3. Concluzii la capitolul 3 ................................................................................................... 125
3

4. MENŢINEREA STĂRII MORFO-FUNCŢIONALE A COMPONENŢILOR
STRUCTURALI DE BAZĂ ŞI STABILIZAREA STATUSULUI MORFO-FUNCŢIONAL
AI SPERMIILOR DE COCOŞ ÎN PROCESUL DE CONSERVARE.
4.1. Influenţa componenţilor structurali principali asupra spermei de cocoş în
procesul de crioconservare a ei .............................................................................................. 128
4.2. Impactul acţiunii antioxidanţilor asupra stării morfo-funcţionale a spermei de
cocoş la acţiunea temperaturilor joase şi ultrajoase ............................................................... 138
4.3. Specificul modificării componenţei spermei de cocoş la congelare-decongelare
sub influenţa regimelor termice tehnologice .......................................................................... 155
4.4. Stabilizarea funcţiei de barieră a spermei de cocoş la crioconservare ............................. 159
4.5. Influenţa substanţelor coordinative la stabilizarea şi fortificarea spermatogenezei
la cocoş ................................................................................................................................... 162
4.6. Concluzii la capitolul 4 .................................................................................................... 169
5. ELABORAREA TEHNOLOGIILOR DE CONSERVARE, PĂSTRARE, UTILIZARE
A SPERMEI DE COCOŞ ŞI IMPLEMNTAREA REZULTATELOR OBŢINUTE.
5.1. Elaborarea principiilor de creare a mediilor sintetice crioprotectoare ............................ 171
5.2. Elaborarea metodelor de stabilizare şi fortificare a spermatogenezei la cocoş ............... 173
5.3. Explorarea mediilor pentru diluarea şi conservarea hipotermală în scopul
menţinerii integrităţii morfo-funcţionale a spermei de cocoş ................................................. 175
5.4. Acţiunea mediilor integrate pentru diluarea şi crioconservarea spermei de cocoş .......... 183
5.5. Experimentarea şi implementarea rezultatelor cercetărilor în condiţii practice
de întreţinere a găinilor şi de producere intensivă a păsărilor ................................................. 188
5.6. Concluzii la capitolul 5 ..................................................................................................... 196
CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI .............................................................. 197
BIBLIOGRAFIE .................................................................................................................... 201
ANEXE ................................................................................................................................... 221
Anexa 1. Brevete de invenţie ................................................................................................... 231
Anexa 2. Acte de implementare a rezultatelor ştiinţifico-practice .......................................... 241
Anexa 3. Materiale expoziţionale ............................................................................................ 245
DECLARAŢIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII ................................................ 251
CV-ul AUTORULUI .............................................................................................................. 252
4

ADNOTARE
Balan Ion, “Teoria şi practica crioconservării spermei de cocoş şi tehnologiei
reproducerii descendenţilor sănătoşi”. Teză de doctor habilitat în biologie, Chişinău, 2013.
Structura tezei: introducere, 5 capitole, concluzii generale şi recomandări, bibliografia din 424
surse, 200 pagini de text de bază, 9 figuri, 88 tabele. Rezultatele obţinute sunt publicate în 189
lucrări ştiinţifice. Cuvinte cheie: cocoş, spermatozoid, acrozom, membrană, lipide, proteine,
antioxidanţi, medii, crioconservare, reproducere. Domeniul de studiu al tezei: fiziologia,
biotehnologia, criobiologia şi sanocreatologia reproducerii. Scopul şi obiectivele tezei:
evidenţierea şi dezvoltarea bazelor teoretice şi practice ale conservării spermei de cocoş în
tehnologia reproducerii descendenţilor sănătoşi, optimizarea mediilor sintetice, regimelor de
conservare şi criotehnologiilor. Metodologia cercetării ştiinţifice: evaluarea fiziologică,
microscopică, spectrofotometrică, preparativă, biochimică, cromatografică, statistică. Noutatea
şi originalitatea ştiinţifică: în procesul crioconservării spermei de cocoş are loc: modificarea
structural-morfologică şi biochimică la diverse nivele de organizare a spermatozoizilor;
stabilizarea stării structural funcţionale a spermatozoizilor la etapele criotehnologice prin
folosirea substanţelor biologice active, electroliţilor, neelectroliţilor, aminoacizilor şi tehnologiei
treptate de congelare. Rezultatele principial noi ale soluţionării problemei ştiinţifice:
dezvoltarea specificului reacţionării diferitor componente membranare la influenţa factorilor de
crioconservare şi stabilirea coraportului lor, estimarea posibilităţilor planificat-direcţionate a
principiilor de creare a mediilor crioprotectoare şi elaborarea metodei de stimulare a
spermatogenezei la cocoş. Semnificaţia teoretică: stabilitatea morfo-funcţională a spermei de
cocoş este predeterminată de procesele biochimice ale plasmei şi membranelor spermiilor,
inclusiv spectrul proteic şi lipidic, raportul proteine/lipide, nivelul de peroxidare a lipidelor,
permeabilitatea membranelor pentru ionii de Na + , K + , Li + , Ca 2+ , Mg 2+ , pH-ul plasmei, gradientul
osmotic, iar menţinerea integrităţii structurale şi proprietăţilor funcţionale ale spermei în
procesul de crioconservare poate fi realizată prin utilizarea substanţelor cu proprietăţi
crioprotectoare şi prin alimentaţia cocoşilor cu preparate, care favorizează spermatogeneza
sanogenă. Valoarea aplicativă a lucrării: elaborarea metodei de stimulare a spermatogenezei la
cocoş prin folosirea preparatelor coordinative; elaborarea principiilor de bază de creare a
mediilor crioprotectoare; determinarea componenţei optimale a mediilor sintetice; elaborarea
mediilor şi metodelor de stabilizare şi menţinere a indicilor care caracterizează starea funcţională
a spermatozoizilor. Implementarea rezultatelor ştiinţifice: cercetările instituţionale ale
Institutului de Fiziologie şi Sanocreatologie al AŞM, procesul didactic al Universităţii Agrare de
Stat din Moldova şi practica reproducerii în domeniul aviculturii.
5

АННОТАЦИЯ
Балан И.В., «Теория и практика криоконсервации спермы петуха в технологии
воспроизводства здорового потомства». Диссертация на соискание ученой степени
доктора хабилитат биологических наук, Кишинев, 2013. Структура диссертации: введение,
5 глав, выводы и практические рекомендации, 424 источников библиографии, 200
страниц основного текста, 9 рисунков, 88 таблиц. Полученные результаты опубликованы
в 189 научных работах. Ключевые слова: петух, сперматозоид, акросома, мембрана,
липиды, белки, антиоксиданты, среды, криоконсервация, воспроизводство. Область
исследования: физиология, биотехнология, криобиология и санокреатология воспроизводства.
Цель и задачи исследования: развитие теоретических и практических основ
консервации спермы петуха в технологии воспроизводства здорового потомства. Методы
научного исследования: физиологические, микроскопические, спектрофотометрические,
препаративные, биохимические, хроматографические и статистические. Научная
новизна и оригинальность: в процессе криоконсервации спермы петуха имеют место:
структурно-морфологические и биохимические изменения на различных уровнях организации
сперматозоидов; стабилизация структурно-функционального состояния спермиев,
на различных этапах, возможна путем использования биологически активных веществ,
электролитов, неэлектролитов, аминокислот и поэтапного замораживания. Принципиально
новые результаты в решении научной проблемы: раскрытие специфичности
реакции различных мембранных компонентов в ответ на действие факторов
криоконсервации и установлении взаимосвязи между ними, разработка принципов
целенаправленного создания криозащитных сред и метода стимуляции сперматогенеза у
петухов. Теоретическое значение: морфо-функциональная стабильность спермы петуха
предопределена биохимическими процессами плазмы и биомембран сперматозоидов, в
том числе белковый и липидный спектр, соотношение белок/липид, уровень перекисного
окисления липидов, проницаемость мембраны для ионов Na + , K + , Li + , Ca 2+ , Mg 2+ , рН
плазмы, осмотический градиент, а подержание структурной и функциональной
целостности спермы в процессе криоконсервации может быть достигнуто путем подбора и
применения препаратов, способствующие саногенному сперматогенезу. Практическое
значение работы: разработка метода стимуляции сперматогенеза с использованием
координативных соединений; разработка основных принципов создания криопротекторных
сред. Внедрение результатов исследования: плановые исследования Института
Физиологии и Санокреатологии АН Молдовы, учебный процесс Государственного
Аграрного Университета Молдовы и практика воспроизводства птицеводства.
6

ANNOTATION
Balan Ion, “The theory and practice of rooster sperm cryoconservation and the
reproduction technology of healthy descendants”. Postdoctoral thesis in biology, Chisinau
2013. Structure of dissertation: introduction, 5 chapters, conclusions and recomandations,
bibliography with 424 titles, 200 pages of main text, 9 figures, 88 tables. The obtained results are
published in 189 scientific papers. Key words: cock, spermatozoon, acrosome, membrane,
lipids, proteins, antioxidants, medium, cryoconservation, reproduction. Domain of study: physiology,
biotechnology, cryobiology and reproduction sanocreatology. The aim and objectives of
the study: to emphasize and develop the theoretical and practical basis of the rooster sperm
conser-vation in the reproduction technology of healthy descendants, optimization of the
synthetic medium conservation regimens and cryotechnology. Methodology of the scientific
research: physiological, microscopic, spectrophotometric, preparational, biochemical,
chromatographic evaluation, statistics. Novelty and scientific originality: in cryoconservation
process of the rooster sperm occurs: the structural-morphological and biochemical modification
at different levels of organization of the spermatozoon; stabilization of the functional structural
state of the spermatozoon at the level of cryotechnology through the use of the biological active
substance, electrolytes, non-electrolyte, aminoacids and gradual freezing technology. Essentially
new results in the solution of a scientific problem are: disclosure of specificity of reaction of
various membrane components in reply to influence of factors of a cryopreservation and to
establishment of interrelation between them, development of principles of purposeful creation of
cryoprotection environments and a stimulation method of the spermatogenesis at the cocks.
Theoretical value: the morpho-functional stability of the rooster sperm is predetermined by
biochemical processes of the plasma and sperm membranes including protein and lipid spectrum,
the ratio of proteins to lipids, the level of lipid peroxidation, membranes permeability for the ions
Na + , K + , Li + , Ca 2+ , Mg 2+ , plasma pH, osmotic gradient, but to maintain the integrity and functional
properties of the sperm during the cryoconservation process can be achieved by using
substances with crioprotective properties and by feeding the rooster with products that favor the
sanogenic spermatogenesis. Practical value: elaboration of the spermatogenesis stimulation
method by using coordinative products; the elaboration of the principle of creating cryoprotective
mediums; determination of the optimal composition of the synthetic mediums; elaboration
of the mediums and methods of stabilizing and maintaining the indices that characterize the
spermatozoa functional state. Implementation of scientific results: the institutional research of
the Institute of Physiology and Sanocreatology of ASM, the teaching process of the State
Agrarian University of Moldova and reproduction in poultry farming practice.
7

DMSO
LISTA ABREVIERILOR
dimetilsulfoxida
DMF dimetilformamida
DMA dimetilacetamida
ADN acidul dezoxiribonucleic
ARN acidul ribonucleic
SM sfingomielina
FEA fosfatidiletanolamina
FS fosfatidilserina
FI fosfatidilinozitolul
FC fosfatidilcolina
FL fosfolipide
POL peroxidarea lipidelor
CL cardiolipina
AF acidul fosfatidic
SL sfingolipidele
CS colesterina
LFC lizofosfatidilcolina
SOD superoxid dismutaza
GSH-Px glutation peroxidaza
ROS reacţii de oxidare specifică
ADH alcooldehidrogenaza
AC anhidraza carbonică
AMP adenozinmonofosfatul
NAD-aza nicotinamiddinucleotidaza
DAM diadehida malonică
IAS indicele absolut de supravieţuire
EG etilenglicol
1,2-BD 1,2-butandiol
AO antioxidant
Mn-SOD forma mitocondrială a superoxid dismutazei
Cu,Zn-SOD forma citoplasmatică a superoxid dismutazei
AA aminoacizi
8

INTRODUCERE
Actualitatea cercetărilor. Avicultura este o ramură a agriculturii, care se dezvoltă cel mai
dinamic. Astfel, în anul 2006 producerea globală a cărnii de pasăre a atins 80 mln tone şi a
ouălor - 66 mln tone, dintre care 67% de carne şi 50% de ouă se produc pe calea industrială
intensivă. Totodată, se prevede sporirea pînă în anul 2030 cu 2,5% anual a cărnii de pasăre în
alimentaţia populaţiei [213-217].
Dintre rasele păsărilor domestice, 30% se află pe calea de dispariţie, iar 9% deja au dispărut,
proporţia dintre rase şi riscul dispariţiei fiind cea mai mare la găini. În legătură cu aceasta în anul
2007 în oraşul Interlaken (Elveţia) cu participarea a 109 ţări a fost elaborată programa globală de
conservare a resurselor genetice ale păsărilor [246, 247]. Această programă reprezintă un
eveniment important în dezvoltarea aviculturii şi include acţiuni strategice pentru elaborarea
cadrului internaţional coerent de gestionare a biodiversităţii avicole. Totodată, în programele de
ocrotire ale naturii sunt incluse 195 de rase de păsări (77% găini, 9% raţe, 9% gîşte şi 3% curci).
S-a estimat că pentru a restabili o rasa sunt necesare peste 600 de doze de spermă congelată
[376] prin retroîncrucişări repetate într-un interval de timp de pînă la şapte generaţii [174, 243].
În acelaşi timp, selecţia puilor broiler, direcţionată sporirii masei corporale a dus la scăderea
continuă a fertilităţii prin împerechere naturală.
Instituţiile ştiinţifice continuă să activeze în domeniul menţinerii sanogenităţii funcţionării
sistemului reproductiv şi stopării degradării precoce funcţionale şi morfologice a acestuia. [122,
128] şi elaborării metodelor performante de păstrare şi conservare a resurselor genetice a
păsărilor [18, 50, 78, 171, 274]. Menţinerea intensităţii spermatogenezei ca proces morfo-
fiziologic, care cuprinde totalitatea transformărilor prin care trec spermatogoniile şi asigurarea
sanogenităţii spermei, reprezintă una dintre sarcinile prioritare ale sanocreatologiei [124, 136]. În
ultimele decenii au fost elaborate şi implementate tehnologii originale de conservare a spermei
de taur, vier, berbec, ţap, iepure [264, 280, 16, 29, 47, 58, 65, 72, 91, 97, 323, 387], de
crioconservare a spermei de cocoş [17, 24, 31, 81, 116, 369, 409].
Eficienţa de conservare depinde de progresele tehnologiilor de congelare şi decongelare.
Deşi elaborarea mediilor de crioconservare a spermatozoizilor de pasăre s-a aflat în vizorul
comunităţii ştiinţifice peste 100 de ani, rezultatele obţinute, tehnologiile de crioconservare a
spermei nu permit pe deplin, folosirea eficientă a materialului genetic în practica de ameliorare şi
selecţie, deoarece după crioconservare numai 50-60% de spermatozoizi îşi păstrează integritatea
funcţională.
9

În prezent metoda cea mai fezabilă pentru gestionarea ex-situ a resurselor genetice ale
păsărilor este crioconservarea materialului seminal, dar nu crioconservarea embrionilor,
ovocitelor [171, 303] sau a celulelor blastodermice şi germinale primordiale [405], sau a altor
metode insuficient de eficace, care sunt prea costisitoare pentru programele de conservare
genetică [340].
Prin urmare, crioconservarea materialului seminal aviar, este singura metodă eficientă şi
disponibilă de management ex-situ pentru toate speciile de păsări.
Eficienţa redusă a criotehnologiilor spermei de cocoş este determinată, atît de complicitatea
mecanismelor modificării morfologice, metabolice şi funcţionale în procesul congelăriidecongelării,
cît şi de reactivitatea sporită şi toleranţa scăzută a materialului seminal către
temperaturi ultrajoase. Reieşind din cele menţionate, succesul crioconservării şi conservării
hipotermale a materialului seminal de cocoş, în mare măsură, depinde de reuşita studierii
mecanismelor menţinerii homeostaziei structural-biochimice, legităţilor apariţiei criodeteriorării
celulelor reproductive şi de elaborarea condiţiilor şi tehnologiilor adecvate de conservare. De
aceea aceste probleme au constituit scopul principal al prezentei lucrări.
Descrierea ştiinţifică în domeniul de cercetare şi identificarea problemelor de
cercetare.
În pofida faptului, că conservarea spermei de cocoş a stat la baza crioconservării spermei ca
atare, primele publicaţii de amploare a utilizării cu succes a materialului seminal crioconservat
de cocoş au fost realizate în anul 1978 de către Lake şi Stewart şi în anul 1980 de către Sexton,
adică după mai mult de treizeci de ani de la raportul lui Shaffner et al. [370]. Lake si Stewart au
utilizat metode de răcire, congelare şi decongelare în rate, glicerina ca agent crioprotector intern
şi flacoane de sticlă pentru împachetarea materialului seminal. Sexton [368], de asemenea, a
utilizat tehnologia de refrigerare lentă a probelor spermatice, dar în calitate de crioprotector
intern a folosit DMSO şi paie pentru ambalare. Ambele metode au fost optimizate mai tîrziu de
către Seigneurin şi Blesbois [366]. Sunt publicaţii în care se descriu metodele de răcire rapidă,
congelarea şi decongelarea materialului seminal [ 50, 81, 90, 109, 365, 400], care includ în
calitate de crioprotectori interni dimetilformamidă (DMF), dimetilacetamida (DMA), glicerina şi
al. Compararea crioprotectorilor şi a metodelor de crioconservare a spermei, folosite în condiţii
standardizate industriale obţinute de la cocoşii broiler, a arătat că cele mai mari rate de fertilitate,
după însămînţarea artificială a găinilor cu material seminal crioconservat au fost obţinute în
cazul folosirii în calitate de crioprotector a glicerinei la ambalarea spermei în paiete. Rezultate
analogice au fost obţinute şi la congelarea-decongelarea spermei de cocoş prin utilizarea DMA
10

ca crioprotector si a paietelor pentru ambalare [400]. Ultima metodă de congelare-decongelare,
după o perfecţionare prin folosirea în calitate de crioprotector a DMA, după optimizarea ei, în
combinaţie cu ambalarea în paiete (în scopuri optime de identificare şi siguranţă) a fost aleasă ca
standard şi de referinţă pentru sistemul bancar de spermă al raselor locale de păsări din Olanda
[413]. În acelaşi timp, în Franţa, metoda cu glicerină este considerată a fi de referinţă în
activitatea spermobăncilor, deoarece aceasta s-a dovedit a fi mai eficientă în procesul de
fecundare [173, 174]. Prin această metodă, rata fertilităţii medii, obţinută cu materialul seminal
crioconservat, provenit din populaţii mici de păsări, pe cale de dispariţie, din linii mai mult sau
mai puţin subfertile şi/sau consangvine variază în limitele 7-68% [174]. Prin folosirea spermei
decongelate, obţinute de la cocoşii din liniile mai puţin fertile, cu femele de tip comercial
(intensiv) fertilitatea a crescut de la 7% pînă la 43%. Glicerina se consideră, cel mai bun
crioprotector pentru spermatozoizii de cocoş, dar în acelaşi timp, este necesar să fie eliminată din
material seminal după decongelarea lui. Acest lucru se propune prin centrifugarea succesivă,
diluare sau dializă [289]. De aceea, metoda de crioconservare a materialului seminal cu utilizarea
glicerinei este considerată mai dificilă, comparativ cu tehnica metodei prin folosirea DMA. Însă,
din cauza complicităţii acestora şi costului înalt al echipamentelor tehnologice, ele nu sunt
utilizate în reproducerea industrială a găinilor. Adică, explorarea noilor criprotectori cu eficienţă
înaltă este o problemă a crioconservării spermei de cocoş.
O altă problemă a păstrării hipotermale a spermei de cocoş reprezintă menţinerea calităţii
materialului seminal proaspăt recoltat. Deteriorările ce apar la crioconservarea spermiilor duc la
scăderea eficacităţii fecundităţii, comparativ cu sperma proaspătă [2, 248, 390]. Diminuarea
sporită a calităţii materialului seminal după decongelare, în mare măsură, este predeterminată de
persistenţa devierilor deja prezente în materialul seminal proaspăt înainte de congelare.
Practica multianuală a Institutului de Fiziologie şi Sanocreatologie de cercetare a spermei de
cocoş relevă despre existenţa dificultăţilor în obţinerea materialului seminal cu o calitate înaltă,
care pot fi rezolvate, în mare măsură, prin modificarea raţiei alimentare a reproducătorilor [70].
În contextul problemelor expuse şi luînd în consideraţie importanţa economică şi ecologică
a lor a fost realizat un studiu aprofundat şi multilateral al proceselor de criodeteriorare şi păstrare
a proprietăţilor funcţionale şi biochimice după decongelarea spermei de cocoş.
Scopul lucrării: Identificarea bazelor teoretice şi practice ale conservării spermei de cocoş
în tehnologia reproducerii descendenţilor sănătoşi.
Obiectivele lucrării:
1) Evidenţierea stabilităţii funcţionale a spermatozoizilor la influenţa factorilor termici şi a
11

aportului componenţilor structurali principali ai spermei de cocoş;
2) Determinarea specificului intensităţii metabolismului proteic la acţiunea factorilor termici
şi a componenţei aminoacizilor în membrane, spermatozoizi şi plasma seminală;
3) Elucidarea particularităţilor spectrului lipidic al spermatozoizilor de cocoş, membranelor
plasmatice ale lor şi plasmei seminale;
4) Elaborarea şi experimentarea in vivo a remediilor coordinative stimulatoare ale
spermatogenezei la cocoş;
5) Elaborarea mediilor sintetice pentru păstrarea hipotermală şi crioconservarea spermei de
cocoş, precum şi a tehnologiei performante de păstrare şi utilizare a ei;
6) Testarea în condiţii industriale de creştere a păsărilor a tehnologiei elaborate.
Metodologia cercetării ştiinţifice se bazează pe conceptele privind:
a) sporirea sanogenităţii spermei prin suplinirea direcţionată a raţiei alimentare a
reproducătorilor [2, 6, 13, 41, 43];
b) conservarea spermei prin utilizarea temperaturilor ultrajoase [3, 14, 34, 37, 40];
c) eficientizarea fortificării procesului de congelare-decongelare a spermei prin utilizarea
crioprotectorilor şi substanţelor membranotrope [7, 12, 17, 33, 35];
d) rolul reacţiilor generale şi specifice de specie în declanşarea dereglărilor morfofuncţionale
şi biochimice în procesul de crioconservare [19, 21, 22, 32, 36];
e) diminuarea intensităţii stresului termic şi osmotic excesiv la etapele tehnologice ale
crioconservării spermei [10, 23, 24, 29].
Noutatea şi originalitatea ştiinţifică se referă la faptul, că în premieră:
► S-a stabilit specificul modificărilor morfo-funcţionale ale spermei de cocoş;
► S-a constatat că modificările integrităţii acrozomale şi deteriorările membranelor
spermatozoizilor de cocoş în procesul de crioconservare, în mare măsură, sunt determinate de
schimbările raportului proteine/lipide şi permeabilitatea selectivă a membranelor plasmatice
pentru ionii de Na + , K + , Li 2+ şi Ca 2+ , predeterminată de forţele determinante ale gradientului
osmotic, dependent de conţinutul şi concentraţia ionilor;
► S-a demonstrat că cele mai sensibile componente ale membranelor plasmatice ale
spermatozoizilor de cocoş la crioconservare sunt fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,
cerebrozidele fracţiile 3 şi 5, trigliceridele şi colesterina;
► S-au stabilit în sperma de cocoş la crioconservare modificări ale dialdehidei malonice;
► S-a elucidat stabilitatea indicelui Fisher prin modificări, destul de moderate, ale
echilibrului aminoacidic al membranelor plasmatice ale spermatozoizilor şi plasmei seminale,
precum şi al intensităţii metabolismului proteinelor spermatice;
12

► S-a stabilit interrelaţia dintre stabilitatea ADN-lui şi 5 1 -nucleotidazei, scăderea activităţii
Мg +2 (Na + +К + )-ATP-azei în membranele plasmatice şi criorezistenţa nucleului, capului şi
flagelului spermatozoizilor;
► S-a determinat efectul stimulator asupra spermatogenezei a preparatelor coordinative,
obţinute prin sinteză LAZ (Zn(CCl3COO)24H2O) şi TAS (Zn(HSeO3)24H2O);
► S-a constatat că la influenţa factorilor crioconservării, proteinele reacţionează prin
reacţiile compensatoare, lipidele - prin reacţiile de oxidoreducere, iar glucidele - prin
modificarea arhitectonicii structurilor extramembranare.
Rezultatele principial noi ale soluţionării problemei ştiinţifice constau în dezvoltarea
specificului reacţionării diferitor componente membranare la influenţa factorilor de
crioconservare şi stabilirea coraportului lor, estimarea posibilităţilor planificat-direcţionate a
principiilor de creare a mediilor crioprotectoare şi elaborarea metodei de stimulare a
spermatogenezei la cocoş.
Semnificaţia teoretică a lucrării constă în elaborarea unui concept nou, conform cărui,
stabilitatea morfo-funcţională a spermei de cocoş este predeterminată atît de procesele
biochimice ale plasmei, cît şi ale membranelor spermiilor, inclusiv spectrul proteic şi lipidic,
raportul proteine/lipide, nivelul de peroxidare a lipidelor, permeabilitatea membranelor pentru
ionii de Na + , K + , Li + , Ca 2+ , Mg 2+ , pH-ul plasmei, gradientul osmotic, iar menţinerea integrităţii
structurale şi proprietăţilor funcţionale ale spermei în procesul de crioconservare poate fi
realizată prin selectarea direcţionată şi utilizarea substanţelor cu proprietăţi de a menţine
procesele biochimice în plasmă şi spermatozoizi la nivelul stării native şi prin alimentaţia
cocoşilor cu preparate, care favorizează spermatogeneza sanogenă. La dezvoltarea teoriei
criobiologiei celulelor reproductive de cocoş contribuie, de asemenea, stabilirea legităţilor
transformării spectrului aminoacizilor, proteinelor, lipidelor şi raportului lor, specificul stării
morfo-funcţionale, funcţiilor bariere, acţiunii antioxidanţilor, regimelor termice, influenţei
substanţelor coordinative şi acţiunii mediilor integrate pentru diluarea şi conservarea spermei.
Valoarea aplicativă a lucrării s-a realizat prin determinarea proprietăţilor protectoare
eficiente ale glucidelor şi poliglucidelor la crioconservare, electroliţilor şi neelectroliţilor în
componenţa mediilor sintetice pentru sperma de cocoş; determinarea concentraţiei optimale a
componenţei mediilor sintetice; studierea regimurilor criotehnologice; elaborarea mediilor pentru
diluarea, păstrarea şi conservarea spermei de cocoş; extracţia tetraoxidului cu proprietăţi
antioxidative; elaborarea metodei de stimulare a spermatogenezei la cocoş; elaborarea
principiilor de bază de creare a mediilor crioprotectoare, care reduc la minimum incidenţa
cercetărilor empirice.
13

Rezultatele ştiinţifice principale înaintate spre susţinere:
● Modificarea proprietăţilor morfo-fiziologice şi fizico-chimice ale spermei de cocoş sub
influenţa factorilor criotehnologici;
● Modificarea spectrului proteic al aminoacizilor şi lipidelor membranelor plasmatice,
spermatozoizilor şi plasmei seminale în procesul de crioconservare;
● Sporirea eficienţei conservării spermei de cocoş prin utilizarea mediilor sintetice
elaborate;
● Stimularea spermatogenezei la cocoş prin administrarea preparatelor coordinative;
● Principiile de bază de elaborare ale mediilor sintetice pentru crioconservarea materialului
seminal;
● Schema de organizare a reproducerii artificiale a găinilor prin utilizarea spermei
conservate de cocoş;
● Conceptul ştiinţific cu privire la stabilitatea şi menţinerea integrităţii structurale şi
proprietăţilor funcţionale ale spermei în procesul de crioconservare.
Implementarea rezultatelor ştiinţifice a fost realizată în cadrul cercetărilor instituţionale
ale Institutului de Fiziologie şi Sanocreatologie al AŞM, în procesul didactic al Universităţii
Agrare de Stat din Moldova şi în practica reproducerii în domeniul aviculturii.
Aprobarea rezultatelor ştiinţifice. Rezultatele cercetărilor ştiinţifice au fost comunicate şi
discutate la şedinţele Consiliului Ştiinţific al Institutului de Fiziologie şi Sanocreatologie pe
parcursul anilor 1992-2012, şedinţa Laboratorului Sanocreatologia sistemului reproductiv şi
Criobiologie ”V. Nauc” al Institutului de Fiziologie şi Sanocreatologie al AŞM, (11.05.2012),
Seminarul ştiinţific de profil „Fiziologia omului şi animalelor” pe lîngă Institutul de Fiziologie şi
Sanocreatologie al AŞM, (25.05.2012), Seminarul ştiinţific de profil „Fiziologia omului şi
animalelor” pe lîngă Universitatea Agrară de Stat din Moldova, (02.11.2012) şi la peste 60 de
foruri ştiinţifice de specialitate la nivel naţional şi internaţional: Congresul VII al fiziologilor din
Republica Moldova, Chişinău, 2012; Congresul III al fiziologilor ţărilor CSI, Moscova-Ialta,
Rusia-Ucraina, 2011; Congresul IX Naţional al Geneticienilor şi Amelioratorilor, Chişinău,
2010; A Magyar Buiatricus Tarsasag. 19 th International Congress of the Hungarian, Debrecen,
2009; Congresul II al fiziologilor ţărilor CSI, Moscova-Chişinău, 2008; XXV Jubilee World
Buiatrices Congress, Budapest, Hungary, 2008; XXXVII national session of scientific
communications of the faculty of animal science, Bucureşti, România, 2008; Conferinţa
internaţională „Problemele actuale ale protecţiei şi valorificării durabile a diversităţii lumii
animale”, Chişinău 2007; Simpozionul ştiinţific „Perspective în creşterea animalelor”,
Maximovca, 2006; Conferinţa ştiinţ.-practică internaţ. „Problemele actuale ale intensificării
14

producerii produselor de origine animală”, Jodino, Belarus, 2005; Congresul V şi VI al
fiziologilor din Republica Moldova, Chişinău, 1999, 2005; Conferinţa ştiinţifico-practică
internaţională „Scopul şi importanţa metodei de însămînţare artificială a animalelor în procesul
de creştere a animalelor în secolele XX-XXI”, Dubroviţî, Federaţia Rusă, 2004; Simpozion
ştiinţific internaţional „70 ani ai UASM”, Chişinău, 2003; Sesiunea anuală de comunicări
ştiinţifice „Problemele actuale şi de perspectivă în zootehnie”, Iaşi, România, 1999, 2002;
Conferinţa a VI-а ştiinţifică internaţională „Progresul tehnico-ştiinţific, biotica si medicina.
Probleme de existenţă umana” Chişinău, 2001; Conferinţa corpului didactic-studenţesc "Bilanţul
activităţii ştiinţifice a USM pe anii 1998-1999", Chişinău, 2000; Conferinţa jubiliară a
Academiei veterinare din Moscova, Moscova, Federaţia Rusă, 1999; 10th European poultry
conference. Ierusalim, Izrael, 1998; Sesiunea anuală de comunicări ştiinţifice „Present interests
in animal pathology” Cluj-Napoca, România, 1997; Congress Programs ICAR, Sidney,
Australia, 1996; XX Worlds Poultry Congress, New Deihl, India, 1996; International scientific
symposium of husbandry, Iasi, România, 1996; Conferinţa ucraineană a avicultorilor, Harkov,
Ucraina, 1996; Reuniunea a XIV de conservare a resurselor genetice, Puşcino, Federaţia Rusă,
1996; Simpozionul „Reproducerea animalelor” dedicat semicentenarului Universităţii de ştiinţe
agricole a Banatului din Timişoara, România, 1995; Symposium 125 years of higher agronomic
education at Cluj-Napoca, România, 1994; Congresul XVIII al Academiei Româno-Americane
de ştiinţă şi artă, Cişinău, 1993; Congresul societăţii medico-biologice din Moldova, Chişinău,
1993; Prima reuniune naţională de ştiinţe fiziologice Iaşi-Chişinău, 1993; Congresul IV al
geneticienilor şi selecţionerilor din Moldova, Chişinău, 1992 şi al.
Publicaţii la tema tezei. Materialele de bază ale tezei au fost publicate în 189 lucrări
ştiinţifice, inclusiv 4 monografii, un manual, 4 articole de sinteză, 5 articole în reviste de
circulaţie internaţională, 4 articole în culegeri internaţionale, 40 de articole în culegeri naţionale,
75 materiale ale comunicărilor ştiinţifice, 44 de teze ale comunicărilor ştiinţifice, 7 brevete de
invenţie, 15 publicaţii sunt fără coautori (11 articole, 4 materiale ştiinţifice), 5 - alte lucrări
ştiinţifice.
Volumul şi structura tezei. Teza este expusă pe 200 pagini de text de bază, procesate la
calculator, fiind constituită din: adnotări în limbile română, rusă şi engleză, lista abrevierilor,
introducere, 5 capitole, concluzii generale, recomandări practice, bibliografie din 424 de titluri şi
3 anexe. Materialul iconografic include 88 de tabele şi 9 figuri.
Cuvinte-cheie: cocoş, spermatozoid, acrozom, membrană, lipide, proteine, antioxidanţi,
medii, crioconservare, reproducere.
Sumarul compartimentelor tezei.
15

Capitolul 1 conţine reviul literaturii bazat pe surse bibliografice. În acest capitol sunt
prezentate datele din literatura ştiinţifică modernă cu privire la starea actuală a cercetărilor în
domeniul crioconservării materialului seminal al păsărilor (modificările morfo-fiziologice în
procesul crioconservării, desfăşurarea proceselor fizico-chimice şi biochimice în sistemele
biologice), reglări în domeniul crioconservării resurselor genetice, posibilităţilor cunoscute de
stabilizare a indicilor vitali ai spermatozoizilor de cocoş în procesul de crioconservare, care
influenţează calitatea materialului seminal.
În capitolul 2 sunt descrise materialele şi metodele moderne de cercetare utilizate în studiul
prezent (fiziologice, microscopice, spectrofotometrice, preparative, biochimice şi
cromatografice), cît şi în logaritmul investigaţiilor efectuate.
În capitolul 3 sunt prezentate şi analizate modificările evidente ale materialului seminal de
cocoş: starea morfologică şi termorezistenţa spermei de cocoş; funcţiile bariere ale membranei
plasmatice a spermatozoizilor; modificările biochimice ale componenţilor membranari, în
particular, a proteinelor, lipidelor şi activităţii enzimelor membranodependente.
În capitolul 4 sunt prezentate şi analizate rezultatele cercetărilor cu privire la stabilizarea şi
menţinerea stării morfo-funcţionale şi biochimice a indicilor vitali ai spermatozoizilor de cocoş
în procesul de crioconservare prin folosirea concentraţiilor optimale ale aminoacizilor, lipidelor,
glucidelor, antioxidanţilor, crioprotectorilor şi combinaţiilor lor, regimelor tehnologice adaptate
la componenţa mediilor; precum şi a electroliţilor şi neelectroliţilor la diluarea şi păstrarea
hipotermală a materialului seminal.
În capitolul 5 sunt prezentate rezultatele elaborării tehnologiilor şi mediilor pentru diluarea,
crioconservarea şi păstrarea hipotermală a materialului seminal; experimentării şi implementării
rezultatelor cercetărilor în condiţii practice de întreţinere a păsărilor, cît şi, de reproducere
intensivă a lor.
16

1. CRIOCONSERVAREA SPERMEI, REALIZĂRI ŞI PERSPECTIVE
1.1. Starea actuală a studiului mecanismelor de criodistrucţie şi crioprotecţie a materialului
seminal.
1.1.1. Starea actuală în crioconservarea materialului seminal al păsărilor.
Crioconservarea materialului seminal al diverselor specii de animale domestice este o
biotehnologie performantă de reproducere, care se utilizează pentru dezvoltarea progresului
genetic, menţinerea şi conservarea biodiversităţii potenţialului genetic şi pentru ameliorarea
proceselor însămînţărilor artificiale.
Dezvoltarea crioconservării gameţilor de pasăre s-a aflat în vizorul atenţiei comunităţii
ştiinţifice peste 100 de ani. În monografia lor clasică Luyet şi Gehenio [293] au elucidat toate
observaţiile acţiunilor temperaturilor biologice scăzute cunoscute între anii 1736 - 1936, inclusiv
şi cele citate de către Atkins (1909) şi de către Moran (1925), cu privire la congelarea şi efectele
temperaturilor scăzute asupra ouălor de găină. După puţin timp Shaffner et al. [370] în rezultatul
numeroaselor cercetări ale celulelor sexuale aviare au demonstrat că este posibilă obţinerea
ouălor fecundate de la găinile însămînţate cu material seminal congelat de cocoş, deşi nu au
obţinut pui vii după incubaţie [171, 182].
Ulterior, Polge et al. [343] au raportat că glicerolul posedă proprietăţi protectoare contra
efectelor temperaturilor scăzute asupra spermatozoizilor. Ei au descoperit că spermatozoizi
aviari, suspendaţi în soluţia Ringher, care conţinea 20% de glicerină şi congelaţi la temperatura
de pînă la 79 °C şi apoi decongelaţi s-au păstrat mobilitatea, care nu devia semnificativ de la
aceeaşi valoare a spermiilor din lotul martor, care nu au fost supuşi congelării.
Din anul 1949, după congelarea cu succes a spermei de cocoş, au fost efectuate multiple
studii pentru îmbunătăţirea şi standardizarea metodelor de conservare pe termen lung a
spermatozoizilor de diferite specii de animale. Acestea au inclus şi spermatozoizii de păsări
domestice [198, 274, 303, 411]. Însă, în pofida investiţiilor relativ intense ale comunităţii
ştiinţifice din domeniul cercetării privind crioconservarea materialului seminal, aceste metode au
fost utilizate neintensiv în creşterea păsărilor de curte. Unul dintre motive este faptul că
însămînţarea artificială nu era utilizată pe scară largă cu numeroase specii de păsări domestice.
Deşi, însămînţările cu material seminal proaspăt sunt intens folosite în reproducerea unor specii
de păsări, atunci succesul procedurilor de congelare, care se aplică păsărilor de curte este foarte
variabil şi depinde de speciile concrete şi liniile specifice de păsări.
Indiferent de constrîngerile menţionate mai sus, ratificarea acordului internaţional asupra
biodiversităţii de la Rio de Janeiro, Brazilia în 1992, a provocat noi interese în dezvoltarea
17

metodelor de congelare a materialului seminal al păsărilor domestice. Cercetările în
crioconservarea celulelor aviare, inclusiv a spermatozoizilor, au căpătat o atenţie renovantă, care
au fost direcţionate asupra următoarelor proprietăţi: 1) conservarea spermei raselor rare; 2)
menţinerea acceptibilă a variabilităţilor genetice în linii parentale; 3) disponibilitatea utilizării pe
termen lung a potenţialului genetic de la indivizii excepţionali.
Progresele recente înregistrate în crioconservarea materialului seminal aviar, în particular,
de cocoş, au predeterminat activizarea gestionării băncilor de gene din Europa şi America de
Nord [169, 225, 413] în realitatea mediului natural asupra condiţiilor de creştere intensivă a
anumitor specii de păsări. Această activitate este foarte importantă pentru speciile de păsări
domestice, care includ un număr foarte mare de crosuri rare şi linii. De exemplu, în Franţa există
în jur de 154 de linii şi crosuri rare din specia Gallus gallus [396], reprezentînd o mare
diversitate de populaţii gestionate de către amatori, instituţii de cercetare şi crescătorii
comerciale. Aceste linii şi crosuri sunt foarte rare în toate ţările şi sunt expuse unor riscuri de
epidemii (ex: Gripa aviară). La fel sunt expuse la eşecul de gestionare şi de consangvinizare
dăunătoare populaţiile mici de păsări. Aceste resurse ar putea fi salvate numai prin programe de
conservare care, în mod ideal ar combina managementul in-situ şi ex-situ.
Metoda cea mai fezabilă pentru gestionarea ex-situ a resurselor genetice ale păsărilor este
crioconservarea materialului seminal, dar nu crioconservarea embrionilor ovocitelor [174, 303]
sau a celulelor blastodermice şi germinale primordiale [405], sau a altor metode insuficient de
eficace, care sunt prea costisitoare pentru programele de conservare genetică [339].
Prin urmare, crioconservarea materialului seminal aviar, este singura metodă eficientă şi
disponibilă de management ex-situ pentru toate speciile de păsări.
Crioconservarea este o metoda nonfiziologică, care implica un nivel ridicat de adaptare a
celulelor biologice la şocurile osmotice şi termice la congelare şi decongelare [164].
Spermatozoizii de pasăre conţin foarte puţină citoplasma şi, în mod proporţional, o suprafaţă
foarte mare de membranele plasmatice [212, 273]. Acestea, de asemenea, conţin un număr
variabil de mitocondrii (20-60), iar nucleul lor este constituit din cromatină foarte condensată.
În consecinţă, multe studii au fost efectuate pentru a se găsi cel mai bun agent crioprotector,
cele mai bune metode de congelare-decongelare, cele mai optime temperaturi şi materiale
(ambalaje), care vin în contact cu materialul seminal [303]. Prin prisma acestor constrîngeri,
rezultatele obţinute de către diferiţi cercetători au elucidat diverse proceduri, în funcţie de
varietăţile de specie iar, uneori, şi la anumite rase din aceeaşi specie.
18

În ciuda faptului, că conservarea cu succes a spermei de cocoş a stat la baza crioconservării
spermei ca atare, primele publicaţii de amploare a utilizării cu succes a materialului seminal
crioconservat de cocoş au fost realizate de către Lake şi Stewart [273] şi Sexton [369], adică
după mai mult de treizeci de ani de la raportul lui Shaffner et al. [370]. Lake si Stewart au utilizat
metode de răcire, congelare şi decongelare în rate, glicerina ca agent crioprotector intern şi
flacoane de sticlă pentru împachetarea materialului seminal. Sexton, de asemenea, a utilizat
tehnologia de refrigerare lentă a probelor spermatice, dar în calitate de crioprotector intern a
folosit DMSO şi paie pentru ambalare. Ambele metode au fost optimizate mai tîrziu de către
Seigneurin şi Blesbois [366]. Alte metode şi proceduri, utilizate pentru răcirea rapidă, congelarea
şi decongelarea materialului seminal au fost elaborate de [50, 116, 365, 400]. În calitate de
crioprotectori interni a fost folosită DMF, DMA, glicerina şi al. Compararea crioprotectorilor şi a
metodelor de crioconservare a spermei, folosite în condiţii standardizate industriale, obţinute de
la cocoşii broiler a arătat că cele mai mari rate de fertilitate (mai mult de 90%), după
însămînţarea artificială a găinelor cu material seminal crioconservat au fost obţinute după
congelarea-decongelarea lui, la folosirea în calitate de crioprotector glicerinei şi la ambalarea
spermei în paiete. Aceleaşi rezultate au fost obţinute şi la congelarea-decongelarea spermei de
cocoş prin utilizarea DMA ca crioprotector si a paietelor pentru ambalare [400]. O adaptare a
ultimei metode de congelare-decongelare, la folosirea în calitate de crioprotector a DMA după
optimizarea ei în combinaţie cu ambalarea în paiete (în scopuri optime de identificare şi
siguranţă) a fost aleasă ca standard şi metodă de referinţă pentru sistemul bancar de spermă al
raselor locale de păsări din Olanda [413]. În Franţa, metoda cu glicerină este considerată a fi de
referinţă în activitatea spermobancurilor, deoarece aceasta s-a dovedit a fi mai eficientă în
procesul de fecundare [173, 182]. Prin această metodă, rata fertilităţii medii, obţinută cu
materialul seminal crioconservat, provenit din populaţii mici de păsări, pe cale de dispariţie, din
linii mai mult sau mai puţin subfertile şi/sau consangvine variază în limitele 7 - 68% [171]. Prin
folosirea spermei decongelate, obţinute de la cocoşii din liniile mai puţin fertile, cu femele de tip
comercial (intensiv) fertilitatea a crescut de la 7% pînă la 43%. La acest capitol, glicerina este,
probabil, cel mai bun crioprotector pentru spermatozoizii de cocoş, dar în acelaşi timp, este
necesar să fie eliminată din material seminal după decongelarea lui. Acest lucru poate fi realizat
prin centrifugarea succesivă, diluare sau dializă [289].
În general este acceptat faptul, că un criteriu important în caracteristica capacităţilor de
rezistenţă a spermei la congelare-decongelare este calitatea materialului seminal proaspăt
recoltat. Deteriorările apărute la crioconservarea spermei duc la scăderea rezultatelor sistematice
19

ale calităţii comparativ cu sperma proaspătă [248, 390]. Diminuarea sporită a calităţii
materialului seminal după decongelare, de asemenea, este predeterminată de persistenţa
devierilor deja prezente în materialul seminal proaspăt înainte de congelare.
Concomitent cu existenţa factorilor generali, sunt prezenţi factorii specifici biologici şi
biofizici, care asigură proprietatea spermei de a preveni posibilele dereglări cauzate de procesul
de crioconservare. Aceşti factori, în general, includ permeabilitatea, compoziţia lipidelor şi
fluiditatea membranelor. Aceste deteriorări membranice provoacă consecinţe nefaste asupra
mobilităţii şi diversităţii proceselor metabolice, inclusiv şi asupra concentraţiei ATP în
spermatozoizi [170, 172, 290, 366]. Dintre toţi aceşti factori, fluiditatea membranară în
materialul seminal proaspăt recoltat s-a dovedit a fi proporţională cu raportul
colesterină/fosfolipidele al spermei şi serveşte ca un indicator al particularităţilor de specie.
Cercetările experimentale contemporane au arătat, că fluiditatea membranară este, în acelaşi
timp, un bun indicator anticipat al proprietăţilor materialului seminal pentru crioconservare,
obţinut de la diverşi masculi din aceeaşi specie [173].
Corelaţia dintre fluiditatea membranară, compoziţia lipidelor şi proprietăţile de congelare
ale materialului seminal, de asemenea, prezintă interes pentru faptul, că compoziţia lipidelor
spermatice pot fi modificate şi de factorii de mediu, cum ar fi dieta [171], care produce
modificări ulterioare asupra fluidităţii membranelor. Ca consecinţă, în viitor, dieta ar putea servi
ca factor etalon de sporire a capacităţilor de congelare a spermei aviare.
1.1.2. Modificări morfo-fiziologice în procesul de crioconservare.
Studiul morfologic al spermiilor a fost posibil datorită coloraţiilor vitale, tehnicilor
biochimice şi, în deosebi, microscopiei electronice.
Sub aspect morfologic spermiul este format din: cap, gît, piesa intermediară, piesa
principală şi piesa terminală. Cele trei piese (intermediară, principală şi terminală) alcătuiesc la
un loc flagelul sau coada spermiului [15].
Capul spermiului, din punct de vedere al structurilor chimice, este format, în special, din
nucleoproteide şi cantităţi mici de proteine libere, lipide şi săruri. Nucleoproteidele conţin acid
dezoxiribonucleic (ADN) şi o proteină simplă, care, în cazul păsărilor este o protamină.
Histonele sunt reprezentate de circa 18 aminoacizi (AA), dintre care arginina constituie
aproximativ 25%. ADN-ul reprezintă circa 55% din substanţa uscată a capului spermiului, iar
împreună cu histonele – 80-83%. În afară de nucleoproteide capul spermiului conţine şi
lipoproteine (17-20%), care sunt concentrate în special în acrozom.
20

În componenţa capului intră mai multe formaţiuni: nucleul, acrozomul, perforatorul,
capişonul sau furoul postnuclear, protuberanţele bazale, fosa de implantaţie şi membrana
celulară.
În procesul derulării etapelor tehnologice de crioconservare a spermei are loc deteriorarea
structurilor celulare, în rezultatul căreia se produc schimbări calitative şi cantitative ale
substanţelor vitale, care provoacă diminuarea indicilor specifici fiziologici ai gameţilor.
Este stabilită corelarea pozitivă dintre concentraţie şi mobilitate, concentraţie şi volum.
Mobilitatea, la rîndul ei, corelează pozitiv cu starea morfologică a spermatozoizilor de cocoş, dar
nu corelează cu integritatea membranelor. S-a dovedit, că mobilitatea, concentraţia, integritatea
membranelor şi starea morfologică depinde şi de rasa cocoşilor.
Mobilitatea şi hemotaxisul sunt funcţii obligatorii ale spermatozoizilor, în absenţa căror este
imposibila fecunditatea [252, 263, 325, 354]. Reglarea mobilităţii poate fi realizată şi prin
intermediul ionilor de Ca +2 [236, 287, 318, 385, 395]. Suplinirea ionilor de Ca +2 sporeşte viteza
mişcării spermatozoizilor [329].
Adaosul proteinelor din ovulele „Xenopus” prelungeşte mobilitatea spermatozoizilor şi
aceste proteine pot servi ca stimulatori ai spermatozoizilor. Este cunoscut, că în ovulă există trei
varietăţi de substanţe hemoatractive, stimulatori ai mobilităţii şi participanţi la reacţia
acrozomală [342, 403]. Aceste substanţe sunt Ca +2 -dependente în diapazonul mili molar [385].
Proprietăţile mecanice ale mediului influenţează viteza mişcării spermatozoizilor. Aceste
proprietăţi includ viscozitatea, care este predeterminată de interacţiunea spermatozoizilor cu
complexul proteoglicanelor [286].
Procesul de crioconservare a celulelor şi ţesuturilor prezintă un factor de risc pe tot fluxul
frigorific. Pierderea celulelor are loc în cazul crioconservării, incomplectităţii perioadei de
precongelare, decongelării întîmplătoare sau contaminării cu microorganisme. Concomitent,
identificarea factorilor de risc, invers sporeşte eficienţa utilizării obiectelor crioconservate [306].
Unul dintre componentele celulei, care deseori se deteriorează la crioconservare este
citoscheletul. Stabilizarea lui poate influenţa benefic rezultatele crioconservării. În acest scop se
propune folosirea componentelor citoschelet-stabilizatoare - cetohalazina sau colhicina, dar
aceste preparate, la rîndul său, pot provoca depolimerizarea actinei, ce poate fi periculos pentru
dezvoltarea embrionilor [75, 294, 393, 399].
Membranele celulare sunt foarte sensibile şi, deseori, se deteriorează în procesul
crioconservării [5, 262]. În membranele plasmatice este prezentă colesterina (CS), coraportul
21

căreia cu fosfolipidele (FL), în mare măsură, determină fluiditatea şi sensibilitatea membranelor
[249].
La studierea spermei cocoşilor de rasa Neagră Casteliană [359], după colorarea ei cu anilină
albastră, s-a diferenţiat clar conţinutul celulelor cu morfologie normală sau anormală, practic,
analogic cu metoda fluoriscentă [380]. Numărul acrozomelor intacte variază în limitele 90-99%
în sperma nativă şi valoarea acestui indice este independentă de anotimp, ceea ce poate fi
explicat prin stabilitatea eriditară a cromatinei împachetate în histoni [170, 210].
Pentru aprecierea calităţii spermei se folosesc indicii: conţinutul spermatozoizilor în
ejaculat, concentraţia spermatozoizilor, mobilitatea, dereglările morfologice, pH-ul materialului
seminal şi altele. Indicii enumeraţi adecvat determină starea spermei, dar nu includ integritatea
structurală a genomului spermatic [102, 145].
Totodată, pentru continuarea vieţii este necesară translarea informaţiei determinante de la o
generaţie la alta. Această informaţie face posibilă translarea prin eriditate a proprietăţilor şi
particularităţilor, care asigură supravieţuirea organismelor. Păstrarea şi realizarea acestei
informaţii trebuie efectuată la nivel molecular. S-a dovedit, că aceste molecule sunt prezentate de
ADN. Important este şi ARN-ul, care contribuie la translarea informaţiei genetice şi acţionează
ca translator al „textului” genetic, transferîndul în succesiunea specifică a AA. Conţinutul
cantitativ al ADN-lui semnificativ reflectă proprietatea fecundativă a spermatozoizilor.
Cercetările privind determinarea conţinutul ARN în sperma de cocoş sunt prezentate în foarte
puţine lucrări, iar în unele dintre ele, sunt şi contradictorii [377, 391].
Anumite deteriorări ale ADN pot provoca dereglarea procesului de reproducere. Tipurile de
dezorganizare ale ADN includ aderaţiile cromosomale, modificaţiile epigenetice ale histonilor şi
ADN, mutaţiile şi fragmentaţiile. Fragmentarea ADN este o cauză, deseori întîlnită, în
spermatozoizii infertili. Conţinutul ADN fragmentat al spermatozoizilor, corelează negativ cu
calitatea spermei [377, 391].
Conform teoriei apoptozei, fragmentarea ADN este iniţiată de activarea endonucleazelor,
conform cărei, defectarea fenomenului menţionat este determinată de substituirea histonilor cu
protamine în procesul spermatogenezei, ce provoacă condensarea cromatinei şi ADN-lui [391].
1.1.3. Desfăşurarea proceselor fizico-chimice şi bio-chimice în sistemele biologice.
Cercetările proceselor fizico-chimice în diverse sisteme biologice la temperaturile
hipotermale sunt descrise în numeroase lucrări ştiinţifice fundamentale [1, 32, 92, 146, 353].
Refrigerarea pînă la temperaturi joase este urmată de schimbări semnificative ale condiţiilor
fizico-chimice ale mediului de amplasare a obiectelor biologice. Scăderea temperaturii,
22

cristalizarea apei, sporirea potenţialului ionizant şi osmotic al soluţiilor, modificarea pH-lui şi
altele sunt factorii fizico-chimici esenţiali, care acţionează asupra celulei la congelaredecongelare
şi sub influenţa căror se produce modificarea macromoleculelor şi a complexelor
supramoleculare ale proteinelor, cromatinei, lipoproteidelor şi membranelor [2, 289, 305, 359,
380].
Eventuala posibilitate de elucidare a mecanismelor de criodestrucţie este cercetarea
corelaţiei dintre transformările fizico-chimice la crioconservare şi indicii păstrării integrităţii
proprietăţilor biologice ale materialului deconservat [5, 61].
Conceptul actual al criodeteriorării şi apariţiei defectelor în membrane nu este predeterminat
de modificarea acţiunelor asupra ei a soluţiilor concentrate, dar de deteriorările mecanice apărute
în rezultatul producerii gradienţilor osmotici. Prin urmare, suprapresiunea hidrostatică provoacă
defecte ireversibile în membrană, care, în esenţial, servesc ca cauză de bază în lezarea celulei. În
acelaşi timp, nu se ia în consideraţie specificaţiile agentului hipertonic şi de aceea prioritate în
procesele de distrugere a celulei la congelare-decongelare îi revene presiunii osmotice. O
importanţă semnificativă în acest proces revine volumului şi configuraţiei celulelor, care suportă
schimbări în rezultatul acţiunii temperaturilor joase şi a factorilor osmotici [61].
Concomitent, în perioada crioconservării, spermatozoizii de cocoş sunt supuşi influenţei
factorilor mecanici şi hipoosmotici [171, 298]. În rezultat se observă o delatare, motivată de
pătrunderea apei prin membrana plasmatică în celulă [380]. Aceşti factori pot diminua
considerabil rezultatele însămînţării găinelor [289].
Permeabilitatea membranelor plasmatice pentru moleculele apei şi a crioprotectorilor este o
caracteristică criobiologică a celulelor, care determină procesele osmotice la congelarea-
decongelarea obiectelor [132].
Permeabilitatea membranelor celulare pentru moleculele crioprotectorilor scade în
diapazonul temperaturilor 35-5 o C. Totodată, valoarea energiei de activare a procesului de
transportare a moleculelor EG, 1,2-BD şi DMSO este aproximativ de 3 ori mai mare decît
valoarea energiei de activare a transportului prin membrană a glicerolului [134].
Transportarea substanţelor în celulă depinde de structura lor, parametrii geometrici ai
moleculelor şi organizarea structurală a biomembranelor, care este determinată de specificul
speciilor şi ţesuturilor [3, 74, 81, 133, 134].
Sporirea bruscă a permeabilităţii membranelor pentru ionii de Ca +2 , ca răspuns la influenţa
diferitor factori, poate provoca nu numai adenozinmonofosfatul (AMP) din contul fosforilării
anumitor structuri ale Ca +2 -canalului, dar şi hidroliza lipidelor membranare [185, 362].
23

Studierea permiabilităţii membranelor face posibilă obţinerea informaţiei despre
masotransportarea prin porii lor a diverselor substanţe [74]. În legătură cu aceasta, modelarea
torentului transmembranar al substanţelor foarte frecvent se foloseşte în criobiologie [254].
O deosebită atenţie se acordă existenţei fenomenelor de formare a clasterilor în procesul de
cristalizare. Producerea lor provoacă reducerea bruscă a dimensiunii cristalelor [335].
La congelarea soluţiilor cu glicerină, în limitele 58-62% nu se formează cristale de gheaţă,
dar are loc cristalizarea intensivă a apei în procesul decongelării în limitele temperaturilor -100-
60 o C. Acest fenomen poate fi lămurit de pe poziţia cristalizării clasterice, deoarece limitele de
temperatură şi concentraţii studiate sunt caracteristice pentru microfazele lichide în bioobiectele
crioconservate la momentul producerii în ele a nano-cristalelor [362].
Este demonstrat că gheaţa extracelulară influenţează celulele indiferent de natura ţesuturilor
[362]. Procesele termodinamice pot fi studiate prin modularea proceselor termodinamice [349] şi
modele matematice de comportare termodinamică a cristalelor de apă [255, 257].
În acelaşi timp, celulele tuturor ţesuturilor şi sistemelor se caracterizează prin existenţa
gradientului electrochimic al ionilor şi cationilor. În ultimii ani, sunt stabilite proprietăţi ale
ionilor, direcţionate spre modificarea împachetării proteinelor şi acizilor nucleici şi prin
interacţiuni cu centrele ionizate ale macromoleculelor, contribuind la stabilizarea lor în anumite
conformaţii [61].
Surplusul sau neajunsul conţinutului de cationi, provoacă unele modificări şi în structura
proteinelor membranare. Acestui proces este supusă structura proteinelor ale membranelor
eritrocitare, pentru care deosebit de periculos este sporirea concentraţiei Ca +2 intracelular, care
provoacă agregarea ireversibilă a eritrocitelor [ 355].
Cunoaşterea mecanismelor de criodeteriorare ale sistemelor vii capătă o semnificaţie
deosebită în consecutivitatea proceselor biologice integre. Studierii mecanismelor criodeteriorării
sistemelor biologice sunt dedicate numeroase cercetări [3, 32, 39, 42, 54, 95, 130, 174, 183, 191,
205, 218, 325, 346, 373, 409, 422].
Totalitatea cercetărilor experimentale acumulate pînă în prezent au elucidat determinarea
factorilor principali, care influenţează asupra obiectelor biologice la temperaturile hipo- şi
superhipotermale, precum şi posibilitatea de a formula ipoteze şi teorii separate, care explică
multilateral mecanismele criodeteriorării obiectelor biologice. Aceste ipoteze şi teorii au fost
expuse multilateral de către cercetătorii: Maximov N. [85], Smith A. [379], Lozina-Lozinschii L.
[84], Farrant J. şi al. [218], Meryman H. [316], Saragusty J. şi al. [361], Lovelock T. [291],
24

Puşcari N. [103], Vişnevschii V. [56], Milovanov V. [88], Nauc V. [92], Ostaşco F. [97],
Boronciuc Gh. [47], Levitt J. [283], Mazur P. [307], Belous A., Bondarenco V. [42].
Ipotezele existente acordă o semnificaţie deosebită deteriorărilor mecanice şi osmotice,
legate de modificarea moleculelor proteice şi lipidice, cristalizarea apei şi împachetarea
moleculelor în microfaze solide [219, 307, 308]. În acelaşi timp, ele nu argumentează rolul
modificărilor proprii ale membranelor în iniţierea criodeteriorării celulelor. Dintre totalitatea
proceselor fizico-chimice, care se desfăşoară în celulă şi în membranele plasmatice la congelare
şi decongelare există un factor principal, care influenţează intensitatea modificărilor criogenice.
Autorii [42] consideră, că acest factor este apariţia, dezvoltarea şi evoluţia defectelor
transmembranice în membranele plasmatice, derularea cărora, depinde de nivelul modificării
scheletului proteic şi schimbarea proprietăţilor fizoco-chimice ale lipidelor şi proteinelor
membranice la diferite etape înainte de congelare. În rezultatul analizei proceselor, care au loc în
membranele plasmatice autorii au elaborat conceptul moleculo-celular susmenţionat.
O semnificaţie deosebită acordă cercetările, direcţionate la studierea mechanismelor
deteriorării membranelor şi componentelor ei. În rezultatul influenţei temperaturilor joase se
observă o succesiune determinată de dezvoltarea criodeteriorărilor. Aceasta reprezintă
diminuarea interacţiunii hidrofobe şi transferarea fazică a lipidelor, modificarea indicilor fizicochimici
(pH, cocentraţia electroliţilor, presiunea osmotică, modificări biochimice), activarea
POL, oxidarea SH-grupelor, activarea fosfolipazelor, dereglarea respiraţiei şi fosforilării [33, 89,
150].
Pe baza cercetărilor fundamentale şi analizei bibliografice speciale V. Nauc [91, 92, 93, 94]
a formulat conceptul, conform cărui criodeteriorările specifice ale gameţilor animalelor agricole
sunt determinate, în primul rînd de dereglarea membranelor biologice în rezultatul diversităţii
conţinutului, coraportului, labilităţii şi stabilităţii componentelor şi complexelor, care fac parte
din componenţa lor.
Ulterior, studiul fiziologo-biochimic şi morfologic complex al materialului seminal de la
diferite specii de animale la diverse niveluri de organizare structurală în condiţiile
crioconservării, efectuat de către profesorul Gh. Boronciuc, a permis de a stabili, că în cadrul
prelucrării tehnologice dereglările criogenice se declanşează atît din contul reacţiilor generale, cît
şi a celor particulare de specie [47].
Unul dintre mecanismele de criodeteriorare la decongelarea materialului este formarea
veziculelor de aer în obiectul biologic la eliminarea din substratul lichifiat a aerului în procesul
transformărilor fazice. În acelaşi timp, degazarea parţială a obiectului pregătit pentru
25

crioconservare, practic, exclude formarea veziculelor de aer la deconservare, care provoacă
apariţia deteriorării morfologice şi modificărilor biochimice în obiect. S-a demonstrat că
vacumarea suspensiilor de celule pînă la crioconservare, garantează vivacitatea lor la 80% în
comparaţie cu 60% în varianta martor [143].
Conform cercetărilor proprii şi analizei factorilor, care provoacă deteriorarea celulelor,
autorul a elaborat un concept nou, conform căruia modelarea teoretică a mecanismului şocului
termic este completată cu acţiunea forţelor deterioratoare a bombardării rezonante a undelor
hidrodinamice, care apar în rezultatul schimbării bruşte a vitezei mişcării apei în spaţiul limitat
al celulei şi cu modificarea bruscă a tensiunii membranei citoplasmatice pînă la nivele critice cu
pierderea elasticităţii sale [98].
Ipotezele menţionate reflectă laturile importante ale mecanismului unic de criodeteriorare a
obiectelor biologice. În acelaşi timp, diversitatea modificărilor endo- şi exocelulare, specificul
lor, face imposibilă analiza lor în conformitate cu prevederile unilaterale ale ipotezelor
menţionate. Acest fapt agravează armonizarea unificată a criodeteriorărilor, iar concomitent,
stabileşte principii de performanţă şi stimulează efectuarea cercetărilor de căutare a legităţilor
generale, care stau la baza criorezistenţei şi criodeteriorării celulelor.
În acest context, este necesară aprofundarea cercetărilor şi generalizarea datelor
experimentale prin folosirea metodelor matematice de modelare şi planificare polifactorială, care
ar simplifica determinarea căilor şi posibilităţilor de stabilizare a membranelor biologice.
1.2. Rolul lipidelor şi proteinelor la derularea procesului de crioconservare a spermei.
Este cunoscut faptul, că lipidele formează nu numai baza structurală a membranelor
celulare, determinînd gradul de viscozitate, difuzia laterală şi asimetria bilaterală, dar sunt şi
substanţe biologice active, care îndeplinesc funcţia compuşilor ai sistemului de transducţie a
semnalelor, ai modulatorilor activităţii enzimatice şi ai proprietăţilor de recepţie [142]. Lipidele
în componenţa membranelor biologice sunt clasificate în 3 clase: lipide neutre, FL şi
sfingolipide.
S-a demonstrat, că gradul de nesaturare a lipidelor determină desfăşurarea semnificativă a
fenomenului fiziologic în membrane - adaptarea homeoviscozitară, rolul cărei constă în
compensarea proceselor membrano-conjugate, cu implicarea fluidităţii membranelor. Prin
urmare, se propune selectarea substanţelor crioprotectore active, în dependenţă de varietatea FL;
de temperatura tranzacţiei fazice şi, în deosebi, de temperatura tranzacţiei gel-cristal-lichid [278].
Repartizarea FL în membrană este asimetrică [57]. Fosfatidilcolina (FC) şi sfingomielina
(SM) se localizează, prioritar, în monostratul extern al membranei, iar aminofosfolipidele -
26

fosfatidiletanolamina (FEA) şi fosfatidilserina (FS), precum şi fosfatidilinozitolul (FI), care nu
conţine azot, sunt amplasate pe partea internă a stratului.
Rolul principal în păstrarea organizării bistratare a membranelor biologice aparţine FC şi
SM [76]. FC este principalul component structural al membranelor majorităţii celulelor. FC este
localizată, prioritar, pe partea externă, iar FEA şi FS pe partea internă a membranei plasmatice.
FEA face parte din lipidele nesăturate şi nu este zwiterion, dar este foarte masivă. FC, invers,
este zwitterion, cu sarcini electrice echilibrate şi reprezintă un FL, la fel, masiv.
Astfel, localizarea deversată determină şi funcţiile principale ale diferitor FL. De exemplu,
FC membranelor plasmatice ale spermiilor are proprietăţi protectoare la şocul termic şi
nemijlocit participă la inhibarea procesului de peroxidare a lipidelor (POL).
Concomitent cu FL neutre, în componenţa lipidelor membranare sunt incluse şi fracţiile
anione (acide) ale lor – FS, FI, cardiolipina (CL) şi acidul fosfatidic (AF), care reglează
activitatea Ca +2 şi Na + ,K + -ATP-azelor, necesare pentru menţinerea echilibrului ionilor în celulă.
Un rol important în reglarea proceselor metabolice aparţine FI, care se menţine în cantităţi
minore, iar produsele descompunerii FI participă în numeroase procese celulare secundare [57].
Acumularea în membrane a FI sporeşte posibilitatea controlului asupra transportării şi
translării informaţiei, în mod de semnale hormonale, în spaţiul intracelular. FI influenţează
proprietăţile fizico-chimice ale membranelor – viscozitatea şi aptitudinea de legătură a ionilor de
Ca +2 , care la rîndul lor, determină modificarea funcţiei membranelor [287, 362, 385].
Se presupune, că sfingolipidele (SL) şi CS sunt localizate, prioritar, pe suprafaţa externă a
membranei plasmatice, în insuliţe structurate (rafte). Conform modelului raftelor, interacţiunea
CS cu FL se facilitează prin conţinutul de terminaţii ale acizilor graşi saturaţi, care pot
interacţiona cu ciclul sterolic al CS. Totodată, este posibilă formarea legăturilor hidrogene dintre
grupa hidroxilă a CS şi ceramida sfingolipidelor. Paralel, s-a propus şi alt model, care presupune
că FL şi CS sunt repartizate în membrană reglementat, iar moleculele CS se situiază pe stratul
extern al membranei, complementar moleculelor FEA. După părerea autorilor, anume acest
model mai bine corespunde interacţiunilor dintre FEA cu CS [57].
CS în membranele biologice, este unul dintre cei mai importanţi reglatori ai organizării
lipidelor. Existenţa în structura CS a grupei hidroxile, determină un şir de proprietăţi fizicochimice
ale acestei substanţe. Ca şi unele FL, CS aparţine lipidelor nestratificate, care sunt apte
de a modifica topologia sistemelor membranare [142]. Funcţia principală a CS, este aptitudinea
de a modula proprietăţile fizico-chimice ale membranelor.
27

Gradul înalt de structurare a FL în membrane provoacă sporirea densităţii şi diminuarea
permeabilităţii membranelor, măreşte microviscozitatea lor [142]. CS sporeşte gradul de
ordonare şi diminuează mobilitatea lanţurilor carbohidrate ale FL şi limitează posibilităţile
conformaţionale ale lanţurilor FC [139, 142]. La prezenţa în membrană a CS, sporirea şi
scăderea temperaturii nu ameninţă structurarea şi mobilitatea lanţurilor acizilor graşi [73].
Colesterina şi LFC participă în procesul de reorganizare a structurilor membranare, iar
variaţiile conţinutului LFC pot provoca modificarea topologiei sistemelor membranare şi duc la
apariţia porilor. Surplusul produselor hidrolizei FL, a acizilor graşi liberi şi a lizoformelor FL
contribuie la modificarea bistratului lipidic şi a proteinelor integrale ale membranei. Efectul
citologic al LFC, însoţit de sporirea permeabilităţii membranelor pentru moleculele organice şi
ioni, este determinat de combinarea acţiunilor substanţelor active şi ionofore, care provoacă
reorganizarea structurală a componenţei proteice a membranei [142, 288]. În acest caz, efectul
maximal citolitic al LFC se produce la extinderea mobilităţii ei după limitele stratului FL al
membranei [142].
Activarea proceselor lipolitice, care provoacă destabilizarea membranelor, se examinează în
calitate de cauză principală a înbătrînirii celulelor [142].
Modificarea valorilor rapoartelor varietăţilor FL are un rol semnificativ în funcţionarea
membranelor celulare [112].
Pe baza datelor obţinute T. Linnic şi al. [82] demonstrează, că un aport esenţial în efectul
citotoxic al crioprotectorilor asupra spermatozoizilor de cocoş constituie aptitudinea lor de a
influenţa activ asupra interacţiunilor hidrofobe cu membranele, de a modifica legăturile şi
formaţiunile structurale din care fac parte lipidele. Intensitatea influenţei substanţelor asupra
interacţiunii lipid-lipidice se află în corelaţie directă cu proprietăţile lor membranotrope, care
sunt determinate de echilibrul hidrofil-hidrofob al moleculelor lor. Datele obţinute, de asemenea,
reprezintă o informaţie importantă despre mecanismele permeabilităţii membranelor biologice,
indirect demonstrînd căile prioritare ale difuziei substanţelor prin membrane, ţinînd cont de
complexitatea şi divergenţa structurală. [38, 82].
Reactivitatea înaltă a membranelor biologice la influenţa condiţiilor hipotermale este
determinată, în primul rînd, de modificarea componenţilor structurali de bază. Modificările
esenţiale ale organizării moleculare a spermatozoizilor în procesul crioconservării provoacă
dereglarea sistemului energetic de transportare a electronilor şi sporirea proceselor de oxidare a
lipidelor. La aplicarea stării lanţului respirator, în procesul de crioconservare-deconservare a
spermei de cocoş s-a demonstrat, că includerea succinatului în componenţa mediului de incubare
28

nu provoacă intensificarea respiraţiei la spermatozoizii intacţi, iar la prezenţa 2,4-dinitrofenolului
se stimulează respiraţia la spermatozoizii de vier de 2,5-3 ori; de taur şi cocoş - de 2 şi mai multe
ori. Stimularea respiraţiei spermatozoizilor congelaţi în mediu cu dinitrofenol şi dibazol permite
de a menţine respiraţia lor, practic, la nivelul spermei native. Reglarea dirijată a respiraţiei
celulelor reproductive poate fi folosită la elaborarea mediilor şi procedeelor de crioconservare a
spermei de cocoş [138].
1.3. Analiza tehnologiei de menţinere şi stabilizare a indicilor vitali ai spermatozoizilor de
cocoş în procesul de conservare.
Continuarea dezvoltării metodei de conservare a spermei este determinată de cercetările
mediilor protectoare, regimurilor tehnologice şi posibilităţii de sporire a calităţii iniţiale a
materialului seminal. Impactul principal în elaborarea mediilor pentru diluarea şi conservarea
spermei de cocoş aparţine realizărilor performante [32, 76, 90].
1.3.1. Mediile pentru diluarea şi conservarea spermei de cocoş.
Utilizarea mediilor protectoare pentru diluarea spermei are ca scop: I. De a repartiza
uniform spermatozoizii astfel, încît să se obţină o concentraţie suficientă de spermatozoizi pentru
însămînţare; II. Menţinerea viabilităţii spermatozoizilor la etapa pregătirii pentru congelare şi
toată perioada păstrării hipotermice; III. Preîntîmpinarea sau diminuarea maximală a acţiunilor
negative ale temperaturilor scăzute şi suprascăzute (cristalizarea şi recristalizarea, sporirea
concentraţiei substanţelor osmotice active şi al.); IV. Stabilizarea proceselor fiziologice,
biochimice şi morfologice pe tot parcursul ciclului de congelare şi decongelare a obiectelor
biologice; V. Menţinerea condiţiilor favorabile pentru realizarea proceselor de fecundare.
Conţinutul mediilor crioprotectoare este diferit, în dependenţă de obiectivele trasate pentru
realizare. De exemplu, pentru asigurarea viabilităţii spermatozoizilor la etapa pregătirii pentru
congelare este necesar de a include componente, care menţin echilibrul osmotic, volumul de
tampon, aprovizionarea energetică pentru susţinerea proceselor metabolice la un nivel optim,
precum şi a antioxidanţilor (AO), pentru diminuarea stresării oxidative, care apare, atît după
ejuculare, cît şi în timpul păstrării celulelor în condiţii fiziologice normale sau hipotermice.
Diluarea spermei cu folosirea mediilor crioprotectoare, reprezintă una dintre etapele
principale ale biotehnologiei crioconservării. Componenţa şi proprietăţile fizico-chimice ale
mediilor sintetice servesc ca factori esenţiali la pregătirea spermei pentru congelare şi determină
eficienţa crioconservării. În literatură este publicat un număr mare de medii pentru diluarea şi
congelarea spermei de păsări [17, 32, 78, 83, 116, 226, 273, 368, 409].
O deosebită valoare capătă cercetarea gradului de diluare a materialului seminal. Este
cunoscut, că celulele conţin structuri intracelulare osmotic neactive. Concentraţia reală a
29

crioprotectorilor în suspensia celulelor sporeşte la creşterea conţinutului de celule într-un anumit
volum. Temperatura de cristalizare a suspensiei de celule este determinată de concentraţia reală a
crioprotectorului. De aceea, temperatura cristalizării scade la creşterea concentraţiei de celule,
care conţin substanţe osmotic neactive, din contul creşterii concentraţiei reale a crioprotectorului.
Aici, este necesar de menţionat, că spermatozoizii conţin o cantitate înaltă de substanţe osmotic
neactive, iar în condiţii experimentale, s-a demonstrat că dacă concentraţia spermatozoizilor
constituie 05-08; 5-8; 11-16 mlrd/ml, atunci temperatura de cristalizare a suspensiei scade,
corespunzător, pînă la -4,73; -5,75 şi -7,16 o C. Adică, se observă o dependenţă invers
proporţională între indicii studiaţi [67].
Pentru aceasta, se propun diferite modalităţi de creare a mediilor protectoare, dar, în
esenţial, au confirmat eficienţa şi se folosesc pe larg două: elaborarea mediilor, maximal posibil,
apropiate de componenţa plasmei spermatice [83, 273, 368] şi elaborarea mediilor din
componenţi, care întrunesc anumite funcţii, dintre care – compensarea sau prevenirea
modificărilor în spermatozoizi, existente la diverse etape ale crioconservării. [78, 83, 412].
În rezultatul cercetării şi analizei datelor bibliografice din domeniul crioconservării spermei
de cocoş s-a stabilit, că compuşii principali ai mediilor protectoare sunt neelectoliţii, electroliţii,
crioprotectorii, sistemele de tampon, substanţele stimulatoare ale fecundităţii ouălor şi apa.
În componenţa mediilor policomponente pentru crioconservarea spermei de pasăre sunt
experimentate peste 10 varietăţi de glucide, mono-, di- şi trizaharide. S-a stabilit, că după gradul
influenţei benefice asupra vivacităţii spermatozoizilor crioconservaţi de cocoş, glucidele
formează succesiunea: fructoza>glucoza>lactoza>zaharoza>maltoza>trialoza>rafinoza. După
congelare-decongelare, monoglucidele şi glicozidele steroide restabilesc pînă la 45-50% din
totalitatea spermiilor şi menţin activitatea lor o perioadă mai îndelungată, păstrînd integritatea
acrozomilor. Dizaharidele, prioritar, influenţează pozitiv integritatea capului spermatozoizilor, în
comparaţie cu monoglucidele [6, 34, 83].
Diglucidul trigaloza posedă efect protector la congelare lentă, la vitrificare şi sublimare.
Unul dintre mecanismele de acţiune a trigalozei, predetermină interacţiunea dintre celulele
sistemului „gheaţă” în cazul congelării lente [250, 350, 352].
Sorbitolul şi trigaloza sporesc mobilitatea spermei după liofilizarea ei [352].
Cercetările ultramicroscopice demonstrează stabilizarea structurilor celulare, scăderea
intensităţii proceselor de peroxidare şi sporirea mobilităţii spermatozoizilor congelaţi, după
diluarea materialului seminal cu mediul, care conţinea trigaloză [149].
30

Un component obligatoriu al mediilor pentru crioconservarea spermei este gălbenuşul de ou
de găină, care posedă şi unele unele neajunsuri, adică nu este posibilă sterilizarea mediului şi
standartizarea componenţei lipidice a gălbenuşului. Folosirea lipidelor purificate, în mod separat,
(de exemplu, a FC) are efect pozitiv, dar economic neeficient. Numeroase experienţe au dovedit,
că înlocuirea în componenţa mediilor sintetice a gălbenuşului nu are acţiune benefică [273, 380,
109] Paralel, ţine de menţionat diminuarea fenomenului citotoxicităţii al DMF la temperaturile
pozitive în prezenţa adausului proteic. Dintre adausurile proteice, mai eficiente sau dovedit a fi
mucoproteinele şi albuminele în diverse concentraţii [83].
În componenţa mediilor sunt experimentate numeroase săruri cu diverse funcţii [49, 78, 88,
368]. Principalele dintre ele sunt: menţinerea echilibrului osmotic, proprietatea de tampon şi
păstrarea coraportului fiziologic al ionilor de potasiu şi sodiu. Datele demonstrează, că utilizarea
sărurilor organice este preferabilă pentru sperma de cocoş, deoarece asigură proprietăţile de
tampon ale mediului [116, 276]. La fel, este cunoscut că în limitele pH 6-8, fecunditatea spermei
păsărilor se păstrează la nivel înalt [411]. Din componenţa mediilor face parte şi glutamatul de
sodiu, ca un component considerabil al spermei de păsări. Prezenţa glutamatului în concentraţie
optimală este evidentă pentru participarea lui în numeroase procese metabolice şi, în special, în
ciclul energetic [78, 273].
Spermatozoizii, în procesele de pregătire, răcire, congelare, decongelare şi însămînţăre se
supun oscilării ionice şi presiunii osmotice ale mediului ambiant [14]. Supravieţuirea lor depinde
de proprietăţile de adaptare la condiţiile conservării. Osmolaritatea mediilor existente pentru
crioconservarea spermei de păsări este unul dintre indicii principali ai caracteristicilor fizico-
chimice ale mediilor şi variază de la 290 pînă la 450 m Osmol [78, 83, 88, 273, 276, 368]. S-a
constatat, că fertilitatea spermei in vitro, în condiţii hipotermale, la folosirea mediilor în
diapazonul 250-400 m Osmol , începe să scadă după 24 ore de păstrare.
Pentru prevenirea consecinţelor transformărilor fazice, apa-gheaţa la congelareadecongelarea
suspensiilor de celule, în componenţa mediilor este necesar de a include
crioprotectori cu activitate înaltă de protecţie [40, 82, 104]. Preferabil, ca crioprotectorii să fie
multifuncţionali. Eficienţa folosirii crioprotectorilor depinde de proprietăţile termo-fazice ale lor,
care asigură cantitatea de căldură necesară pentru transferarea de la/la obiectul crioconservat prin
schimbarea temperaturii lui. Temperatura şi componenţa obiectului influenţează asupra
capacităţii de căldură a lui, care este mai pronunţată în momentul cristalizării şi topirii, cînd
capacitatea de căldură brusc sporeşte. Pentru dirijarea proceselor, care se produc în perioada
31

congelării-decongelării este necesar de a avea în vedere interdependenţa capacităţii de căldură a
soluţiilor congelate, dependentă de temperatura şi concentraţia lor [118].
Congelarea spermei păsărilor, diluată cu mediul, care conţine DMA, permite de a obţine
numai 25% de însămînţări rezultative. Comparativ cu tehnologia de congelare lentă, metoda
accelerată (60 o C/min) s-a dovedit a fi mai efectivă în păstrarea structurilor morfologice şi a
fertilităţii [268].
Dimetilsulfoxida (DMSO) şi etilenglicolul (EG) în procesul crioconservări menţin, dar nu
blochează dehidratarea celulelor [ 348].
Pentru crioconservarea spermei de cocoş sunt elaborate diferite metode alternative, care se
bazează pe folosirea diferitor crioprotectori, dintre care glicerina, EG, DMF, DMA, DMSO şi
altele [82], fiecare în parte posedînd anumite neajunsuri. În particular, toxicitatea
crioprotectorilor, care, în primul rînd, acţionează la nivelul membranelor celulare ale
spermatozoizilor de cocoş.
Toxicitatea crioprotectorilor reprezintă un factor, care limitează crioconservarea reuşită a
sistemelor biologice. Ea poate fi micşorată prin perfecţionarea mediilor. De exemplu, amidele
pot bloca toxicitatea DMSO, dar acest fapt nu s-a confirmat experimental. Informaţie
convingătoare despre detoxicarea crioprotectorilor lipseşte [234].
Bazele moleculare ale influenţei crioprotectorilor asupra membranelor biologice rămîn pînă
în prezent neelucidate, cu toate că crioprotectorii pot modifica interacţiunile lipid-lipidice şi
lipid-proteice, schimbă potenţialul membranar şi influenţează activitatea enzimelor membranare
[1, 35, 82, 116].
În literatura contemporană s-a acumulat un volum enorm de informaţie despre proteinele
antifrize, care pot servi ca componente ale mediilor crioprotectoare. Interesul studiului lor este
determinat prin faptul, că aceste proteine protejează celulele de factorii deterioratori, care
reprezintă un risc enorm la cristalizarea lichidului din obiectele biologice în procesul scăderii
temperaturii. Proteinele antifrize formează o grupă specială de proteine, pentru care este
caracteristică – aptitudinea de scădere a temperaturii de congelare; de modificare sau stopare a
formării cristalelor de apă; de inhibiţie a recristalizării şi, probabil, de protecţie a membranelor
celulare de deteriorare. Reieşind din cele menţionate, A. Gulevschii şi L. Relina [61] au clasificat
aceste proteine, în dependenţă de provenienţa lor, după următoarele principii: I - Proteinele şi
glicoproteidele peştilor; II - Proteinele insectelor; III - Proteinele rematodelor; IV - Proteinele
vegetale; V - Proteinele micotice; VI - Proteinele bacteriene. Însă, puţine clarităţi există în
mecanismele de acţiune a lor [62, 63].
32

Există patru ipoteze, care elucidează activitatea proteinelor antifrize: Prima ipoteză se
bazează pe rezultatele radiografiei, modulării computerizate şi altor metode fizice, care, probabil,
predetermină rolul principal al complementării atomilor de oxigen în gheaţă, cu structurile
moleculare în proteine, formînd legături de hidrogen; A doua ipoteză se bazează pe mutageneza
direcţionată şi modelarea computerizată; conform acestei ipoteze, partea hidrofobă a spiralei
amfifile a proteinelor antifrize se află în starea limitei gheaţă-apă; A treia ipoteză, la fel, se
bazează pe mutageneza direcţionată şi modularea computerizată; se presupune că proteinele
antifrize, care se află la limita suprafeţei gheaţă-apă, influenţează asupra planului cristalelor, cu
care ele interacţionează.
Prevederile primelor două ipoteze servesc, ca indicatoare asupra faptului, că proteinele se
acumulează pe suprafaţa cristalului, iar conform ipotezei a treia, proteinele determină locurile de
conexiune [296]. Proteinele antifrize, conform proprietăţilor criobiologice se clasifică în 3 clase:
I. Proteine nucleare – iniţiază cristalizarea, fiind matricea de formare a gheţii şi blochează
suprarăcirea; II. Proteine antinucleare – inhibează formarea cristalelor; III. Proteine antifrize –
micşorează temperatura congelării, modifică sau stopează formarea cristalelor de gheaţă, inhibă
procesul de recristalizare şi protejează celulele de deteriorare [61].
Proteinele antifrize au un rol deosebit şi în desfăşurarea adaptării la temperaturile scăzute
[295, 372]. Ele pot demonstra atît acţiuni protectoare, cît şi citotoxice, care sunt condiţionate în
raport cu programa congelării, doza, tipul proteinelor antifrize, componenţa mediilor de
conservare şi tipul biomaterialului. [408].
Avînd în vedere aceste proprietăţi, proteinele antifrize pot fi folosite pentru stabilizarea
membranelor la păstrarea frigorifică. Eficacitatea utilizării proteinelor antifrize depinde şi de
componenţa lipidică a membranelor, în legătură cu ce glicoproteidele pot servi ca componente
eficiente ale mediilor pentru crioconservare [63, 179].
În literatura specială persistă anumite informaţii despre componenţa şi proprietăţile
secretului tractului genital al găinilor. S-a demonstrat, că conţinutul de potasiu în acest lichid este
de 4 ori mai mare, decît în plasma seminală. Este depistată o cantitate mare de inozitol. Se
înregistrează sporirea conţinutului ionilor de Zn +2 şi altele [78].
După caracterul de acţiune, substanţele biologice active pot fi clasificate în două grupe: 1)
substanţele care nemijlocit influenţează capacităţile funcţionale ale spermatozoizilor - AO,
stabilizanţii echilibrului energetic, substanţele care micşorează şi sporesc permeabilitatea
membranelor pentru molecule de apă, ioni, neelectroliţi şi alţi reglatori ai metabolismului; 2)
substanţele care influenţează organismul femelelor prin stimularea motoricii tractului
33

eproductiv, contribuind la pătrunderea spermatozoizilor şi fecundarea ovulelor (enzimele,
hormonii şi al.) [88, 270].
Calitatea scăzută a spermei este legată de producţia excesivă a reacţiilor de oxidare specifică
(ROS), ca urmare a POL în materialul seminal [147, 228]. În funcţie de tipul, concentraţia, locul
şi timpul de producere, ROS pot avea efecte benefice sau nocive [148].
Fiind cea mai răspîndită substanţă în natură, apa este cel mai important component al
organismelor vii, reprezintă mediul principal şi dizolvant universal, care determină realizarea
metabolismului hidrosalin. Progresul ştiinţifico-tehnic şi biotehnologiile avansate realizează
cercetări avansate în această direcţie şi, în special, asupra posibilităţilor modificărilor dirijate a
proprietăţilor ei. S-a demonstrat, că prelucrarea electromagnetică a apei deplasează diapazonul
cristalizării în direcţia temperaturilor scăzute, însă aceste proprietăţi nu se referă şi la apa
distilată, iar păstrarea izotonică a mediului influenţează formarea cristalelor de apă şi are o
deosebită perspectivă [258].
Este studiată influenţa concentraţiei naturale a izotopilor grei din conţinutul apei asupra
cineticii reacţiei generatoare a apei în mitohondriile izolate, în prezenţa acidului succilic, care
seveşte în calitate de substrat. S-a demonstrat, că izotopii grei în componenţa apei naturale,
veridic inhibă reacţia studiată. Diminuarea conţinutului izotopilor grei în apă provoacă
deinhibarea şi accelerarea veridică a reacţiei studiate [100].
Pentru prevenirea consecinţelor transformărilor fazice, apa-gheaţă la congelareadecongelarea
suspensiilor de celule, în componenţa mediilor este necesar de a include
crioprotectori multifuncţionali cu activitate înaltă de protecţie [83].
1.3.2. Regimuri şi metote de congelare şi decongelare a spermei de cocoş.
Din actualele menţiuni bibliografice rezultă, că există o gamă de regimuri, care asigură
posibilităţi de congelare-decongelare şi păstrare a spermei de cocoş [18, 274, 365, 369, 409].
Congelarea spermei prin diverse viteze liniare pînă la multiple valori variate ale temperaturii
a stabilit, că la răcirea lentă cu viteza de 2 ºC/min criodeteriorarea celulelor se produce în
diapazonul temperaturilor de pînă la -30 ºC. În acest interval scade semnificativ mobilitatea
spermatozoizilor la -20-30 ºC şi are loc deteriorarea acrozomilor la -15-30 ºC. Congelarea
accelerată cu viteza de 40 ºC/min provoacă deteriorări critice principale ale mobilităţii,
integrităţii membranelor celulare şi acrozomului. Aceste deteriorări se declanşează,
corespunzător, în diapazoanele de temperatură de -60-70; -30-40; -10-15 ºC. De asemenea, are
loc deteriorarea precoce a acrozomilor, şi anume în jur de 50%, dintre aceste organele se
deteriorează deja la -5ºC [109, 116]. Conform rezultatelor cercetărilor, la răcirea lentă a
34

suspensiilor spermatice, ca factor deteriorator se presupune a fi „efectul soluţiei”, iar la cea
accelerată – cristalizarea intracelulară a compuşilor gameţilor.
Congelarea spermei de cocoş de la 0 ºC pînă la 10 ºC cu viteză lentă, face posibilă scăderea
considerabilă a deteriorării spermatozoizilor în acest interval al temperaturilor negative şi,
parţial, produce diminuarea dehidratării celulelor. Importanţa derulării proceselor menţionate
constă în admiterea posibilităţii de sporire ulterioară a vitezei de răcire în scopul minimalizării
influenţei „efectului soluţiei” şi a evitării consecinţelor cristalizării intracelulare în spermii.
Avînd în vedere rezultatele acestor constatări, s-a elaborat regimul optimal, prin multiple etape
de congelare a spermei de cocoş şi ambalarea ei în fiole plastice. Tehnologia include următorii
parametri: intervalul perioadei de cristalizare (de la începutul cristalizării pînă la -8 ºC) constituie
2,0-2,5 min; viteza răcirii în intervalul de temperatură -8-20 ºC este de 25-30 ºC/min, în
intervalul -20-85 ºC este de 50-70 ºC/min şi în intervalul -85-196 ºC este de 30-50 ºC/min.
Decongelarea spermei a fost realizată în baia cu apă la 40 ºC.
La congelarea spermei de cocoş ambalată în fiole sau paiete plastice T. P. Linic [81]
propune următorul regim de congelare şi decongelare a spermei: viteza de răcire de la 4 pînă la -
8 ºC constituie 1-3 ºC/min, expunerea la platoul cristalizării 1-2-min, răcirea pînă la 25 ºC cu
viteza de 25-30 ºC/min, pînă la -80 ºC cu viteza de 65-70 ºC/min, ulterior sperma ambalată se
introduce în azot lichid.
În cazul congelării spermei în formă de granule, temperatura suprafeţei metalice
hidrofobizată cu preparatul cremneorganic GKT-94, depinde de proprietăţile crioprotectorului
utilizat. În particular, pentru DMA şi DMF trebuie să fie în limitele de -140 ºC, la folosirea
metilacetamidei, EG, 1,2-propandiolului sau combinările lor temperatura suprafeţei de congelare
urmează să constituie -50 ºC. Pentru decongelarea spermei indiferent de varietăţile metodelor de
ambalare se utilizează temperatura de -40 ºC.
Este necesar de menţionat şi regimurilede congelare şi decongelare ale spermei de cocoş,
ambalate în flacoane de sticlă, au fost propuse de către L. E. Narubina [90]. Această tehnologie
prevede cîteva etape după cum urmează: flacoanele cu spermă diluată se ermetizează, se
instalează în platouri şi se expun la 2-4 ºC timp de 40-60 min, ulterior se introduc crioprotectorii
la răcire continuă în camera criostatului şi rotaţia flacoanelor timp de 4 min cu frecvenţa de 12-
13 rot./min pînă la temperatura de -80 ºC. Congelarea spermei se produce prin introducerea
flacoanelor în azotul lichid.
Decongelarea spermei, la fel, include cîteva etape: iniţial după extragerea flacoanelor cu
spermă din azot, ele se păstrează timp de 30-40 sec la temperatura camerei (18-20 ºC) pentru
35

evaporarea azotului lichid. După ce, flacoanele se transferă în baia cu apă la 60-70 ºC, unde se
păstrează pînă la începutul alunecării spermei de pe suprafaţa sticlei, timp de 7-10 sec.
O altă tehnologie este crioconservarea spermei în formă de granule prin metoda picurării
directe în azotul lichid [90]. Sperma după recoltare se diluează în raport de 1:1 cu mediul LKS-1
cu următoarea componenţă (%): glutamat de sodiu – 1,657; protaminsulfat – 0,028; acetat de
potasiu (dehidratat) – 0,432; D-fructoză – 0,691; polivinilpirolidon (10000 - 12000) – 0,259 şi
restul apă. Ulterior sperma se expune timp de 40 min la 2-4 ºC sau 15-30 min la -7-12 ºC şi se
adaugă 8% de DMA, nemijlocit înainte de congelare. Temperatura se coboară pînă la 0-12 ºC şi
sperma se picură, prin picături cît mai mici, direct în azotul lichid cu seringa prealabil răcită.
Pentru decongelare granulele se extrag din azot, se transferă în conusul metalic special, încălzit
pînă la 40-50 ºC. Sperma decongelată se colectează în eprubete şi se fololoseşte pentru
însămînţarea găinelor.
În tehnologia crioconservării spermei de cocoş în granule, recoltarea spermei se realizează
conform [233] sau prin alte metode, care nu stresează cocoşii. Nu se admite poluarea spermei.
După recoltare, sperma se diluează cît mai rapid cu mediul de următoarea componenţă (g/100 ml
apă): glutamat de sodiu (monohidrat) – 1,103-1,192; acetat de magniu (tetrahidrat) – 0,004-0,08;
acetat de potasiu (anhidrat) – 0,051-0,50; pirolidon polivinilclorid (MM 10,000) – 0,03-0,30;
glucoză – 0,044-0,80 şi DMA (lichid - 99%), care se adaugă în sperma diluată în concentraţie de
6% (V/V) nemijlocit înainte de congelare.
Congelarea spermei: 1) sperma (1-2 ml) în flacon de polisterol se transferă în lada cu gheaţă
timp de 10 min, după ce se adaugă în acelaşi volum mediu lui Lake la temperatura, aproximativ,
5 o C, unde rămîne pentru echilibrare timp de 20-30 min; 2) în altă ladă se toarnă azot lichid la
nivel nu mai mic de 10 cm şi se răceşte 10 min; 3) la agitare permanentă în sperma diluată se
adaugă, cu picătura DMA, pînă la concentraţia finală de 6% (V/V) şi se echilibrează timp de 1
min; 4) cu pipeta automată de 1 ml sperma se picură direct în azot. Picăturile cu volumul 0,05
ml, iniţial plutesc la suprafaţa azotului, pe urmă se afundă; 5) crioeprubetele pentru ambalare se
afundă în azot; 6) în fiecare eprubetă se ambalează cîte 6 granule şi eprubetele se închid cu
capac; 7) ulterior eprubetele se transferă pentru păstrare în vasul cu azot lichid.
Decongelarea spermei decurge în următoarele etape: 1) crioeprubetele cu granule se extrag
din azot şi se deschid; 2) pînă la evaporarea azotului din flacon granulele se transferă în alt
flacon de polisterol; 3) flacoanele se plasează în baia cu apă, la temperatura de 60 o C. În acest
moment, flaconul permanent se agită pînă la lichefierea granulelor, după care imediat se extrage
din baie şi spermă poate fi folosită pentru însămînţarea găinilor [233].
36

Eficienţa deosebită a însămînţării artificiale a păsărilor a determinat necesitatea creării
mediilor pentru păstrarea de scurtă durată şi îndelungată (prin congelare) a materialului seminal
[226, 378]. Posibilitatea diluării şi păstrării spermei de cocoş simplifică munca avicultorilor şi
creează posibilităţi de transportare a spermei cocoşilor de prăsilă la diferite distanţe. Cele mai
răspîndite procedee pentru păstrarea neîndelungată a spermei, de la cîteva ore pînă la cîteva zile
(în condiţiile frigiderului) trebuie să includă diluanţi, care ar asigura menţinerea indicilor vitali ai
celulelor reproductive. Aceşti diluanţii trebuie să dispună de proprietăţi pentru aprovizionarea
spermatozoizilor cu energie, menţinerea pH-lui şi osmocităţii la nivelul spermei native [297,
389].
Experimental a fost studiată eficienţa diferitor diluanţi pentru păstrarea spermei la
temperatura de 4 o C. Componenţa mediilor este prezentată în tabelul 1.1 [378].
Nr.
ctr.
Tabelul 1.1. Componenţa diluanţilor pentru păstrarea spermei de cocoş la 4 o C timp de 24 ore
Denumirea
Diluantul
componentelor, g Lake Lucaszewies Tellutin
1. Glutamat de sodiu 1,35 1,4 1,92
2. Citrat de potasiu XH2O 0,128 0,14
3. Acetat de potasiu 0,5
4. Acetat de sodiu 0,51
5. Acetat de magneziu X4H2O 0,08
6. Glucoză 0,8 0,7
7. Fructoză 0,2 0,8
8. Inozitol 0,7
9. Polivinilpirolidon 0,1 0,3
10. Protamin sulfat 0,02 0,32
11. Sodiu hidrogen fosfat anhidrat 0,98
12. Sodiu dihidrogen fosfat anhidrat 0,21
13. pH 7,2 7,3 7,05
14. Presiunea osmotică (mOsmol/kg) 310 390 320
15. Apa bidistilată 100 100 100
Componentele principale ale mediilor pentru păstrarea spermei de păsări sunt glutamatele,
citratele şi acetatele. Glutamatele, posibil, nu sunt foarte importante ca substrat oxidativ pentru
spermatozoizii de cocoş la temperaturile înalte (5 o C) şi pot fi toxice [223, 224]. Acetatele sunt
benefice pentru sperma de curcan [199]. Sperma cocoşilor şi curcanilor pe parcursul păstrării în
condiţii aerobe la 5 o C timp de 48 ore pierd FL în rezultatul hidrolizei acestora [412].
37

Păstrarea spermei păsărilor in vitro, în condiţiile de hipotermie (0-5 o C) reprezintă un
obiectiv aparte, deoarece, anume această metodă se foloseşte pe larg în domeniul selecţiei şi
creşterii păsărilor [224].
În contextul celor expuse, regimurile existente de congelare şi decongelare ale spermei de
cocoş, relativ pot fi divizate în două grupe: 1) conservarea lentă după anumite programe
concrete; 2) congelarea accelerată - nemijlocit în azotul lichid sau vaporii lui.
Astfel, reieşind din faptul nestabilităţii regimurilor existente de crioconservare a spermei de
cocoş şi impedimentele tehnologice de utilizare a spermei în condiţiile practice de creştere a
păsărilor, este evidentă şi rămîne pe viitor actuală perfecţionarea regimurilor şi metodelor de
congelare-decongelare a materialului seminal.
1.4. Factorii care influenţează calitatea materialului seminal.
Fertilitatea reprezintă un proces de prima necesitate şi este cea mai importantă în creşterea
păsărilor. Numărul de ouă fertile, produse pentru incubaţie, elucidează rentabilitatea finală a
găinilor de prăsilă. Fertilitatea scăzută în reproducţia păsărilor este considerată, în mare măsură,
o problemă a efectivului masculin. Exista mai multe cauze factoriale de fertilitate scăzută, care
au un efect negativ asupra succesului de reproducere al cocoşilor [284].
În ultimele decenii, cercetările efectuate în domeniul optimizării raţiilor păsărilor, paralel cu
complementarea anorganică a lor, s-a evidenţiat biodisponibilitatea şi activitatea biologică
sporită a compuşilor organici. Efectele lor benefice au fost înregistrate în biotehnologiile de
reproducţie a păsărilor agricole şi, în special, asupra proceselor de derulare a spermatogenezei şi
de ameliorare a proprietăţilor vitale ale spermatozoizilor. Unele dintre mineralele organice de
mare importanţă pentru nutriţia păsărilor de prăsilă sunt seleniul (Se) şi zincul (Zn) [ 25, 27, 101,
119, 155, 386, 418].
În acelaşi timp, este cunoscut, că dezechilibrele dintre concentraţia pro- şi AO au impact
negativ asupra calităţii spermei [72, 375]. Aceasta duce la creşterea POL, scăderea mobilităţii şi
viabilităţii spermei şi, în cele din urmă, la infertilitate.
Antioxidanţii biologici bine cunoscuţi sunt enzimelesuperoxid dismutaza (SOD) si
glutation-peroxidaza (GSH-Px), care au fost bine documentate în literatura de specialitate [204,
284]. În categoria AO chimici atît a produselor naturale, cît şi a celor sintetice, s-a atras o atenţie
deosebită asupra utilizării lor în procesul de reproducere şi în gestionarea fertilităţii [147]. S-a
accentuat, asupra faptului, că AO naturali (vitamina E, acidul ascorbic) şi enzimele (SOD şi
GSH-Px), creează în materialul seminal un sistem integral de protecţie contra ROS şi produselor
toxice ale metabolismului [91, 204, 284, 198, 223].
38

Conform relatărilor academicianului T.Furdui [122], echilibrul fiziologic optimal al
fenomenelor biologice ale sistemului reproductiv şi intensităţii degradării funcţionale şi
morfologice a lui, precum şi echilibrul dintre producţia ROS şi AO protectori sunt considerate,
ca factori ai calităţii materialului seminal şi, în special, ai capacităţii de fertilizare [47, 286].
Paralel, este cunoscut, că matricea structurală al spermatogenezei, care este condiţionat de
integritatea organogenezei a sistemului reproductiv, se află în corelaţie, atît cu factorii genetici,
cît şi cu cei epigenetici [122]. Ultimii includ şi influenţe ale mediului ca factori determinanţi ai
spermatogenezei (acţiuni teratogenice, remediile farmaceutice, dereglări alimentare etc).
Organismul continuu este supus acţiunilor schimbătoare ale mediului, ceea ce poate determina
sporirea frecvenţei de formare a gameţilor anormali [125].
Relaţiile dintre ROS şi statutul AO în sperma aviară, dintre morfologia şi funcţionalitatea
spermatozoizilor, precum şi posibilităţile de modelare ale lor prin diverse mijloace [21, 32],
inclusiv şi cele nutriţionale au o importanţă considerabilă [386]. AO, în general, pot fi împărţiţi
în două grupe, şi anume, enzimatici şi nonenzimatici, iar rolul lor în materialul seminal aviar este
elucidat mai jos [31, 147].
Formarea spermatozoizilor implică o serie de modificări moleculare si morfologice în
celulele germinale masculine, care sunt reprezentate prin celule stem diploide, spermatogoniile,
al caror stoc este intreţinut prin mitoze, în deosebi, în fazele iniţiale ale spermatogenezei [20,
124]. Menţinerea intensităţii spermatogenezei, ca proces fiziologic, care cuprinde totalitatea
transformărilor prin care trec spermatogoniile, reprezintă una dintre sarcinile prioritare ale
sanocreatologiei şi se realizează prin formarea dirijată şi reglementarea statusului fiziologic,
inclusiv şi al cordului în condiţiile variabile ale mediului [135].
Pentru depăşirea problemelor de fertilitate din cauza performanţei slabe a efectivului
masculin, mai multe studii au arătat, că anume influenţarea proceselor de spermatogeneză prin
intermediul factorilor esenţiali, participanţi în spermoproducţie, ar putea reglementa creşterea
proprietăţilor biologice ale spermatozoizilor [122, 124, 125].
Eficienţa activităţii de reproducere a cocoşilor se reduce semnificativ la deficienţe de
micronutrienţi (Se sau Zn), care apar prin medierea dezvoltării testiculelor şi prin scăderea
calităţii materialului seminal [26, 51, 161387].
O importanţă majoră în acest sens îi revine Se. Unul dintre efectele biologice ale Se constă
în faptul, că este componentul unei proteine, formate din patru subunităţi identice, fiecare
subunitate incluzînd un atom de Se, sub formă de selenocisteină. Această proteină, care conţine
Se, intră în compoziţia enzimei GSH-Px, care este enzima principală de luptă contra excesului
producerii radicalilor liberi. Meritul acestei descoperiri îi revine lui Rotruck [358].
39

Selenocisteina este un AA ce derivă din aminoacizi cisteina, în care Se a substituit sulful. De
asemenea Se este un element esenţial, care are un rol important în reproducerea păsărilor [159,
195, 386].
Neve J. [332], studiind funcţiile biologice ale Se, a constatat că agresiunile, care se produc
în timpul proceselor metabolice normale sau în timpul unui număr mare de circumstanţe
patologice (maladii degenerative, dereglarea spermatogenezei etc.), sunt legate de radicalii liberi
şi de pericolele pe care, aceştia le cauzează. Un deficit de Se, chiar neînsemnat, afectează
activitatea GSH-Px şi conduce la peroxidarea membranelor celulare şi intracelulare [204, 387].
În rezultat, permeabilitatea celulară este afectată, inclusiv şi numeroase structuri ale
biomoleculelor, în timp ce, de exemplu ADN şi ARN continuă să funcţioneze, însă din cauza
acestor anomalii, deja codul genetic al lor produce anumite devieri [232, 277, 317, 364, 391,
407]. Anumite deteriorări ale ADN, pot provoca dereglarea procesului de reproducere.
Deteriorarea ADN şi a proteinelor de legare, de asemenea, poate perturba calitatea materialului
seminal. Spermatozoidul cu ADN disfuncţionabil nu este în apt pentru a participa la fecundarea
ovulei. Prin urmare, rata de fertilizare scade concomitent cu deteriorarea ADN-lui [371].
La fel şi, fragmentarea ADN-ului este o cauză deseori întîlnită în spermatozoizii infertili.
Conţinutul ADN-ului fragmentat al spermatozoizilor corelează negativ cu calitatea spermei [377,
391]. Conform teoriei apoptozei, fragmentarea ADN este iniţiată de activarea endonucleazelor
[272, 300, 337]. Totodată, conform acestei teorii, defectarea fenomenului menţionat este
determinată de substituirea histonilor cu protamine în procesul spermatogenezei, ce provoacă
condensarea cromatinei şi ADN-lui [232, 277, 301, 317, 364, 408].
În calitate de micronutrient, Se are o deosebită importanţă în nutriţia păsărilor. Sub forma
organică, Se este legat chimic de un agent chelant, sau ligant, reprezentat de AA sau peptide. De
aici provine şi denumirea de minerale sau oligoelemente proteinate [165, 235].
Seleniul organic, ca şi majoritatea mineralelor organice, are o biodisponibilitate şi activitate
biologică mult mai mare, comparativ cu cea a Se anorganic [26, 264]. Seleniul poate determina
modificări fiziologice în ţesuturi, inclusiv şi în testicule, ceea ce are o influenţă directă asupra
calităţii produselor, care vor fi destinate consumului uman [11] şi calităţii materialului seminal
[281]. Integrarea Se organic în lanţul alimentar favorizează un transfer mai mare al Se într-o
formă ce poate fi asimilată la maximum de către organism [165].
Seleniul interacţionează cu un număr mare de minerale, potenţial toxice. La niveluri
micronutriţionale, Se este capabil de a preveni manifestările toxice ale acestor substanţe,
probabil, prin formarea derivaţilor mai puţin toxici sau inactivi. Ca rezultat, Se modelează
40

toxicitatea metalelor grele, avînd ca unul dintre efectele benefice asupra organismului,
diminuarea pericolelor gonadice [155, 157, 203, 418].
Funcţia esenţială pe care o are Se în organism, este cea de component al GSH-Px, enzima
plasmatică şi cito-plasmatică, care interacţionează radicalii liberi cu efecte negative asupra stării
de sănătate a organismului şi reduce excesul producerii lor [311, 336]. De asemenea, Se este
implicat şi în reglarea mai multor sisteme enzimatice, care participă, inclusiv şi în desfăşurarea
metabolismului energetic al spermatozoizilor [223].
O altă funcţie importantă a Se în organism este condiţionată de rolul antioxidativ al lui, care
poate fi explicat prin faptul că acesta este parte componentă a enzimei antioxidante GSH-Px
[204, 386]. Există diferite tipuri de selenoproteine, care participă la reglementarea funcţiilor
fiziologice, inclusiv la protecţia AO şi stabilizatoare a membranei celulare a spermiului. Recent a
fost stabilit, că o parte a GSH-Px din formă enzimatică convertibilă, trece în parte structurală a
spermei. Importanţa Se reiese din faptul, că Se adăugat în spermă, sporeşte caracteristicile de
păstrare şi mobilitate a spermei şi micşorează eliberarea totalului de lipide şi FL din
spermatozoizi în plasma seminala în timpul păstrării [195]. Acţiunea AO este predeterminată şi
de interacţiunile existente între Se şi a vitamina E, prin potenţarea mecanismelor de protecţie
contra peroxidării FL membranice [204, 240, 386]. Seleniul, component al GSH-Px, acţionează
printr-un mecanism secundar de apărare, ca urmare a incapacităţii vitaminei E de a distruge total
peroxizii metabolismului [387]. În calitate de component intracelular al GSH-Px, Se acţionează
împreună cu vitamina E şi considerabil reduce stresul celular [198, 374]. Concomitent, există
legături strînse între consumul Se şi vitaminei E şi calitatea produselor de pasăre [11]. Ca urmare
a proprietăţilor sale, prezenţa suplimentară a Se în alimentaţie are influenţe benefice asupra
ameliorării funcţionale a sistemului reproductiv şi a altor sisteme vitale ale organismului [165,
235].
S-a constatat, că aportul suplimentar al Se organic în organism este vindecarea infertilităţii
masculine şi dublarea capacităţilor imune ale celulelor implicate în răspunsul imun [25, 26].
Prezintă importanţă declanşarea mecanismelor metabolice, prin intermediul cărora Se manifestă
proprietăţi amelioratoare şi biologice benefice [203, 282, 328].
În acelaşi timp, la deficitul de Se la cocoşi, scade semnificativ numărul de celule Sertoli si
Leydig, care sunt necesare, respectiv, pentru spermatogeneză şi producţia de testosteron [203].
Cercetările anterioare au demonstrat, că deficitul de Se provoacă scăderea fertilităţii şi
afectează funcţia de reproducere la cocoşi [159]. Selenoproteinile contribuie la stabilizarea
spermatozoizilor şi, prin urmare, la apariţia deficienţei de Se scade calitatea spermei. Surai şi al.
41

[386] au raportat că GSH-Px este enzimă dependentă de Se, care reprezintă un component
esenţial al sistemului AO al spermei de pasăre. Barber şi al. [159] au demonstrat, că adăugarea
Se în materialul seminal de broiler în doze foarte mari (7896 micrograme/l) este nocivă şi
diminuează indicii calităţii spermei.
Este cunoscut, că deficitul de Se negativ influenţează mecanismele de apărare antioxidativă
a spermei de cocoş [386]. Edens şi Sefton [203] au demonstrat că, atunci cînd cocoşii au fost
hrăniţi prin suplimentare de Se cu 0,2 ppm la raţia de bază, care conţinea Se 0,28 ppm, procentul
de spermatozoizi normali a crescut, iar anomaliile spermiilor semnificativ au scăzut.
Prezenţa Se organic în alimentaţia omului cu amintite produse are influenţe benefice asupra
reducerii multor maladii, iar în raţiile alimentare ale păsărilor duce la sporirea semnificativă a
productivităţii şi ameliorarea funcţiilor de reproducţie [157]. Concomitent, conform avantajelor
sanocreatologiei, în scopul prevenirii posibilelor acţiuni nocive ale factorilor epigenetici asupra
spermatogenezei este necesar de asigurat o alimentaţie integră şi de exclus acţiunea factorilor
stresogeni din activitatea vitală masculină [121, 124].
În contextul interesului crescînd pentru efectele benefice ale alimentelor asupra sănătăţii
umane, creării şi menţinerii dirijate a statusului fizic, fiziologic, morfologic şi psihic al omului
[136], rezultatele succesului înregistrat în urma consumului produselor bogate în Se au
predeterminat direct proporţional beneficiile aduse sănătăţii, decizia cumpărătorului şi
intensitatea de profil a producătorului. O preocupare majoră în Europa, reprezintă nivelul Se-ului
în sînge la populaţia umană. Consumul redus de Se din ultimii 20 de ani poate avea influenţe
asupra creşterii incidenţei infertilităţii şi apariţiei altor devieri ale organismului. Prin
administrarea de Se organic în raţiile pentru găinile ouătoare, necesitatea zilnică (20-100mcg),
recomandată pentru om, se poate asigura prin consumul de două ouă pe zi [282].
Suplimentarea hranei cu Se organic, nu numai îmbunătăţeşte starea de sănătate şi
productivitatea păsărilor, dar poate servi şi, ca o sursă naturală de alimente, care au o importanţă
vitală pentru procesele fiziologice ale organismului, respectiv şi pentru producţia de ouă şi carne
de pasăre îmbogăţită cu Se [281]. Este important, în practică, de a se evita prescrierea
administrării unui singur element în doze mari, dar este binevenită administrarea
micronutrienţilor într-o manieră multielementară şi într-un bun interechilibru [27, 115], care
asigură, în acelaşi timp, şi o derulare optimă a proceselor de digestie a nutrienţilor în tractul
digestiv [140].
Un rol, nu mai puţin important, în funcţionarea sistemelor şi organelor organismului îl are
Zn. Ca element de bază, care se conţine în peste 200 de enzime, acest element coordonează şi
participă în reglarea unui număr multiplu de procese biologice şi metabolice, care decurg în
42

organism. În particular, Zn este implicat în procesele metabolice şi balanţa electrolitică, formarea
structurală a scheletului, creşterea şi dezvoltarea organismului, tonusul muscular şi activitatea
sistemului enzimatic, fortificarea sistemului imun, transferul energetic şi metabolismul
carbohidraţilor, balanţa acido-bazică şi altele. În acelaşi timp, Zn participă în sinteza proteinelor
şi menţinerea compoziţiei AA esenţiali, asigurînd funcţia de reproducere şi a stării generale
echitabile a organismului [168].
Zincul are roluri importante în diverse activităţi biologice, fiind urmate de o gamă largă de
relatări ştiinţifice, inclusiv şi de informaţii disponibile, cu privire la funcţiile sale în
spermatogeneză. Cercetările actuale au relevat faptul, că Zn se acumulează în celulele germinale,
în special, în mitocondriile spermatogoniilor şi spermatozoizilor [162, 383, 416].
Zincul prin proprietăţile sale biologice, împiedică atrofierea prematură a timusului,
stimulează digestia, asimilarea şi are un rol important în activitatea organelor reproductive şi
metabolismului tractului digestiv [161, 251].
Zincul este bine cunoscut, ca un element esenţial în activităţi biologice ale organismului. În
sistemele biologice, Zn este prezent în formă de proteine şi ioni, joacă un rol important în
medierea funcţiei şi structurii proteinelor, precum şi în menţinerea echilibrului fiziologic [208].
Zn se acumulează în testicule la nivel identic cu concentraţia lui din ficat şi rinichi [209].
Din motivul lipsei constituirii unei rezerve constante de Zn, pentru asigurarea optimală a
acestui mineral, organismul se află în dependenţă directă de asimilarea necesarului de Zn din
alimente. Concomitent şi alţi autori au demonstrat, că Zn se acumulează în testicule în
concentaţii ridicate, care, la fel, sunt comparabile cu cele din ficat şi rinichi [162]. Peste 300 de
enzime cu funcţii vitale în organism depind de aportul Zn în funcţionarea fiziologică a lor. Unele
dintre aceste metaloenzime, au ca component structural principal ionul de Zn [351]. Printre
acestea, ce au importanţă vitală esenţială în organism sunt anhidraza carbonică (AC), care
produce excreţia CO2; fosfataza alcalină, care eliberează fosfaţii anorganici ai metabolismului
oaselor; SOD, care protejează celulele contra radicalelor liberi; alcool-dehidrogenaza (ADH),
care asigură detoxicarea ficatului de alcool; carboxipeptidaza, implicată în digestia proteinelor
alimentare şi al. Mai mult, meioza celulară fiziologică nu poate avea loc în lipsa unei cantităţi
optime de Zn, necesară pentru sinteza ADN-ului, ARN-ului şi a proteinelor. Zn este o
componentă structurală de legătură a proteinelor ADN-lui şi protejează membrana celulară
contra lizării ei [26].
În studiile contemporane, inhibarea spermatogenezei si anomaliilor spermei au fost
observate în patologiile, care induc deficit de Zn [209, 345]. Deficitul de Zn poate provoca
leziuni severe ale testiculelor, cum ar fi, atrofia la nivelul tubilor testiculari şi inhibarea
43

spermatidelor [345]. În acelaşi timp, există unele relatări, care denotă, că prezenţa Zn poate
atenua deteriorarea testiculelor, provocată de către metalele grele, fluoruri şi de către căldură
[177]. Aceste constatări sugerează faptul, că testiculele ar putea adăposti un sistem încorporat de
Zn şi, că Zn poate exercita un efect protector contra leziunilor testiculare, precum şi joacă un rol
esenţial în menţinerea funcţiilor reproductive. Cu toate acestea, nu există nici o dovada de
acţiune directă a Zn asupra spermatogenezei.
În comparaţie cu spermatogeneza, eficienţa Zn asupra mobilităţii spermatozoizilor a fost
examinată la diferite vertebrate si nevertebrate [247]. La om, scade mobilitatea spermei, în
asociere cu creşterea concentraţiei Zn în plasma seminală [241]. Morisawa şi Yoshida, de
asemenea, au relatat, că Zn în plasma seminală suprimă mobilitatea spermei, iar înlăturarea lui
ameliorează mobilitatea [177]. Aceste rezultate sugerează asupra faptului, că Zn extracelular
afectează mobilitatea spermatozoizilor. În plus, s-a raportat că Zn este prezent în mitocondrii şi
flagelul spermatozoizilor [324, 383], dar nu există date, cu privire la rolul Zn intracelular în
funcţiile vitale ale spermei.
Concomitent, sunt clarificate unele mecanisme de reglementare, care stau la baza evoluţiei
spermatogenezei [321, 322]. Paralel cu investigaţiile de distribuire a concentraţiei de Zn, au fost
arătate efectele inhibatoare ale plumbului, molibdenului, rubidiului şi arseniului asupra
spermatogenezei [416].
Unele studii au relatat, concentraţii mari de Zn în testicule la diferite nivele, iar un deficit de
Zn inhibă spermatogeneza şi produce anomalii ale spermei [315]. În prezent există unele relatări,
care vizează, în detalii, funcţia Zn în procesul spermatogenezei. Sorensen şi cooautorii au
demonstrat, că Zn este prezent în spermatogoniile şi spermatocitele primare [381]. S-a
demonstrat, de asemenea, că Zn se acumulează în testicule în timpul spermatogenezei precoce şi
poate juca un rol-cheie în reglementarea proliferării spermatogoniilor şi în meioza celulelor
germinale [208, 322].
Experimental s-a stabilit acumularea Zn în mitocondrii, spermatogonii, spermatide şi
spermatozoizi. Costello şi al. [191] au arătat, că Zn este importat în mitocondrii de prostată şi
celulele hepatice, în forma unui complex de Zn-ligande. Există numeroase dovezi ale prezenţei
sistemului de transport pentru Zn [189]. Zn, la rîndul său, ar putea avea un rol important în
funcţiile mitocondriale şi celulele germinale [245]. În plus, Zn a fost depistat şi în alte zone ale
citoplasmei. Zn se acumulează în citoplasmă, cît şi în spermatogonii, spermatocite [381]. Acest
lucru denotă că Zn este un element esenţial pentru menţinerea celulelor germinale. Prin sondaj
fluorescent s-a constatat, că Zn se acumulează în mitocondriile celulelor germinale şi acest lucru
poate spori protecţia acestor celule de la apoptoza [244, 398]. Unele studii au demonstrat
44

corelaţia dintre Zn şi apoptoză şi arătă că Zn ar putea funcţiona ca un AO în celule [398]. Studii
suplimentare vor fi necesare pentru stabilirea rolului Zn-ului în integritatea celulelor germinale.
Unele cercetări au demonstrat, că sub influenţa Zn-ului se intensifică spermatogeneza, se
înoiesc spermatogoniile, sporeşte meioza şi concentraţia celulelor germinale [321, 322, 334].
Rezultatele cercetărilor au arătat, de asemenea, că Zn are un rol important în sinteza ADN-ului
prin proliferarea celulelor şi meiozei. În plus, receptori hormonilor steroizi – ai progesteronului,
androgenilor, estrogenilor si cei ai Zn reciproc interacţionează în ansamblul structurilor lor, care
nemijlocit sunt implicate în procesul spermatogenezei [222]. Aceste constatări sugerează, că în
timpul sintezei ADN-ului hormonii steroizi şi celulele embrionare pot încorpora Zn pentru a
activa o serie de enzime specifice şi proteine. Prin urmare, analize de perspectivă vor fi necesare
pentru clarificarea rolului Zn, cu privire la îndeplinirea funcţiilor de receptori ai hormonilor
steroizi şi de factori ai tranzacţiilor în timpul spermatogenezei.
O importanţă deosebită în mobilitatea spermei îi revine Zn intracelular, care preponderent se
acumulează în mitocondrii spermatici [381] şi este important pentru mobilitatea spermei. ATP
sintetizat de către mitocondrii, cu participarea Zn este necesar pentru mobilitatea
spermatozoizilor [402]. Paralel, în mobilitatea spermatozoizilor participă şi AC, care se menţine
în membranele spermatice. AC catalizează hidratarea reversibilă a carbonului şi reglează pH-ul
în lichidele celulare, care influenţează mobilitatea spermatozoizilor. AC este o proteină Znobligatorie,
iar activitatea sa este dependentă de concentraţia Zn-ului [321].
O atenţie deosebită s-a atribuit AO dietetic, vitaminei E. A fost demonstrat, că 88% a
vitaminei E din sperma de cocoş se găseşte în spermatozoizi. În funcţie de dietă, concentraţia
vitaminei E în materialul seminal de cocoş variază între 0,46 micrograme/ml (fără suplimentarea
raţiei cu vitamina E) pînă la 1,04 micrograme/ml (cu suplimentarea raţiei cu vitamina E la
nivelul de 200 mg/kg) [386].
Vitamina C (acidul ascorbic) este un AO solubil în apă şi, în mod natural, se sintetizează de
către organism. A fost recomandat în hrana păsărilor ca supliment pentru a atenua stresul,
deoarece în timpul stresului cerinţele organismului în vitamina C pot depăşi capacitatea de
sinteză a ei [206, 231]. Stresul fiziologic, cum ar fi, căldura, bolile sau suprapopularea poate
spori necesitatea organismului în acid ascorbic. Vitamina C este implicată în metabilismul AA,
metabolismul mineral şi participă în sinteza testosteronului [311], care este esenţial în funcţiile
de reproducere a cocoşilor. Nowaczewski şi Kontecka [208] au documentat faptul, că acidul
ascorbic asigură potenţialul antioxidativ al plasmei seminale în mărime de 65%.
Carnitina, reprezintă un vitamino-aminoacid, sintetizat de metionină şi lizină, care
acţionează ca receptor intercelular pentru activarea acizilor graşi [2]. Carnitina posedă proprietăţi
45

AO, care protejează membrana spermatozoizilor împotriva toxinelor ROS [145 331, 384, 363].
Concentraţii mari de carnitină sunt prezente, atît în plasma seminala, cît şi în spermatozoizi, care
reduc POL prin transportul acizilor graşi polinesaturaţi în mitocondrii pentru β-oxidare şi pentru
producerea energiei necesare mobilităţii spermatozoizilor [331, 424]. Carnitina poate proteja alţi
AO împotriva potenţialelor deteriorări peroxidative, de exemplu, funcţionează concomitent cu
SOD în protecţia membranei lipidice a spermatozoizilor şi joacă un rol esenţial în reducerea
POL, protejînd celulele de deteriorări peroxidative [224, 384].
Suplimentarea raţiei cocoşilor cu L-carnitină a înregistrat îmbunătăţiri ale indicilor
materialului seminal şi ai parametrilor de fertilitate prin inhibarea POL din membranele
spermatozoizilor de cocoş [2, 145, 331, 363]. Includerea în raţia dietetică a L-carnitinei în doză
de 250-500 mg/kg a stabilit o sporire semnificativă a numărului de spermatozoizi normali şi
ameliorarea calităţii spermei de cocoş [145, 331, 363].
Glutathion peroxidaza, este o enzimă importantă, care joacă un rol-cheie în detoxicarea
peroxidelor lipidice în sperma de cocoş [223, 386]. GSH-Px este un AO deosebit, datorită rolului
său de conversie a peroxidului de hidrogen în componente mai puţin toxice [204, 284]. Această
enzimă este considerată calitativ superioară catalazei, deoarece menţine scăzută acţiunea celulară
a H2O2 [156]. GSH-Px şi vitamina E sunt considerate componentele principale ale sistemului AO
şi aceste două componente acţionează ca sinergiste în procesul de protecţie a spermei de cocoş
împotriva stresului oxidativ [204]. GSH-Px acţionează în concordanţă cu alte enzime, de
exemplu, catalază şi poate modifica statusul unor componente structurale [284].
SOD este un component important al plasmei seminale şi joacă un rol esenţial în echilibrul
dintre generarea ROS şi degradarea purităţii anionului de superoxid [204, 284]. SOD modifică
anionul de superoxid în peroxid de hidrogen, care este, în cele din urmă, transformat în apă,
enzimele catalazei şi GSH-Px. Scăderea concentraţiei de SOD a coincis cu mobilitatea anormală
a spermatozoizilor [284].
Materialul seminal aviar întruneşte două varietăţi de SOD, forma mitocondrială (Mn-SOD)
şi forma citoplasmatică (Cu,Zn-SOD). Există particularităţi de specie în activitatea şi distribuţia
SOD în material seminal al păsărilor. De exemplu, Mn-SOD este principala varietate a acestei
enzime în spermatozoizi aviari, variind de la 57% (la cocoş) pînă la 69% (la alte specii) din
totalul SOD [386]. Mn-SOD, prioritar, este prezentă în spermatozoizi, în timp ce Cu,Zn-SOD se
află în plasma seminala [386].
SOD este sintetizată şi reglementată endogen şi funcţionează în cooperare cu alte enzime,
cum ar fi GHS-Px [284]. O cantitate semnificativă de SOD este secretată de epididium.
46

Această enzimă purifică anionul de superoxid extra- şi intracelular, precum şi inhibă
peroxizii lipidelor din membranele spermatice [204, 284]. De asemenea, acţionează împotriva
peroxidului de hidrogen prin conjugarea sa cu catalaza sau GSH-Px [259, 284]. SOD
preîntîmpină hiperactivaţia şi capacitaţia prematură, cauzate de radicalii de superoxid, înainte de
ejaculare. Pe baza studiilor in vitro, Froman [223] a constatat o cantitate minoră de SOD în
modelele probelor de material seminal de curcan, examinarea cărora, paralel, a stabilit o
sensibilitate mai înaltă la stresul oxidativ, comparativ cu sperma de cocoş.
Unul dintre componenţii minerali ai raţiei este calciul. Reglarea acţiunii celulelor, ca
răspuns la influenţa factorilor intra- sau extracelulari se realizează la diferite niveluri sub
controlul proprietăţilor genelor. Reglarea accelerată a activităţii se realizează prin modificarea
funcţiei proteinelor, care poate avea loc sub influenţa hormonilor sau factorilor de creştere. Unul
dintre aceste mecanisme este modificarea concentraţiei calciului (Ca +2 ) intracelular [362]. În
particular în nucleu [201, 227], în aparatul Goldji [164, 320], în liposome [185, 266] şi alte
organe [190]. Mitocondriile pot acumula Ca +2 în spaţiul matricei lor, datorită existenţei sarcinii
negative a membranei mitocondriale.
În condiţiile cînd conţinutul ionilor de Ca +2 este scăzut, are loc activitatea dehidrogenazelor
tricarbonice ale ciclului Krebs [237]. Acumularea Ca +2 mitocondrial, în cantitate excesivă, poate
provoca activarea permeabilităţii porilor, care iniţiază necrotizarea celulelor [187, 197]. În
condiţii fiziologice, mitocondriile îndeplinesc un rol important în menţinerea nivelului ionilor de
Ca +2 în celulă [167, 355]. Concomitent, este stabilită existenţa organelelor spermatice, unde se
depozitează ionii de Ca +2 [362]. Calciul este un element, care participă activ în procesul de
fecundare. Procesele fiziologice, care decurg în zona pelucidă şi acţiunea nucleotidelor ciclice
sunt determinate de starea canalelor Ca +2 -conductibile [194].
În momentul fecundării naturale, rolul principal al spermatozoizilor constă în transportarea
materialului genetic şi contopirea lor cu ovula. Ionii de Ca +2 îndeplineşte un rol important în
capacitaţie, hemotaxis şi pătrunderea spermatozoidului în ovulă. Spermatozoizii sunt apţi pentru
fecundarea ovulei numai după sfîrşirea procesului de capacitaţie. Procesul de maturizare al
spermatozoidului se încheie în tractul reproductiv al femelei. Capacitaţia este însoţită de
modificări celulare, inclusiv hiperpolarizarea membranei, modificarea lipidelor membranare,
sporirea pH-ului intracelular, creşterea conţinutului tirozinei şi a nivelului de fosforilare,
majorarea concentraţiei Ca +2 şi AMP-c [194].
47

Ovula este înconjurată de zona pelucidă, unde se localizează glicoproteinele, care sporesc
concentraţia ionilor de Ca +2 în spermă, iniţiază modificări ale mobilităţii spermatozoizilor şi
contribuie la reacţia acrozomală [194].
Atît în celulele somatice, cît şi în spermatozoizi ţesuturile depozitelor de Ca +2 reglează
pătrunderea sau eliminarea lui în spaţiu intra- sau extracelular [163, 347]. La dereglarea
permeabilităţii canalelor Ca +2 -conductoare are loc pierderea proprietăţilor de fertilizare ale
materialului seminal [194].
O influenţă semnificativă asupra calităţii materialului seminal are şi anotimpul. Astfel, în
decembrie, la longevitatea vizibilă a zilei de 8 ore şi temperatura de pînă la 4 o C, volumul
ejaculatului, concentraţia spermatozoizilor şi mobilitatea lor constituie, corespunzător, numai
0,05 ml; 20×10 6 sp/ml şi 5,0 baluri. Valori maximale ale indiciilor studiaţi s-au înregistrat în
februarie, concentraţia spermatozoizilor a fost de 2500×10 6 sp/ml şi mobilitatea – 8,0 baluri.
Volumul ejaculatului înregistrează valori maxime (>0,3 ml) în luna iunie şi constituie 0,3 ml.
Valorile indicilor studiaţi sunt interdependente de rasele de cocoşi, ceea ce se va avea în vedere
la crearea bancurilor genetice şi realizarea tehnologiilor reproductive [174, 359].
1.5. Evoluţia şi perspectiva cercetărilor în domeniul conservării, păstrării şi utilizării
spermei de cocoş.
Cercetările în domeniul crioconservării spermei de cocoş au început de la comunicarea lui
Polge [343], despre obţinerea descendenţilor după însămînţarea găinilor cu sperma decongelată.
Acest fapt a fost confirmat de numeroşi savanţi [274]. Rezultatele limitate în domeniul
crioconservării şi tehnologiile complicate au diminuat valoarea aplicativă a acestor cercetări
fundamentale. Între timp, s-a dovedit că diferite rase şi linii de găini dispar cu viteze
îngrozitoare, din cauza lipsei surselor financiare pentru menţinerea infrastructurii de existenţă a
lor. Concomitent, a sporit nivelul bolilor (invaziilor) virotice. Această situaţie a contribuit la
organizarea Simpozionului extraordinar [374] şi adoptarea Programului strategic de acţiuni
pentru păstrarea surselor genetice de păsări. În aşa fel, a fost conştientizată importanţa dezvoltării
programelor de conservare a spermei de cocoş şi, în particular, crearea băncurilor de spermă în
SUA [169], Franţa [173], Niderlanda [413], Federaţia Rusă [90] şi Ucraina [81].
Metodele contemporane de crioconservare a spermei animalelor agricole şi a păsărilor, în
linii generale, asigură satisfăcător obţinerea descendenţilor, dar totuşi, nu asigură pe deplin
folosirea efectivă a materialului genetic al reproducătorilor preţioşi în practica de selecţie şi
prăsilă, deoarece după congelarea-decongelarea spermei tuturor speciilor, practic, se reuşeşte de
a obţine nu mai mult de 50% de celule funcţional active [47, 81, 92, 410, 412].
48

Pînă în prezent, cu toate, că există rezultate convingătoare [174, 297], folosirea spermei
crioconservate de cocoş este limitată din cauza mobilităţii şi vivacităţii scăzute a materialului
seminal [256, 297]. Conform literaturii de specialitate, sperma de cocoş are volum mic şi
concentraţie mare de spermatozoizi, în legătură cu ce, este necesară diluarea ei. Pentru
crioconservarea reuşită a spermei se realizează multilateral selectarea mediilor de diluare,
selectarea crioprotectorilor şi folosirea tehnologiilor eficiente pentru congelarea-decongelarea
spermei, care determină reducerea deteriorării membranelor [200, 297, 378]. Prin utilizarea
mediilor cu dimetilsulfoxod [297] a fost congelată sperma diferitor rase de cocoş. S-a
demonstrat, că sperma de cocoş congelată în paiete este criolabilă şi poate fi păstrată nu mai mult
de 60 min [239, 297]. Totodată, s-a observat dependenţa calităţii spermei decongelate de rasa
cocoşilor [297, 389], în schimb alţi autori nu stabilesc această dependenţă [297].
Actualmente, metodele criobiologice includ unele părţi negative, care micşorează
posibilităţile reale de soluţionare a problemelor de crioconservare a spermei de cocoş. În
particular, se face imposibilă păstrarea la 100% a viabilităţii celulelor în procesul de
crioconservare, care este urmat de perderea unei părţi a genofondului şi prezenţa efectelor
nocive. Paralel cu investigaţiile efectelor existente nedorite sunt necesare cercetări suplimentare
în studierea influenţei crioconservării asupra conţinutului ADN-ului [59].
O atenţie deosebită se acordă noilor modalităţi de perspectivă în elaborarea mediilor pentru
sperma de cocoş. În anumite perioade ale anilor precedenţi, a fost observat şi constatat
fenomenul de supravieţuire a spermatozoizilor în căile sexuale ale femelelor, aşa numita
„conservarea fiziologică”, durata căreia variază în limitele de la 48 ore la om pînă la 15 ani la
furnici [52, 86, 92]. Pentru găini această perioadă durează circa 25 zile. La păsările domestice
locul pentru supravieţuirea spermatozoizilor sunt glandele uretro-vaginale, care pot fi numite şi
spermodepozitare. În ultimele, spermatozoizii se află în stare de inhibiţie şi intensitatea
proceselor metabolice a lor, este semnificativ redusă. Reieşind din cele menţionate, este firesc şi
rezonabil de a presupune, că mediile optimale pentru păstrarea spermei de cocoş în condiţiile
hipotermice sau crioconservării, pot servi mediile, apropiate după componenţă şi proprietăţi, de
secretul „spermodepozitar”, adică de condiţiile mediului glandelor tubulare din oviductul
găinilor. În acest caz, este necesar de a include în componenţa mediilor menţionate a
activatorilor metabolismului, care ar favoriza procesul de crioconservare, însă nu este clară
perioada de includere a lor în etapele tehnologice ale proceselor de diluare, congelare,
decongelare, însămînţare [83].
49

Accelerarea reproducerii animalelor agricole, sporirea reprezentabilităţii animalelor este
posibilă şi prin elaborarea şi implementarea tehnologiilor de transplantare a embrionilor [113].
Problema crioconservării embrionilor atrage atenţia mai multor cercetători [144, 152, 160,
166, 184, 202, 242, 285, 304, 356, 357, 388, 395]. Crioconservarea embrionilor de păsări rămîne
de perspectivă, deoarece embrionii lor au un volum, comparativ, mare, conţin o cantitate mare de
gălbenuş şi, cel puţin 3 straturi de membrane. Cu cît este mai mic volumul, cu atît este mai mare
probabilitatea vitrificării [419]. Micşorarea volumului este posibilă prin utilizarea plasei de la
microscopia electronică, picăturilor mici, criotopului, minipaietelor, suprafeţei dure, plasei de
neilon, diferitor fibre etc. [153, 271, 275, 327, 340, 344, 417, 419, 420].
În acelaşi timp, vitrificarea poate fi realizată şi cu o viteză de răcire, destul de mică şi o
concentraţie redusă de crioprotectori [367]. La congelarea lentă are loc cristalizarea apei
extracelulare în rezultatul gradientului osmotic, care extrage apa din celulă, ce provoacă
vitrificarea intracelulară. Condiţiile congelării şi decongelării determină procesele, care au loc la
congelarea lentă, iar condiţiile de răcire şi încălzire, determină procedeele, care au loc la
vitrificare. Ambele procese decurg sub egida crioconservării. Spre deosebire de metoda de
congelare, cînd are loc dirijarea vitezei de răcire şi folosirea utilajului complicat, metoda de
vitrificare poate fi realizată cu mai puţine surse financiare, este mai simplă şi mai avantajoasă la
crioconservarea spermei şi embrionilor de păsăre [367]. Materialul biologic crioconservat prin
vitrificare nu pierde proprietăţile funcţionale, chiar şi după 20 de ani de păstrare.
Actualmente sunt acumulate multe date în favoarea ideei, că inhibarea exogenă sau
endogenă a metabolismului celulelar în condiţiile de stres poate avea un rol protector [87, 121].
Realizarea acestei relatări considerabile şi, evident, benefice nu se reuşeşte din cauza lipsei
cunoştinţelor suficiente despre procesele metabolice în ciclul vitalităţii spermatozoizilor.
Intensitatea reacţiilor hetero- şi endotermice este determinată de factorii ecologici, care
conţin sistemele antioxidative şi asigură derularea proceselor de adaptare la temperaturile joase.
Aceste temperaturi provoacă producerea energiei şi, ca consecinţă, modifică concentraţia
formelor active ale oxigenului. În rezultat se poate iniţia stresul oxidativ cu dereglarea
homeostaziei celulare şi a sistemului antioxidativ. Sistemele AO, reacţionînd la stresul termic
acut, provoacă epuizarea echivalentelor de oxido-reducere. La rîndul său, acţiunea temperaturilor
scăzute determină adaptarea sistemului antioxidativ şi a conţinutului aminoacidic, reglarea cărora
nu este complet elucidată prin mecanisme stabilite şi rămîne a fi o problemă pentru cercetările
viitorului [12, 183, 299, 312, 314, 326].
50

Păstrarea izotonică (volumul permanent) este alternativa metodelor tradiţionale de
crioconservare, reprezentînd o metodă, care reduce concentraţia crioprotectorilor şi este simplă
în realizare. S-a demonstrat, că păstrarea izohoră influenţează formarea cristalelor de apă şi are o
perspectivă deosebită [258]. De perspectivă sunt şi cercetările referitoare la folosirea liposomilor
[48, 278, 279] şi a lipoproteidelor antifrize la conservarea spermei de cocoş [239].
Pentru rezolvarea problemei de păstrare a resurselor genetice ale cocoşilor, este oportună
cercetarea concomitentă în următoarele direcţii: 1) cercetării fundamentale asupra depistării
mecanismelor de criodeteriorare şi aplicării metodelor de crioprotecţie a celulelor; 2) elaborarea
noilor metode de sporire a numărului celulelor cu supravieţuire sporită şi cu genomul
nedeteriorat; 3) elaborarea noilor metode de conservare a celulelor, care minimalizează factorul
economic pentru întreţinerea criobăncilor [59].
1.6. Concluzii la capitolul 1.
Ameliorarea fertilităţii masculine a fost în centrul cercetărilor majore din domeniul
conservării spermei de cocoş din ultimele decenii. O mai bună înţelegere a mecanismelor de
derulare a spermatogenezei a predeterminat studierea diverşilor factori, ca produşi de remediere
a fertilităţii scăzute. Datele actuale demonstrează proprietăţi foarte benefice ale factorilor
epigenetici, însă concluzii definitive din studiile existente nu pot fi făcute numai în derularea
spermatogenezei, deoarece nu este singura cauză a infertilităţii cocoşilor. Dozele şi durata de
aplicare a factorilor sunt critice şi specifice, mai cu seamă, că cercetătorii nu au stabilit nivele
necesare ale acţiunilor factoriale concrete, în scopuri fiziologice normale ale spermatogenezei.
Unele studii au arătat, de asemenea, lipsa de eficienţă a folosirii factorilor esenţiali asupra
parametrilor spermei. Pe de altă parte, doze de niveluri ridicate au demonstrat, fie nici un efect
asupra calităţii materialului seminal sau efecte negative. Indiferent de cele menţionate, există
dovezi ample în avantajele utilizării factorilor sus menţionaţi pentru a îmbunătăţi calitatea
materialului seminal, care a putut fi afectată la expunerea carenţelor sau a nivelurilor ridicate a
lor în procesul de menţinere, reglare, protecţie, stimulare la diverse etape evolutive ale
spermatogenezei la cocoş. Drept soluţie ar servi stabilirea optimă a tipurilor, dozelor şi duratelor
de acţiune a factorilor, care ar putea fi utilizate în derularea parametrilor studiaţi pentru a spori
proprietăţile biologice ale materialului seminal. În plus, numeroase cercetări multicentrice şi un
număr mai mare de probe studiate pe şeptele vaste de cocoşi sunt unele necesităţi prioritare
pentru a obţine o imagine amplă în avantajele de perspectivă ale acestei probleme esenţiale.
În acelaşi timp, urmare a analizei şi generalizării informaţiei bibliografice prezentate în
acest capitol, succint, putem menţiona, că actualmente sunt obţinute succese considerabile în
51

domeniul crioconservării spermei de cocoş şi succese deosebit de avansate în tehnologia
însămînţării artificiale a găinilor.
Eventualele relatări ale literaturii de specialitate de profil oferă posibilitatea de a
considera, că crioconservarea spermei de cocoş a devenit reală datorită cercetărilor fundamentale
ale particularităţilor specifice ale fiziologiei şi criobiologiei spermei animalelor domestice.
Rezultatele diversităţii cercetărilor morfologice, biochimice, fizico-chimice şi funcţionale ale
spermatozoizilor în procesul crioconservării spermei de cocoş au permis cercetătorilor de a
stabili (determina) metode diferenţiale pentru elaborarea mediilor protectoare şi procedeelor
tehnologice de prelucrare ale spermei. În acelaşi timp, procedeele propuse în prezent pentru
crioconservarea spermei de cocoş sunt departe de eventualitate şi nu fac posibilă, în măsura
amplă, folosirea potenţialul genetic al păsărilor. Aceasta se confirmă prin faptul, că valorile
rezultatelor însămînţării artificiale a găinilor cu sperma congelată-decongelată variază în limite
mari, iar tehnologiile recomandate pentru congelarea şi decongelarea spermei de cocoş sunt
destul de dificile şi complicate în realizare.
Datele susmenţionate, concomitent cu succesele obţinute la elaborarea proceselor de
crioconservare a spermei de cocoş, relevă şi necesitatea continuării cercetărilor ştiinţifice
fundamentale în acest domeniu. Valoarea problemelor actuale de sporire a indicilor vitali ai
spermatozoizilor după decongelare a determinat realizarea cercetărilor prezente, direcţionate spre
aprofundarea studierii teoriei şi practicii conservării spermei de cocoş prin prisma
sanocreatologiei avansate.
În aceeaşi măsură, o deosebită importanţă provoacă cercetările direcţionate spre
perfecţionarea şi elaborarea metodelor performante de păstrare a spermei de cocoş în condiţii
hipotermale.
Astfel, sporirea continuă a eficacităţii reproducţiei animalelor domestice, în mare măsură,
este condiţionată de elaborarea mediilor sintetice înalt eficiente, procedeelor optimale de
prelucrare tehnologică şi utilizare a spermei în combinare cu folosirea reproducătorilor - donori
ai materialului seminal integru şi cu rezistenţa înaltă la influenţa factorilor biotehnologici de
conservare a celulelor reproductive ale cocoşilor.
52

2. CARACTERISTICA MATERIALULUI EXPERIMENTAL ŞI A METODELOR DE
INVESTIGAŢIE
2.1. Aspecte metodice generale.
Cercetările experimentale au fost realizate în Laboratorul Sanocreatologia sistemului
reproductiv şi Criobiologie ”V. Nauc” al Institutului de Fiziologie şi Sanocreatologie al AŞM;
Centrul de Automatizare şi Metrologie al AŞM; Laboratorul Metabolismului lipidelor al
Institutului de Biochimie al Academiei de Ştiinţe a Uzbechistanului; Laboratorul Biologia
Reproducerii păsărilor şi Întreprinderea experimentală ale Institutului de Avicultură al
Academiei Naţionale Agrare a Ucrainei; Vivariul Institutului de Fiziologie şi Sanocreatologie;
Asociaţia de cercetări şi producţie „Avicola”, Întreprinderea avicolă „Orhidea Nani” şi Vivariul
Facultăţii de Zootehnie şi Biotehnologii a UASM.
În calitate de material experimental a fost folosită sperma cocoşilor de diverse rase, inclusiv
şi rase comune. Prelevarea spermei a constat în provocarea artificială a ejaculării, fără a avea loc
actul sexual între mascul şi femelă. Sperma de cocoş a fost recoltată prin folosirea spermorezervorului
din sticlă în corespundere cu cerinţele „Instrucţiunii pentru însămînţare artificială a
păsărilor”, fără să prejudicieze sănătatea masculilor. Ejaculatele recoltate au fost apreciate prin
folosirea metodelor general acceptate pentru determinarea volumului, concentraţiei, mobilităţii
şi supravieţuirii spermatozoizilor.
Pentru reproducere artificială au fost folosite găinile raselor din colecţia de prăsilă sau care
reprezentau obiectul de producţie al unităţilor menţionate mai sus.
Cercetările au fost efectuate în majoritatea cazurilor cu respectarea identităţii condiţiilor
pentru toate păsările şi condiţii analogice pentru toate variantele martor şi experimentale. Sperma
a fost diluată cu diferite medii sintetice în corespundere cu regulile general acceptate, la diferite
temperaturi şi tehnologii de conservare în dependenţă de scopul prioritar al anumitor cercetări.
Însămînţarea artificială a găinilor cu sperma decongelată s-a petrecut o dată la trei zile (4, 5,
6 şi 7 zile). Prima şi a doua însămînţare a fost realizată cu intervalul de 24 ore. Colectarea ouălor
începea peste 24 ore după însămînţarea a doua. Rezultatul însămînţării găinilor a fost determinat
de totalizarea incubării ouălor.
2.2. Metodele de cercetare a membranelor plasmatice.
Obţinerea membranelor plasmatice ale spermatozoizilor a fost realizată conform etapelor
schemei 2.1.
Această schemă include etapele: a) divizarea; b) separarea şi c) aprecierea gradului de
purificare a membranelor.
2.2.1. Divizarea membranelor.
53

Pentru separarea membranelor plasmatice ale gameţilor a fost folosită metoda propusă de
savanţii bulgari N. Ivanov şi Y. Profirov [253] în modificarea autorilor V. Nauc, Gh. Boronciuc
[93]. Principiul metodei este predeterminat de proprietăţile mediului hipotonic, care în calitate de
dizolvant organic conţine EDTA în concentraţie de 2 mMol/l. În rezultatul acţiunii şi diferenţei
de presiune osmotică a mediului şi spermatozoizilor are loc diluarea celulelor şi desprinderea
membranelor plasmatice ale lor.
Agitarea precipitatului de spermatozoizi în soluţiile
Centrifugarea suspensiei de spermatozoizi
Precipitat Supernatant
Înlăturare Centrifugare
Precipitat Supernatant
Resuspendare în sistemă Înlăturare
Determinarea gradului de purificare a
memranelor
Depunere
Separarea membranelor
Resuspendarea membranelor
Fig. 2.1. Schema de extracţie a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor.
2.2.2. Separarea membranelor.
Pentru separarea membranelor spermatozoizilor a fost folosită sistemul polimer bifazic pe
baza dextranului cu masa moleculară 500000 D şi polietilenglicolului-6000 D; producţia firmei
Fluka, A.G.Busch (Elveţia). Componentele sistemului polimeric au fost dizolvate în 0,1Mol/l de
tampon fosfatic cu pH 6,5. Suspensia membranelor şi spermatozoizilor a fost transferată în pîlnia
gradată, unde în decurs de 12 ore s-a produs separarea membranelor la limitele devierii fazelor
lichide. Toate operaţiunile au fost realizate la temperatura 4 o C.
54
Folosirea membranelor în diferite
scopuri

Spre deosebire de metoda propusă iniţial [253], membranele au fost separate cu ajutorul
coloanei probelor cu construirea şi realizarea curbei de calibrare. Soluţia de albumină s-a
preparat prin utilizarea tris-HCl (sau EDTA la determinarea conţinutului proteinelor). Astfel de
modificare a metodei permite centrifugarea soluţiilor în eprubetele plastice. Procedura utilizată
exclude necesitatea în veselă de sticlă, sporeşte siguranţa metodei şi diminuează pierderile
conţinutului de membrane. Corecţia intensităţii colorării probelor cu evidenţa acţiunii asupra ei a
componenţilor mediului de omogenizare şi resuspendare, face posibilă sporirea exactităţii
indicilor determinaţi.
2.2.3. Aprecierea gradului de purificare a membranelor.
Gradul de purificare a membranelor plasmatice separate a fost determinat prin cercetarea
activităţii Mg +2 (Na + +K + )+ATP-azei (EC 3.6.1.3), 5 1 -nucleotidazei (EC 3.1.3.5) şi a fosfatazei
alcaline (EC 3.1.1.1.) după N.Ivanov, Y.Profirov [253]. Conform acestei metode a fost
determinată şi activitatea Mg +2 (Na + +K + )ATP-azei şi 5 1 -nuclotidazei. Mediu de incubaţie la
determinarea activităţii Mg +2 (Na + +K + )ATP-azei a inclus într-un ml: 50 mMol tris-HCl, 5 mM
MgCl2, 100 mMol NaCl, 20 mMol KCl şi 5 mMol sare de natriu al ATP cu pH 7,4. Pentru 5 1 -
nucreotidază - 50 mMol tris-HCl, 10 mMol MgCl2 şi 5 mMol sare de natriu al AMP cu pH 7,4.
Activitatea fosfatazei a fost studiată conform metodei lui Bodanschii, descrisă de A.Pocrovschii
[100]. În perioada incubării s-a folosit mediul alcalin, care conţinea β-glicerofostat.
Determinarea fosforului organic a fost realizată după Chen et al. [188] prin metoda
spectrofotometrică la lungimea de undă - 820 nm. Conform comunicării autorilor şi bazîndu-ne
pe rezultatele cercetărilor noastre metoda folosită permite de a atinge un grad de purificare a
membranelor în jur de 70%.
2.3. Metode de cercetare a proteinelor.
2.3.1. Determinarea conţinutului general de proteine în membranele plasmatice.
Determinarea cantitativă a proteinelor în membranele plasmatice separate s-a efectuat prin
folosirea metodei Lowry şi al. [292]. La baza acestei metode se află capacitatea complexului
proteinelor cu cupru de a reduce soluţia Folin, cu formarea ulterioară a produselor colorate ale
reacţiei.
Conţinutul proteinelor a fost determinat prin metoda spectrofotometrică cu folosirea
spectrofotometrului SF-26 şi SF-46 la lungimea de undă - 750 nm cu recalcularea ulterioară a
rezultatelor obţinute conform curbei de calibrare determinată anterior.
Cantitatea proteinelor membranelor plasmatice, în micrograme la 1 ml de spermă a fost
calculată conform formulei:
55

X=AxBx5, (2.1)
unde: X - cantitatea proteinelor în 1 ml de spermă;
A - valoarea densităţii optice conform diapazonului măsurărilor la SF-26 şi SF-46 în
varianta experimentală;
B - datele obţinute conform curbei de calibrare;
5 - coeficientul recalculării conţinutului proteinelor din membranele plasmatice în
micrograme la 1 ml de spermă.
2.3.2. Determinarea conţinutului aminoacizilor liberi şi legaţi.
Determinarea conţinutului AA membranelor plasmatice ale spermatozoizilor animalelor
agricole a fost realizată în Centru de Automatizare şi Metrologie al AŞM cu folosirea
aminoanalizatorului AAA-339. Aparatul a fost reglat conform parametrilor: înălţimea coloanei
de extincţie – 35 cm, temperatura de start a analizei (T1) – 45-52 o C, temperatura de finisare a
analizei (T2) – 65 o C. În calitate de material al trasabilităţii ionice a fost folosită smoala de marca
„Оstion AGWB”. Probele au fost transferate în coloana pentru schimbarea ionilor şi au fost
supuse extracţiei prin tampoane cu următoarea succesiune:
I tampon - 0,3n Na + , pH=3,50;
II tampon - 0,4n Na + , pH=4,25;
III tampon - 0,45n Na + , pH=9,45.
Hidroliza acetică a proteinelor a fost realizată cu utilizarea HCl 6n, la temperatura 110±2,0
o
C, timp de 24 ore. Hidrolizatul vaporizat s-a spălat prin tamponul de sodiu cu pH 2,0. În
aceleaşi condiţii, la determinarea AA liberi s-a folosit tamponul de litiu.
Identificarea picurilor cromatogramei a fost efectuată prin compararea lor cu cele analogice
ale standardelor AA corespunzători.
Ejaculatele recente ale spermei recoltate au fost divizate în două părţi. Una dintre ele a fost
centifugată la 10000 rot/min timp de 10 min. Plasma seminală separată a fost folosită pentru
determinarea conţinutului AA liberi şi legaţi.
În scopul determinării conţinutului AA legaţi în spermatozoizi, după centrifugarea spermei
precipitatul s-a supus resuspendării de 2 ori în soluţie fiziologică cu precipitarea ulterioară a lui.
Ulterior precipetatele au fost supuse deshidratării în decurs de 4 ore la temperatura 105 o C, în
decurs de 24 ore şi expuse în exicator, după ce s-au hidrolizat şi s-au aplicat procedurile necesare
pentru analiza cromatografică a proteinelor prin intermediul analizatorului sus-menţionat.
A doua jumătate a spermei se supune congelării în vaporii azotului lichid fără diluare cu
medii crioprotectoare. În continuare sperma se supune investigaţiilor ca şi volumul primei
jumătăţi a spermei.
56

2.3.3. Metodele de determinare a conţinutului fracţiilor proteice în plasma seminală.
Principiul metodei se bazează pe proprietăţile soluţiilor fosfatice de diferită concentraţie de
a sedimenta proteinele. Valoarea densităţii optice a soluţiilor diferitor fracţii de proteine a fost
determinată prin folosirea metodelor spectrofotometrice. În acest scop s-a utilizat
spectrofotometrul SF-26 şi SF-46. Intensitatea culoraţiilor soluţiilor s-a determinat la lungimea
de undă de 720 nm.
Pentru aceasta a fost pregătită soluţia de baza care conţine 226,8 g KHrPO4, 33,5 de NaOH
în 500 ml de soluţie preparată cu apă bidistilată. Soluţia 1. Conţine 92,6 de soluţie de bază
dizolvată cu apă distilată pînă la 100 ml. Soluţia 2. Se prepară prin adăugarea la 75 ml de soluţie
de bază a apei pînă la 100 ml. Soluţia 3. La 58,8 ml de soluţie de bază se adaugă apă pînă la 100
ml. Soluţia 4. Conţine 48,7 ml soluţie de bază dizolvată în apă distilată pînă la 100 ml.
Pentru determinarea conţinutului fracţiilor de proteine se utilizează 6 eprubete cu volumul
de 10-15 ml, care se numerotează respectiv 0, 1, 2, 3, 4, 5. În eprubeta „0” se toarnă 10 ml de apă
distilată. În eprubeta „2”, „3” şi „4” se introduce cîte 5 ml de soluţie dizolvantă (soluţiile 1-4). În
eprubeta „5” se toarnă 0,5 ml de plasmă seminală, 0,75 ml apă distilată şi 3,75 ml soluţie de
bază. Conţinutul eprubetei „5” se omogenizează bine, iar plasma din conţinutul acestei eprubete
se toarnă cîte 0,5 ml în eprubetele „1”, „2”, „3” şi „4”. În eprubeta „0” se adaugă 1,0 ml de
plasmă. Conţinutul fiecărei eprubete se agită, evutînd formarea bulelor de aer.
Peste 15 min se determină densitatea optică a soluţiilor din eprubeta „1”, „2”, „3” şi „4” cu
folosirea spectrofotometrului SF-26 şi SF-46 la lungimea de undă 720 nm. În calitate de martor
serveşte soluţia din eprubeta „0”. După determinarea densităţii optice a conţinutului eprubetelor
„1”, „2”, „3” şi „4”, se efectuează calculele respective. Din indicele densităţii optice a soluţiei
eprubetei „1” se scade acelaşi indice a eprubetei „2”. Diferenţa demonstrează densitatea optică a
albuminelor. Apoi din densitatea optică a albuminelor eprubetei „2” se scade acelaşi indice al
eprubetei „3”. Diferenţa constituie densitatea optică a α-globulinelor. Analogic din densitatea
optică a eprubetei „3” se scade densitatea optică a eprubetei „4”. Diferenţa corespunde densităţii
optice a β-globulinelor, iar densitatea optică a conţinutului eprubetei „4” este egală conţinutului
γ-globulinelor. Apoi toţi indicii diferenţei densităţii optice a eprubetelor „1”, „2”, „3” şi „4” se
adună şi suma obţinută se egalează cu 100. După aceea se calculează conţinutul fracţiilor
proteice în procente. Conţinutul fracţiilor separate se calculează în gram-procente.
2.4. Metode de cercetare a lipidelor.
2.4.1. Metoda de determinare a lipidelor generale ale membranelor plasmatice.
Extracţia lipidelor generale s-a realizat conform metodei lui Bligh, Dijer [175].
57

Principiul metodei constă în distrugerea legăturilor lipo-proteice cu folosirea dizolvantului
polar (metanolul), care contribuie la extragerea ulterioară a lipidelor cu folosirea dizolvantului
nepolar (cloroformul). În acest caz dizolvanţii polari şi nepolari se combină într-un amestec –
cloroform-metanol-apă bidistilată în coraport 1:2:0,8. După finisarea extragerii dizolvantul a fost
evaporat la evaporatorul rotator.
Conţinutul lipidelor generale în extract a fost studiat conform metodei Bragdon descrisă de
V.Scorohod şi M.Stefanic [111]. Principiul metodei constă în aptitudinea bicromatului de potasiu
(K2Cl2O7) de a se reduce la interacţiunea cu lipidele. În rezultatul reacţiei culoarea soluţiei se
modifică, ceea ce face posibilă realizarea colorimetriei acidului cromatic redus. Indicii densităţii
optice au fost determinaţi la spectrofotometru SF-26 şi SF-46 la lungimea de undă 590 nm,
concomitent cu soluţia standardă a lipidelor (1 mg de lipide la 1 ml de soluţie).
Conţinutul lipidelor generale a membranelor plasmatice recalculată la 1 ml de spermă a fost
calculat conform formulei:
L=A/Bx1000, (2.2)
unde: L - conţinutului lipidelor generale μg/ml spermă;
A - indicele densităţii optice la SF-26 şi SF-46 în varianta experimentală;
B - indicele densităţii optice la SF-26 şi SF-46 soluţia standardă;
1000-conţinutul lipidelor în soluţia standardă, μg/ml.
2.4.2. Metoda microanalitică de cercetare a lipidelor prin intermediul cromatografiei în
straturi subţiri.
Selectarea acestei metode de cercetare a fracţiilor lipidice din spermatozoizi în procesul
crioconservării spermei animalelor agricole este legată de faptul, că această metodă semnificativ
depăşeşte metoda cromatografică în coloane, după viteza divizării şi proprietăţile admisibile ale
ei. În acelaşi timp, la selectarea corectă a diluanţilor cu ajutorul cromatografiei în straturi subţiri
practic se identifică toate fracţiile de lipide, iar reactivele speciale utilizate au proprietatea de a
localiza şi identifica aceste clase de lipide.
Pentru diferenţierea lipidelor au fost folosite plăcuţe cu dimensiuni 13x18, la suprafaţa căror
s-a aplicat amestec din silicogel şi gips medical în raport 16:1. Ulterior plăcuţele au fost uscate la
temperatura camerei şi activate înainte de folosire timp de 30 min. la temperatura de 110 ºC.
Extracţia şi divizarea lipidelor s-a realizat ţinînd cont de proporţia - 30mlrd. de gameţi în
sistemul cloroform-metanol-apă. După divizarea fazelor pe parcursul a 24 de ore mostrele au fost
centrifugate la 2000 rotaţii pe minută timp de 30 min. În faza cloroformică au fost determinate
FL şi lipidele neutre, iar în faza apă şi metanol s-au determinat cerebrozidele.
58

2.4.3. Determinarea fosfolipidelor.
Mostrele din faza cloroformică au fost evaporate la evaporatorul rotativ. După care,
precipitatul a fost spălat cu acetonă pînă la culoarea străvezie a soluţiei. cu eliminarea
consecutivă a ei. Precipitatul s-a spălat cu cloroform în proporţie suficientă pentru aplicarea pe
suprafaţa plăcuţei. Conglomeratul obţinut de lipide s-a folosit pentru cromatografie, iar divizarea
lor a fost efectuată în sistemul cloroform/metanol/acid acetic/apă (65/43/1/4). Plăcuţele cu
conţinut lipidic s-au colorat în exicator în vapori de iod cristalic. Apoi cromatogramele au fost
fotografiate pe plăcuţe foto şi supuse densitometriei la densitometrul autografic NF-4.
2.4.4. Determinarea gliceridelor.
Mostrele din faza cloroformică, incluzînd spermatozoizi în proporţie de două miliarde s-au
supus evaporării. Precipitatul de lipide, la fel, a fost spălat cu cloroform în proporţie suficientă
pentru aplicarea pe suprafaţa plăcuţei. Celelalte proceduri s-au efectuat ca şi pentru FL, cu
excluderea sistemului de divizare. Divizarea lor s-a petrecut prin sistemul eter/hexan/acid acetic
în raport 20/80/1,5. Cromatogramele obţinute au fost fotografiate, supuse densitometriei şi
utilizate ca şi în metoda precedentă.
2.4.5. Determinarea cerebrozidelor.
Mostrele din faza apă-metanol, care includeau spermatozoizi în proporţie de două miliarde
au fost supuse evaporării în termostat la temperatura de 60 ºC. Precipitatul de lipide s-a spălat cu
amestec de cloroform şi metanol (1:1). În acelaşi timp, volumul amestecului a fost proporţional
cu cantitatea necesară pentru aplicare la suprafaţa plăcuţei. După uscarea plăcilor, lipidele au fost
separate prin intermediul sistemului cloroform/metanol/amoniac (80/20/0,4) cu prelucrarea
ulterioară ca şi în metodele sus menţionate.
2.4.6. Determinarea raportului proteine/lipide în membranele plasmatice.
Raportul proteine/lipide în membranele plasmatice a fost calculat prin împărţirea
conţinutului proteinelor în membranele spermatice, care se conţin într-un ml (1 ml) de spermă la
cantitatea lipidelor generale din acelaşi volum de spermă.
2.4.7. Metoda de determinare a conţinutului produşilor finali ai POL în spermatozoizi.
Determinarea concentraţiei dialdehidei malonice (DAM), ca indice a stării de stres a
obiectului de studiu, a fost efectuată după metoda lui Iu.A. Vladimirov şi A.I. Arciacov la
spectofotometru SF-26 şi SF-46 (LOMO) [55]. Determinarea concentraţiei DAM în variantele
cercetate s-a realizat prin metoda, bazată pe reacţia dintre DAM şi acidul tiobarbituric, care are
loc la temperatură înaltă şi la valoarea acidă a pH-lui, cu formarea complexului trimetin colorat
şi care conţine o moleculă de DAM şi două molecule de acid tiobarbituric. Absorbţia maximă are
loc la lungimea de undă 535 nm.
59

Metoda a fost folosită pentru determinarea proceselor de POL în sisteme izolate, cum sunt
spermatozoizii. Pentru realizarea ei s-a procedat în felul următor:
1. Amestecul, care conţine 50 ml de TRIS-HCl şi 1 ml suspensie de spermatozoizi, s-a
incubat în baia de apă (t =37 °C).
2. În timpul incubării periodic amestecul se agită.
3. Probele în volum de 1,9 ml s-au transferat în eprubete pentru centrifugare.
4. După incubare reacţia s-a blocat prin adăugarea a 0,1 ml soluţie de 100% acid
tricloracetic.
5. În fiecare eprubetă s-au adăugat cîte 2,0 ml de acid tricloracetic de 30%, acid clorhidric
0,2 ml cu concentraţia de 5 N şi 2,0 ml de acid tiobarbituric cu concentraţia de 0,75%.
6. Amestecul din eprubete s-a încălzit în baia de apă timp de 15 min.
7. Conţinutul eprubetelor s-a centrifugat.
8. Densitatea optică s-a determinat la lungimea de undă 535 nm.
Conţinutul DAM în celule este prezentat în unităţile de extincţie (u.e.).
2.4.8. Metoda de determinare a conjugatelor dienice.
Pe parcursul POL la nivelul de formare a radicalilor liberi în moleculele acizilor graşi
polinesaturaţi apare sistemul legăturilor duble conjugate, care se însoţeşte de apariţia a unui nou
maximum în spectrul de absorbţie la 233 nm. Conţinutul conjugatelor dienice au fost determinate
conform I.D. Stalinaia [114] şi a fost calculat reieşind din valorile coeficientului molar al
extincţiei, egal cu 2,2x10,5 cm -1 x M -1 .
2.4.9. Determinarea hidroperoxizilor din lipide.
Principiul metodei se determină prin aceea, că în soluţiile apoase peroxizii de hidrogen ai
lipidelor oxidează Fe +2 pînă la Fe +3 . Ultimul se determină cu ajutorul reacţiei de colorare cu
tiocianat de amoniu la o lungime de undă – 480 nm. Despre nivelul relativ a hidroperoxizilor în
spermatozoizi s-a judecat conform densităţii optice descrise de L.A. Romanova şi I.D. Stalinaia
[105].
2.5. Metode de cercetare a spermatozoizilor şi de crioconservare a spermei.
2.5.1. Metodele de determinare a indicilor fiziologici.
Metodele de apreciere a indicilor fiziologici aveau ca scop de a determina în materialul
seminal numărul de spermatozoizi într-o unitate de volum (indicele concentraţiei celulelor),
numărul spermatozoizilor vii cu mişcare rectilinie (indicele mobilităţii) şi durata timpului de
supravieţuire a lor la anumită temperatură (indicele longevităţii) [15]. Indicii studiaţi au fost
determinaţi la temperatura de 35ºC.
Volumul (ml) materialului seminal a fost determinat, imediat după recoltare, cu ajutorul
60

pipetelor gradate de 2 sau 5 ml, încălzite pînă la temperatura prevăzută de condiţiile
experienţelor sau direct în spermocolectorul gradat.
Concentraţia spermatozoizilor s-a determinat aplicînd camera Goreaev. Pentru aceasta a
fost pregătită soluţia de 3% de clorură de sodiu. Sub influenţa soluţiei hipertonice a clorurii de
sodiu spermatozoizii se imobilizează, ceea ce simplifică tehnica de numărare a lor. În cazul
determinării concentraţiei spermatozoizilor din sperma umană a fost folosit melangerul
leucocitar, iar în cazul spermei animale s-a utilizat melangerul eritrocitar. Stabilirea numărului
de spermatozoizi s-a realizat la mărirea cîmpului studiat de 200 ori. Numărarea pe diagonală s-a
efectuat în 5 pătrate mari. În pătratele mici spermatozoizii s-au numărat în formă de zigzag. S-au
luat în considerare numai spermatozoizii, al căror cap este situat în interiorul pătratului.
În cazul studierii spermei animalelor, indicele studiat s-a determinat după formula:
C=400×P×D/N×R×100000, (2.3)
unde: C – concentraţia spermatozoizilor; P – numărul celulelor evidenţiate; D – gradul de
diluare; N – numărul pătratelor mici; R – adîncimea camerei Goreaev; 400 – coeficientul folosit
la recalculare pentru suprafaţa pătratului mic.
În cazul studierii concentraţiei spermei umane se utilizează aceeaşi formulă ca şi în cazul
spermei animalelor, deosebire fiind doar că concentraţia spermatozoizilor se împarte la 1000000,
de aceea ea se exprimă în milioane/ml.
Mobilitatea. Pentru determinarea mobilităţii s-a apreciat numărul de spermatozoizi cu
mişcare rectilinie. Determinarea se efectuează vizual după scara de zece baluri. Atunci, cînd toţi
spermatozoizii posedă mişcare rectilinie, sperma se califică de zece baluri, balul acordat
depinzînd de procentul spermatozoizilor din probă care posedă mişcări rectilinii, de exemplu
90% corespunde la 9 baluri etc.
Mobilitatea (în baluri) s-a determinat cu ajutorul microscopului „Ampleval”, firma germană
Carl Zeitz (Iena) la mărimea obiectivului 200 de ori (obiectivul 20 şi ocularul 10 ori).
Mobilitatea spermatozoizilor s-a apreciat la temperatura confortogenă. Temperatura a fost reglată
cu ajutorul termomăsuţei electrice a microscopului.
Longevitatea s-a apreciat, de asemenea, la temperatura confortogenă, care a fost păstrată în
termostat special pe tot parcursul determinării acestui indice. Sperma a fost determinată ca vie în
acel caz, cînd mobilitatea ei nu era mai mică de 0,5 baluri.
Indicele absolut de supravieţuire (IAS) a fost calculat conform formulei:
IAS = Σ a×t, (2.4)
unde: a – mobilitatea spermatozoizilor; t – durata (în ore) timpului după demararea
experienţei.
61

2.5.2. Metoda de congelare a spermei de cocoş.
Congelarea a fost efectuată prin două metode. Conform primei metode sperma nativă era
refrigerată timp de 15-20 min pînă la temperatura camerei şi treptat era diluată cu mediu
protector 1:1 (glutamat de natriu – 2,87; glucoză 0,5; inozit 0,25; acetat de magneziu x 4H2O –
0,07; acetat de kaliu 0,5 şi apă pînă la 100 ml) [365] fără crioprotector, apoi a fost expusă în
frigider la o temperatură de +4 ºC. După 30-40 min sperma s-a diluat cu acelaşi mediu în raport
de 1/2, conţinînd 21% de DMF [116]. După 15-20 min de la administararea crioprotectorului
sperma diluată a fost ambalată în paiete cu volumul de 0,25 ml şi congelată. În calitate de
frigider pentru îndeplinirea procedurilor preventive ale spermei pentru congelare a fost folosită
camera frigorifică MK-25, ceea ce a permis de a menţine condiţii stabile de temperatură.
Crioconservarea spermei s-a efectuat cu ajutorul congelatorului programat pentru
bioobiecte. Menţinerea temperaturii s-a realizat prin intermediul termoreglatorului conectat la
instalaţia de autografiat H-306. Parametrii evidenţiaţi ai regimului de răcire au fost timpul de
platocristalizare a probei (t tp.) şi viteza de congelare (ºC/min.). Concomitent, s-au respectat
regimele din cameră: de la +4 pînă la -6 ºC – 3 ºC/min., de la -6 pînă la -19 ºC - -40 ºC/min, de la
-19 pînă la -80 ºC – -70 ºC/min, şi mai apoi au fost scufundate în azot lichid; regimul de
modelare – 3 ºC/min pînă la -3 ºC, t – platocristalizaţiei = 0,5 1 , 45 ºC/min pînă la -19 ºC şi 100
ºC/min pînă la -80 ºC.
Decongelarea spermei congelate s-a efectuat pe baiea de apă la temperatura de +40 ºC.
Conform metodei nr. 2 sperma nativă fără diluarea ei cu medii crioprotectoare a fost
congelată în vaporii azotului lichid. Sperma a fost decongelată pe baia cu apă la temperatura de
+40 ºC, nemijlocit pînă la folosirea ei pentru analizele ulterioare.
2.5.3. Determinarea calităţii spermei decongelate de cocoş.
Indici, care au fost evidenţiaţi sunt mobilitatea spermatozoizilor (în baluri, după scara de
zece puncte), numărul spermatozoizilor cu membrane şi acrozome integre (în procente).
Mobilitatea spermatozoizilor a fost apreciată sub microscop (x450) în picătură pe masa
termică la temperatura 36 ºC.
Determinarea numărului spermatozoizilor cu membranele integre şi deteriorate s-a realizat
conform metodei Halangk, Bohnensak [238], modificată pentru analiza spermei de cocoş la
fluorimetru [116], cu folosirea în experienţă a fluorohromei etidium bromidă.
Pentru determinarea spermatozoizilor cu acrozomele integre şi deteriorate a fost folosită
colorarea spermatozoizilor vii cu colorantul fluoriscent - tiazinul roşu.
Pentru analiză s-au utilizat mediile, prevăzute pentru diluarea spermei, care au fost
suplimentate cu fluorocromele - etadionbromida şi tiozinul roşu în concentraţie, respectiv, 10 −6
62

Mol şi 5x10 −4 - 5x10 −5 Mol. Sperma de cocoş s-a diluat cu mediul, care conţinea fluorocromi în
raport de 1/5. O picătură mică de spermă (1 μl), amestecată cu coloranţi, a fost aplicată pe
suprafaţa lamei şi acoperită cu lamela în scopul obţinerii stratului subţire dintre lamele,
aproximativ de 0,5-1,0 mkl., pentru a limita mobilitatea spermatozoizilor şi ameliorarea
condiţiilor de vizualizare. Examinarea s-a realizat la microscopul luminiscent ML-3 în lumina
reflectă sub imersie la mărirea 1350. Pentru provocarea luminiscenţei s-a utilizat lumina filtrului
CC cu maximumul de transmisie de 400 nm. În calitate de „filtru de blocare” a fost folosit filtru
de lumină JS-18.
2.5.4. Determinarea rezistenţei spermatozoizilor la şocul termic.
Metoda de determinare a rezistenţei la şocul termic este bazată pe supravieţuirea
spermatozoizilor după răcirea rapidă a lor de la temperatura camerei pînă la 1-3 ºC.
Două picături de spermă nediluată, expusă la temperatura camerei în decurs de 20 min cu
pipeta se introduc într-o eprubetă cu conţinut de 6% soluţie de glucoză, preventiv răcită pînă la
2±1 ºC. În altă eprubetă cu aceeaşi soluţie, încălzită pînă la 37-40ºC, se introduc două picături de
spermă nediluată. Ambele eprubete se păstrează în decurs de 5 min la temperaturile menţionate
şi se examinează microscopic mobilitatea spermatozoizilor în baluri după metoda acceptată. Prin
urmare, devierea rezultatelor obţinute dintre două determinări paralele nu trebuie să depăşească
mai mult de 10%.
Calitatea spermei se determină după coeficientul de rezistenţă a spermatozoizilor la şocul
termic (K), care se calculează după formula:
a
a
1
K = , (2.5)
2
unde: a 1 – mobilitatea spermatozoizilor peste 5 min după introducerea spermei în soluţia de 6%
de glucoză la temperatura de 2±1 ºC, în baluri;
a2 - mobilitatea spermatozoizilor peste 5 min după introducerea spermei în soluţia de 6% de
glucoză la temperatura de 37-40 ºC, în baluri.
2.5.5. Determinarea rezistenţei osmotice a spermatozoizilor.
Determinarea rezistenţei osmotice (Ro) se bazează pe stabilitatea spermatozoizilor în
condiţiile soluţiei hipotonice de clorură de sodiu. Rezistenţa osmotică a spermatozoizilor se
determină în sperma nativă, diluată, păstrată la temperaturile pozitive sau congelată-decongelată
pentru aprecierea proprietăţilor biologice ale ei sau proprietăţilor protectoare ale mediilor
sintetice. La determinarea Ro a spermatozoizilor se respectă regulile de prevenire a şocului
termic.
63

Pentru determinarea rezistenţei termice se pregătesc 9 eprubete cu cîte 1 ml soluţie de
clorură de sodiu cu diferită concentraţie: 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,5 şi 0,6%. Toate
eprubetele se termostatează la 30-37 o C, timp de 10-15 min. În fiecare eprubetă se adaugă
spermă în proporţia în care să fie diluată 1:100 (:200) ori. Eprubetele cu sperma diluată se
păstrează la temperatura 18-22 o C timp de 3 ore. După ce se determină mobilitatea
spermatozoizilor în picătura strivită cu folosirea microscopului cu contrast de fază.
Prin Ro se marchează valoarea concentraţiei de NaCl a acelei eprubete, unde spermatozoizii
au păstrat mobilitatea nu mai puţin de 0,5 baluri. Cu cît concentraţia soluţiei este mai mică, cu
atît este mai mare rezistenţa osmotică. Ultima maximal poate atinge 0,6. La moartea
spermatozoizilor în soluţia 0,6 - Ro= 0.
La determinarea calităţii spermei prin Ro se recomandă utilizarea coeficientului de rezistenţă
(Rk), care se calculează conform formulei:
R
k
0,
1
= , (2.6)
R
o
unde: 0,1 – coeficientul constant;
R o – rezistenţa osmotică.
Maxima valoare a Rk=1.
2.5.6. Metoda de colorare a spermatozoizilor.
Pe marginea lamei microscopice curate, prelucrată cu un amestec de alcool şi eter se aplică
o picătură de spermă. Către ea se aduce marginea sticluţei protectoare, pe muchia căreia se
răspîndeşte picătura. După aceasta printr-o mişcare rapidă sticluţa protectoare este împinsă de la
unghiul lamei microscopice sub un unghi de circa 45º, opus direcţiei de mişcare pentru a nu
distruge spermatozoizii. Frotiul trebuie să fie atît de subţire ca să se usuce timp de 1-2 min.
Frotiul uscat se fixează în alcool de 96%. Se colorează cu soluţie apoasă de 5% eozină. Astfel de
prelucrare a probelor de material permite de a îmbunătăţi contrastul imaginii şi de a o studia.
2.5.7. Analiza şi clasificarea formelor patologice ale spermatozoizilor în ejaculat.
Prezenţa formelor patologice de spermatozoizi în spermă denotă despre scăderea activităţii
funcţionale a lor şi determină importanţa practică a acestui indice. El poate fi apreciat cu ajutorul
microscopului luminiscent. Estimarea formelor patologice în spermă constă în determinarea
numărului de spermatozoizi cu aspect anormal în rezultatul examenului morfologic al lor.
Valoarea acestui indice a fost studiată prin metoda microscopiei luminiscente. Pentru
determinarea procentului de forme patologice ale spermatozoizilor s-a utilizat microscopul
(x400-600 mărire). Pentru calcularea formelor anormale, pe un frotiu, au fost analizate cel puţin
64

cîte 300-500 de spermatozoizi. Această procedură a fost repetată de opt ori, după ce s-a calculat
valoarea medie. Procentul formelor patologice a fost determinat după formula:
n⋅100
x = ,
N
(2.7)
unde: n – numărul spermatozoizilor patologici;
N – numărul total de spermatozoizi constanţi.
Claritatea viziunii a fost obţinută prin folosirea coloranţilor sau a invertorului special, după
caz, care este componentă a complexului microscopului (adaptorului fazocontrast, condensorul
cu cîmp întunecat).
Formele anormale ale spermatozoizilor au fost determinate conform metodei descrise [19].
Pe baza raportului spermiilor normali şi anormali s-a calculat indicele-B teratologic (B).
În cercetările efectuate formele patologice ale spermatozoizilor au fost divizate în două
grupuri:
I – formele patologice primare, care se formează în procesul spermatogenezei. La ele se
referă spermatozoizii cu capul deformat (cu cap îngust, alungit, pariform ş.a.) şi dimensiuni
modificate (mici, mari);
II - formele patologice secundare, care se formează în căile sexuale. La ele aparţin
spermatozoizii, cărora le lipsesc unele componente structurale (lipsa capului, cozii, deteriorarea
capului şi cozii), precum şi spermatozoizi încovoiaţi în regiunea cozii, gîtului, spermatozoizi
monştri cu două cozi, două capuri şi gameţi imaturi.
2.5.8. Metoda de cercetare a aparatului acrozomal.
Schimbările morfologice ale aparatului acrozomal al spermatozoizilor au fost studiate prin
microscopia luminiscentă, utilizînd microscopul MBI-11 şi adaptorul fazocontrast FK-4.
Microscopia a fost realizată sub imersie la mărirea de 1500 ori. Studierea schimbărilor
morfologice ale acrozomilor a fost efectuată după fixarea gameţilor prin diluarea spermei în
soluţie de 1% de fluorid de sodiu. O astfel de fixare permite de a obţine o deplină imobilizare a
spermatozoizilor în condiţiile păstrării structurilor lor submicroscopice.
Starea morfologică a acrozomului spermatozoizilor a fost studiată în dependenţă de regimul
de decongelare a spermei.
În fiecare mostră au fost număraţi cîte 300-500 de spermatozoizi şi, în dependenţă de starea
morfologică a acrozomului celulele, au fost împărţite în două categorii:
1. spermatozoizi cu acrozomul integru, cînd marginea apicală este normală şi bine se
vizualizează;
65

2. spermatozoizi cu acrozomul distrus, structura căruia este granulată, tumefiată, deformată
s-au lipseşte.
2.6. Micrometoda de determinare a fosforului după Vasilicovschii.
Metoda de determinare a fosforului este bazată pe proprietăţile amoniului de molibden
acidic de a forma în mediul acid cu fosfatul neorganic a complexului fosformolibdenic, care
după reducere formează produse colorate în albastru (albastru de molibden). Intensitatea
coloraţiei obţinute este proporţională cu conţinutul de fosfor în obiectul cercetat.
După evaporarea din mostra a soluţiei cloroform-metanol la substanţa uscată s-a adăugat
0,2 ml 72% HClO4 şi eprubetele au fost încălzite timp de 20 min în blocul de aluminiu la
temperatură de 180-200 ºC (pînă la decolorare). După răcire în eprubete s-a introdus cîte 4,8 ml
de soluţie nr. 1. Soluţia nr. 1 s-a preparat prin amestecul a 48 ml de soluţie 1N de H2SO4 cu 4 ml
de reactiv iniţial şi volumul amestecului a fost suplinit cu apă bidistilată pînă la 100 ml. Pentru
pregătirea reactivului iniţial s-au diluat 400 mg de hidrozină acido-clorică în 14 ml de soluţie 4N
HCl. Soluţia obţinută a fost amestecată cu soluţia 10 g (NH4)2Mo2O7 în 60 ml soluţie 4N HCl.
Conglomeratul obţinut s-a supus încălzirii timp de 20 min în baia ferbîndă cu apă, după ce s-a
răcit şi s-a adăugat 14 ml de H2SO4 concentrat cu majorarea consecutivă a volumului pînă la 100
ml. Ulterior eprubetele au fost supuse prelucrării termice în baia de apă la fierbere timp de 15
min. După răcirea eprubetelor cu apă curgătore din reţeaua de apeduct conţinutul eprubetelor a
fost supus calorimetriei la spectrofotometrul SF-26 şi SF-46 cu o lungime de undă 820 nm.
Conţinutul fosforului a fost determinat conform curbei de calibrare în Laboratorul
metabolismului lipidelor al Institutului de Biochimie al Academiei de Ştiinţe din Uzbechistan.
2.7. Determinarea conţinutului ionilor prin metoda fotometriei în flacără.
Fotometria în flacără (Flamfotometria) este varianta analizei spectrale de emisie (11).
Această metodă este o variantă simplificată a spectroscopiei de emisie în care sursa de excitare
este o flacără. Spectrul de emisie al unui atom se obţine prin excitarea termică a acestuia, după
aducerea în prealabil în stare de vapori, deci prin aducerea probei la o temperatură suficient de
ridicată încît moleculele acesteia să disocieze în atomi, care emit apoi spectre caracteristice.
Spectrele atomice ale elementelor sunt determinate de electronii de valenţă, fiind una dintre
proprietăţile periodice. Cu ajutorul unui pulverizator pneumatic soluţia analizată este adusă în
arzătorul alimentat cu aer, unde arde cu o flacără - gaz combustibil natural. Radiaţia emisă, mai
exact spectrul emis, este monocromat cu ajutorul filtrului sau monocromatorului, care selectează
lungimea de undă dorită. Curentul fotoelectric ce ia naştere în fotomultiplicator este amplificat
de un amplificator şi înregistrat. Determinarea conţinutului cantitativ al Na + , K + , Li + şi Ca ++ în
soluţie a fost realizată cu folosirea fotometrului în flacără FPL-2.
66

Proporţionalitatea directă dintre intensitatea liniilor spectrale şi concentraţia soluţiei
analizate se observă numai la anumite concentraţii: pentru Na + şi K + limita minimală este 0,5
mg/l, pentru Ca 2+ - 0,5 mg/l. Limita maximală pentru toate elementele constituie – 100 mg/l.
Pentru separarea liniilor spectrale ale elementului studiat se folosesc filtre de lumină
interferenţiale cu următoarea lungime a undelor: pentru măsurarea emisiei a natriului, potasiului,
litiului şi calciului, corespunzător, 589,0; 766,5; 670,8 şi 422,5 nm.
2.8. Metoda folosirii preparatelor coordinative pentru menţinerea şi fortificarea
spermatogenezei la cocoş.
Preparatele coordinative au fost cu amabilitate oferite de către catedra chimia anorganică a
USM. Condiţiile de întreţinere şi hrana a cocoşilor implicaţi în experiment au corespuns
cerinţelor zoo- şi sanitare veterinare. Cocoşii au fost selectaţi conform principiului de analogie şi
divizaţi în patru grupe, dintre care o grupă martor şi trei grupe experimentale.
Compusele coordinative s-a administrat cocoşilor în formă lichidă per os cîte 1 ml zilnic
timp de 35 zile. Calitatea spermei a fost apreciată conform indicilor fiziologici (volumul
ejaculatului, longivitatea, concentraţia şi mobilitatea spermatozoizilor).
În grupa martor s-a administrat zilnic, după schema descrisă, cîte 1 ml de soluţie fiziologică.
La cocoşii din grupa experimentală 1 preparatul LAZ – Zn(CCl3COO)24H2O.
La cocoşii din grupa experimentală 2 s-a administrat în acelaşi volum preparatul TAS –
Zn(HSeO3)24H2O.
La cocoşii din grupa experimentală 3 a fost administrat în aceiaşi cantitate preparatul
combinat LAZ - (Zn(CCl3COO)24H2O) + TAS - (Zn(HSeO3)24H2O).
2.9. Metoda de efectuare a experienţelor ştiinţifico-practice de însămînţare a găinilor.
Pentru determinarea valorii biologice a spermei de cocoş au fost efectuate experienţe
ştiinţifico-practice de însămînţare a găinelor cu spermă congelată-decongelată la Întreprinderea
experimentală a Institutului de Avicultură al Academiei Naţionale Agrare a Ucrainei, Vivariul
Institutului de Fiziologie şi Sanocreatologie; Asociaţia de cercetări şi producţie „Avicola” şi
Întreprinderea avicolă „Orhidea Nani”. Prelucrarea tehnologică a spermei a fost utilizată
conform metodei prezentate mai sus. Cercetările au fost efectuate cu folosirea găinilor din rasele
colecţionate de prăsilă sau care reprezentau obiectul de producţie al unităţilor menţionate.
Însămînţarea artificială a găinilor cu folosirea spermei diluate, conservate şi decongelate s-a
produs în oviduct la profunzimea de 2-3 cm. Primele două însămînţări s-au efectuat cu un
interval de 24 ore, ulterior odată la 3 zile. Doza de însămînţare a constituit de la 0,02-0,03 ml
pînă la 0,11-0,12 ml de spermă. Colectarea ouălor s-a început peste o zi după a doua însămînţare.
67

Eficacitatea însemînţării artificiale a găinilor s-a evaluat conform rezultatelor incubării
ouălor – fertilităţii ouălor, eclozionării ouălor şi obţinerea puilor.
2.10. Prelucrarea statistică a materialului cifrologic.
Prelucrarea biometrică a datelor obţinute s-a efectuat în conformitate cu metodologia
general acceptată după E.K. Mercureva (1964) şi E.A Novicov [96].
La prelucrarea statistică a materialului cifrologic o atenţie deosebită s-a acordat determinării
veridicităţii diferenţei dintre valorile comparative, care s-a realizat după schema următoare:
1. Crearea unei serii de variaţii, care reprezintă totalitatea cifrelor rezultate din calculul
anumitor valori;
2. Aranjarea succesivă – repartizarea cifrelor variabile în ordine descrescîndă sau crescîndă;
3. Selecţionarea variaţiilor – numărul variaţiilor, care include numai parţial de secţiuni ale
tuturor posibilelor variante (x1, x2, x3, ... xn) din seria de variaţii (cu excluderea celor mari
şi celor mai complicate variante);
4. Determinarea indicilor de volum ai seriei – numărul variantelor în serie. Numărul în
seriile comparate trebuie să fie identic;
5. Determinarea mediei aritmetice (M), care reprezintă suma algebrică a tuturor cifrelor ale
seriei, împărţită la volumul seriei (n):
v1
+ v2
+ v3
+ ... vn
M = . (2.8)
n
6. Determinarea mediei patratelor abaterilor valorilor fată de media lor aritmetică (σ) –
variaţia variantelor în jurul valorilor medii:
=
2
( − )
−1
∑ σ
V M
.
n
(2.9)
7. Determinarea erorii medii aritmetice:
m =
σ
.
n −1
(2.10)
8. Determinarea criteriului de veridicitate(t):
t
M
− M
1 2
= . (2.11)
2 2
m1
+ m2
9. Determinarea gradului de împrăştiere a valorilor (f):
f = n + n − 2 . (2.12)
1
2
68

10. În tabelul Student pentru gradul de împrăştiere determinat f = n + n − 2 şi nivelul
selectat de probabilitate P se găseşte valoarea t corespunzătoare şi se compară cu cea
calculată.
11. Dacă tcalc. > ttabl., atunci diferenţa constatată dintre valorile comparate se consideră
autentică cu nivelul de veridicitate selectat sau nu mai mic decît 0,95. Şi invers, dacă tcalc.
< ttabl., atunci diferenţa constatată dintre valorile comparate se consideră neautentică cu
nivelul de veridicitate selectat. În acest caz este posibil de confirmat, că valorile
comparate 1 2 V
V ≈ , iar diferenţa cifrică formală este condiţionată de variaţiile statistice
ale parametrilor rezultatelor de măsurare.
12. Concluziile principale în lucrare sunt bazate pe diferenţele statistic autentice între loturile
martor şi experimental. Rezultatele sunt exprimate ca medie±eroare standard. Pragul de
semnificaţie prezentat: P

3. SPECIFICUL MODIFICĂRILOR MORFO-FUNCŢIONALE ŞI BIOCHIMICE
ALE MATERIALULUI SEMINAL DE COCOŞ LA CRIOCONSERVARE
3.1. Starea morfo-funcţională a spermatozoizilor de cocoş la crioconservare.
3.1.1. Transformări morfologice şi funcţionale ale spermatozoizilor de cocoş şi acţiunea
temperaturii şi pH-lui asupra rezistenţei spermei la crioconservare.
Actualitatea studierii stării morfo-funcţionale a sistemului reproductiv şi spermatogenezei
este determinată de faptul diminuării inopinate a spermogramei. Acest proces, conform
relatărilor academicianului T. Furdui [122, 123], denotă despre fenomenul degradării biologice a
organismului, în general, şi nu în ultimul rînd, a sistemului reproductiv. Astfel de degradări
rămîn neclarificate definitiv şi pot fi determinate de o diversitate de factori, care separat sau în
combinaţii influenţează negativ spermatogeneza nu numai la intensitate excesivă, dar şi la
expoziţia de lungă durată a lor [128]. În acelaşi timp, nu este definitiv cercetat gradul de
influienţa a diferitor factori naturali şi artificiali asupra statusului morfo-funcţional al organelor
vitale. Factorii influienţează nederijat, stihiinic starea organismului şi, în rezultat, nu se asigură
un nivel corespuntător pentru garantarea realizării potenţialului genetic al organismului în
ansamblu [136] şi, în particular, pentru menţinerea adecvată a proprietăţilor fecundative ale
materialului spermatic.
În calitate de unitate biologică, capabilă de a demonstra proprietăţi vitale este
spermatozoidul. Vivacitatea lui, în mare măsură, este detrminată de structura, proprietăţile fizico-
chimice şi starea funcţională a membranelor biologice. Majoritatea celulelor posedă structură
membranară dezvoltată. Această structură include membrana plasmatică şi un set destul de
complicat al membranelor intracelulare [5, 32].
Modificările compensatoare în spermatozoizi sunt direcţionate asupra menţinerii structurii
lichid-cristalice a lipidelor şi a bistratului lipidic, proprietăţilor de barieră şi permeabilităţii
membranelor [42, 57]. Stereotipicitatea reacţiilor biochimice adaptive, la nivel structural, este,
probabil, una dintre posibilităţile principale ale evoluţiei obiectelor vii, care determină lipsa
modificărilor calitative ale reacţiilor bioobiectului la influenţa factorilor externi, inclusiv a celor
principali, care provoacă degradarea precoce a organismului [10,173]. Volumul şi caracterul
interconexiunii dintre indicii coordonaţi pot fi diferite, atăt în dependenţă de natura şi intensitatea
factorului extern, cît şi de starea fizico-chimică iniţială a sistemelor biologice [362]. Aceasta
determină diferenţierea cantitativă şi calitativă, care se observă, nu numai la diferite etape ale
congelării, dar şi în dependenţă de iniţierea influenţei factorului termoosmotic [164, 378].
În contextul celor expuse, în prezentele cercetări atenţia principală a fost direcţionată spre
studierea membranelor plasmatice, component al fiecărui spermatozoid şi, în primul rînd, a
70

sistemului acrozomal al lui, precum şi a dereglărilor morfologice, termo- şi osmorezistenţei
spermiilor, influenţei pH-lui asupra indicilor funcţionali ai spermei şi modificărilor componenţei
chimice a membranelor plasmatice ale gameţilor de cocoş.
În morfologia spermatozoizilor cele mai sensibile structuri sunt membranele acrozomale, la
modificarea cărora, accelerat se reface structura şi componenţa lor [50].
Numărul acrozomilor intacţi la spermatozoizii de cocoş variază şi valoarea acestui indice
este independentă de anotimp, ceea ce poate fi explicat prin stabilitatea iriditară a cromatinei
împachetate în histoni [170, 210].
La diluarea spermei cu mediile sintetice, deseori apar efecte nedorite, de la aglutinarea
spermatozoizilor pînă la iniţierea prematură a reacţiei acrozomale. Se presupune, că producerea
acestor fenomene este cauzată de diminuarea concentraţiei proteinelor cationice cu sarcină
pozitivă în plasma seminală, care absorbindu-se pe suprafaţa negativă a membranelor
citoplasmatice manifestă o funcţie protectoare [141].
Avînd în vedere proprietăţile şi fenomenele menţionate în cercetările iniţiale paralele am
studiat starea morfologică a acrozomului la diferite etape ale crioconservării spermei de cocoş.
Rezultatele experimentale sunt prezentate în tabelul 3.1.
Tabelul 3.1. Modificarea acrozomului spermatozoizilor de cocoş în procesul crioconservării, %
Nr.
crt.
Specia
animalului Diluare
Acrozomi normali, %, după
Refrigerare
Congelaredecongelare
1. Cocoş 75,1 ± 3,06 72,6 ± 3,16 16,2 ± 2,60*
2. Taur 76,4 ± 2,19 69,0 ± 1,36* 53,6 ± 1,92*
3. Berbec 76,4 ± 2,72 57,0 ± 0,71* 46,4 ± 1,59*
4. Vier 73,4 ± 1,50 62,4 ± 1,00* 19,3 ± 1,90*
Notă: *Statistic autentică este diferenţa în comparaţie cu sperma diluată.
Rezultatele obţinute ale cercetărilor comparative demonstrează, că în sperma diluată se
conţin deja aproximativ 25% de spermatozoizi cu membranele acrozomale deteriorate. Procesul
de refrigerare la etapă iniţială nu influenţează esenţial asupra stării morfologice a acrozomului,
iar refrigerarea, congelarea şi decongelarea materialului seminal de cocoş provoacă deteriorarea
semnificativă a acrozomului.
Conţinutul acrozomilor integri ai spermatozoizilor scade cu 58,9% şi constitue numai
16,2±2,60% după congelarea-decongelarea spermei (P

Modificările înregistrate pot fi explicate prin faptul, că procesul de crioconservare reprezintă
un factor nefavorabil de risc pentru structura acrozomală, influenţa cărui se evidenţiază
considerabil după decongelarea spermei şi care diminuează aportul acrozomului în evenimentul
iniţial de fertilizare [280]. La acestă etapă producerea modificărilor poate fi predeterminată de
procesele cristalizării şi recristalizării substanţelor aflate în stare lichidă, pentru care sunt
caracteristice limitele temperaturilor la decongelare între 60-100 o C [64]. Acest fenomen poate fi
lămurit de pe poziţia cristalizării clasterice, deoarece limitele de temperatură şi concentraţii
studiate sunt caracteristice pentru microfazele lichide în bioobiectele crioconservate la momentul
producerii în ele a nano-cristalelor [64]. Procentul mic de acrozomi normali ai spermatozoizilor
de cocoş, în comparaţie cu cel al altor specii de animale poate fi deteminat de specificul
biochimic al spermei şi de suprafaţa acrozomului, care este comparativ mare la cocoş [280, 323].
În aceste condiţii acrozomul serveşte ca ţintă şi poate fi, comparativ, mai deteriorat de atacul
factorilor nefavorabili.
Astfel, în procesul crioconservării cea mai vulnerabilă etapă este congelarea-decongelarea
spermei de cocoş, în care se produc majoritatea proceselor deterioratoare şi în care mediile
crioprotectoare posedă proprietăţi protectoare scăzute faţă de structurile acrozomale.
În scopul studierii comparative a fost supusă cercetărilor şi mobilitatea spermatozoizilor ale
speciilor menţionate în tabelul 3.1. Rezultatele experienţei se prezintă în tabelul 3.2.
Tabelul 3.2. Acţiunea etapelor tehnologice de crioconservare asupra mobilitatăţii
spermatozoizilor
Nr.
crt.
Specia
animalului
Mobilitatea spermatozoizilor, baluri, după:
Congelare-
Diluare Refrigerare
decongelare
1. Cocoş 8,7 ± 0,21* 8,3 ± 0,20* 4,8 ± 0,20*,**
2. Taur 8,5 ± 0,01 8,0 ± 0,03 4,9 ± 0,11**
3. Berbec 7,9 ± 0,22 6,7 ± 0,21 3,4 ± 0,34**
4. Vier 7,9 ± 0,14 7,1 ± 0,13 3,4 ± 0,24**
Notă: *Diferenţile sunt statistic autentice în comparaţie cu sperma de berbec şi vier.
**Modificările criogenice sunt statistic veridice.
Datele tabelului 3.2 denotă, că mobilitatea spermatozoizilor în procesul de crioconservare
suportă schimbări criogenice. În particular, mobilitatea spermatozoizilor de cocoş scade
considerabil de la 8,7±0,21 pînă la 4,8±0,20 baluri (P

La soluţionarea problemelor fiziologiei reproducerii animalelor o importanţă deosebită are
reducerea şi evitarea formele patologice ale spermatozoizilor, condiţionate de dereglările
structurilor morfologice ale lor. În multiple ceretări realizate în ţară şi peste hotare s-a
demonstrat existenţa anomaliilor morfologice primare şi secundare [8, 22, 106, 147]. Cele
primare sunt determinate de tulburarea spermiogenezei, avînd o localizare în tubii seminiferi,
pînă la ajungerea în epididim şi constau în alterarea morfologică şi structurală a capului
spermului. Anomaliile secundare se produc în epididim, datorită stagnării prelungite la acest
nivel sau sunt efecte ale acţiunii unor factori termici (şocul termic), chimici (şocul osmotic), sau
mecanici în timpul ejaculării şi manipulării spermei, adică după ce ei capătă o valoare
funcţională deplină. Numai spermatozoizii integral funcţionali, notaţi, cu cel puţin 6-8 baluri la
diferite specii de animale, pot fi admişi pentru crioconservare [58, 95], în rezultatul cărei se pot
produce anumite modificări în structurile morfologice ale spermilor. În acelaşi timp, indicii
morfologici ai materialului seminal pot servi ca criteriu esenţial al stării funcţionale a spermei,
iar intensitatea fecundităţii ovulelor se află în corelaţie directă cu raportul spermatozoizilor
normali şi patologici [50].
Aceste rezultate abordează întrebări cu privire la caracteristicile specifice ale biologiei
spermei de cocoş, care se consideră esenţiale în tratamentul materialului seminal, iar fecunditatea
ovulelor se află în corelaţie directă cu raportul de spermatozoizi normali şi patologici.
În contextul celor expuse şi reieşind din importanţa practică a acestui parametru,
următoarele experienţe au fost – de determinare a conţinutului spermatozoizilor patologici în
materialul seminal nativ de cocoş şi la etapele crioconservării lui. Rezultatele experienţilor
efectuate sunt prezentate în tabelul 3.3.
Tabelul 3.3. Anomalii ale spermatozoizilor de cocoş la etapele crioconservării spermei
Nr.
crt.
Etapa
tehnologică
Numărul
spermiilor
examinaţi
Starea spermatozoizilor
Forme Forme
patologice, integre,
numărul numărul
Spermatozoizi
patologici,
%
1. Sperma nativă 300 52 248 17,3 ± 2,18
2. Sperma diluată 300 56 244 18,7 ± 2,25
3. Sperma refrigerată 300 57 243 19,0 ± 2,26
4.
Sperma congelatădecongelată
300 72 228 24,0 ± 2,27*
Notă: *Statistic sunt veridice schimbările criogenice.
Datele tabelului 3.3 denotă, că prezenţa celulelor patologice în sperma nativă de cocoş
constituie 17,3±2,18%, iar procesele de crioconservare condiţionează sporirea treptată a indicilor
73

examinaţi la toate etapele tehnologice de la 18,7±2,25% pînă la 24,0±2,27%. Aceste schimbări
sunt statistic veridice numai la etapele decongelării (P

4,7±1,22%, comparativ cu anomaliile de categoria I – 8,0±1,57%. În rezultatul congelăriidecongelării
numărul patologiilor sporeşte cu 8,5% şi, practic, s-a dublat valoarea indicelui-B
teratologic al spermei, de la 0,14 pînă la 0,26 u.c.
Gametopatiile în procesul crioconservări sunt determinate de modificarile şi deteriorările
morfologice ale spermatozoizilor. Un impact decisiv al acestor fenomene au gametopatiile de
categoria II şi, anume, flagele răsucite şi deteriorate. Aceasta demonstrează că morfologia
flagelului este mai labilă decît cea a capului [23].
Astfel, în sperma nativă de cocoş au fost constatate, în proporţii variabile, diverse anomalii
ale spermiilor. Dintre ele au fost preponderente gametopatiile de categoria I. Congelareadecongelarea
spermei provoacă sporirea autentică a gametopatiilor de categoria II. Aceste
anomalii ale spermiilor sunt direct proporţionale cu starea funcţională a spermatozoizilor.
Paralel cu estimarea formelor patologice ale spermatozoizilor de cocoş în procesul de
crioconservare a fost studiată rezistenţa spermei la şocul termic prin răcire pînă la temperaturi
negative avansate şi la şocul osmotic prin modificări fizico-chimice.
Crioconservarea este o metoda nonfiziologică, care implica un nivel ridicat de adaptare a
celulelor biologice la şocurile osmotice şi termice la congelare şi decongelare [164], şi care,
concomitent, declanşează modificări esenţiale, care defavorizează calitatea spermei. S-a
demonstrat, că rezistenţa spermei la şocul termic este egală cu rezistenţa la congelare [107].
Spermatozoizii de păsăre sunt celulele, care conţin foarte puţină citoplasmă şi, în mod
proporţional, o suprafaţă foarte mare de membranele plasmatice [212, 273]. De asemenea,
spermatozoizii conţin un număr variabil de mitocondrii (20-60), iar nucleul lor este constituit din
cromatină foarte condensată.
Există mai multe teorii şi ipoteze referitor la producerea şocului termic, însă, nici una nu
elucidează complet mecanismul apariţiei acestuia. Se consideră, că un rol important în acest sens
îl au procesele de osmoză şi difuzie din spermă. Cu cît aceste procese decurg mai lent, cu atît
manifestările şocului sunt mai atenuate.
Conform cercetărilor proprii şi analizei factorilor, care provoacă deteriorarea celulelor, s-a
elaborat un concept nou, conform căruia modelarea teoretică a mecanismului şocului termic este
completată cu acţiunea forţelor deterioratoare a bombardării rezonante a undelor hidrodinamice,
care apar în rezultatul schimbării bruşte a vitezei mişcării apei în spaţiul limitat al celulei şi cu
modificarea bruscă a tensiunii membranei citoplasmatice pînă la nivele critice cu pierderea
elasticităţii sale [98].
Unul dintre principalii factori, care deteriorează obiectele biologice în procesul
crioconservării este şocul osmotic [262], iar valoarea gradientului osmotic este direct
75

proporţională cu sensibilitatea spermatozoizilor la şocul termic [98]. Conform ipotezelor de
criodeteriorare, acest fenomen poate fi provocat de modificări fizico-chimice, dintre care este şi
osmolaritatea. Concomitent, în perioada crioconservării, spermatozoizii de cocoş sunt supuşi
influenţei factorilor hipoosmotici [171, 182, 298]. În acelaşi timp, nu se ia în consideraţie
specificaţiile agentului hipertonic şi, de aceea, prioritate în procesele de destrugere a celulei la
congelare-decongelare îi reveine presiunii osmotice. Prin urmare, în scopul selecţiei ejaculatelor
complete, necesare pentru experienţe am studiat rezistenţa termică şi osmotică a
spermatozoizilor de cocoş în cercetările ulterioare.
Experimentarea cu sperma de cocoş a permis de a stabili criorezistenţa ei. S-a dovedit, că
acest indice este egal cu 0,87±0,123. Rezultatele comparării criorezistenţei spermei de cocoş cu
cea de om şi vier sunt prezentate în tabelul 3.5.
Tabelul 3.5. Diversitatea rezistenţei spermei de cocoş
Nr.
crt.
Denumirea
bioobiectului
Rezistenţa la şocul termic
76
Rezistenţa,
coeficientul de rezistenţă
1. Sperma de cocoş 0,87 ± 0,123*
2. Sperma de om 0,96 ± 0,092
3. Sperme de vier 0,43 ± 0,096
Rezistenţa osmotică
1. Sperma de cocoş 0,79 ± 0,81
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice comparativ cu sperma de vier.
Datele tabelului 3.5 demonstrează, că indicii criorezistenţei spermei animalelor variază în
limite autentice (P

ecomandată este de 325 - 350 mOsmol/kg [368]. Astfel, rezistenţa osmotică demonstrează că
starea funcţională a membranelor poate fi folosită ca indice valoros în determinarea calităţii
materialului seminal.
Aşadar, reieşind din datele prezentate putem concluziona că, materialul spermatic de cocoş
dispune de coeficiente comparative de termo- şi osmorezistenţă relativ înalte.
Conform datelor literaturii universale celulele sexuale şi structurile competitive ale lor,
activitatea funcţională a spermatozoizilor şi a sistemului reproductiv, se află sub influenţa majoră
a factorilor interni şi ambientali, care provoacă scăderea indicilor morfologici, biochimici şi
funcţionali ai materialului seminal. Prin urmare, potrivit relatărilor academicianului T. Furdui şi
al. [127] este evidentă elaborarea metodelor şi principiilor de menţinere a activităţii funcţionale a
sistemului reproductiv în limitele sanogene. Actualitatea lor se încadrează în conceptul
mecanismelor dirijate a sanogenităţii sistemelor vitale, inclusiv reproductiv prin prisma
menţinerii şi fortificării proprietăţilor fiziologice, somatice şi psihice ale lor. [136]. Una dintre
aceste metode la realizarea strategiei reproductive în menţinerea viabilităţii şi puterii sanogene
fecundative a spermatozoizilor un timp variabil în afara căilor genitale, în sectorul avicol,
serveşte însămînţarea artificială a păsărilor.
Însămînţarea artificială reprezintă o biotehnică modernă de imitaţie a împerecherii
efectivului femel de păsări. Aplicarea metodelor de conservare a materialului seminal face
posibilă creşterea numărului de găini însămînţate de un cocoş şi, implicit sporirea productivităţii
acestora. La păsările domestice aplicarea însămînţării artificiale ameliorează proprietăţile de
reproducţie, urmate de scăderea considerabilă a cheltuielelor tehnologice [221]. În acelaşi timp,
pentru aprecierea calităţii spermei se folosesc indicii principali: conţinutul spermatozoizilor în
ejaculat, starea morfologică a spermatozoizilor, concentraţia şi mobilitatea lor, rezistenţa şi pH-
ul materialului seminal şi altele. Indicii enumeraţi adecvat determină starea spermei [102].
Spermatozoizii de păsăre sunt celule, care conţin foarte puţină citoplasma şi, în mod
proporţional, o suprafaţă foarte mare de membrane plasmatice [164, 212, 273]. În membranele
plasmatice sunt prezenţi factorii specifici biologici şi biofizici, care asigură permeabilitatea,
compoziţia lipidelor şi proteinelor, precum şi fluiditatea membranelor. La deteriorări
membranice, aceste proprietăţi se dereglează şi apar consecinţe nefaste asupra mobilităţii şi
diversităţii proceselor metabolice în spermatozoizi [147, 170, 172, 290, 366]. Aceste dereglări se
produc, în primul rînd, la nivelul membranelor plasmatice ale spermatozoizilor, care sunt
structurile iniţiale ce se supun acţiunii factorilor de mediu [36, 173].
În corespundere cu relatările contemporane, membranele reprezintă structuri mozaice şi
lichid-cristalice, care sunt formate din stratul bimolecular al lipidelor, unde spaţial sunt localizate
77

proteinele şi componentele glucidice. Conform structurii lichid-mozaice, moleculele proteinelor
globulare sunt situate în matricele lipidic în modul, care stabileşte contactarea cu mediul acvatic
a grupelor polare şi ionizate [42]. Lipidele sunt printre componentele majore ale membranelor
spermatozoizilor, implicate într-o serie de procese, care influenţează în cele din urmă potenţialul
lor de fertilizare [154]. La cocoşi, lipidele sunt parte integrală a membranei spermatozoizidului şi
sunt implicate în diferite stadii ale reacţiilor de maturizare, capacitaţie şi acrozomale, într-o serie
de modificări biochimice şi funcţionale, care se desfăşoară în procesul de pregătire sau producere
a fecundării [269].
Este cunoscut, că stabilitatea proteinelor, în mare măsură, depinde de puterea ionică şi
permeabilitatea dielectrică a soluţiei. Conform opiniilor contemporane [108], stabilitatea
proteinelor este determinată de concentraţia sumară a anionilor şi cationilor în soluţie, care se
află într-un echilibrul dinamic între ei. Pe măsura schimbării valorii pH-ului se modifică şi
indicii funcţionali ai spermatozoizilor. Acest fapt prezintă un interes deosebit în procesul
elaborării mediilor crioprotectoare cu scopul stabilizării structurii şi funcţiei spermatozoizilor în
condiţiile criconsevării.
În contextul celor expuse, investigaţiile întreprinse în lucrarea de faţă şi-au propus
cercetarea evidenţierii unor eventuale influienţe ale pH-lui mediului asupra calităţii spermei de
cocoş şi a coraportului proteine/lipide al membranelor plasmatice ale spermiilor de cocoş în
procesul de crioconservare.
Remediile corespunzătoare pentru materialul seminal de cococş trebuie să asigure sursa
adecvată de energie pentru spermatozoizi şi să menţină pH-ul şi osmocitatea identice, cu cele din
plasma seminală, mediu natural pentru spermă [378]. Asigurarea pH-ului spermei are o
importanţă majoră în susţinerea viabilităţii spermatozoizilor. Un material seminal cu pH-ul mai
mic de 6,4 nu este potrivit pentru crioconservare, deoarece aceasta poate provoca deteriorări ale
membranei plasmatice a celulelor spermatice [276]. Alţi autori [198, 378], invers au arătat că
sperma de cocoş poate tolera o gamă largă a pH-ul de 6,0-8,0. La fel, este cunoscut că în limitele
pH 6,0-8,0 fecunditatea spermei păsărilor se păstrează la un nivel înalt [198].
Avînd în vedere importanţa pH-lui în menţinerea proprietăţilor morfo-funcţionale ale
spermatozoizilor şi diversitatea variată a opiniilor cu privire la pH-ul mediului, prezentată în
actualele surse bibliografice, acest studiu a fost conceput pentru a investiga rezistenţa spermei de
cocoş la diverse valori ale pH-lui în procesul crioconservării. Rezultatele obţinute sunt redate în
tabelul 3.6.
Datele expuse în tabelul 3.6 denotă despre faptul, că majoritatea rezultatelor restabilirii
mobilităţii gameţilor de cocoş s-au produs în cazul diluării spermei cu pH-ul mediului, apropiat
78

de neutru. Devierea nivelului pH-lui din varianta optimală numai cu 0,5 în direcţia acidulării sau
alcalinizării, iniţiază diminuarea bruscă a mobilităţii spermatozoizilor după decongelare.
Tabelul 3.6. Acţiunea pH-ului mediului asupra calităţii spermei de cocoş după congelaredecongelare
Nr. Varianta
pH-ul
Mobilitatea spermiilor după
ctr. experimentală
mediului
decongelare, puncte
1. I 4,75 1,1 ± 0,12
2. II 5,25 1,1 ± 0,12
3. III 5,75 1,8 ± 0,12
4. IV 6,25 2,5 ± 0,02
5. V 6,50 3,1 ± 0,12
6. VI 6,75 4,0 ± 0,02*
7. VII 7,00 4,5 ± 0,02*
8. VIII 7,25 4,0 ± 0,02*
9. IX 7,50 3,1 ± 0,12
10. X 7,75 2,7 ± 0,12
Notă: *Diferenţa este statistic veridică: P

[47] putem conchide, că membranele plasmatice ale gameţilor de cocoş se caracterizează prin
prezenţa proteinelor cu prevalarea legăturilor slabe, care se rup la devierea pH-lui de la valoarea
neutră. Aceasta demonstează rezistenţa scăzută a spermei de cocoş la modificarea pH-ului.
Valoarea pH-ului în limitele stabilite demonstrează, că compoziţia mediul pentru sperma de
cocoş, utilizat în cercetare, probabil, conform relatărilor [108], reprezintă un dezechilibru
dinamic al concentraţiei sumare a anionilor şi cationilor în soluţie.
Întrucît literatura de specialitate nu oferă suficiente date despre eventualele corelaţii
funcţionale între pH-ul spermei de pasăre şi structura morfo-funcţională a membranelor
plasmatice ale spermatozoizilor, în următoarea experienţă ne-am propus să investigăm raportul
proteine/lipide al membranelor plasmatice, de asemenea, la crioconservare. Mai mult ca atît,
membranele plasmatice ale spermatozoizilor sunt structurile iniţiale, care se supun acţiunii
factorilor de mediu şi posedă funcţii unicale de reglare a principalelor procese, care decurg în
celulă. În legătură cu aceasta, studierea modificărilor componenţei chimice a membranelor
plasmatice ale spermiilor de cocoş are o importanţă semnificativă.
Membranele reprezintă un fluid structural alcătuit din bistrat lipidic penetrat total sau partial
de molecule proteice; între lipide şi proteine exista, mai ales, legături necovalente. Proteinele şi
lipidele în membranele biologice interacţionînd prin legăturile hidrofobe, hidrofile, ionice şi
hidrogene, precum şi cu cele ale metalelor bivalente formează complexe lipoproteice [9, 83]. În
acest caz, rolul legăturilor covalente este neesenţial. Caracterul interacţiunii proteinelor, lipidelor
şi glucidelor, în mare măsură, depinde de condiţiile mediului. Astfel, proteinele localizate pe
ambele părţi ale membranelor se leagă cu stratul bilipidic, în general, din contul interacţiunilor
electrostatice, dar aceste legături sunt destul de labile [34, 83, 230].
Numeroase date demonstrează că la crioconservarea spermei are loc modificarea lipidelor şi
proteinelor din spermatozoizi. Însă, analizînd criorezistenţa obiectelor biologice la nivel
molecular, diferite componente (lipidele, proteinele, glucidele şi biocomplexele lor) reacţionează
variat la scăderea temperaturii: lipidele sunt mai labile, iar proteinele şi glucidele sunt mai stabile
[6, 50, 92].
Astfel, criorezistenţa spermatozoizilor, în mare măsură, este condiţionată de componenţa
membranei plasmatice şi proprietăţile fizico-chimice ale lor, iar cunoştinţele acumulate despre
proteine, lipide şi alţi componenţi membranici sunt unicele surse accesibile numai pentru
evaluarea superficială a mecanismelor, de formare a biocomplexelor funcţionale active [50].
In legătură cu cele expuse, în continuare problema de bază este cercetarea conţinutului
raportului proteine/lipide din membrana plasmatică a spermatozoizilor nativi şi crioconservaţi de
80

cocoş în comparaţie cu rezultatele obţinute de către noi în cercetările anterioare pe mamifere.
Valorile rezultatelor obţinute sunt prezentate în tabelul 3.7.
Tabelul 3.7. Raportul proteine/lipide al membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş
Nr.
Denumirea
crt.
bioobiectului
1. Membranele plasmatice ale spermatozoizilor nativi de
cocoş
2. Membranele plasmatice ale spermatozoizilor
congelaţi-decongelaţi de cocoş
3. Membranele plasmatice ale spermatozoizilor nativi de
vier
4. Membranele plasmatice ale spermatozoizilor
congelaţi-decongelaţi de vier
Notă: *Diferenţele sunt autentic veridice: (P

loc din cauza diminuării conţinutului lipidic în procesul crioconservării. În acest caz,
proprietăţile membranelor se determină nu de orice interacţiune specifică între componenţi, dar,
preponderent, de proprietăţile fizice ale rezistenţei structurii bistratare [71].
Astfel, rezultatele cecetărilor biochimice ale modificărilor produse în membranele
spermatozoizilor de cocoş şi vier în condiţii identice relevă, că raportul principalelor componenţi
structurali ai membranelor plasmatice în procesul congelării şi decongelării spermei este
predeterminat de particularitatea de specie.
Concluzii:
1. Structurile acrozomale ale spermatozoizilor de cocoş, comparativ cu cele ale spermiilor
speciilor studiate de animale sunt supuse deteriorărilor morfologice autentice numai la etapa de
congelare-decongelare.
2. S-a stabilit că procesele general acceptate de prelucrare tehnologică a spermei de cocoş
produc modificări structural-morfologice autentice ale spermatozoizilor după decongelarea lor,
inclusiv şi o creştere semnificativă a indicelui-B teratologic al spermei.
3. Crioconservarea materialului seminal contribuie, practic, la dublarea conţinutul formelor
patologice de spermatozoizi cu anomalii ale cozii şi, ca consecinţă, se reduce considerabil
concentraţia spermiilor cu proprietăţi de mişcări rectilinii.
4. În sporirea proprietăţilor biologice ale spermei de cocoş după congelare-decongelare o
semnificaţie majoră îi revine rezistenţei proprii a celulelor sexuale la influenţa temperaturilor
hipotermale şi condiţiilor variabile ale osmocităţii.
5. Devierea bilaterală acido-alcalină a pH-lui de la valoarea neutră cu mai mult de o unutate,
provoacă diminuarea bruscă a mobilităţii spermatozoizilor de cocoş în procesul de congelaredecongelare
a spermei.
6. Variabilele experimentale pre- şi postoptimale îşi păstreză valoarea autentică numai în
limitele slab acide şi slab alcaline şi, implicit oferă avantaje majore în menţinerea proprietăţilor
sanogene ale materialului seminal de cocoş.
7. Din datele prezentate se constată o interrelaţie direct proporţională între valoarea
raportului proteine/lipide din membranele plasmatice ale spermatozoizilor şi rezistenţa spermei
de cocoş la influienţa temperaturilor scăzute.
8. Elucidarea particularităţii conţinutului raportului proteine/lipide din membranele
plasmatice ale spermatozoizilor nativi şi crioconservaţi de cocoş comparativ cu cei de vier,
condiţionează cercetări de performanţă în vederea completării opiniei ştiinţifice despre
organizarea structurală a biomembranelor şi specificaţiei lor.
82

9. Perspectiva direcţionată a cercetărilor în domeniul crioprotecţiei obiectelor biologice,
rămîne optimizarea condiţiilor de reglementare a raportului compuşilor structurali de bază ai
membranelor în scopul sporirii rezistenţei spermatozoizilor păsărilor la acţiunea factorilor
crioconservării.
3.1.2. Funcţiile de barieră ale membranei plasmatice a spermatozoizilor de cocoş în
procesul de crioconservare.
Clarificarea mecanismelor de modificare criogenică în sistemele biologice la diferite nivele
de organizare, reprezintă una dintre problemele fundamentale ale criobilogiei contemporane.
Numeroase date ale literaturii de specialitate demonstrează, că una dintre cele mai criolabile
structuri a celulelor este membrana biologică [50]. În acelaşi timp, modificarea funcţiei de
barieră a lor provoacă diferite modificări intra- şi extracelulare [37, 44, 191, 220, 273]. Studierea
proprietăţilor bariere ale membranelor este predeterminată de valoarea teoretică şi aplicativă a
problemei abordate.
În primul rînd, dereglarea transportării metaboliţilor poate fi unul dintre principalele
mecanisme ale blocări metabolismului celulelor. Actualitatea studierii desfăşurării mecanismelor
acestui fenomen este determinată prin faptul, că în procesul crioconservătrii, nu numai se inhibă
reversibil activitatea enzimelor şi a complexelor enzimatice, dar are loc şi blocarea funcţiilor
vitale ale celulei, cum sunt proliferarea, respiraţia etc. [1, 50]. În al doilea rînd, studierea stării
funcţionale a sistemelor membranare prezintă interes întrucît reprezintă o modalitate de apreciere
a caracterului şi profunzimii modificării membranelor, precum şi a clarificării mecanismelor
interacţiunii lor cu crioprotectorii în procesul conservării. Deosebit de valoroase aceste date sunt
pentru descifararea mecanismelor moleculare de crioprotecţie ale membranelor biologice.
În al treilea rînd, modificarea proprietăţilor bariere ale membranelor capătă o semnificaţie
deosebită şi în sensul aplicativ, deoarece prin rezultatele obţinute putem concluziona că
concentraţiile pragale ale crioprotectorilor nu provoacă modificări esenţiale a stării structuralfuncţionale
a celulelor [61]. Condiţiile experimentale denotă, că la etapele de crioconservare au
loc modificări membranare, caracterul şi intensificaţia căror, este determinată de componenţa
mediilor sintetice şi regimurile de prelucrare tehnologică a bioobiectelor [48, 50, 92].
Una dintre fincţiile prioritare ale membranelor biologice este reglarea permiabilităţii
selective pentru substanţele, care sunt transportate, în procesul activităţii vitale a celulelor din
mediul înconjurător în celulă şi invers. Unele structuri complexe ale sistemelor vii, separate de
membrane, funcţionează ca sisteme de sine stătătoare deschise.
Moleculele substanţelor transportate sau a ionilor metalelor pot fi transportate prin
membrană, independent de prezenţa şi transferul altor substanţe şi astfel, se realizează importul
83

substanţelor. Transportarea substanţelor poate fi realizată unidirecţionat şi concomitent cu alte
substanţe – în acest caz are loc simportul substanţelor. În sfîrşit, transportul concomitent al
substanţelor contra gradientului de transportare al altor substanţe reprezintă antiportul. Astfel,
simportul şi antiportul sunt varietăţi ale transportului substanţelor, în rezultatul cărora, viteza
sumară a proceselor se controlează prin disponibilitatea şi accesibilitatea pentru sistemul ambelor
componente ale procesului de transportare [61]. În acelaşi timp, de starea funcţiei de barieră a
membranelor, care asigură transportul ionilor, depinde şi translarea informaţiei, care poate fi
realizată de către transportul ionilor prin canalele corespunzătoare ale membranei [193] sau în
rezultatul deformării structurii lichid-cristalice a ei [46].
Reieşind din cele menţionate mai sus, devine clară importanţa cercetărilor funcţiei de
barieră a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor, ceea ce s-a realizat de către noi într-o
serie de experienţe separarte. Rezultatele cercetărilor concentraţiei ionilor de Na + , K + , Li + şi Ca 2+
în sperma de cocoş sunt prezentate în tabelul 3.8.
Tabelul 3.8. Concentraţia de Na + şi K + , Li 2+ şi Ca 2+ în sperma nativă de cocoş, mg%
Nr.
ctr.
Denumirea
bioobiectului
Na
Concentraţia ionilor de:
+ ,
mg%
K + , Li
mg%
+ ,
mg%
Ca 2+ ,
mg%
Raportul
Na + / K +
1. Sperma nativă 29,8 ± 9,72 31,3 ± 9,72 0,4 ± 0,02 9,9 ± 0,04 0,952
2.
3.
Plasma spermatică
nativă
Spermatozoizii
nativi
407,0 ±
22,80*
147,9 ±
5,48
35,7 ±
2,52*
156,8 ±
27,90
84
0,6 ± 0,01*
12,0 ±
0,49*
11,401
0,7 ± 0,03 7,5 ± 0,16 0,943
Notă: *Diferenţa este statistic autentică dintre plasmă şi spermatozoizi.
Din tabelul 3.8 urmează, că concentraţia tuturor ionilor studiaţi, precum şi raportul Na/K
este variabilă în plasma seminală şi spermatozoizii nativi de cocoş. Concentraţia ionilor de Na +
şi Ca 2+ este mai mare în plasma seminală comparativ cu spermatozoizii, iar concentraţia ionilor
de K + şi Li + , invers, este mai înaltă în spermatozoizi şi mai joasă în plasma seminală. Diferenţele
în ambele cazuri sunt statistic autentice (P

Concomitent ionilor de Ca 2+ şi Na + , fiind componenţi ai Ca +2 şi Na + ,K + -ATP-azelor,
reglează activitatea acestor fermenţi, care sunt, în acelaşi timp, strict necesari pentru menţinerea
echilibrului ionilor în celulă [57].
În cea mai mare concentraţie în sperma de cocoş se află ionii monovalenţi de K + şi Na + , care
sunt cei mai răspîndiţi în natură, asigură formarea asimetriilor ionice, sunt cationi de mobilitate
înaltă, formează diverse săruri hidrosolubile, precum şi complexe mobile cu ligandele. Formarea
asimetriei ionice a celulei se asigură prin transportarea activă a Na + , K + , Ca +2 şi H + . Acest proces
se realizează prin sisteme transportatoare specifice.
Gradientele concentraţionale de Na + şi K + , care se formează la transportarea activă, asigură
celulele cu potenţialele osmotice şi electrochimice. În acelaşi timp, aceşti ioni se deosebesc prin
proprietăţi valoroase. Ambele elemente au potenţial de ionizare scăzut al electronului pe orbita
externă, iar ionul format are configuraţia gazului inert, adică este sferic şi slab polarizat [261].
În lichidele biologice sodiul şi potasiul sunt prezentate, prioritar, în formă ionică. În faza
acvatică aceste elemente se ionizează, iar ionul nou format uşor se hidratează. Ionii de Na + şi K +
sunt repartizaţi în sistemele biologice neuniform. Sodiul în lichidul interstiţal, reglează echilibrul
osmotic şi conţinutul apei în celulă, de asemenea participă la menţinera echilibrului acido-bazic
în sistemele biologice [46].
Potasiul, spre deosebire de sodiu, este element intracelular, unde îndeplineşte rolul de
reglator al presiunii osmotice intracelulare şi în spermatozoizii nativi de cocoş constituie
156,8±27,90 mg% contra 35,7 ± 2,52 mg% în plasma spermatică (P

156,8±27,90 şi 147,9±5,48 mg% (P

Scăderea autentică treptată a conţinutului de K + , consecutiv cu fiecare etapă tehnologică,
demonstrează despre trecerea lui din spermatozoizi în plasma seminală la crioconservare.
Sporirea concentraţiei Na + în spermatozoizi pînă la 182,6±5,32 mg% în sperma crioconservată şi
diminuarea conţinutului lui în plasma spermatică de la 407,0±22,80 mg% în plasma nativă pînă
la 280,6±19,00 mg% în cea decongelată denotă despre faptul elimenării-pătrunderii reciproce a
lor după gradientul concentraţional.
În acelaşi timp, este necesar de menţionat, că criodistrucţia membranelor celulare, parţial,
depinde de natura sărurilor, anionilor şi, îndeosebi, a cationilor. Foarte frecvent se întîlnesc
comunicări, dedicate acţiunii nefavorabile a ionilor de Ca +2 , inclusiv şi în componenţa mediilor
pentru crioconservarea celulelor reproductive [156, 415].
Proprietăţi stabilizatoare putem întîlni la ionii monovalenţi în mediul 1,2-propandiol-H2O-
MeCl, unde ei formează lanţul coerent: Li + >Na + >K + . Astfel, influenţa diferenţiată a electroliţilor
asupra reacţiei bioobiectelor la temperaturi joase, concomitent cu acţiunea lor asupra
parametrilor fizico-chimici ai soluţiilor congelate, este determinată şi de particularităţile
interacţiunii cationilor şi anionilor cu proteinele şi lipidele membranelor plasmatice [362].
Rezultatele obţinute se află în strînsă concordanţă cu datele literaturii contemporane [50,
261]. În particular, unul dintre indicii cu variabilitate sporită de dereglare a permiabilităţii
membranelor plasmatice în procesul de crioconservare este schimbarea conţinutului cationilor
intracelulari ai K + şi Na + , despre ce relevă faptul, că celulele după congelare-decongelare
păstrîndu-şi semiconductibilitatea pierd K + intracelular şi acumulează Na + extracelular. De
asemenea, se arată altă coincidenţă, conform căreia, la pierderea de K + şi Na + contribuie
gradientul osmotic, îmbogăţirea celulelor cu Na + are loc la etapa decongelării, iar elimenarea K + ,
preponderent, se produce în momentul congelării. Se presupune, că pierderea K + şi a altor cationi
(Ca 2+ , Mg 2+ ) este momentul iniţial de reconstrucţie structurală a celulei, care dereglează
permiabilitatea selectivă a membranei plasmatice [61].
Elucidarea în literatura de specialtate a rolului Li + în procesul crioconservării spermei de
cocoş este relativ limitată.
Concomitent cu cele menţionate, proteinele membranare se asociază cu proteinele specifice
ale mediului înconjurător sub influenţa componenţilor chimici ai lui şi supun modificărilor
corespunzătoare componenţa moleculară a membranei plasmatice. În acest caz, ionii de K + şi P 5+
manifestă proprietăţi stabilizatoare asupra proteinelor, iar ionii de Na + şi Cl - - acţiuni
destabilizatoare. În acelaşi timp, scăderea temperaturii tehnologice duce la modificarea funcţiei
proteinelor membranare şi provoacă, la rîndul său, dereglarea activităţii pompei de Na + şi K + ,
inclusiv şi pînă la stoparea definitivă a activităţii ei [46]. De asemenea, de către acest autor este
87

stabilit, că proteinele membranare în condiţiile fiziologice normale sunt intercalate în zona
periferică a bistratului lipidic, sporind permiabilitatea membranelor pentru ioni şi neelectroliţi,
iar la scăderea temperaturii, proteinele stabilizează bistratul, mai concret o parte imponantă din
lipidele implicate în transferul fazic în rezultatul interacţiunilor lipo-proteice.
Modificarea concentraţiei ionilor de Na + în spermatozoizi duce la dereglarea glicolizei [98],
iar dereglarea echilibrului ionilor se reflectă asupra funcţionării normale a spermetozoizilor [50].
De exemplu, este cunoscut că conţinutul de Ca 2+ liber în citoplasmă mai mult de norma
fiziologică provoacă moartea celulei în rezultatul deteriorării citoscheletului, cauzată de
disociaţia turbulentă a microtuburilor. Totodată, Ca 2+ activează fosfolipazele bistratului
membranic, care deteriorează lipidele membranare [46].
Modificările determinate ale componenţei ionilor în plasma şi spermatozoizii de cocoş pot fi
interpretate, din punct de vedere al viziunii contemporane despre arhitectonica membranelor
biologice, ca structură înalt mobilă, care îndeplinesc diverse fincţii vitale, iar la influenţa
temperaturilor joase pot forma canale suplimentare pentru transportul ionilor cercetaţi. Astfel,
reglarea stării de barieră a membranelor spermatice poate fi realizată prin utilizarea preparatelor
membranotrope, care conţin ioni de Ca 2+ , K + , Na + , P 5+ şi Cl - , precum şi a grupelor metilice ale
substanţelor organice. De asemenea, la eleborarea şi aplicarea metodelor de crioconservare a
obiectelor biologice este necesar să se ia în consideraţie schimbarea proprietăţi de barieră ale
membranelor sub influienţa factorilor mediului înconjurător.
3.2. Modificarea biochimică a componenţilor membranelor plasmatice, spermatozoizilor şi
plasmei spermei de cocoş sub influienţa factorilor de crioconservare.
3.2.1. Componenţa lipidică a spermatozoizilor, membranelor şi a plasmei spermatice.
În conformitate cu datele prezentate în reviul literaturii, baza biomembranelor constituie
structurile lichid-cristalice şi mozaice ale stratului bimolecular al lipidelor, în care spaţial sunt
localizate proteinele. Rolul lipidelor în funcţionarea normală a biomembranelor se determină de
starea fizică a lor, permiabiltatea selectivă, recepţia, interacţiunile intercelulare, transportul
biologic, reglarea activităţii fermenţilor membranodependenţi şi alte procese importante.
Lipidele sunt componentele esenţiale şi integrale ale membranelor şi îndeplinesc funcţii
importante în viabilitatea obiectelor biologice. Rolul specific al lipidelor constă în faptul, că ele
sunt principalele elemente structurale şi funcţionale ale membranelor biologice şi servesc ca
surse energetice pentru spermatozoizi [421].
Este cunoscut, că lipidele formează nu numai baza structurală a membranelor celulare,
determinînd gradul de viscozitate, defuzia laterală şi asimetria bilaterală, dar sunt şi
88

suntsubstanţe biologice active, care îndeplinesc funcţia compuşilor ai sistemului de transducţie a
semnalelor, ai modulatorilor activităţii enzimatice şi ai proprietăţilor de recepţie [76, 142, 229].
La fel, este cunoscut, că mecanismele apariţiei şi dezvoltării numeroaselor stări patologice
sunt determinate de dereglarea structurii şi de proprietăţile membranelor biologice [57].
Rolul lipidelor intracelulare nu este studiat complet. Unii autori presupun că ele sunt nu
numai sursa energetică, dar îndeplinesc şi alte funcţii [421].
Structurile principale, care se supun criodeteriorării sunt membranele biologice, iar lipidele
lichid-cristalice sunt apte de a restabili aceste deteriorări. În acest caz, nu numai tranzacţiile
fazice ale lipidelor membranare pot proteja celulele de deteriorări la şocul termic, dar şi lipidele
exogene, în dependenţă de comportarea lor termotropă, care este determinată de specificul
componenţei chimice a lor. Lipidele sunt printre componentele majore ale membranelor
spermatozoizilor, implicate într-o serie de procese, care influenţează în cele din urmă potenţialul
lor de fertilizare [154].
La cocoş, lipidele sunt parte integrantă a membranei spermatozoizidului şi sunt implicate în
diferite stadii ale reacţiilor de maturizare, capacitaţie şi acrozomale, într-o serie de modificări
biochimice şi funcţionale, care se desfăşoară în procesul de pregătire sau producere a fecundării
[269]. Un nivel ridicat de acizi grasi polinesaturati ai spermatozoizilor aviari provoacă
vulnerabilitatea spermiilor la efectele nocive ale POL [412] şi, care se află în corelaţie directă cu
fertilitatea masculină.
Numeroase date demonstrează, că la crioconservarea spermei are loc modificarea lipidelor
şi proteinelor din spermatozoizi. Dar, analizînd criorezistenţa obiectelor biologice la nivel
molecular, diferite componente (lipidele, proteinele, glucidele şi biocomplexele lor) reacţionează
variat la scăderea temperaturii: lipidele sunt mai labile, iar proteinele şi glucidele sunt mai stabile
[50, 92].
Astfel, criorezistenţa spermatozoizilor, în mare măsură, este condiţionată de componenţa
membranei plasmatice şi de proprietăţile fizico-chimice ale lor [53]. În această ordine de idei,
ţine de menţionat, că pînă în prezent lipsa metodelor eficiente de izolare şi separare a
membranelor spermatozoizilor nu permite de a studia în ansamblu, multilateral componenţa
chimică şi totalitatea proceselor care decurg în membrane.
Avînd în vedere că organizarea structurală şi activitatea funcţională a biomembranelor, în
mare măsură, se determină de particularităţile componenţilor structurali, există necesitatea
cercetărilor caracteristicilor structural-funcţionale ale lipidelor membranice, participante în
89

funcţiile vitale ale gameţilor. În acest caz, prezintă interes stabilitatea conţinutului chimic al
membranelor plasmatice şi schimbările lui în procesul crioconservării spermei de cocoş.
Reieşind din cele expuse, cercetările lipidelor din membranele gameţilor prezintă un interes
mare pentru clarificarea de mai departe a deteriorării gameţilor şi constatarea condiţiilor de
crioprotecţie ale lor. În acelaşi timp, constatatarea de către noi a modificării sensibilităţii
spermatozoizilor presupune şi schimbarea componenţei chimice a membranelor biologice ale
gameţilor. În legătură cu aceasta, scopul acestei serii de experienţe a fost determinarea
conţinutului de lipide a biomembranelor spermatozoizilor de cocoş în procesul de crioconserare.
Cercetările au fost îndeplinite în colaborare cu cercetătorii Laboratorului Metabolismul
Lipidelor al Institutului de Biochimie al Academiei de Ştiinţe din Uzbechistan. Rezultatele
obţinute au permis de evedenţiat şi de determinat conţinutul gliceridelor, FL, colesterinei şi a
cerebrozidelor în membranele native şi după congelarea-decongelarea spermei de cocoş.
În particular, în tabelul 3.10 sunt prezentate rezultatele experienţelor prin care s-a
determinat conţinutul FL, digliceridului-2, colesterinei (CS) şi trigliceridelor în spermatozoizii
nativi şi congelaţi-decongelaţi de cocoş.
Tabelul 3.10. Conţinutul fosolipidelor, gliceridelor şi colesterinei în membranele
spermatozoizilor de cocoş la crioconservare
Nr.
ctr.
Lipide
Conţinutul lipidelor (%) în
Membrane congelate-
Membrane native
decongelate
1. Fosfolipide 44,78±0,049 79,41 ±0,257*
2. Diglicerid-2 8,04±0,150 9,53±0,173*
3. Colesterină 36,51±0,290 11,06±0,246*
4. Trigliceride 10,60±0,150 urme
5. Colesterină:Fosfolipide 0,815 0,139
Notă: *Diferinţele sunt statistic autentice între indicii membranelor native şi cele congelatedecongelate.
Datele tabeluli 3.10 permit de a constata, că componenţa lipidică a membranelor
spermatozoizilor de cocoş este prezentată, preponderent, de FL, gliceride şi CS, care sunt supuse
schimbărilor semnificative sub acţiunea temperaturilor scăzute. De exemplu, s-a înregistrat
diferenţă statistic autentică între conţinutul de FL în membranele gameţilor nativi şi ale celor
congelaţi-decongelaţi. În rezultatul prelucrării tehnologice a spermei de cocoş (diluare,
refrigerare, congelare şi decongelare) în membranele plasmatice ale spermatozoizilor conţinutul
FL se majorează, iar cel al colesterinei se micşorarea după congelarea şi decongelarea spermei.
În acelaşi timp, la crioconservare autentic se majorează conţinutul digliceridei-2 în membranele
90

spermatozoizilor (de la 8,04±0,150 pînă la 9,53±0,173% - P

0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Fig. 3.1. Raportul colesterină/fosfolipidele în membranele spermei de cucoş la crioconservare.
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Raportul colesterină:fosfolipide
Raportul colesterină:fosfolipide
92
Fara diluare
Duliată cu mediul
VIJ
Duliată cu mediul
VIJ + stabilizator
al membranelor
Membranele
native
Membranele
decongelate
Fig. 3.2. Raportul colesterină/fosfolipidele în membranele spermei de vier la crioconservare.
Conform lui E. Blesbois [173] fluiditatea membranară în materialul seminal proaspăt
recoltat s-a dovedit a fi proporţională cu raportul colesterină/fosfolipide şi astfel, scăderea
coraportului menţionat serveşte şi ca un indicator al particularităţilor crioconservării.
Modificarea cantitativă evidentă a raportului colesterină/fosfolipide are un rol important
adaptiv la funcţionarea membranelor celulare [112]. Totodată, sunt cunoscute mecanisme de
adaptare, care modifică componenţa membranelor la scăderea temperaturii, dintre care şi
sporirea nesaturării acizilor graşi [76]. Avînd în vedere, că conţinutul acestor legături se află în
corelaţie directă cu conţinutul CS, putem menţiona, că factorii crioconservării influenţează mai
puternic decît lipidele, la care pot fi adaptate membranele şi în rezultat are loc modificarea
structurilor membranare. În acelaşi timp, această descreştere poate avea loc în cazul formării

iocomplexelor între elementele membranei plasmatice şi componenţei mediilor crioprotectoare,
adică în componenţa biocomplexelor noi pot fi implicate FL mediului sintetic.
În contextul celor expuse, experienţele efectuate au permis de a evidenţia şi a descrie
conţinutul FL, gliceridelor şi CS membranelor spermatozoizilor de cocoş în procesul
crioconservării. Astfel, experimental este marcată majorarea autentică în spermatozoizi, după
congelarea şi decongelarea lor, a conţinutului FL şi scăderea conţinutului digliceridei-2 şi
trigliceridelor. De asemenea, s-a stabilit scăderea semnificativă a valorii raportului
colesterină:fosfolipide în procesul congelării şi decongelării spermei, influenţînd la deplasarea
trecerilor fazice ale lipidelor membranelor spermatozoizilor.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Lipidele membranelor spermatozoizilor de cocoşi
93
*
* *
Membranele native Membranele decongelate
fosfolipide
diglicerid-2
colesterina
trigliceride
Fig. 3.3. Lipidele membranelor spermatozoizilor de cocoş la crioconservare.
Notă: *Diferenţele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native şi cele congelatedecongelate.
Analiza comparativă a densitogramelor lipidelor din biomembranele spermatozoizilor de
cocoş şi vier (figura 3.3 şi 3.4) demonstrează, în principiu, despre proprietăţile deosebite ale
componenţei lipidice. În rezultatul densitometriei fotoplastinelor prelucrate cu componenţi
lpidici ai spermiilor de cocoş sunt stabilite limitele de înaintare a FL, digliceridei-2 şi CS, la vier
– a FL, digliceridei-2 şi trigliceridelor. Conţinutul FL şi digliceridei-2 semnificativ diferă între
spermatozoizii speciilor cercetate (P

predeterminată de acest raport şi serveşte ca un bun indicator anticipat al proprietăţilor
materialului seminal pentru crioconservare, obţinut de la diverşi masculi din aceiaşi specie [173].
70
60
50
40
30
20
10
0
Lipidele membranelor spermatozoizilor de vier
Fara diluare Duliată cu mediul
VIJ
*
*
*
94
*
*
*
Duliată cu mediul
VIJ + stabilizator
al membranelor
fosfolipide
diglicerid-1
diglicerid-2
colesterină
trigliceride
Fig. 3.4. Lipidele membranelor spermatozoizilor de vier la crioconservare.
Datele prezentate în tabelul 3.10 demonstrează, că procesul de crioconservare provoacă
modificarea fizico-chimică a componenţei lipidice a membranelor şi concomitent, aceste
modificări ale diversităţii lipidelor în direcţia micşorării sau sporirii conţinutului lor în parte, pot
fi explicate prin intermediul concepţiei interacţiunii CS cu alte componente de natură lipidică sau
proteică [142]. În acest caz, sporirea conţinutului FL poate fi determinată prin formarea
complexelor colesterin-fosfolipidice, care coincide cu rezultatele diminuării CS. Scăderea
conţinutului CS în procesul crioconservării spermei de cocoş se demonstrează prin micşorarea
numărului legăturilor duble [117], care pot fi deteriorate sub influenţa factorilor de congelaredecongelare
a obiectului studiat.
În corespundere cu teoriile cunoscute despre organizarea moleculară a membranelor,
lipidele în structura lor sunt prezentate, în general, ca substanţe amfipatice: FL, glicolipide,
lipoproteide şi cholesterolul. FL, de exemplu, constituie 60-70% din lipidele totale ale
membranelor şi sunt destul de labile ca componenţi structurali ai celulelor. În legătură cu
aceasta, studierea FL şi fracţiilor lor are o semnificaţie deosebită la clarificarea mecanismelor de
crioprotejare şi criodeteriorare ale spermatozoizilor. Proprietăţile funcţionale ale lipidelor sunt
determinate de componenţa lor şi caracteristica fizico-chimică.
În membranele biologice componenţa lipidică integrată în matricele funcţional participă la
iniţierea programei de reglare celulară [181]. Membrana plasmatică posedă funcţii unicale de
reglare a principalelor procese, care decurg în celulă. FL menţin activitatea mecanismelor
metabolice. În particular, metabolismul mineral şi de oxidare biologică, iar de starea fazică a

lipidelor membranice depinde activitatea enzimelor membrano-conjuctoare şi reacţia celulei la
influenţa diferitor factori [57, 139].
FL tradiţional se consideră factorii naturali ai fertilităţii. Din punct de vedere chimic, ele
sunt asemănătoare cu moleculele trigliceridelor, însă în FL un acid gras este înlocuit cu eterul
acidului fosforic şi cu diferiţii substituenţi. Deosebirile esenţiale ale lor de trigliceride constau în
faptul, că FL nu reprezintă sursă energetică pentru organism, dar componenţi structurali
principali ai membranelor celulare. Una dintre cele mai reprezentabile este FC, care include o
grupă de substanţe, care diferă prin componenţa acizilor graşi în molecula lor. FL sunt substanţe
biologice active şi contribuie la menţinerea integrităţii sistemelor membranare ale celulelor, a
proceselor de diferenţiere, proliferare şi regenerare ale lor. Participarea FC, cît şi a altor FL este
stabilită şi la reglarea activităţii receptorilor membranari şi enzimelor, la reglarea proceselor
metabolice intra- şi extracelulare. FL sunt şi componente structurale ale lipoproteinelor [178,
179]. Activitatea biologică a lor depinde de structura chimică, iar prezenţa lor este obligatorie
pentru realizarea normală a mobilităţii spermatozoizilor şi a menţinerii reacţiei acrozomale.
Modificarea conţinutului FL determină schimbarea proprietăţilor fizico-chimice ale lor şi
manifestarea reacţiilor reglatoare, în rezultatul cărora, spermatozoizii se adaptează la condiţiile
nefavorabile ale crioconservării [110, 142].
FL fiind elemente structurale a lipoproteinelor determină starea biocomplexelor [110, 178].
Aceste lipide menţin activitatea mecanismelor metabolice, cum ar fi: metabolismul ionilor şi
oxidarea biologică de la starea fazei lipidice a membranelor, care depind de activitatea enzimelor
membranodependente şi reacţia spermatozoizilor la influenţa factorilor mediului ambiant [61].
În literatura de specialitate există date despre sensibilitatea spermatozoizilor la temperaturile
hipotermice, care sunt studiate insuficient şi numai unilateral, iar sensibilitatea lor este
determinată de conţinutul FL, deoarece diferite subclase ale lor influenţează variat asupra
transferului fazic şi este condiţionată de influenţa POL asupra activităţii enzimelor
membranoconjugate, ceea ce determină rezistenţa obiectelor biologice la influenţa factorilor
extremali ai mediului ambiant.
Cercetările efectuate de noi pentru determinarea FL în spermatozoizii nativi şi deconservaţi
de cocoş au permis de a constata şi a identifica şase fracţii de FL – SM, FC, FS, FEA, CL şi
acidul fosfatidic (AF) (tabelul 3.11).
Din datele tabelului 3.11 se observă, că FL membranelor spermiilor nativi de cocoş sunt
reprezentate în cantitate mare de acidul fosfatidic (48,02±0,354%), FC (13,40±0,312%) şi CL
(12,11±0,323%). Cercetarea fracţiilor FL după congelarea şi decongelarea spermei de cocoş a
constatat tendinţa de majorare a cantităţii fracţiilor FL, cu excepţia acidului fosfatidic şi FS,
95

conţinutul cărora semnificativ scade. Procesul de crioconservare duce practic la absenţa fracţiei
de CL.
Tabelul 3.11. Conţinutul FL în membranele spermatozoizilor de cocoş la crioconservare
Nr.
ctr.
Varietatea
Conţinutul fosfolipidelor (%) în
fosfolipidului Membranele native Membranele decongelate
1. Sfingomielină 6,65 ± 0,154 7,25 ± 0,180
2. Fosfatidilcolină 13,40 ± 0,312 19,41 ± 0,054*
3. Fosfatidilserină 9,56 ± 1,304 7,72 ± 0,199
4. Fosfatidiletanolamină 10,24 ± 0,175 20,60 ± 0,147*
5. Cardiolipină 12,11 ± 0,323 urme
6. Acid fosfatidic 48,02 ± 0,354 46,01 ± 0,289*
Notă: *Diferenţele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native şi cele congelatedecongelate.
În aşa fel, în rezultatul cercetărilor efectuate este stabilit conţinutul FL al membranelor
spermatozoizilor de cocoş în procesul crioconservării. În baza datelor obţinute, odată cu sporirea
conţinutul FEA (cel mai nesaturat FL), mai mult decît de două ori, în sperma deconservată
(P

Variaţiile semnificative (P

demonstrată la incubarea celulelor cu detergentul X-100. Coraportul SM/FC determină rezistenţa
osmotică a celulelor [142].
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Fosfolipidele membranelor spermatozoizilor
de cocoşi
Membranele native Membranele congelatedecongelate
98
*
*
*
Sfingomielin
Fosfatidilholin
Fosfatidilserin
Fosfatidiletanola
min
Cardiolipin
Acid fosfatidic
Fig. 3.5. Fosfolipidele membranelor spermatozoizilor de cocoş la crioconservare.
Notă: *Diferenţele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native şi cele congelatedecongelate.
Analiza densitogramelor (figura 3.5 şi 3.6) a arătat, că în spermatozoizii de cocoş sunt
înregistrate 5 varietăţi de FL, iar în cei de vier – 4. În spermii de vier lipseşte FS. Cercetările
comparative a mărimilor punctelor culminante ale FL spermiilor de cocoş şi vier au demonstrat
anumite particularităţi de specie după conţinutul fracţiilor FL. În aşa fel, diferenţa în conţinutul
FC, FEA şi AF a spermatozoizilor de cocoş şi vier sau dovedit a fi autentice. Concomitent, în
procesul congelării şi decongelării spermei de cocoş şi vier este deteriorată fracţia CL.
Compararea cromatogramelor obţinute demonstrează prezenţa particularităţilor calitative şi
cantitative a componenţei FL din spermatozoizii ambelor specii implicate în cercetate. Dintre FL
spermiilor de cocoş şi vier în cantitate mare se conţin FC, FEA şi AF, care în spermatozoizii de
vier au un conţinut mai sporit. Concentraţia înaltă a AF în spermii de vier 54,85±0,360%, relevă
despre derularea distrucţiilor mult mai semnificative a membranelor lor şi, concomitent, denotă
despre posibiltatea iniţierii proceselor de restabilire în membranele spermiilor la crioconservare.
În acelaşi timp, componentul minor al FL este SM, conţinutul cărei, practic, este identic la
ambele specii.
Procesul de congelare-decongelare a spermei de vier diluată duce la schimbări senificative a
tuturor fracţiilor de FL, inclusiv a conţinutului FL principale ale membranelor – FC şi FEA.
Prin urmare, în rezultatul cercetărilor îndeplinite sunt evidenţiate particularităţile de specie a
conţinutului FL în membranele spermatozoizilor de cocoş şi vier în procesul crioconservării.

60
50
40
30
20
10
0
Fosfolipidele membranelor spermatozoizilor
de vier
Fara diluare Duliată cu mediul
VIJ
*
*
*
*
99
*
*
*
*
Duliată cu mediul
VIJ + stabilizator
al membranelor
Sfingomielin
Fosfatidilholin
Fosfatidilserin
Fosfatidiletanolamin
Acid fosfatidic
Fig. 3.6. Fosfolipidele membranelor spermatozoizilor de vier la crioconservare.
Este necesar de luat în consideraţie, că stabilizarea fracţiilor FL ale gameţilor de vier mai
bine se realizează la folosirea pentru diluarea şi congelarea spermei a mediului elaborat de către
Institutul Unional de Zootehnie cu stabilizator pentru membrane.
Rezultatele obţinute se află în concordare cu comunicările [112] şi demonstrează
variabilitatea diferenţelor reactive ale FL la influenţa factorilor de crioconservare.
Astfel, totalizarea datelor experimentale şi ale analizei literaturii de specialitate
demonstrează, că activitatea funcţională a spermatozoizilor, în mare măsură, se determină, atît de
conţinutul FL, cît şi de conţinutul şi raportul fracţiilor FL. Influenţa factorului hipotermic
provoacă modificării esenţiale a tuturor parametrilor lipidici. Aceasta demonstrează importanţa
biologică a reacţiei lipidelor la influenţa factorilor de criconservare.
Alte componente lipidice ale biomembranelor sunt cerebrozidele. Aceste lipide se referă la
glicolipidele neutre, care sunt prezentate, în general, ca substanţe amfipatice şi sunt unul dintre
componenţii de bază ai membranelor plasmatice [32].
Prezenţa lor în toate celulele vii, activitatea metabolică, structura amfipatică (prezenţa în
structura moleculei a subunităţilor polare şi nepolare) şi fiind ca elemente structurale şi integrale
ale tuturor membranelor biologice, demonstrează actualitatea cercetării cerebrozidelor -
componente biochimice ale spermatozoizilor.
Reieşind din cele menţionate, în cercetările ulterioare a fost determinată componenţa
cerebrozidelor membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş în procesul
crioconservării. În rezultatul cercetărilor efectuate s-a stabilit că, cerebrozidele determinate în
membranele spermatozoizilor nativi şi decongelaţi sunt reprezentate de 6 fracţii. Rezultatele
cercetărilor se prezintă în tabelul 3.12.

Tabelul 3.12. Conţinutul cerebrozidelor membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş
la crioconservare
Nr.
ctr.
Varietatea
Conţinutul cerebrozidelor (%) în
cerebrozidelor Membranele native Membranele decongelate
1. Cerebrozide - fracţia 1 31,27±0,740 28,80±0,099*
2. Cerebrozide - fracţia 3 19,74±0,510 37,48±0,842*
3. Cerebrozide - fracţia 5 13,87±0,430 6,92±0,092*
4. Cerebrozide - fracţia 6 15,00±0,170 11,27±0,317*
5. Cerebrozide - fracţia 7 7,82±0,198 7,71±0,260
6. Cerebrozide - fracţia 8 12,28±0,357 7,81±0,190*
Notă: *Diferenţele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native şi cele congelatedecongelate.
Din datele tabelul 3.12 reiese, că printre cerebrozidele membranelor plasmatice ale
spermatozoizilor nativi şi decongelaţi de cocoş, prevalează conţinutul cerebrozidelor fracţiilor 1,
2, şi 6, constituind mai mult de 50% din cantitatea totală a lor. În procesul congelării şi
decongelării spermei de cocoş s-au produs schimbări esenţiale în conţinutul fracţiilor
cerebrozidelor. În particular, conţinutul cerebrozidelor fracţiei 3 s-a majorat de la 19,74±0,510
pînă la 37,48±0,842% (P

Analiza comparativă a densitogramelor (figura 3.7 şi 3.8) a permis de a stabili şi determina
particularităţi evidenţiate de specie. În membranele plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş nu
au fost depistate fracţiile 2 şi 4 ale cerebrozidelor, comparativ cu prezenţa lor în cele de vier. Prin
urmare, aceste fracţii ale cerebrozidelor sunt specifice numai speciei respective. Studiul
comparativ al componenţei cerebrozidice al membranelor plasmatice a spermatozoizilor de
cocoş şi vier în procesul crioconservării a depistat valori variate ale conţinutului cerebrozidelor
fracţiilor – 3, 5, 6, 7 şi 8.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Cerebrosidele membranelor spermatozoizilor
de vier
* *
*
*
*
*
Fara diluare Duliată cu mediul
VIJ
*
101
* *
Duliată cu mediul
VIJ + stabilizator
al membranelor
Cerebroside-1
Cerebroside-2
Cerebroside-3
Cerebroside-4
Cerebroside-5
Cerebroside-6
Cerebroside-7
Cerebroside-8
Fig. 3.8. Cerebrozidele membranelor spermatozoizilor de cocoş la crioconservare.
Notă: *Diferenţele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native şi cele congelatedecongelate.
Prin urmare, în rezultatul cercetărilor efectuate este descris spectru cerebrozidic al
membranelor plasmatice native şi congelate-decongelate ale spermatozoizilor de cocoş.
Concomitent, sunt elucidate şi acţiunile mediului sintetic utilizat şi a stabilizatorului
membranelor în componenţa mediului sintetic, asupra conţinutului cerebrozidelor în membranele
plasmatice ale spermatozoizilor de vier în procesul crioconservării. În particular, folosirea
mediului sintetic elaborat de către Institutului Unional de Zootehnie a determinat o stabilizare
mai bună a fracţiilor cerebrozidice, în comparaţie cu mediul, care conţinea stabilizator al
membranelor.
În acelaşi timp, au fost depistate particularităţile calitative şi cantitative de specie în
conţinutul fracţiilor cerebrozidice. S-a stabilit, că în condiţii analogice de efectuare a experienţei
conţinutul total al cerebrozidelor membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş este
mult mai majorat (de 6 ori) decît cel din membranele spermatozoizilor de vier.

Modificarea conţinutului cerebrozidelor membranare (sporirea conţinutului cerebrozdelor
fracţiei 3 şi deminuarea conţinutului cerebrozidelor fracţiilor 5, 6, şi 8) este provocată de factorul
crioconservării, dar aceste modificări se produc în diferite direcţii neidentice. Direcţionări
similare a modificărilor lipidelor sunt determinate în eritrocite în methemoglobinemia
experimentală [32, 76]. În acest caz, modificarea conţinutului cerebrozidelor tot este determinată
de proprietăţile fizico-cimice diferenţiate ale acestor lipide.
Lipidele sunt substanţe uşor oxidabile, de aceea metabolismul lor, activitatea enzimelor
lipid-dependente, viteza proliferării şi permiabilitatea membranelor sunt determinate de nivelul
POL [264]. Lipidele asigură rezerva de energie, sinteza unor vitamine esenţiale, termoreglarea
fizică şi reglarea activităţii enzimelor membranoconjugate. Concomitent, moleculele lipidelor
conţinînd grupe hidrofobe nepolare şi hidrofile pot interacţiona cu diferiţi componenţi şi,
respectiv, pot participa la realizarea numeroaselor funcţii ale membranelor [319, 384].
Ca consecinţă a peroxidării extinse a lipidelor, reacţiile de oxidare specifică (ROS) în mod
constant produc produse, care influenţiază în detrimentul capacităţii de fertilizare a spermei [148,
375, 387]. Anionii de superoxid, peroxidul de hidrogen şi radicalii hidroxili sunt unele majore,
dintre cele prezente în plasma seminala la ROS. Avînd în vedere creşterea producţiei de ROS,
apare stresul oxidativ, care duce la dezechilibrul dintre pro-oxidanţi şi anti-oxidanţi [148, 404].
În condiţii fiziologice, organismul dispune, de obicei, de rezerve suficiente antioxidative pentru
neutralizarea produselor ROS [186]. Cu toate acestea, atunci cînd ROS depăşesc capacitatea
organismului de producţie a AO se dezvoltă stresul oxidativ. Stresul oxidativ reduce numărul de
spermatozoizi, scade mobilitatea spermiilor şi sporeşte procentul de celule moarte [148, 151,
375, 387].
POL este o condiţie necesară pentru funcţionarea normală a celulelor. Menţinerea POL la
nivelul constant se realizează de către sistemele fizico-chimice de reglare, existenţa cărora este
demonstrată, atît la nivel experimental, cît şi celular. Parametrele acestui sistem de reglare la
toate nivelele de organizare a sistemului biologic sunt activitatea antioxidativă şi componenţa
lipidelor, aptitudinea lor de a se oxida [142]. În condiţii fiziologice, spermatozoizii produc o
cantitate mică de produse ale procesului de POL, cum ar fi anionul de superoxid, care are un rol
foarte important în reacţiile de capacitaţie şi acrozomale [148].
Nivelul ridicat al acizilor graşi polinesaturaţi în membrana plasmatică şi citoplasma
spermatozoidului sporeşte vulnerabilitatea lui la atacul ROS [154]. Prin urmare, producerea
excesivă de ROS este una dintre cauzele de bază ale infertilităţii [151, 371]. Reieşind din cele
expuse, în experinţele efectuate, intensitatea POL în sperma de cocoş a fost apreciată prin
102

conţinutul produselor iniţiale, intermediare şi finale ale acestui proces. Rezultatele cercetării sunt
prezentate în tabelul 3.13.
Tabelul 3.13. Conţinutul produselor POL în sperma de cocoş la etapele crioconservării
Nr. Etapa
Produsele peroxidării lipidelor
ctr. tehnologică a Conjugatele dienice, Hidroperoxizi, Dialdihida malonică,
crioconservării u.e.
u.e.
nMol/mlrd
1. Diluare 3,8 ± 0,39 0,26 ± 0,20 38,6 ± 7,82
2. Refrigerare 2,1 ± 0,06 0,3 ± 0,02 40,2 ± 1,08
3. Decongelare 4,0 ± 0,47 0,72 ± 0,02 67,0 ± 2,48*
Notă: *Diferenţa este statistic autentică.
Din tabelul 3.13 reiese, că conţinutul produselor POL variază semnificativ. În sperma
diluată de cocoş majoritatea constituie DAM - 38,6±7,82 nMol/mlrd, urmată de conjugatele
dienice cu 3,8±0,39 u.e. şi hidroperoxizii cu 0,26±0,20 u.e. Procesul de crioconservare a spermei
provoacă majorarea autentică numai a conţinutului DAM pînă la 67,0±2,48 nMol/mlrd (P

O deosebită importanţă la studierea stării proteinelor îi revine efectului hidrofob, care
determină coagularea proteinelor şi are un rol deosebit în reglarea stabilizării biomoleculelor.
Denaturarea termică la perderea rezistenţei de către proteine la temperaturile joase, la fel, este
determinată de efectul hidrofob. În legătură cu aceasta, o atenţie deosebită se acordă studierii
termodinamicii proteinelor, efectului hidrofob şi denaturării proteinelor la nivelul atomilor [192].
Proteinele şi lipidele în membranele biologice interacţionînd prin legăturile hidrofobe,
hidrofile, ionice şi hidrogene, precum şi cele ale metalelor bivalente, formează complexe
lipoproteice. În acest caz rolul legăturilor covalente este neesenţial. Caracterul interacţiunii
proteinelor, lipidelor şi glucidelor, în mare măsură, depinde de condiţiile mediului. Astfel,
proteinele localizate pe ambele părţi ale membranelor se leagă cu stratul bilipidic, în general, din
contul interacţiunei electrostatice, dar aceste legături sunt destul de labile [82].
Temperatura mediului ambiant manifestă o acţiune semnificativă asupra dinamicii
componenţilor membranelor plasmatice ale celulei [42] şi poate provoca modificări criogenice a
proteinelor. Avînd în vedere că componentele principale ale biomembranelor sunt proteinele şi
lipidele, studierea modificării criogenice a lor prezintă un deosbit interes. Este cunoscut că,
proteinele citoscheletului, care se deteriorează la crioconservare, se consideră a fi punctul forte
central, care determină stabilitatea celulelor şi, astfel stabilizînd citoscheletul se poate influenţa
benefic rezultatele crioconservării [393].
Scăderea temperaturii iniţiează trecerile fazice ale lipidelor anulare. În zona temperaturilor
joase majoritatea lipidelor trec în stare de gel şi se schimbă funcţiile de barieră ale membranelor
[42]. Însă, pînă în prezent, reacţia componenţilor proteici la acţiunea factorilor extremali ai
mediului este studiată insuficient, adică rămîne neclară modalitatea schimbării stării structurale a
membranei şi a proteinelor membranice în aceste condiţii.
Reieşind din cele menţionate în experienţele ulterioare s-a supus cercetărilor spectrul proteic
al spermei de cocoş şi posibilităţile de stabizare a conţinutului de proteine în spermă la
congelarea-decongelarea ei (tabelul 3.14).
Datele tabelului 3.14 arată, că dintre fracţiile proteice determinate atît în plasmă, cît şi în
spermatozoizi predomină albuminele respectiv, cu 47,8 şi 54,3%. α- şi β-globulinele s-au
depistat în cantităţi minore. În sperma nativă de cocoş globulinele nu au fost depistate.
Procesul de crioconservare a spermei de cocoş provoacă scăderea conţinutului de albumine.
Acest fenomen poate fi argumentat ca rezultat al deteriorării proteinelor la etapele tehnologice
sau în procesul crioconservării spermei şi, în special, a albuminelor. De exemplu, la diluarea
spermei cu medii sintetice, deseori apar efecte nedorite, de la aglutinarea spermatozoizilor pînă
la iniţierea prematură a reacţiei acrozomale. Se presupune, că cauza producerii acestor fenomene
104

este produsă de diminuarea concentraţiei proteinelor cationice cu sarcină pozitivă în plasma
seminală, care absorbindu-se pe suprafaţa negativă a membranelor citoplasmatice manifestă o
funcţie protectoare [141].
Nr.
ctr.
Fracţiile
proteice
Tabelul 3.14. Spectrul proteic al spermei de cocoş în condiţiile criconservării
Sperma
nativă
105
Sperma
crioconservată
mg/ml/mlrd % mg/ml/mlrd %
Plasmă
1. Albumine 6,0 ± 2,45 47,8 4,8 ± 1,90 46,3
2. α - globuline 2,8 ± 0,88 22,1 1,5 ± 0,21 14,5
3. β - globuline 3,8 ± 1,08 30,1 2,6 ± 0,50 25,0
4. γ – globuluine urme urme 1,5 ± 0,23 14,2
5. Proteine totale 12,5 100 10,4 100
Spermatozoizi
1. Albumine 11,8 ± 0,47 54,3 2,1 ± 0,91* 9,6
2. α - globuline 2,7 ± 1,53 12,4 1,2 ± 0,12 5,5
3. β - globuline 1,9 ± 0,85 9,0 0,6 ± 0,08 2,8
4. γ – globuluine 5,3 ± 0,70 24,3 17,9 ± 1,08* 82,1
5. Proteine totale 21,6 100 21,9 100
Total 34,2 22,2 -
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice comparativ cu sperma nativă: *P

Este cunoscut că proteinele membranelor biologice diferă prin conţinutul AA, enzimelor şi
masa moleculară [137, 313]. Studierea conţinutului AA în spermatozoizii animalelor agricole
capătă o importanţă majoră, întrucît AA pot forma molecule proteice specifice, participînd în
iniţierea proceselor de fecundare. Este important de menţionat, că AA şi derivaţii lor participă în
reglarea metabolismului, funcţiei organelor şi ţesuturilor organismului. Funcţiile reglatoare ale
AA şi derivaţilor lor sunt elucidate prin polifuncţionalitatea lor chimică [137].
În legătură cu aceasta, cercetările particularităţilor specifice ale AA în membranele
plasmatice a spermatozoizilor nativi şi congelaţi-decongelaţi de cocoş şi vier prezintă un interes
deosebit pentru depistarea mecanismelor de criodeteriorare a spermiilor şi condiţiilor de
stabilizare a componenţilor structurali ai membranelor plasmatice în procesul de elaborare a
metodelor efeciente de crioconservare a spermei.
Scopul cercetărilor prezente – stabilirea componenţei AA a membranelor plasmatice, izolate
ale spermatozoizilor nativi şi decongelaţi de cocoş şi vier (tabelele 3.15 şi 3.16). Analza
aminogramelor obţinute au permis de a constata în membranele plasmatce ale spermatozoizilor
de cocoş 16 AA, precum şi amoniac şi uree (dervaţi ai AA).
Din datele tabelului 3.15 se constată, că în membranele plasmatice native ale
spermatozoizilor de cocoş mai mult se conţin AA din grupa hidrofobă, 33,55±0,171% şi
34,53±0,241% în membranele decongelate (P

hidrofobă, ceea ce corelează cu datele literaturii referitoare la natura şi efectul hidrofob al
proteinelor membranice [60, 82].
Nr.
ctr.
Tabelul 3.15. Conţinutul AA în membranele plasmatice a spermatozoizilor de cocoş la
crioconservare
arietăţi (grupe) ale
aminoacizilor
1. Aminoacizi bazici
2. Aminoacizi acizi
3. Aminoacizi neutri
4. Aminoacizi hidrofobi
107
Conţinutul aminoacizilor (%) în:
Denumirea
aminoacidului
Membranele
native
Membranele
congelatedecongelate
Lizină 7,32 ± 0,375 6,95 ± 0,268
Histidină 6,81 ± 0,329 4,24 ± 0,382
Arginină 8,11 ± 0,441 8,38 ± 0,251
Total 22,24 ± 0,222 19,57 ± 0,177*
Asparigină 8,02 ± 0,539 7,72 ± 0,399
Glutamină 10,08 ± 0,529 12,70 ± 0,529
Total 18,10 ± 0,642 20,42 ± 0,331*
Trionină 7,54 ± 0,850 6,76 ± 0,060
Serină 5,40 ± 0,256 4,55 ± 0,109
Prolină 1,66 ± 0,380 1,98 ± 0,156
Glicină 5,98 ± 0,053 5,75 ± 0,206
Alanină 6,08 ± 0,240 6,00 ± 0,167
Total 26,66 ± 0,199 25,04 ± 0,066*
Metionină Urme Urme
Valină 8,33 ± 0,187 7,57 ± 0,095
Izoleucină 5,76 ± 0,309 5,90 ± 0,262
Leucină 10,37 ± 0,734 9,48 ± 0,614
Tirozină 2,61 ± 0,049 4,65 ± 0,888
Fenilalanină 6,48 ± 0,246 6,93 ± 0,459
Total 33,55 ± 0,171 34,53 ± 0,241*
5. Derivţi ai aminoacizilor Amoniac 0,92 ± 0,041 0,69 ± 0,142
Uree Urme Urme
Total 100,47 ± 0,146 100,25 ± 0,132
Notă: *Diferenţele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native şi cele decongelate.
Pentru analiza comparativă a AA din membranele plasmatice ale spermatozoizilor în tabelul
de mai jos se prezintă componenţa AA determinaţi în membranele plasmatice ale
spermatozoizilor de vier la crioconservare (tabelul 3.16).

Nr.
ctr.
Tabelul 3.16. Conţinutul AA în membranele plasmatice ale spermatozoizilor de vier la
crioconservare
Varietăţi (grupe) ale
aminoacizilor
1. Aminoacizi bazici
2. Aminoacizi acizi
3. Aminoacizi neutri
4. Aminoacizi hidrofobi
108
Conţinutul aminoacizilor (%) în:
Denumirea
aminoacidului
Membranele
native
Membranele
congelatedecongelate
Lizină 6,90 ± 1,591 5,89 ± 0,670
Histidină 6,95 ± 1,846 6,13 ± 0,504
Arginină 33,24 ± 0,812 30,76 ± 5,895
Total 47,09 ± 0,847** 42,76 ± 1,964
Asparigină 5,91 ± 0,836 6,79 ± 1,022
Glutamină 7,42 ± 2,335 8,92 ± 0,826
Total 13,33 ± 1,240** 15,71 ± 0,657
Trionină 3,30 ± 0,441 3,66 ± 0,802
Serină 4,01 ± 0,377 4,54 ± 0,254
Prolină 3,21 ± 0,152 3,29 ± 0,583
Glicină 3,19 ± 0,434 4,33 ± 0,268
Alanină 3,23 ± 0,161 3,16 ± 0,581
Total 16,94 ± 0,151** 18,98 ± 0,241*
Metionină 0,54 ± 0,164 0,42 ± 0,231
Valină 2,90 ± 0,678 3,39 ± 0,816
Izoleucină 2,51 ± 0,929 3,31 ± 0,798
Leucină 4,06 ± 1,256 5,05 ± 1,255
Tirozină 5,70 ± 0,695 3,81 ± 1,037
Fenilalanină 4,29 ± 0,591 4,34 ± 0,815
Total 20,00 ± 0,095** 20,32 ± 0,334
5 Derivate ale aminoacizilor Amoniac 2,64 ± 0,410 2,21 ± 0,348
Total 100,01 ± 0,309 99,98 ± 0,428
Notă: *Diferenţele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native şi cele decongelate.
**Diferenţele de specie sunt statistic autentice.
Din datele tabelului 3.16 se constată modificări semnificative ale conţinutului grupelor de
AA după crioconservarea spermei de vier.
La anliza comparativă s-a stabilit, că dintre AA membranelor plasmatice ale
spermatozoizilor de cocoş prevalează conţinutul AA hidrofobi, iar în membranele plasmatice ale
spermatozoizilor de vier – conţinutul AA bazici. O particularitate deosebită constituie conţinutul
înalt al argininei (33,24±0,812%) în membranele spermiilor de vier, comparativ cu cel din
membranele plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş (8,11±0,441%). La ambele specii studiate

în minoritate sunt prezentate grupele AA acidici, care constituie 18,10±0,642% în membranele
plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş şi 13,33±1,240% în membranele plasmatice ale celor
de vier. AA neutri în membranele plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş şi vier sunt
prezentaţi, corespunzător, de 26,66±0,199 şi 16,94±0,151%. Totodată, se constată şi schimbări
cantitative criogenice a spectrului aminoacidic studiat.
Astfel, datele obţinute în cercetările de mai sus demonstrează prezenţa particularităţilor
specifice de specie a conţinutului AA în membranele plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş şi
vier. În particular, conţinutul AA hidrofobi şi neutri în membranele plasmatice ale
spermatozoizilor de cocoş este cu 1,5 ori mai mic, ceea ce indică la prezenţa interacţiunilor
hidrofobe mult mai slabe între proteinele şi lpidele membranelor plasmatice ale spermatozoizilor
de vier.
Potrivit relatărilor literaturii de specialitate, menţionate în capitolul 1, interesul cu privire la
cercetările elementelor structurale ale proteinelor - AA este argumentat prin faptul, că prin
intermediul lor se realizează legăturile lor cu alte substanţe. De exemplu, la existenţa particulelor
hidrofobe pe suprafaţa proteinei poate avea loc formarea complexelor proteinlipidice ale
membranelor. Anume descompunarea complexului lipoproteic în procesul congelării celulelor
este cauza principală a deteriorărilor în procesul congelării-decongelării celulelor. În special,
sistemele lipoproteice sunt legate cu mitocondrii şi membranele plasmatice şi la deteriorare se
modifică activitatea enzimatică şi proprietăţile de barieră ale membranelor.
Reieşind din cele expuse, cercetările AA şi proteinelor în spermatozoizii nativi şi congelaţidecongelaţi
reprezintă un interes deosebit pentru determinarea mecanismelor de criodistrucţie a
obiectelor biologice. În particular, studierea componenţei AA spermatozoizilor de cocoş şi vier,
atît în sperma nativă, cît şi după congelare şi decongelare permite de a stabili particularităţile
criogenice şi de specie.
Rezultatele cercetărilor AA structurali ai proteinelor spermatozoizilor de cocoş au stabilit
prezenţa a 16 aminoacizi (tabelul 3.17).
Datele tabelului 3.17 denotă că în spermatozoizii nativi de cocoş cantitatea cea mai mare de
AA revine celor hidrofobi 30,88±0,296%, conţinutul procentual al căror scade în spermatozoizii
decongelaţi pînă la 22,83±0,040%. Dintre varietăţile acestei grupe, cel mai înalt conţinut în
spermatozoizii nativi este ocupat de valină (7,95±1,720%) şi izoleucină (10,33±,096%), care
după congelarea şi decongelarea spermei se reduce pînă la 4,90±0,096 (P

Nr.
ctr.
Varietăţi (grupe) ale
aminoacizilor
1. Aminoacizi bazici
2. Aminoacizi acizi
3. Aminoacizi neutri
4. Aminoacizi hidrofobi
5. Derivaţi ai
aminoacizilor
Tabelul 3.17. Conţinutul AA în spermatozoizii de cocoş la crioconservare
Denumirea
aminoacidului
110
Conţinutul aminoacizilor (%) în:
Spermatozoizii
nativi
Spermatozoizii
congelatidecongelaţi
Lizină 5,68 ± 0,092 4,90 ± 0,053
Histidină 0,56 ± 0,054 2,36 ± 0,032
Arginină 18,30 ± 0,528 18,82 ± 0,365
Total 24,54 ± 0,179 26,08 ± 0,123*
Asparigină 6,26 ± 0,433 8,48 ± 0,163
Glutamină 11,28 ± 0,389 16,95 ± 0,207
Total 17,54 ± 0,291 25,43 ± 0,132*
Trionină 5,31 ± 0,419 5,05 ± 0,493
Serină 6,36 ± 0,786 5,52 ± 0,530
Prolină 1,74 ± 0,124 3,29 ± 0,109
Glicină 7,75 ± 0,169 6,27 ± 0,302
Alanină 5,69 ± 0,520 3,74 ± 0,086
Total 26,85 ± 0,210 23,87 ± 0,160*
Metionină 0,75 ± 0,315 0,29 ± 0,103
Valină 7,95 ± 1,720 4,90 ± 0,096
Izoleucină 10,33 ± 0,096 3,39 ± 0,107
Leucină 2,45 ± 0,223 6,40 ± 0,157
Tirozină 4,26 ± 0,175 4,08 ± 0,052
Fenilalanină 5,14 ± 0,103 3,77 ± 0,039
Total 30,88 ± 0,296 22,83 ± 0,040*
Amoniac 0,63 ± 0,017 1,80 ± 0,076*
Total 100,44 ± 0,094 100,01 ± 0,057
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice dintre indicii gameţilor nativi şi a celor decongelaţi
Conţinutul AA neutri în spermatozoizii nativi constituie 26,85±0,210%, care scade în
spermatozoizii congelaţi-decongelaţi pînă la 23,87±0,160%. Aici, pe fonul scăderii acestor AA
are loc mărirea conţinutlui prolinei de la 1,74±0,124% pînă la 3,29±0,109%. Procentul AA, care
fac parte din grupurile acidice şi alcaline, în spermatozoizii nativi este, corespunzător, de
17,54±0,291% şi 24,54±0,179%, ce suportă respectiv modificări în celulele decongelae pînă la
25,43±0,132% şi 26,08±0,123%, corespunzător. Printre AA grupei alcaline este stabilit un
conţinut înalt al argininei (18,30 ± 0,528%) şi o cantitate mică de histidină (0,56±0,054%).

Astfel, cercetările efectuate au permis de a stabili componenţa AA din proteinele
spermatozoizilor de cocoş în procesul crioconservării. Este demonstrat, că la congelareadecongelarea
spermei are loc scăderea AA neutri şi hidrofobi şi majorarea AA acidici şi alcalini.
În scop comparativ, a fost studiat şi conţinutul AA în spermatozoizii de vier la
crioconservare (tabelul 3.18).
Tabelul 3.18. Conţinutul AA în spermatozoizii de vier la crioconservare
Nr.
ctr.
Varietăţi (grupe) ale
aminoacizilor
1. Aminoacizi bazici
2. Aminoacizi acizi
3. Aminoacizi neutri
4. Aminoacizi hidrofobi
Denumirea
aminoacidului
111
Conţinutul aminoacizilor (%) în:
Spermatozoizii
nativi
Spermatozoizii
congelatidecongelaţi
Lizină 2,82 ± 0,197 6,29 ± 0,007
Histidină 3,93 ± 0,305 3,37 ± 0,065
Arginină 18,70 ± 3,389 15,41 ± 0,558
Total 25,45 ± 1,136 25,07 ± 0,187
Asparigină 8,91 ± 0,175 8,78 ± 0,225
Glutamină 12,79 ± 0,613 11,86 ± 0,092
Total 21,70 ± 0,319** 20,64 ± 0,121*
Trionină 5,13 ± 0,064 5,01 ± 0,092
Serină 5,19 ± 0,305 5,27 ± 0,302
Prolină 7,08 ± 0,537 5,31 ± 0,180
Glicină 6,99 ± 0,590 6,14 ± 0,802
Alanină 4,79 ± 0,614 4,41 ± 0,044
Total 29,18 ± 0,210** 26,14 ± 0,176*
Metionină 0,49 ± 0,026 0,98 ± 0,210
Valină 4,92 ± 0,085 4,85 ± 0,049
Izoleucină 4,48 ± 0,234 11,59 ± 0,253
Leucină 6,64 ± 0,330 3,08 ± 0,189
Tirozină 2,11 ± 0,228 4,84 ± 0,127
Fenilalanină 4,54 ± 0,155 0,48 ± 0,208
Total 23,18 ± 0,082** 25,82 ± 0,076*
5. Derivaţi ai aminoacizilor Amoniac 0,48 ± 0,076 1,68 ± 0,060*
Total 99,99 ± 0,241 99,35 ± 0,059
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice dintre indicii spermatozoizii nativi şi decongelaţi.
**Diferenţele de specie sunt statistic autentice.
Analiza comparativă a componenţei AA din proteinele spermatozoizilor nativi şi congelaţidecongelaţi
de cocoş şi vier (tabelele 3.17 şi 3.18) a stabilit diferenţe cantitative între conţinutul
de AA. În particular, în spermatozoizii nativi de cocoş cea mai mare cantitate de AA ocupă AA

hidrofobi, iar în spermatozoizii de vier prevalează AA neutri. În acelaşi timp, atît în
spermatozoizii de cocoş, cît şi în cei de vier componentele minore ale proteinelor sunt AA aciz.
La analiza aminogramelor proteinelor gameţilor de cocoş şi vier s-a stabilit, că concentraţia
AA în spermatozoizii de cocoş este mai mare, comparativ cu cea din spermii de vier, care
implicit denotă rezistenţa mai înaltă a spermatozoizilor de cocoş la temperaturile scăzute.
În legătură cu faptul, că plasma spermatică este veriga de legătură, care asigură
spermatozoizii cu AA şi transportul lor prin membranele plasmatice, ulterior a fost studiat
conţinutul AA liberi ai plasmei seminale de cocoş şi vier în procesul de congelare-decongelare.
Cercetările consacrate studierii conţinutului AA liberi din plasma spermei animalelor
agricole prezintă un interes major, deoarece prin intermediul lor se realizează legătura
spermatozoizilor cu mediul extern. În acest context, scopul cercetărilor prezentate a fost
investigarea AA liberi din plasma spermei de cocoş la crioconservare şi, concomitent, stabilirea
particularităţilor de specie a conţinutului AA liberi din plasma spermei de cocoş şi vier la
crioconservare (tab. 3.19 şi 3.20).
Rezultatele cercetărilor, prezentate în tabelul 3.19 denotă, că plasma spermei de cocoş este
prezentată de 20 AA şi 4 derivaţi ai lor. Dintre AA plasmei spermei în cantitate majoră sunt AA
acidici - 597,02±55,638 mg/100 ml în plasma nativă şi 709,10±65,657 mg/100 ml în plasma
crioconservată. În ambele condiţii, aceşti AA sunt prezentaţi în majoritate de acidul glutamic,
care constituie în plasma nativă a spermei 88,87±1,749% şi 86,78±30,286% (tabelul 3.22). AA
grupelor alcaline, neutre şi hidrofobe, atît în plasma nativă, cît şi în plasma spermei congelatedecongelate
sunt reprezentaţi de o cantitate minoră.
Procesul congelării şi decongelării spermei de cocoş este însoţit de majorarea concentraţiei
AA alcalini, neutri şi hidrofobi, corespunzător, de la 5,50±0,360, 19,90±0,169 şi 5,02±0,081
mg/100 ml de plasmă în plasma nativă pînă la 7,37±0,548, 29,40±0,350 şi 8,40±0,164 mg/100
ml de plasmă în plasma congelată-decongelată. Dintre componenţii acestor grupe, urmează de
evedenţiat majorarea în plasma spermei decongelate a conţinutului aminacizilor cu radicali
alifatici ramificaţi – leucina şi izoleucina. De asemenea, este necesar de menţionat că conţinutul
derivaţilor AA în procesul refrigerării, congelării şi decongelării spermei de cocoş nu suportă
schimbări semnificative.
În procesul criconservării spermei de cocoş are loc majorarea conţinutului total de AA liberi
şi derivaţilor lor în plasma seminală de la 644,63±11,128 în cea nativă pînă la 774,67±13,133
mg/100 ml în plasma decongelată. Această majorare are loc, preponderent, din contul sporirii
conţinutului acidului glutamic, fapt care poate fi explicat, în aceste condiţii, prin trecerea lui din
spermatozoizi în plasma seminală.
112

Nr.
ctr.
Tabelul 3.19. Conţinutul AA liberi ai plasmei spermei de cocoş la crioconservare
Varietăţi (grupe) ale
aminoacizilor
1. Aminoacizi bazici
2. Aminoacizi acizi
3.
Aminoacizi neutri
4. Aminoacizi hidrofobi
5.
Derivţi ai
aminoacizilor
Denumirea
aminoacidului
113
Conţinutul aminoacizilor (mg/100 ml
plasmă) în
plasma nativă
plasma cong.decongelată
Lizină 2,31 ± 0,820 3,19 ± 0,738
Histidină 1,26 ± 0,462 1,15 ± 0,181
Arginină 1,93 ± 0,533 3,03 ± 1,457
Total 5,50 ± 0,360 7,37 ± 0,548
Asparigină 15,12 ± 3,419 26,96 ± 3,152
Glutamină 581,90 ± 111,224 682,14 ± 131,277
Total 597,02 ± 55,638 709,10 ± 65,657
Cisteină 1,47 ± 0,509 3,01 ± 1,006
Trionină 2,37 ± 0,489 7,13 ± 2,659
Serină 3,78 ± 0,8I8 4,54 ± 0,240
Prolină 2,21 ± 0,460 3,19 ± 1,127
Glicină 2,72 ± 0,239 3,95 ± 0,416
Alanină 3,09 ± 0,435 3,99 ± 0,330
β- alanină 0,47 ± 0,091 0,74 ± 0,376
γ-aminobutiric urme urme
Cisteină 3,79 ± 0,437 2,85 ± 0,367
Total 19,90 ± 0,169 29,40 ± 0,350*
Metionină urme urme
Valină 1,62 ± 0,262 2,99 ± 0,627
Izoleucină 0,60 ± 0,100 0,36 ± 0,247
Leucină 1,09 ± 0,167 1,85 ± 0,150
Tirozină 0,98 ± 0,209 1,13 ± 0,422
Fenilalanină 0,73 ± 0,133 1,97 ± 0,142
Total 5,02 ± 0,081 8,40 ± 0,164*
Amoniac 9,73 ± 1,251 12,05 ± 2,874
Uree urme urme
Taurină 3,28 ± 0,880 5,16 ± 0,246
Etanolamina 4,18 ± 1,433 3,19 ± 0,389
Total 17,19 ± 0,691 20,40 ± 0,970
Total 644,63 ± 11,128 774,67 ± 13,133*
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice între indicii plasmei native şi decongelate.

Tabelul 3.20. Conţinutul AA liberi ai plasmei spermei de vier la crioconservare
Nr.
ctr.
Varietăţi (grupe) ale
aminoacizilor
Denumirea
aminoacidului
Conţinutul aminoacizilor (mg/100
ml plasmă) în
plasma
plasma nativă congelatădecongelată
1. Aminoacizi bazici
Lizină 0,24 ± 0,079 0,17 ± 0,600
Histidină 0,74 ± 0,213 0,59 ± 0,104
Arginină urme urme
Total 0,98 ± 0,114** 0,76 ± 0,304
2. Aminoacizi acizi
Asparigină 1,09 ± 0,125 0,93 ± 0,126
Glutamină 8,06 ± 2,303 5,42 ± 0,977
Total 9,15 ± 1,153** 6,35 ± 0,493
3. Aminoacizi neutri
Cisteină 3,48 ± 0,243 2,35 ± 0,368
Trionină 2,08 ± 0,471 2,54 ± 0,672
Serină 1,31 ± 0,084 0,91 ± 0,184
Prolină 1,14 ± 0,434 0,89 ± 0,231
Glicină 4,52 ± 0,303 3,07 ± 0,469
Alanină 1,45 ± 0,085 0,94 ± 0,167
β- alanină 0,16 ± 0,030 0,11 ± 0,026
Cisteină 1,16 ± 0,016 0,93 ± 0,176
β-aminobutiric 0,50 ± 0,243 0,83 ± 0,455
Total 15,80 ± 0,088** 12,57 ± 0,119*
Metionină 0,16 ± 0,027 0,27 ± 0,015
4. Aminoacizi hidrofobi
Valină 2,51 ± 0,155 1,89 ± 0,752
Izoleucină 0,74 ± 0,194 0,77 ± 0,152
Leucină 1,15 ± 0,240 0,88 ± 0,099
Tirozină 0,96 ± 0,338 0,67 ± 0,339
Fenilalanină 0,34 ± 0,080 0,21 ± 0,057
Total 5,86 ± 0,081** 4,69 ± 0,130*
5. Derivaţi ai
Amoniac 0,70 ± 0,101 0,61 ± 0,077
aminoacizilor
Uree mare mare
Taurină 9,87 ± 1,144 9,21 ± 1,126
Ornitină 0,17 ± 0,072 0,14 ± 0,028
Citrulină 4,31 ± 0,206 2,74 ± 0,590
Etanolamina 1,42 ± 0,200 1,24 ± 0,151
Total 16,47 ± 0,237 13,94 ± 0,256*
În total 48,26 ± 0,237** 38,31 ± 0,131*
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice între indicii plasmei native şi decongelate.
**Diferenţele de specie sunt statistic autentice.
114

Astfel, cercetările efectuate au permis de a descrie componenţa şi conţinutul AA liberi din
plasma spermei de cocoş în procesul crioconservării. În rezultatul cercetărilor s-a stabilit un
conţinut înalt al acidului glutamic, care denotă despre prezenţa lui în ejaculat prin intermediul
canalelor epididiumului, deoarece la păsări lipsesc glandele sexuale anexe. Conţinutul înalt al
acidului glutamic şi, în general, a AA acidici influenţează structura şi funcţia spermatozoizilor.
În acelaşi timp, în rezultatul acestor cercetări s-a demonstrat, că drept răspuns la acţiunea
temperaturilor suprascăzute are loc schimbarea conţinutului AA neutri şi hidrofobi, ceea ce
denotă despre schimbările interacţiunilor componenţilor structurali spermatici. Totodată,
experimental au fost determinaţi derivaţii AA plasmei spermatice de cocoş, dintre care ureea
prezintă numai urme.
Compararea aminogramelor obţinute ale acizilor liberi şi derivaţilor lor în sperma nativă de
cocoş şi vier (tabelele 3.19 şi 3.20) relevă, că există diverse particularităţi cantitative şi calitative
de specie. De exemplu, în plasma spermei de cocoş 92,09±0,966% sunt prezentate de AA
acidici, în care acidul glutamic constituie 88,87±1,749%, iar în plasma spermei de vier -
18,56±0,303% şi, respectiv, 16,30±0,569%. Dintre AA liberi ai plasmei spermei de vier cel mai
mult se conţin AA neutri (15,80±0,088 mg/100 ml plasmă), care în plasma spermei de cocoş
constituie 19,90±0,169 mg/100 ml de plasmă. Deosebiri semnificative sunt înregistrate între AA
alcalini, reprezentaţi în plasma spermei de cocoş de 5,50±0,360 mg/100ml plasmă contra la
0,98±0,114 mg/100 ml plasmă în plasma spermei de vier. În plasma spermei animalelor
experimentale, la fel, sunt stabilite deosebiri statistic autentice între AA hidrofobi.
Spre deosebire de plasma de vier, în care într-o cantitate mare se conţine ureea şi urme de
arginină, în plasma spermei de cocoş sunt depistate urme de metionină, acid aminobutiric şi uree,
precum şi prevalarea taurinei şi a acidului glutamic.
Concomitent cu particularităţile cantitative sunt stabilite şi deosebiri calitative ale AA liberi
şi derivaţilor lor. În particular, în plasma spermei de cocoş sunt depistaţi 24 de AA liberi şi
derivaţii acestora, iar în plasma spermei de vier - 26. În plasma spermei de cocoş nu sunt
depistaţi astfel de derivaţi ai AA, ca ornitina şi citrulina, precum şi acidul β-aminobutiric, iar în
plasma spermei de vier, invers nu s-a depistat acidul γ-aminobutiric.
Astfel, în rezultatul analizei spectrului AA liberi şi derivaţilor lor în plasma spermei de
cocoş şi vier este stabilit un conţinut înalt de acid glutamic în plasma spermei de cocoş, căruia îi
aparţine funcţia principală în determinarea structurii moleculelor proteice, reglarea proprietăţilor
şi menţinerea vitală a lor, ceea ce denotă despre rolul important al lui în stabilizarea moleculelor
proteice în procesul crioconservării. De asemenea, s-a constatat un conţinutul scăzut de arginină
115

(urme) în plasma spermei de vier, ceea ce demonstrează despre apariţia unei manifestări mai
slabe a proceselor adaptive în procesul crioconservării spermei.
Conţinutul AA legaţi din plasma spermatică de cocoş în procesul crioconservării sunt
prezentaţi în tabelul 3.21.
Tabelul 3.21. Conţinutul AA legaţi ai plasmei spermei de cocoş la crioconservare, %
Nr.
ctr.
Varietăţi (grupe) ale
aminoacizilor
1. Aminoacizi bazici
2. Aminoacizi acizi
3. Aminoacizi neutri
4. Aminoacizi hidrofobi
Denumirea
aminoacidul plasmă nativă
116
Conţinutul aminoacizilor (%) în
plasmă
congelatădecongelată
Lizină 8,05 ± 0,192 7,34 ± 0,106*
Histidină 3,47 ± 0,41 2,82 ± 0,104
Arginină 7,26 ± 0,212 6,92 ± 0,142
Total 18,78 ± 0,096 17,08 ± 0,096*
Asparigină 8,89 ± 0,230 11,89 ± 0,353*
Glutamină 10,57 ± 0,358 15,75 ± 0,215*
Total 23,96 ± 0,212 27,59 ± 0,207*
Trionină 6,67 ± 0,329 5,09 ± 0,137
Serină 5,63 ± 0,061 5,06 ± 0,291
Prolină 1,37 ± 0,123 3,92 ± 0,029*
Glicină 5,70 ± 0,392 5,30 ± 0,130
Alanină 5,87 ± 0,302 6,00 ± 0,018
Total 25,04 ± 0,434 25,37 ± 0,069
Metionină 1,20 ± 0,340 1,34 ± 1,206
Valină 7,87 ± 0,068 6,10 ± 0,055*
Izoleucină 12,65 ± 0,414 11,99 ± 0,335
Leucină 2,56 ± 0,243 2,61 ± 0,231
Tirozină 6,82 ± 0,287 5,79 ± 0,239*
Fenilalanină 0,67 ± 0,161 0,39 ± 0,218
Total 31,77 ± 0,112 28,22 ± 0,062*
5. Derivaţi ai aminoacizilor Amoniac 0,45 ± 0,053 1,22 ± 0,062*
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice dintre indicii plasmei native şi decongelate.

Datele tabelului 3.21 denotă că procesul de crioconservare a spermei de cocos provoacă
modificări esenţiale ale tuturor grupelor de AA legaţi din plasma seminală.
În scopul realizării investigaţiilor ulterioare în tabelul 3.22 se prezintă componenţa
procentuală a AA liberi din plasma spermei de cocoş la crioconservare.
Tabelul 3.22. Conţinutul AA liberi ai plasmei spermei de cocoş la crioconservare, %
Nr.
ctr.
Varietăţi (grupe) ale
aminoacizilor
1. Aminoacizi bazici
2. Aminoacizi acizi
3.
4.
5.
Aminoacizi neutri
Aminoacizi hidrofobi
Derivaţi ai
aminoacizilor
Denumirea
aminoacidul plasmă nativă
117
Conţinutul aminoacizilor (%) în
plasmă
congelatădecongelată
Lizină 0,36 ± 0,086 0,45 ± 0,217
Histidină 0,20 ± 0,057 0,16 ± 0,033
Arginină 0,32 ± 0,074 0,38 ± 0,149
Total 0,88 ± 0,042 0,99 ± 0,088
Asparigină 3,22 ± 0,823 3,77 ± 0,839
Glutamină 88,87 ± 1,749 86,78 ± 30,286
Total 92,09 ± 0,966 90,55 ± 15,149
Cisteină 0,25 ± 0,057 0,43 ± 0,107
Trionină 0,39 ± 0,057 0,99 ± 0,358
Serină 0,63 ± 0,106 0,64 ± 0,141
Prolină 0,35 ± 0,037 0,38 ± 0,104
Glicină 0,47 ± 0,097 0,55 ± 0,111
Alanină 0,53 ± 0,106 0,55 ± 0,111
β- alanină 0,07 ± 0,007 0,09 ± 0,036
Cisteină 0,63 ± 0,305 0,39 ± 0,065
Total 3,23 ± 0,046 4,02 ± 0,055*
Valină 0,27 ± 0,048 0,39 ± 0,068
Izoleucină 0,10 ± 0,016 0,19 ± 0,053
Leucină 0,19 ± 0,050 0,26 ± 0,039
Tirozină 0,16 ± 0,039 0,18 ± 0, 057
Fenilalanină 0,12 ± 0,021 0,14 ± 0,017
Total 0,84 ± 0,017 1,16 ± 0,022*
Amoniac 1,63 ± 0,233 1,69 ± 0,489
Uree Urme Urme
Taurină 0,56 ± 0,088 0,73 ± 0,164
Etanolamina 1,12 ± 0,310 0,47 ± 0,165
Total 3,31 ± 0,132 2,89 ± 0,180
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice dintre indicii plasmei native şi decongelate.

Datele literaturii contemporane (capitolul 1) relevă, că o importanţă deosebită în reglarea
metabolismului celulelor au AA hidrofobi şi nepolari. Ultimii includ AA cu radicali alifatici
hidrocarbonaţi şi amnoacizii aromatici. Concentraţia lor serveşte drept indici de bază la
calcularea indicelui Fischer, care reprezintă raportul sumei concentraţiei AA liberi cu lanţ
ramificat (valina, leucina şi izoleucina) şi acizii aromatici (tirozina şi fenilalanina). Valoarea
indicelui Fischer se utilizează ca criteriu obiectiv a disbalansului AA [32]. În legătură cu aceasta,
a fost cercetat indicele Fischer în plasma spermei de cocoş şi vier în procesul de crioconservare
(tabelul 3.23).
Tabelul 3.23. Indicele Fischer în plasma spermei de cucoş şi de vier la crioconservare
Nr.
ctr.
Obiectul de studiu Indicele Fischer
1. Plasma spermatică nativă de cocoş
1,90 ± 0,078
2. Plasma spermatică congelată-decongelată de cocoş
1,83 ± 0,013
3. Plasma spermatică nativă de vier
4,77 ± 0,091**
4. Plasma spermatică congelată-decongelată de vier
2,12 ± 0,027*
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice dintre indicii plasmei native şi decongelate.
**Diferenţele de specie sunt statistic autentice.
Din datele tabelului 3.23 se constată, că valoarea indicelui Fischer în plasma spermei de
cocoş constituie 1,90±0,078, care în procesul crioconservării spermei nu suferă schimbări
semnificative şi constituie 1,83±0,013. În plasma spermei de vier acest indice în procesul
refrigerării, congelării şi decongelării spermei suferă schimbări. De exemplu, în plasma nativă a
spermei indicele Fischer este 4,77±0,91, contra la 2,12±0,027 în plasma spermei decongelate
(diferenţele sunt statistic autentice).
Analiza comparativă a valorilor indicelui Fischer în plasma spermei de cocoş şi vier permite
de a determina particularităţi specifice de specie. În particular, în plasma spermei native de vier
acest indice este mai înalt, decît în plasma spermei de cocoş. Prin urmare, ca răspuns la acţiunea
temperaturilor scăzute indicele Fischer din plasma spermei de cocoş, practic, nu se supune
schimbărilor, ceea ce demonstrează că la crioconservarea spermei de cocoş, care este mai
criorezistentă, valoarea acestui indice rămîne stabilă.
În plasma spermei de vier după refrigerare, congelare şi decongelare indicele Fischer scade
mai mult de două ori în comparaţie cu nivelul lui din sperma nativă. Modificările prezente
denotă despre un disbalans semnificativ al AA şi, implicit, despre dereglările metabolismului
proteinelor în plasma spermei de vier.
118

Rezumînd rezultatele cercetării spectrului AA al spermei de cocoş putem menţiona, că
plasma este veriga de legătură, care aprovizionează spermatozoizii cu AA şi asigură
transportarea lor prin membranele plasmatice. AA liberi ai plasmei spermei de cocoş sunt
prezentaţi, preponderent, de AA acidici (acidul asparaginic şi glutamic), cu prioritate
considerabilă a acidului glutamic. AA hidrofobi sunt reprezentaţi în cantitate minoră. Merită
atenţie şi faptul, că AA liberi ai spermei de cocoş se modifică la crioconservare într-o măsură
mai mică. Excepţie constituie AA neutri şi hidrofobi, conţinutul căror sporeşte de 1,5 ori.
Dintre AA liberi şi derivaţii lor, ureea este prezentată prin cantităţi foarte mici, unde au fost
depistate numai urme. Conţinutul scăzut de uree în plasma spermei de cocoş poate fi
predeterminat de criorezistenţa spermei, întrucît în concentraţii mici ea acordă efect antioxidativ
[92], care se observă nu numai la hiperoxie, dar şi în toate cazurile pentru care este caracteristică
sporirea intensităţii POL, modificarea proprietăţilor şi funcţiei membranelor biologice.
Spre deosebire de AA liberi din plasma spermatică, cei legaţi sunt reprezentaţi, prioritar, de
cei hidrofobi şi în minoritate de cei alcalini. Modificări criogenice ale conţinutului sunt
înregistrate la toate grupele AA, cu excepţia celor neutri.
În cazul congelării-decongelării spermei de cocoş în membranele plasmatice se observă
modificarea conţinutului tuturor grupelor de AA (P

membrana plasmatică este nesemnificativă, deoarece conţinutul argininei în aceste structuri este
mai mic mai mult de două ori decît în spermatozoizi.
De asemenea, merită atenţie faptul, că numai conţinutul AA hidrofobi se modifică în toate
componentele spermei (P

Dintre enzimele cuplate cu membrană plasmatică o importanţă deosebită aparţine ATPazelor
transportatoare. De exemplu, la congelarea accelerată a eritrocitelor pînă la -196 o C brusc
sporeşte activitatea Na + +K + -ATP-azelor, atunci cînd activitatea Mg +2 -ATP-azei în diapazonul
temperaturelor de la 0 pînă la -30 o C nu se modifică esenţial.
Tripolifosfatazele în combinaţie cu glucidele pot ameliora rezultatele crioconservării
bioobiectelor [267] .
Cercetările îndeplinite pentru claritatea activităţii Mg +2 (Na + +К + )-ATP-azei, 5 1 -
nucleotidazei şi fosfatazei alcaline în membranele plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş în
comparaţie cu rezultatele studierii activităţii fermenţilor membrano-dependenţi de vier (tabelul
3.24) au demonstrat că diluarea, congelarea şi decongelarea spermei acţionează asupra
activităţii lor specific.
Tabelul 3.24. Activitatea Мg +2 (Na + +К + )-ATP-azei, 5'-nucleotidazei şi fosfatazei alcaline în
membranele plasmatice izolate ale spermatozoizilor la crioconservare (mcMol/o/mg proteină)
Activitatea
Nr. Etapa prelucrării
Мg
ctr. tehnologice
+2 (Na + +К + Activitatea
Activitatea
)-ATP-
fosfatazei
5'-nucleotidazei
azei
alcaline
Cocoş
1. Diluare (martor) 16,23 ± 12,20 8,09 ± 0,86 1,19 ± 0,08
2. Congelare-
9,57 ± 0,56* 7,39 ± 0,59 1,17 ± 0,06
decongelare
Vier
1. Diluare (martor) 28,03 ± 1,30 4,49 ± 0,98 3,02 ± 0,36
2. Congelare-
18,85 ± 1,43* 3,17 ± 0,66 2,48 ± 0,37
decongelare
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
Datele obţinute în rezultatul cercetării activităţii Мg +2 (Na + +К + )-ATP-azei în membranele
spermiilor proaspăt diluate, cît şi după congelarea şi decongelarea spermei de cocoş şi vier
denotă despre o distrucţie semnificativă a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor acestor
specii. În particular, în procesul crioconservării spermei activitatea acestui ferment scade de la
16,23±12,20 pînă la 9,57±0,56 mcMoli/o/mg proteină la cocoş şi de la 28,03±1,30 pînă la
18,85±1,43 mcMoli/o/mg proteină la vier. Avînd în vedere, că acest sistem fermentativ
îndeplineşte funcţia de transport şi rolul de transformator al energiei, acumulate în ATP pentru
transportul activ al Na + şi К + prin membrană, constatarea schimbării activităţii Мg +2 (Na + +К + )-
ATP-azei denotă despre o deenergizare semnificativă a membranelor plasmatice ale
spermatozoizilor de cocoş şi vier. Analiza datelor obţinute, de asemenea, demonstrează că în
121

membranele spermiilor de vier la congelare-decongelare are loc o scădere mai semnificativă a
activităţii Мg +2 (Na + +К + )-ATP-azei, care indică la legături mult mai labile a acestui ferment în
membrana spermatozoizilor de vier.
Diminuarea înregistrată demonstrează că are loc deteriorarea semnificativă a membranelor
plasmatice ale spermatozoizilor speciilor studiate şi dezechilibrul transportării ionilor, care a fost
stabilit şi prezentat la elucidarea funcţiilor de barieră ale membranei plasmatice a
spermatozoizilor de cocoş în procesul de crioconservare.
Modificarea activităţii acestor enzime prezintă reacţia celulei la influenţa factorilor
defavorizanţi ai homeostaziei [80].
Activitatea 5 1 -nucleotidazei din fracţiile bogate ale membranelor plasmatice izolate ale
spermatozoizilor nativi de cocoş este mai înaltă, decît în spermatozoizii de vier, care constituie
8,09±0,86 contra 4,49±0,98 mcMol/o/mg proteină, corespunzător. În procesul crioconservării
spermei de cocoş şi vier are loc o scădere neînsemnată a activităţii acestui ferment şi, anume pînă
la 7,39±0,59 la cocoş şi pînă la 3,17±0,66 mcMol/o/mg proteină la vier. Din rezultatele
înregistrate urmează, că acest ferment nu suferă schimbări importante la crioconservarea spermei
acestor specii de animale, ceea ce se confirmă prin rezistenţa înaltă a elementelor nucleare la
influenţa factorilor mediului ambiant.
Reprezentantul fermenţilor, legaţi cu membrana plasmatică, este fosfataza alcalină, care
participă activ în mecanismul realizării acţiunii fiziologice a AMP prin eliberarea ortofosfatului
din substratele proteice fosforilate [108]. Cercetările noastre au stabilit schimbări
nesemnificative ale activităţii acestui ferment în membranele plasmatice native şi congelatedecongelate
ale spermatozoizilor de cocoş şi vier. Activitatea fosfatazei alcaline constituie
1,19±0,08 şi 1,17±0,06 mcMol/o/mg proteină, corespunzător, în membranele gameţilor nativi şi
decongelaţi de cocoş. La vier activitatea acestui ferment scade de la 3,02±0,36 în membranele
plasmatice ale spermatozoizilor nativi pînă la 2,48±0,38mcMol/o/mg proteină în membranele
spermatozoizilor decongelaţi. Datele obţinute vin în concordanţă directă cu rezultatele
cercetărilor indicilor funcţionali ai spermatozoizilor după congelarea şi decongelarea spermei de
cocoş şi vier. Rezultatele cercetărilor ne permit de a menţiona, că schimbările activităţii
Мg +2 (Na + +К + )-ATP-azei, 5 1 -nucleotidazei şi fosfatazei alcaline la crioconsevare sunt
predeterminate de modificarea organizaţiei moleculare a membranelor plasmatice, restructurarea
cărora, apare în procesul diluării, refrigerării, congelării şi decongelării spermei .
Analiza comparativă a particularităţilor de specie a activităţii fermenţilor spermatozoizilor
speciilor menţionate a arătat, că activitatea Мg +2 (Na + +К + )-ATP-azei şi fosfatazei alcaline este
mai sporită în membranele plasmatice ale spermatozoizilor de vier. Activitatea acestor fermenţi
122

variază, corespunzător, în membranele spermatozoizilor nativi şi decongelaţi de la 16 şi 1 la
cocoş pînă la 28 şi 3 mcMol/o/mg proteină la vier. Activitatea 5 1 -nucleotidazei, invers, este mai
mare în membranele gameţilor de cocoş şi variază de la 4,5 şi 3 la vier pînă la 8 şi 7
mcMol/o/mg proteină la cocoş. Prin urmare, datele obţinute demonstrează despre faptul că
fermenţii membrano-dependenţi ai membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş şi vier
posedă particularităţi de specie, întrucît sunt stabilite devieri statistic autentice între activitatea
lor. Astfel, pentru membranele plasmatice ale spermatozoizilor de vier sunt caracteristice, ca
particularităţi Мg +2 (Na + +К + )-ATP-aza şi fosfataza alcalină, iar pentru cocoş - 5 1 -nucleotidaza.
În contextul celor expuse, analiza în ansamblu a datelor cercetărilor activităţii enzimelor
membranare [1] demonstrează, ca la acţiunea factorilor hipotermali are loc activarea unor enzime
şi inactivarea altora. În acest caz, modificările criogenice ale enzimelor membranare ale
spermatozoizilor, practic, sunt rezultatul răspunsului secundar la dereglarea stabilităţii legăturilor
în complexele lipoproteice. Modificarea activităţii enzimelor la crioconservarea materialului
seminal, în mare măsură, se reflectă asupra proceselor metabolice în spermatozoizi prin
diminuarea fertilităţii lor.
În conformitate cu relatările academicianului T. Furdui [124], la baza formării dirijate a
sănătăţii se află gametogeneza, în procesul cărei se formează spermatozoizii, ca produs al
sistemului reproductiv. Proprietăţile organismului direct sau indirect depind de informaţia
genetică, care este codificată în succesiunea bazelor în structura ADN-lui celulelor reproductive.
Conţinutul cantitativ al ADN-lui semnificativ reflectă proprietatea fecundativă a
spermatozoizilor [391]. Cercetările privind determinarea conţinutul ARN-lui în sperma de cocoş
sunt prezentate în foarte puţine lucrări, iar în unele dintre ele, sunt şi contradictorii [20, 277,
377]. Reieşind din aceste considerente a fost studiată posibilitatea modificării conţinutului de
ADN şi a altor indici, care caracterizează sanogenitatea materialului seminal [7]. La prima etapă
a fost studiată eficienţa administrării „Fosfosanului”, preparat care conţine o cantitate sporită de
fosfor şi care poate influenţa asupra rezistenţei bioobiectelor la factorii nefavorabili ai mediului
extern. Rezultatele cercetărilor sunt prezentate în tabelul 3.25.
Tabelul 3.25. Acţiunea „Fosfosanului” administrat asupra indicilor spermei de cocoş
Nr.
ctr.
Varianta
Mobilitatea,
puncte
Concentraţia,
mlrd/ml
123
IAS,
u.c.
ADN,
mg%
1. Preexperimentală 7,2 ± 0,52 1,44 ± 0,59 90,1 ± 26,54 4,4 ± 0,76
2. Experimentală 7,8 ± 0,18 2,082 ± 0,19 135,8 ± 15,04 3,6 ± 0,10
Notă: *Diferenţa este statistic autentică dintre variantele experienţei.

În rezultatul cercetărilor s-a demonstrat, că „Fosfosanul” administrat pe cale orală nu a
contribuit la modificarea indicilor studiaţi, necătînd la faptul că în varianta experimentală se
observă tendinţa de sporire a IAS.
La continuarea cercetărilor influenţei fosfosanului asupra calităţii spermei de cocoş, în
următoarea experienţă preparatul studiat a fost administrat parenteral, în doze de 1 ml la cocoş.
Rezultatele sunt prezentate în tabelul 3.26.
Tabelul 3.26. Studierea acţiunii „Fosfosanului” la administrarea parenterală asupra indicilor
spermei de cocoş
Nr.
ctr.
1.
2.
Varianta
Preexperimentală
Experimentală
Mobilitatea,
puncte
Concentraţia,
mlrd/ml
124
IAS,
u.c.
ADN,
mg%
7,2 ± 0,52 1,44 ± 0,59 90,1 ± 26,54 4,4 ± 0,76
8,2 ± 0,179 2,78 ± 0,20* 253,75 ± 8,88* 4,68 ± 0,47
Notă: *Diferenţa este statistic autentică dintre variantele experienţei.
Datele prezentate în tabelul 3.26 arată că, administrarea parenterală a preparatului
experimentat face posibilă majorarea volumului ejaculatelor cu 37%, IAS se majorează mai mult
de 2 ori, iar concentraţia spermatozoizilor se modifică neesenţial. Conţinutul ADN-ului în
varianta experimentală, la fel, nu suportă schimbări semnificative, dar anumite deteriorări ale
ADN pot provoca dereglarea procesului de reproducere. Tipurile de dezorganizare ale ADN-ului,
includ aderaţiile cromozomale, modificaţiile epigenetice ale histonilor şi ADN-ului, mutaţiile şi
fragmentaţiile. Fragmentarea ADN-ului este o cauză, care deseori se întîlneşte, în spermatozoizii
infertili. Conţinutul de ADN fragmentat al spermiilor, corelează negativ cu calitatea spermei
[377, 391]. Astfel, în rezultatul cercetărilor se presupune că fosforul administrat în organismul
cocoşilor a contribuit la păstrarea energiei acumulate în legăturile macroergice ale ATP.
Un alt ferment, nu mai puţin important în metabolismul plasmatic este SOD. După cum este
documentat în literatura performantă de specialitate (capitolul 1), SOD este un component
important al plasmei seminale şi joacă un rol esenţial în echilibru dintre generarea ROS şi
degradarea purităţii anionului de superoxid [204, 284]. SOD modifică anionul de superoxid în
peroxid de hidrogen, care este, în cele din urmă, transformat în apă de către enzimele – catalaza
şi glutation-peroxidaza (GSH-Px) [284]. Materialul seminal aviar conţine două tipuri de SOD,
Mn-SOD şi Cu,Zn-SOD. Aceste varietăţi sunt sintetizate şi reglementate endogen şi funcţionează
în cooperare cu alte enzime, cum ar fi GHS-Px [284]. O cantitate semnificativă de SOD este
secretată de către epididim.

SOD purifică anionul de superoxid extra- şi intracelular, precum şi inhibă peroxizii lipidelor
din membranele spermatice [204, 284]. De asemenea, acţionează împotriva peroxidului de
hidrogen prin conjugarea sa cu catalaza sau GSH-Px [259, 284]. Reieşind din cele expuse
cercetările ulterioare au fost direcţionate asupra studiului activităţii SOD în procesul de
crioconservare a spermei de cocoş. Rezultatele cercetărilor sunt prezentate în tabelul 3.27. În
acest tabel se prezintă şi datele obţinute anterior pe sperma de taur [47], în scopul analizei
comparative a activităţii SOD.
Tabelul 3.27. Activitatea SOD la crioconservarea spermei de cocoş
Nr.
ctr.
Varianta experienţei,
mg/100 ml mediu sintetic
125
Mobilitatea gameţilor
decongelaţi, puncte
1. Sperma de cocoş (0,156) 4,3 ± 0,21
2. Sperma de cocoş (Lotul martor) 4,1 ± 0,21
3. Sperma de taur (0,156) 4,6 ± 0,10*
4. Sperma de taur (Lotul martor) 3,9 ± 0,19
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
Datele prezentate în tabelul 3.27 denotă, că SOD nu manifestă activităţi antioxidative faţă de
spermatozoizii de cocoş. Lipsa acestor proprietăţi poate fi explicată prin faptul că sperma de
cocoş nu conţine varietăţi active de oxigen în formă de radicali ai superoxidării.
Astfel, cercetarea activităţii enzimelor membrano-dependente a spermatozoizilor de cocoş şi
vier reprezintă un deosebit interes teoretic şi practic. Rezultatele permit de a obţine date despre
compoziţia chimică a membranelor, de a determina integritatea interacţiunilor celulare în
complexele substratelor enzimatice şi de a stabili corelaţii de compoziţie şi raport a
componenţilor structurali ai membranelor şi rezistenţa spermatozoizilor la temperaturi joase.
3.3. Concluzii la capitolul 3.
În contextul celor expuse şi analizei literaturii de specialitate este posibil de a concluziona,
că structurile acrozomale ale spermatozoizilor de cocoş, comparativ cu cele ale spermiilor
speciilor studiate de animale sunt supuse deteriorărilor morfologice autentice numai la etapa de
congelare-decongelare. S-a stabilit că procesele general acceptate de prelucrare tehnologică a
spermei de cocoş produc modificări structural-morfologice autentice ale spermatozoizilor după
decongelarea lor, inclusiv şi o creştere semnificativă a indicelui-B teratologic al spermei.
Studiul stării morfo-funcţionale a spermatozoizilor de cocoş la crioconservare
demonstrează, că procesul de crioconservare a materialului seminal contribuie, practic, la
dublarea conţinutul formelor patologice de spermatozoizi cu anomalii ale cozii şi, ca consecinţă,
se reduce considerabil concentraţia spermiilor cu proprietăţi de mişcări rectilinii. Concomitent, în

sporirea proprietăţilor biologice ale spermei de cocoş după congelare-decongelare o semnificaţie
majoră îi revine rezistenţei proprii a celulelor sexuale la influenţa temperaturilor hipotermale şi
condiţiilor variabile ale osmocităţii.
S-a stabilit, că devierea bilaterală acido-alcalină a pH-lui de la valoarea neutră cu mai mult
de o unitate provoacă diminuarea bruscă a mobilităţii spermatozoizilor de cocoş în procesul de
congelare-decongelare a spermei, iar variabilele experimentale pre- şi postoptimale îşi păstrează
valoarea autentică numai în limitele slab acide şi slab alcaline şi, implicit oferă avantaje majore
în menţinerea proprietăţilor sanogene ale materialului seminal de cocoş.
Cercetările transformărilor morfologice şi funcţionale ale spermatozoizilor de cocoş
constată o interrelaţie direct proporţională între valoarea raportului proteine/lipide din
membranele plasmatice ale spermatozoizilor şi rezistenţa spermei de cocoş la influenţa
temperaturilor scăzute. În acest caz, elucidarea particularităţii conţinutului raportului
proteine/lipide din membranele plasmatice ale spermatozoizilor nativi şi crioconservaţi de cocoş
comparativ cu cei de vier, condiţionează cercetări de performanţă în vederea completării opiniei
ştiinţifice despre organizarea structurală a biomembranelor şi specificaţiei lor şi, implicit
demonstrează, că perspectiva direcţionată a cercetărilor în domeniul crioprotecţiei obiectelor
biologice rămîne optimizarea condiţiilor de reglementare a raportului compuşilor structurali de
bază ai membranelor, în scopul sporirii rezistenţei spermatozoizilor păsărilor la acţiunea
factorilor crioconservării.
Evaluarea funcţiilor de barieră ale membranei plasmatice a spermatozoizilor de cocoş în
procesul de crioconservare a stabilit, că crioconservarea spermei de cocoş la diverse etape
tehnologice este însoţită de restribuirea concentraţiei ionilor studiaţi între spermatozoizi şi
mediul înconjurător şi, aceasta la rîndul său, provoacă echilibrarea gradienţilor concentraţionali
şi duce la pierderea activităţii funcţionale a membranelor biologice. Prelungire serveşte
constatarea, că funcţia de barieră a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş se
modifică esenţial şi este condiţionată de pierderea bruscă a ionilor de K + în procesele tehnologice
ale crioconservării şi pătrunderea excesivă a ionilor de Na + în spermatozoizi, are loc sporirea
consecutivă a raportului lor, care constituie 2,01; 3,77 şi 4,21, corespunzător, în spermatozoizii
nativi, refrigeraţi şi decongelaţi. La cele relatate, la fel, s-a stabilit că mecanismul de deteriorare
a asimetriei naturale a concentraţiei ionilor de Na + , K + , Li + şi Ca 2+ din ambele părţi ale
membranei plasmatice a spematozoidului de cocoş este predeterminat de forţele determinante ale
gradientului osmotic, dependent de conţinutul şi concentraţia ionilor.
O importanţă aparte îi revine faptului că stabilizarea sistemului barieră-transport al
membranelor biologice ale spermatozoizilor de cocoş este posibilă prin includerea în
126

componenţa mediilor crioprotectoare a componenţilor cu proprietăţi de sistematizare şi
optimizare a interacţiunilor ionice între mediu şi spermatozoid, iar stabilizarea stării morfofuncţionale
a spermatozoizilor de cocoş în procesul crioconservării este posibilă prin reglarea
funcţiilor bariere ale membranelor plasmatice.
Răspunsul lipidelor, ca componenţi principali şi elemente esenţiale integrale ale
membranelor, la influenţa factorilor de criconservare se manifestă prin reacţiile de compensare
directă şi invers proporţională a diminuării-sporirii conţinutului lor, în timp ce, valoarea
conţinutului produsului final al POL – DAM în sperma de cocoş serveşte drept criteriu de
elucidare a modificărilor stării lipidelor, iar produşii iniţiali şi intermediari (conjugatele dienice
şi hidroperoxizii) nu posedă astfel de valoare informaţională.
La oscilaţia bruscă a temperaturii, modificări criogenice mai evidenţiate în spermă sunt
prezente în conţinutul AA acidici şi hidrofobi, iar la cei alcalini, caracteristici pentru proteinele
nucleare, s-au stabilit modificări destul de moderate.
Studierea componenţei proteinelor a demonstrat că variabilitatea spectrului proteic în
sperma de cocoş poate fi predeterminată de tranzacţia fazică a lui în procesul de modificare a
structurii şi proprietăţilor proteinelor, structura albuminelor şi a γ-globulinelor spermei de cocoş
la crioconservare, fiind condiţionat labilă, comparativ cu cea a α- şi β-globulinelor, care
manifestă stabilitate. Totodată, s-a stabilit că proteinele reacţionează la influenţa factorilor de
crioconservare prin reacţii transformatoare de sinteză sau de disociere a compuşilor structurali ai
lor. Aici, reacţiile de adaptare în procesul crioconservării se produc, preponderent, la nivelul
spermatozoizilor, iar plasma seminală şi membrana plasmatică participă nesemnificativ la
derularea acestor procese.
Diminuarea conţinutului AA în membrane şi spermatozoizi la crioconservare şi sporirea lor
în plasma seminală, demonstrează migrarea proteinelor din spermatozoizi, în particular a celor
intercalate în structura membranelor, deoarece proteinele transmembranice sunt legate de
membrane prin interacţiuni dure. La fel, s-a stabilit că conţinutul AA hidrofobi sporeşte de 1,5
ori în toate componentele structurale ale spermei, ceea ce denotă despre faptul că
criodeteriorările sunt legate de modificarea interacţiunii hidrofobe şi, implicit confirmă că
crioprotecţia este necesară pentru toţi componenţii structurali ai spermei.
În acelaşi timp, s-a demonstrat că spermatozoizii de cocoş reacţionează la influenţa
factorilor de crioconservare prin reacţia de deenergizare a lor, care este predeterminată de
scăderea activităţii Мg +2 (Na + +К + )-ATP-azei, localizată în membrana mitocondrială şi activitatea
căreia, variază concomitent cu deteriorarea flagelului spermatozoizilor în procesul
127

crioconservării, în schimb, capul este mai criorezistent, despre ce demonstrează stabilitatea
ADN-lui şi 5 1 -nucleotidazei.
Introducerea în organismul cocoşilor a fosfosanului stimulează spermatogeneza şi provoacă
sporirea semnificativă a volumului ejaculatului şi a IAS.
Conţinutul ADN-lui în procesul de crioconservare a spermei de cocoş nu suportă modificări
şi la diferite etape poate servi ca indice, care caracterizează sanogenitatea sistemului reproductiv.
4. MENŢINEREA STĂRII MORFO-FUNCŢIONALE A COMPONENŢILOR
STRUCTURALI DE BAZĂ ŞI STABILIZAREA STATUSULUI MORFO-FUNCŢIONAL
AI SPERMIILOR DE COCOŞ ÎN PROCESUL DE CONSERVARE
4.1. Influenţa componenţilor structurali principali asupra spermei de cocoş în procesul de
crioconservare a ei.
4.1.1. Rolul proteinelor în stabilizarea indicilor morfo-funcţionali ai spermatozoizilor de
cocoş la crioconservare.
În prezent se pot conserva pe o durată mare în condiţiile temperaturilor foarte scăzute
diverse obiecte biologice, care formează suspensii (spermatozoizi, microorganisme, celule
sangvine etc). Metodele utilizate pentru crioconservarea la temperaturi joase, în mare măsură,
sunt consecinţele modalităţilor empirice de abordare a problemei. Posibilităţile ultimelor s-au
dovedit a fi foarte limitate şi insuficiente pentru dezvoltarea ulterioară a teorii şi practicii
criobiologice. Aşa de exemplu, modalităţile elaborate de abordare sunt destul de neîntemeiate şi
insuficiente pentru perfecţionarea mediilor şi procedeelor tehnologice în scopul majorării
eficacităţii crioconservării materialului biologic. Problemele menţionate, necesită declanşarea
unor experimentări complexe, atît fundamentale, cît şi aplicative, care ar asigura obţinerea şi
prelucrarea informaţiei necesare.
O sarcină primordială în domeniul cercetărilor fundamentale ale criobiologiei spermei
animalelor de fermă, constă în dezvăluirea mecanismelor de criodistrucţie la diferite nivele de
organizare biologică şi, pe această bază, elaborarea metodelor, care asigură păstrarea eficientă a
meterialului biologic. Una dintre modelele eficiente de soluţionare a acestei probleme este
studierea corelaţiilor dintre transformările fizico-chimice în procesul criconservării la
temperaturi scăzute şi indicii păstrării proprietăţilor biologice ale materialului deconservat.
În criobiologia spermei s-a acumulat mult material experimental despre starea celulelor la
diferite etape ale congelării, ceea ce a permis de a evedenţia cei mai nocivi factori, care participă
în decalanşarea criodeteriorării structurii spermatozoizilor. Însă, mecanismele de deteriorare a
128

structurii şi funcţiei spermatozoizilor condiţionează studierea aprofundată, precizarea şi
generalizarea lor.
Destul de superficial sunt studiate criodeteriorările la nivel supramolecular. Prezintă un
interes deosebit, studierea particularităţilor de specie ale criodeteriorării spermatozoizilor, ceea
ce permite evedenţierea componenţilor, cei mai vulnerabili şi ai structurilor celulare de acest tip.
Prin urmare, elaborarea metodelor eficiente de crioconservare a spermatozoizilor animalelor de
fermă trebuie să se bazeze pe rezultatele studierii aprofundate a proceselor, care însoţesc
congelarea, decongelarea şi alte etape ale criconservării.
În conformitate cu punctul de vedere, anterior formulat, referitor la criodeteriorările
spermatozoizilor animalelor de fermă, determinate de dereglarea, în primul rînd, a membranelor
biologice (plasmatică, acrozomală, mitocondrială), datorită declanşării proceselor fizico-chimice
(slăbirea durităţii legăturilor proteo-lipidice şi proteo-glucidice din complexele biologice,
trecerile fazice ale lipidelor şi apei, stresul termic şi osmotic etc), şi biochimice (intensificarea
proceselor de POL, schimbarea activităţii fermenţilor membranici, metabolismului glucidic,
lipidic şi proteic).
Dezvoltînd prezenta poziţie, o atenţie deosebită a fost acordată cercetării interdependenţei
dintre biocomplexele membranelor plasmatice şi păstrarea integrităţii funcţionale a
spermatozoizilor deconservaţi.
Despre labilitatea înaltă a biomembranelor în condiţiile crioconservării demonstrează datele
obţinute de către noi anterior [32, 50]. Cu toate acestea, considerăm că între componenţii şi
structura membranei există o verigă în formă de biocomplexe. Din aceste considerente, o
importanţă deosebită se atribuie studierii interacţiunii dintre molecule în condiţiile
crioconservării spermei. Bistratul lipidic în care sunt scufundate proteinele membranice integrale
nu este solvent inert al globulelor proteice. Interacţiunile proteo-lipidice pot duce la schimbarea
conformaţiei proteinelor [45, 46].
Cercetările interacţiunii dintre molecule permite de a obţine informaţie preţioasă despre
starea biocomplexelor.
Pentru aceasta, unul dintre modurile de abordare cu perspectivă, pare a fi, introducerea în
componenţa mediilor a unor componenţi, care ar asigura formarea biocomplexelor noi dintre
componenţii membranei şi mediile sintetice.
Sub acest aspect, s-a studiat acţiunea AA din diferite grupe şi, în particular, integritatea
funcţională a spermatozoizilor de cocoş după congelarea spermei în mediile sintetice, care conţin
AA alcalini (arginină), acidici (acidul asparaginic), hidrofobi (valină) şi neutri (alanină). Datele
obţinute sunt expuse în tabelul 4.1.
129

Nr.
ctr.
Tabelul 4.1. Influenţa aminoacizilor asupra calităţii spermei de cocoş
Denumirea aminoacidului Mobilitatea spermatozoizilor decongelaţi, puncte
1. Alanină 3,80 ± 0,136
2. Arginină 4,40 ± 0,119*
3. Acid asparaginic 3,90 ± 0,209
4. Valină 4,60 ± 0,112*
5. Martor (mediul C-2) 3,90 ± 0,111
Notă: *Diferenţele sunt statistic veridice în comparaţie cu lotul martor.
Datele tabelului 4.1 arată că după congelarea şi decongelarea spermei de cocoş în mediile,
care conţin AA testaţi, mobilitatea spermatozoizilor divizează între 3,8 şi 4,6 puncte.
Este cunoscut că suprafaţa gameţilor poartă încărcătură electropozitivă [88] şi din această
cauză eficacitatea AA evaluaţi este mai uşor de explicat prin clasificarea lor conform stării
resturilor AA ale lanţului proteic. În acest caz, AA se diviază în polari şi nepolari. Arginina şi
acidul asparaginic, conform acestei clasificaţii, se referă la acizii polari. Ei sunt apţi de a forma
legături hidrogenice, acţionînd astfel asupra structurii apei în procesul crioconservării. Însă, în
intervalul fiziologic al pH-ului egal cu 6-8, arginina este încărcată pozitiv, iar acidul asparaginic
– negativ. Reieşind din acestea, efectul pozitiv al argininei este condiţionat de formarea
biocomplexelor cu componenţii membranei, cu sarcină electropozitivă. Acidil asparaginic nu
poate forma astfel de biocomplexe din care cauză eficacitatea lui scade.
Alanină şi valină sunt acizi nepolari. Eficacitatea diferită a acestor AA, poate fi explicată
prin faptul că valina are resturi nepolare, care sunt expuse în interiorul globulei, iar la alanină
lipseşte tendinţa clară de localizare a acestor resturi în anumite sectoare ale globulei moleculare.
La cel din urmă interacţiunea hidrofobică trebuie să fie mai puţin pronunţată.
Unul dintre indicii menţinerii integrităţii funcţionale a spermatozoizilor deconservaţi este
raportul proteine/lipide din membrana plasmatică [50]. În legătură cu aceasta, ne-am propus
studierea acţiunii AA de diferită polaritate asupra raportului proteine/lipide din membrana
plasmatică a spermatozoizilor de cocoş la crioconservare (tabelul 4.2).
Rezultatele experimentale, expuse în tabelul 4.2 denotă, că includerea AA în componenţa
mediului crioprotector pentru crioconservarea spermei de cocoş după schema similară, cu cea din
experienţa precedentă, stabilizează integritatea indicelui studiat.
Aceasta demonstrează, că în urma utilizării AA se iniţiază stabilizarea, atît a componenţilor
lipidici, cît şi ai celor proteici ai membranei. De exemplu, arginina acţionează asupra
metabolizmului lipidelor, manifestînd efect antioxidativ [360].
130

Tabelul 4.2. Influenţa aminoacizilor de diferită polaritate asupra raportului proteine/lipide din
membrana plasmatică a spermatozoizilor de cocoş în condiţiile crioconservării
Nr.
ctr.
Varianta
experimentală
Componenţa mediului
crioprotector
Raportul proteine/lipide din
membranele plasmatice ale
spermatozoizilor
1. I C – 2 + alanină 0,91 ± 0,168
2. II C – 2 + arginină 1,05 ± 0,249
3. III C – 2 + acid asparaginic 0,74 ± 0,146
4. IV C – 2 + valină 0,91 ± 0,275
5. V C – 2 (martor) 0,73 ± 0,200
Astfel, studierea acţiunii AA de diversă polaritate asupra mobilităţii spermatozoizilor de
cocoş permite de a menţiona, că arginina şi valina stabilizează indicele studiat, în timp ce alanina
şi acidul asparaginic au efect mai slab. Introducerea AA în componenţa mediilor pentru
crioconservarea spermei de cocoş nu provoacă schimbări esenţiale ale raportului proteine/lipide
din membrana plasmatică.
Experimentările ulterioare au urmărit scopul de a elucida posibilităţi de reglare a
conţinutului fracţiilor proteice în condiţiile congelării şi decongelării spermei de cocoş.
Rezultatele cerecetărilor sunt prezentate în tabelul 4.3.
Tabelul 4.3. Influenţa mediilor crioprotectoare asupra spectrului proteic din sperma de cocoş în
condiţiile crioconservării
Nr.
ctr.
Fracţiile
Martor Mediul C – 2
proteice mg/ml/mlrd % mg/ml/mlrd %
Plasma
1. Albumine 7,5 ± 2,46* 37,3 4,9 ± 0,40 22,7
2. α - globuline 5,8 ± 2,48 28,8 6,6 ± 2,40 30,6
3. β - globuline 2,9 ± 0,47 14,2 3,0 ± 0,83 13,9
4. γ – globuluine 4,0 ± 2,18 19,7 7,1 ± 3,25* 32,8
5. Proteine totale 20,2 100 21,7 100
Gameţi
1. Albumine 3,2 ± 1,53 11,7 1,1 ± 0,30 4,1
2. α - globuline 1,9 ± 0,88 7,1 1,1 ± 0,73 3,9
3. β - globuline 1,1 ± 0,29 4,0 0,9 ± 0,52 3,2
4. γ – globuluine 21,1 ± 3,10* 77,2 24,0 ± 4,47* 88,8
5. Proteine totale 27,3 100 27,0 100
Notă: *Prevalarea proteinelor.
131

Datele tabelul 4.3 relevă, că aplicarea mediilor în procesul crioconservării spermei de cocoş
duce la sporirea conţinutului globulinelor din plasma seminală. Intensitatea derulării acestui
proces este identică cu cea a spermei de taur, în condiţii similare [47, 65, 91]. Stabilizarea acestui
indice are importanţă, întrucît conform В.К. Милованов и Ф.И. Осташко [88, 98] proteinele
plasmatice din spermă majorează mobilitatea şi longevitatea spermatozoizilor decongelaţi.
Aşadar, condiţiile crioconservării spermei animalelor de fermă nu provoacă transformări
semnificative ale proteinelor generale, plasmatice şi ale spermatozoizilor. Anologice concluzii
sunt prezentate şi de alţi cercetători, care au studiat spectrul lipidelor spermei animalelor
domesice [47] şi a eritrocitelor [142]. Este necesar de menţionat, că în spermatozoizii de cocoş
prevalează γ-globuluinele după congelare-decongelare, iar în plasmă - albuminele, ceea ce
demonstrează că spermatozoizii după crioconservare se află în stare de stres termic.
Analiza conţinutul fracţiilor proteice în varianta experimentală a stabilit, că în
spermatozoizi, cum şi în varianta martor, prevalează γ-globulinele, iar în plasma seminală γglobulinele
sunt majoritare numai în varianta experimentală. În varianta-martor a plasmei
spermatice prevalează albumunele. Prin urmare, modificările înregistrate în conţinutul
proteinelor din varianta experimentală demonstrează despre producerea lor sub influienţa
factorilor componenţi ai mediului C-2.
Astfel, în contextul celor expuse în prezentul subcapitol putem concluziona, că folosirea
argininei în componenţa mediului C-2 stabilizează indicii fiziologici după crioconservarea
spermei de cocoş, care poate fi explicată prin stabilizarea complexelor dintre elementele
structurale ale proteinelor, membranelor şi ale mediului crioprotector. În acelaşi timp, proteinele
din componenţa mediilor provoacă modificări evidente în structura proteinelor plasmei seminale
şi duc la prevalarea γ-globulinelor pe fonul scăderii albuminelor, manifestînd efecte protectoare.
4.1.2. Rolul lipidelor în procesul de crioconservare a materialului seminal de cocoş.
Particularităţile specifice ale reacţiei genomului animalelor la condiţiile extremale ale
mediului extern, realizate anterior în Institutul de Fiziologie şi sarcinile puse în lucrare au
condiţionat continuarea experienţilor similare cu sperma de cocoş.
În ultimii ani, în legătură cu studierea activă a mecanismelor moleculare de criodeteriorare
şi crioprotecţie a bioobiectelor la nivelul sistemelor membranare, brusc a sporit interesul către
rolul reglator al lipidelor asupra stării funcţionale a lor. Lipidele membranelor biologice,
particularităţile compoziţiei structurale ale lor, au un rol deosebit în reacţiile compensatoare la
echilibrarea condiţiilor mediului, care permit de a influenţa asupra stării indicilor funcţionali ai
spermatozoizilor.
132

Este cunoscut, că lipidele formează nu numai baza structurală a membranelor celulare,
determinînd gradul de lichiditate, difuzia laterală şi asimetria transmembranară, dar ele sunt şi
substanţe biologice active. În membranele biologice, componenţa lipidică integrată în matrica
funcţională, participă la iniţierea programei de reglare celulară [181]. Modificările
compensatoare în spermatozoizi sunt direcţionate asupra menţinerii structurii lichid-cristalice a
lipidelor şi a bistratului lipidic, proprietăţilor de barieră şi permeabilităţii membranelor.
Stereotipicitatea reacţiilor biochimice adaptive, la nivelul lipidelor, este, probabil, una dintre
posibilităţile principale ale evoluţiei obiectelor vii, care determină lipsa modificărilor calitative
ale reacţiilor biobiectului la influenţa factorilor externi. În schimb, parametrii fizico-chimici ai
sistemului de reglare a POL au diversă sensibilitate [147, 264]. Volumul şi caracterul
interconexiunii dintre indicii coordonaţi pot fi diferite, nu numai în dependenţă de natura şi
intensitatea factorului extern, dar şi de starea fizico-chimică iniţială a sistemelor biologice.
Aceasta determină diferenţierea cantitativă, care se observă nu numai la diferite cercetări, dar şi
în dependenţă de iniţierea influenţei factorului de referinţă.
În legătură cu aceasta, în experienţe speciale a fost studiată influenţa lipidelor din
componenţa mediilor pentru crioconservare asupra patologiilor spermiilor de cocoş. Rezultatele
cercetăriloe sunt expuse în tabelul 4.4.
Tabelul 4.4. Influenţa lipidelor exogene asupra spermatozoizilor de cocoş
Nr.
ctr.
Etapa prelucrării tehnologice
Spermatozoizi cercetaţi, %
a spermei Patologici Integri
1. Sperma nativă 11,4 ± 0,94 89,59 ± 0,94
2.
3.
Sperma crioconservată în mediu
glucoză-glicerină
Sperma crioconservată în mediu
glucoză-glicerină-extract de lipide
133
26,8 ± 0,59* 73,17 ± 0,59*
27,5 ± 0,84 73,50 ± 0,84
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu sperma nativă.
Datele tabelului ilustrează sporirea conţinutului de spermatozoizi patologici pînă la
26,8±0,59% sau de 2 ori mai mare, în comparaţie cu rezultatele obţinute în cazul experimentării
cu sperma nativă de cocoş. La acest capitol, glicerina este, probabil, cel mai bun crioprotector
pentru spermatozoizii de cocoş, dar în acelaşi timp, este necesar să fie eliminată din material
seminal după decongelarea lui. Acest lucru poate fi realizat prin centrifugarea succesivă, diluare
sau dializă [289]. În acelaşi timp, fiecare moleculă de glicerină oxietilată, are proprietatea de a
lega 48 molecule de apă, ceea ce predetermină participarea ei în procesul de vitrificare [207].

Perfecţionarea remediului crioprotector, prin introducerea în componenţa acestuia a
componentului lipidic, nu modifică esenţial conţinutul celulelor atipice. Avînd în vedere, că fără
participarea nemijlocită a compuşilor lipidici nu se realizează nici un proces biologic în
organism, atunci reiese, că lipidele exogene din componenţa mediului nu sunt implicate
nemijlocit în metabolismul vital al spermatozoizilor .
Paralel cu studierea conţinutului formelor patologice, au fost studiaţi şi indicii fiziologici ai
spermei de cocoş după crioconservare, de asemenea, sub influienţa lipidelor exogene.
Rezultatele studiului sunt prezentate în tabelul 4.5.
Tabelul 4.5. Indicii fiziologici ai spermei decongelate de cocoş la folosirea lipidelor în
componenţa mediului crioprotector
Nr.
ctr.
Denumirea bioobiectului
şi mediul sintetic
1. Sperma crioconservată în mediu
glucoză-glicerină (martor)
2. Sperma crioconservată în mediu
glucoză-glicerină-lipide (experimental)
134
Indicii fiziologici ai spermatozoizilor
Mobilitatea,
puncte
Longivitatea,
ore
3,2 ± 0,12 4,3 ± 0,55
3,5 ± 0,22 6,8 ± 0,61*
Notă: *Diferenţa este statistic autentică.
Datele prezentate în tabelul 4.5 demonstrează, că lipidele studiate au proprietate
stabilizatoare asupra stării fiziologice a spermei. În particular, are loc sporirea semnificativă a
longevităţii spermatozoizilor de cocoş după decongelare. Acest proces poate fi predeterminat de
reducerea conţinutului produselor toxice a activităţii vitale a spermatozoizilor de cocoş [92],
fiind produse biologice active.
Astfel, rezultatele cercetăroilor relevă, că lipidele exogene, folosite în varianta
experimentală posedă proprietăţi protectoare numai asupra longevităţii spermatozoizilor
decongelaţi de cocoş, ceea ce poate fi condiţionat prin proprietăţile lipidelor de a substitui şi
economisi sursele energetice, necesare pentru prelungirea activităţii vitale a lor.
4.1.3. Rolul glucidelor la stabilizarea stării morfofuncţionale a spermei de cocoş în procesul
de crioconnservare.
Glucidele reprezintă substratul energetic pentru spermatozoizi, ceea ce determină
necesitatea includerii lor în componenţa mediilor, atît pentru păstrarea hipotermală, cît şi
superhipotermală a spermiilor [50, 78, 82, 92, 411]. În plus, glucidele sunt reglatori puternici ai
osmozei mediului intra- şi extracelular. Un interes deosebit reprezintă aptitudinea glucidelor,

îndeosebi a dizaharidelor, de a menţine activitatea spermiilor crioconservaţi, în lipsa
crioprotectoarelor stabilite [171]. Se presupune, că glucidele au o influenţă stabilizatoare asupra
membranelor celulare, formînd legături de hidrogen puternice între grupele hidrofile ale
glucidelor şi grupele polare ale FL. Adăugător se consideră, că dizaharidele sunt mai eficiente
decît monoglucidele în activitatea protectoare a lor, datorită influenţei asupra compuşilor
membranei citoplasmatice. Efectul crioprotector al glucidelor asupra spermatozoizilor, se
observă şi în cazul mediilor hipertonice (450-550 m Osmol ) la viteze mari de răcire (100-300
o C/min) [413]. Practic, toate glucidele au eutectică scăzută, viscozitate înaltă la temperaturile mai
joase de 0 o C şi influenţează forma şi dimensiunile canalelor în apa neîngheţată.
În acelaşi timp, glucidele asigură în mediul extern şi intern presiunea osmotică
corespunzătoare spermiilor şi, totodată, servesc ca substrat energetic al celulelor, în condiţiile
aerobe şi anaerobe; stabilizează complexele proteo-lipidice ale membranelor celulare şi structura
citoscheletului; manifestă activitate protectoare asupra spermatozoizilor, complet sau parţial
înlocuind crioprotectorii aceptaţi [81].
Reieşind din cele expuse, au fost efectuate cercetări a influenţei glucidelor asupra stării
morfo-funcţionale a materialului seminal de cocoş. La etapa iniţială a investigaţiilor s-a studiat
acţiunea hidraţilor de carbon asupra structurilor morfologice ale spermatozoizilor (tabelul 4.6).
Tabelul 4.6. Influenţa glucidelor asupra gametopatiilor în sperma de cocoş
Nr.
ctr.
1.
2.
3.
4.
Componenţa
mediilor sintetice
Glucoză-glicerinăgălbenuş
Lactoză-glicerinăgălbenuş
Rafinoză-glicerinăgălbenuş
Maltoză-glicerinăgălbenuş
Sperma- Spermatozoizi Spermatozoizi
tozoizi
integri
patologici
cercetaţi Bucăţi % Bucăţi %
300 221 73,7 ± 1,27 79 26,3 ± 1,27
300 170 36,7 ± 1,43* 130 43,3 ± 1,43*
300 215 71,7 ± 1,69 85 28,3 ± 1,69
300 238 79,8 ± 1,16* 62 22,2 ± 1,16*
5. Total (media) 1200 844 70,3 ± 1,32 356 29,7 ± 1,32
Notă: *Diferenţa este autentică în comparaţie cu media la experienţă.
Datele prezente în tabelul 4.6 demonstrează, că numărul grupelor glicozidice în molecula
hidraţilor de carbon (glucoza, lactoza, rafinoza, maltoza), spre deosebire de materialul seminal
de taur în aceleaşi condiţii [47, 92], nu manifestă influenţă asupra conţinutului de forme
patologice ale spermatozoizilor.
135

În acest caz, rata gametopatiilor, practic, este determinată nu de numărul grupelor
glicozidice în moleculă, dar de proprietăţile fizico-chimice ale glucidului experimentat, întrucît
lactoza şi maltoza sunt dizaharide. În mediul cu lactoză gametopatiile în materialul seminal de
cocoş constituie 43,3±1,43%, iar, în condiţii similare, includerea maltozei în componenţa
mediilor, contribuie la majorarea spermatozoizilor integri pînă la 79,8±1,16%. Una dintre
cauzele înregistrării acestor devieri, poate fi faptul că monoglucidele se caracterizează în
exclusivitate prin legături hidrogene conform tipului, geometriei şi energiei, care le formează.
Mecanismul acţiunii lor se realizează la stabilizarea apei prin modificarea stării componentelor
citoplasmatice ale celulei, sporind păstrarea ei după influenţa factorilor de crioconservare, [47].
Întro-o măsură mai mică posedă astfel de proprietăţi şi di- şi trizaharidele, cum sunt lactoza,
maltoza şi rafinoza.
Avînd în vedere că glucidele, paralel cu proteinele şi lipidele, sunt componente principale
ale biomembranelor, un interes deosebit prezintă informaţia cu privire la apartenenţa
interacţiunilor structurale ale lor. De exemplu, glucoza face parte din componenţa glicolipidelor
şi glicoproteidelor, xiloza - proteoglicanelor şi glicoproteidelor, manoza – glicoproteidelor şi
galactoza este compus al tuturor trei glicoconjugate [46]. În acest caz, proprietăţile membranelor,
preponderent, se determină nu de orice interacţiune specifică între componenţi, dar de
proprietăţile fizice ale rezistenţei structurii bistratare, viscozitatea regiunii glucidice şi polaritatea
grupelor implicate [71]. Rezistenţa membranelor biologice, în mare măsură, depinde de gradul
saturării sau nesaturării resturilor acizilor graşi ai FL, care condiţionează viscozitatea necesară a
componenţei glucidice în componenţa stratului bilipidic în cazul influenţei temperaturilor
hipotermice. Astfel, în baza mecanismelor de crioprotecţie poate fi considerată aptitudinea
glucozei în stabilirea biocomplexelor de natură glicoproteidă şi glicolipidă în membrane (sunt
obţinute unele dintre cele mai bune rezultate la stabilizarea morfologiei spermatozoizilor de
cocoş). Glucoza este substanţa stabilizatoare a proteinelor şi influenţează structura
citoscheletului la acţiunea factorilor deterioratori în procesul crioconservării [82]. Confirmare a
acestui fenomen serveşte stabilizarea biocomplexelor glicoproteice la includerea în componenţa
mediului crioprotector a manozei [92], care diminuează calitatea spermei decongelate.
Ameliorarea rezultativităţii crioconservării spermei este reală în rezultatul perfecţionării
mediilor crioprotectoare prin utilizarea procedeelor tehnologice eficiente pe baza cercetărilor
experimentale, efectuate la diferite nivele de organizare a obiectelor biologice. Potrivit priorităţii
rolului biocomplexelor în activitatea membranelor plasmatice, în experienţele ulterioare s-a
studiat acţiunea monozaharidelor, componenţi principali ai derivaţilor glucidici ai membranelor
asupra indicilor fiziologici ai spermei de cocoş.
136

În particular, în experienţe separate, a fost determinată eficacitatea neelectroliţilor în
componenţa mediilor crioprotectoare pentru diluţia şi congelarea spermei de cocoş. Pentru
aceasta, în calitate de neelectroliţi au fost utilizate soluţii izotonice de glucoză, zaharoză, maltoză
şi rafinoză. La prima etapă sperma de cocoş s-a diluat cu soluţiile enumerate şi a fost determinată
eficacitatea glucidelor după indicii fiziologici ai spermatozoizilor (mobilitatea, longevitatea,
IAS). Rezultatele experimentale sunt prezentate în tabelul 4.7.
Tabelul 4.7. Acţiunea neelectroliţilor asupra indicilor fiziologici ai spermatozoizilor de cocoş
Indicii fiziologici ai spermatozoizilor
Nr. Denumirea Mobilitatea spermatozoizilor
Longevitatea, IAS,
ctr. neelectrolitului nativi, baluri
ore
u. c.
Nativi Diluaţi
1. Galactoza 8,3 ± 0,22 7,0 ± 0,09* 7,8 ± 0,22 18,2 ± 1,34
2. Lactoza 8,3 ± 0,22 6,0 ± 0,35* 5,0 ± 0,35 8,6 ± 1,44
3. Zaharoza 8,3 ± 0,22 7,1 ± 0,44* 7,4 ± 0,27 15,8 ± 1,20
4. Maltoza 8,3 ± 0,22 7,8 ± 0,22** 8,8 ± 0,22** 29,1 ± 2,48**
5. Rafinoza 8,3 ± 0,22 6,7 ± 0,22* 5,8 ± 0,22 13,6 ± 2,21
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu sperma nativă, **- lactoza.
Datele prezentate în tabelul 4.7 relevă, că utilizarea soluţiilor izotonice de glucide pentru
diluţia spermei de cocoş, contribuie la menţinerea calităţii spermei. De exemplu, micşorarea
mobilităţii spermatozoizilor diluaţi se produce la nivelul, la care se asigură viabilitatea înaltă a
spermiilor. Excepţie constituie soluţia izotonică de maltoză, care a asigurat cel mai înalt indice al
mobilităţii spermatozoizilor diluaţi. Longevitatea şi IAS ale spermatozoizilor sunt cele mai
minore în varianta de utilizare a lactozei şi cele mai majore la utilizarea maltozei.
În continuare neelectroliţii au fost utilizaţi pentru crioconservarea spermei de cocoş. În
special, s-a cercetat acţiunea lor asupra mobilităţii spermatozoizilor (tabelul 4.8).
Tabelul 4.8. Influenţa neelectroliţilor asupra mobilităţii spermatozoizilor de cocoş la
crioconservare
Nr. Mediile crioprotectoare suplimentate Mobilitatea spermatozoizilor,
ctr.
cu neelectroliţi
puncte
1. Pe bază de glucoză (martor) 4,9 ± 0,187
2. Pe bază de lactoză 4,3 ± 0,199*
3. Pe bază de zaharoză 4,5 ± 0,223
4. Pe bază de maltoză 5,8 ± 0,122*
5. Pe bază de rafinoză 4,6 ± 0,244
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
137

Datele tabelului 4.8 denotă, că folosirea soluţiilor izotonice de neelectroliţi pentru
crioconservarea spermei de cocoş permite de a menţine mobilitatea gameţilor în limitele
4,3±0,19 şi 5,8±0,12 puncte. În cazul utilizării maltozei în componenţa mediului crioprotector au
fost înregistrate cele mai înalte rezultate (5,8±0,122 baluri). Includerea lactozei în componenţa
mediului a dus la diminuarea mobilităţii spermatozoizilor. La experimentarea celorlalte glucide,
au fost stabilite rezultate, practic, identice cu cele din varianta martor.
Influenţa pozitivă a di- şi trizaharidelor poate fi argumentată prin faptul, că primele
interacţionînd cu moleculele de apă, formează legături puternice, care contribuie la structurarea
apei, iar dizaharidele, prioritar, influenţează pozitiv integritatea capului spermatozoizilor în
comparaţie cu monoglucidele [83]. Mai mult, di- şi trizaharidele provoacă o scădere mai mare a
punctului de cristalizare [103]. Printre ele se întîlnesc şi zaharide reduse.
Analiza în ansamblu a cercetărilor [6] denotă, că prezenţa glucidelor în componenţa
mediilor crioprotectoare pentru sperma de cocoş iniţiază inhibarea procesului de POL din
membrane şi diminuarea acumulării produselor toxice ale acestui proces. În rezultat se
ameliorează calitatea spermei decongelate şi selectiv se stabilizează indicii fiziologici ai
spermatozoizilor de cocoş.
4.2. Impactul acţiunii antioxidanţilor asupra stării morfo-funcţionale a spermei de cocoş la
acţiunea temperaturilor joase şi ultrajoase.
4.2.1. Acţiunea antioxidanţilor steroizi asupra stării morfologice şi funcţionale a
spermatozoizilor de cocoş la crioconservare.
Glicozidele steroide reprezintă o clasă imensă a substanţelor naturale din grupul
saponinelor, care atrag atenţia cercetătorilor datorită spectrului larg de activitate biologică şi
securitate ecologică. Ele pe larg se folosesc în medicina tradiţională ca preparate
antiinflamatoare, funghicide, contraceptive, antibiotice şi citotostatice. De asemenea, este
cunoscut că aceste substanţe diminuează nivelul CS în sînge şi au proprietate de acţiune
antioxidativă. Totodată, stimularea creşterii şi fitoimunităţii de către glicozidele steroide, permite
de a prezenta aceste substanţe ca adaptogeni naturali [120].
Soluţionarea problemei ce ţine de crioconservarea spermei animalelor domestice este strîns
legată de studierea componenţilor structurali ai gameţilor. În această vedere, o atenţie deosebită
se acordă lipidelor, ca elemente necesare, integrale şi esenţiale ale membranelor biologice.
Anume, compoziţia lipidică a membranelor determină un şir de funcţii esenţiale ale celulei.
Fluiditatea membranelor, clasterizarea proteinelor receptoare, formarea şi caracteristica
materialului supramembranic, toate acestea depind de componenţa şi structura lipidelor [42, 92].
138

Paralel, metabolismul lipidelor, activitatea enzimelor lipiddependente, viteza proliferării şi
permeabilitatea membranei sunt determinate de nivelul de POL [264]. Însă, dereglarea
intensităţii acestui proces poate fi cauza, într-o măsură oarecare, ca factor însoţitor al patologiilor
celulare. În legătură cu aceasta, s-a efectuat o serie de experienţe cu scopul explorării
posibilităţilor de stabilizare a structurilor morfologice şi proprietăţilor funcţionale ale
spermatozoizilor, folosind AO în componenţa mediilor crioprotectoare. În calitate de asemenea
compuşi, au fost experimentate glicozidele steroide. Eficacitatea utilizării lor pentru crioprotecţia
materialului seminal de cocoş este prezentată în tabelele 4.9-4.15.
Tabelul 4.9. Dinamica gametopatiilor şi mobilitatea spermatozoizilor crioconservaţi de cocoş în
funcţie de utilizare a glicozidului steroid – Asparagozid-B
Nr.
crt.
Varianta
experienţei
Concentraţia
antioxidanţilor,
mg%
Au fost
cercetaţi
spermatozoizi
Conţinutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelaţi,
baluri
1. I 5 600 27,2 ± 1,64 4,92 ± 0,168
2. II 2,5 600 27,3 ± 1,05 4,83 ± 0,183
3. III 1,25 600 27,3 ± 0,83 4,92 ± 0,166
4. IV 0,624 600 26,5 ± 1,40 5,08 ± 0,091
5. V 0,312 600 26,8 ± 1,63 5,25 ± 0,234
6. VI 0,156 600 26,3 ± 1,08 5,25 ± 0,234
7. VII 0,078 600 27,2 ± 0,87 5,17 ± 0,183
8. VIII 0,039 600 26,7 ± 1,12 5,17 ± 0,183
9. IX - martor 0 - martor 600 27,5 ± 0,84 5,17 ± 0,231
Datele prezentate în tabelul 4.9 demonstrează, că folosirea asparagozidei-B în componenţa
mediului pentru crioconservarea spermei de cocoş nu este eficientă.
În experienţa următoare a fost continuată studierea eficienţei asparagozidei, dar de acum a
fracţiei C. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.10.
Datele tabelului 4.10 demonstrează, că Asparagozida-C în concentraţii de la 5 pînă la 0,039
mg% în coponenţa mediilor crioprotectoare nu influenţează calitatea spermei de cocoş după
decongelarea ei.
Continuînd cercetările eficienţei asparagozidei, în următoarele experienţe a fost studiată
acţiunea asparagozidei-H asupra indicilor morfo-funcţionali ai spermatozoizilor de cocoş la
crioconservare. Rezultatele cercetărilor sunt prezentate în tabelul 4.11.
139

Tabelul 4.10. Dinamica gametopatiilor şi mobilitatea spermatozoizilor crioconservaţi de cocoş în
funcţie de utilizare a glicozidului steroid – Asparagozid-C
Nr.
crt.
Varianta
experienţei
Concentraţia
antioxidanţilor,
mg%
Au fost
cercetaţi
spermatozoizi
Conţinutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelaţi,
baluri
1. I 5 600 29,7 ± 1,41 3,75 ± 0,122
2. II 2,5 600 29,2 ± 1,42 3,92 ± 0,168
3. III 1,25 600 29,2 ± 2,27 4,17 ± 0,115
4. IV 0,624 600 29,5 ± 1,09 4,24 ± 0,122
5. V 0,312 600 28,5 ± 0,84 4,33 ± 0,115
6. VI 0,156 600 28,8 ± 0,87 4,58 ± 0,168
7. VII 0,078 600 28,8 ± 1,86 4,92 ± 0,168
8. VIII 0,039 600 29,7 ± 1,89 5,25 ± 0,168
9. IX - martor 0 - martor 600 29,8 ± 1,75 5,25 ± 0,122
Tabelul 4.11. Dinamica gametopatiilor şi mobilitatea spermatozoizilor crioconservaţi de cocoş în
funcţie de utilizare a glicozidului steroid – Asparagozid-H
Nr.
crt.
Varianta
experienţei
Concentraţia
antioxidanţilor,
mg%
Au fost
cercetaşi
spermatozoizi
Conţinutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelaţi,
baluri
1. I 5 600 26,3 ± 0,88 5,08 ± 0,261
2. II 2,5 600 25,8 ± 0,88 5,67 ± 0,115
3. III 1,25 600 23,3 ± 0,67 6,25 ± 0,112*
4. IV 0,624 600 21,8 ± 0,52* 6,67 ± 0,183
5. V 0,312 600 22,5 ± 0,68* 6,50 ± 0,200*
6. VI 0,156 600 25,5 ± 0,88 6,00 ± 0,141*
7. VII 0,078 600 26,3 ± 0,88 5,67 ± 0,183
8. VIII 0,039 600 26,7 ± 0,73 5,58 ± 0,168
9. IX - martor 0 - martor 600 26,5 ± 0,79 5,58 ± 0,168
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu lotul-martor.
Datele prezentate în tabelul 4.11 demonstrează efectul stabilizator al Asparagozidei-H în
concentraţii optimale.
În cercetările ulterioare a fost studiată eficienţa glicozidului steroid din grupa „Lilia”. Datele
obţinute în urma cercetărilor se prezintă în tabelul 4.12.
140

Tabelul 4.12. Dinamica gametopatiilor şi mobilitatea spermatozoizilor crioconservaţi de cocoş în
funcţie de utilizare a glicozidului steroid – Lilia-H
Nr.
crt.
Varianta
experienţei
Concentraţia
antioxidanţilor,
mg%
Au fost
cercetaşi
spermatozoizi
Conţinutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelaţi,
baluri
1. I 5 600 27,0 ± 1,16 4,75 ± 0,230
2. II 2,5 600 27,3 ± 1,60 4,92 ± 0,261
3. III 1,25 600 26,5 ± 2,39 5,17 ± 0,183
4. IV 0,624 600 24,7 ± 1,06 5,58 ± 0,165
5. V 0,312 600 23,2 ± 0,72 6,08 ± 0,168*
6. VI 0,156 600 23,8 ± 1,04 5,92 ± 0,168*
7. VII 0,078 600 25,5 ± 1,09 5,58 ± 0,166
8. VIII 0,039 600 26,7 ± 1,05 5,33 ± 0,115
9. IX - martor 0 - martor 600 26,7 ± 0,69 5,17 ± 0,115
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu lotul-martor.
Datele tabelului 4.12 denotă eficienţa includerii preparatului Lilia-H asupra stabilizării
mobilităţii gameţilor de cocoş după decongelare. Concentraţia optimă a glicozidului steroid a
constituit 0,312 şi 0,156 mg%.
Continuitatea cercetărilor influenţei compuşilor din seria „Lilia” s-a axat pe studiul acţiunii
substanţei Triozid-Lilia, rezultatele cărui sunt prezentate în tabelul 4.13.
Tabelul 4.13. Dinamica gametopatiilor şi mobilitatea spermatozoizilor crioconservaţi de cocoş în
funcţie de utilizare a glicozidului steroid – Triozid-Lilia
Nr.
crt.
Varianta
experienţei
Concentraţia
antioxidanţilor,
mg%
Au fost
cercetaţi
spermatozoizi
Conţinutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelaţi,
baluri
1. I 5 600 18,3 ± 0,46* 5,75 ± 0,121
2. II 2,5 600 17,5 ± 0,68* 6,25 ± 0,234*
3. III 1,25 600 18,5 ± 0,97* 6,08 ± 0,216
4. IV 0,624 600 20,8 ± 0,91 5,58 ± 0,154
5. V 0,312 600 24,0 ± 1,50 5,33 ± 0,115
6. VI 0,156 600 25,8 ± 1,04 5,25 ± 0,112
7. VII 0,078 600 26,3 ± 0,92 5,42 ± 0,091
8. VIII 0,039 600 27,2 ± 0,66 5,33 ± 0,115
9. IX - martor 0 - martor 600 27,7 ± 0,54 5,42 ± 0,215
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu lotul-martor.
141

Datele din tabelul 4.13 stabilesc rezultate benefice asupra stării morfologice şi funcţionale
ale spermatozoizilor de cocoş la influenţa Triozidei-Lilia.
În cercetările dedicate studierii eficienţei glicozidelor steroide de o altă provenienţă, a
Petumozidului-2, a fost studiată mobilitatea spermatozoizilor la diferite etape de crioconservare a
spermei de cocoş. Rezultatele obţinute sunt prezentate în tabelul 4.14.
Tabelul 4.14. Eficacitatea glicozidei steroide Petumozidei-2 pentru crioconservarea spermei de
cocoş
Nr.
ctr.
Concentraţia
Mobilitatea spermatozoizilor, puncte
glicozidelor, g/100 ml Nativi Refrigeraţi Decongelaţi
1. 5,0 x 10 -4 8,7 ± 0,21 8,3 ± 0,20 3,3 ± 0,21
2. 2,5 x 10 -4 8,7 ± 0,21 8,3 ± 0,20 3,7 ± 0,20
3. 1,25 x 10 -4 8,7 ± 0,21 8,3 ± 0,20 4,5 ± 0,36
4. 6,25 x 10 -5 8,7 ± 0,21 8,3 ± 0,20 5,2 ± 0,54
5. 3,15 x 10 -5 8,7 ± 0,21 8,3 ± 0,20 5,8 ± 0,21*
6. Mediul C2 (martor) 8,7 ± 0,21 8,3 ± 0,20 4,8 ± 0,20
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
Rezultatele experienţelor expuse în tabelul 4.14 relevă, că concentraţia optimă a
Petumozidului-2 este de 3,15x10 -5 g/100 ml mediu. Utilizarea acestui preparat permite de a
majora mobilitatea spermatozoizilor cu 24%, comparativ cu indicii analogici din grupul-martor,
unde AO nu a figurat.
Concomitent, s-a studiat şi influenţa Petumozidului-3 asupra mobilităţii spermatozoizilor
nativi şi decongelaţi. Rezultatele acţiunii acestei substanţe sunt prezentate în tabelul 4.15.
Tabelul 4.15. Eficacitatea gicozidei steroide Petumozidei-3 la crioconservarea spermei de cocoş
Nr.
ctr.
Concentraţia
Mobilitatea spermatozoizilor,
glicozidelor,
puncte
g/100 ml Nativi Decongelaţi
1. 5,0 x 10 -4 8,7 ± 0,21 4,2 ± 0,20
2. 2,5 x 10 -4 8,7 ± 0,21 4,0 ± 0,35
3. 1,25 x 10 -4 8,7 ± 0,21 4,0 ± 0,35
4. 6,25 x 10 -5 8,7 ± 0,21 4,7 ± 0,21
5. 3,15 x 10 -5 8,7 ± 0,21 4,7 ± 0,35
6. Mediul C2 (martor) 8,7 ± 0,21 4,7 ± 0,21
Datele cercetărilor au stabilit, că concentraţia Petumozidului-3 mai mare de 6,25x10 -5 g/100
ml este toxică pentru mobilitatea spermatozoizilor, iar concentraţiile egale cu cea menţionată şi
142

mai mici, sunt neutre pentru indicii studiaţi. Acest remediu posedă proprietăţi antioxidative
neutre.
Din datele tabelelor 4.9-4.15 urmează, că folosirea triozidei Liliea-H şi asparagozidei-H în
componenţa mediului crioprotector pentru materialul seminal de cocoş micşorează gametopatiile
cu 3-10 la sută. Îndeosebi, s-a dovedit a fi eficient triozidul. Este important de a menţiona, că
experimentarea asparagozidei-C şi asparagozidei-B nu manifestă acţiune asupra ratei de
gametopatii, ceea ce poate fi explicat prin specificul şi proprietăţile fizico-chimice ale AO.
Din datele expuse în tabele reiese, că concentraţia de 5 mg% a substanţelor experimentate
este toxică pentru gameţii de cocoş. Îndeosebi, s-a evidenţiat această proprietate în experienţele
cu asparagozida-C. Diminuarea concentraţiei AO a contribuit la majorarea mobilităţii
spermatozoizilor decongelaţi. Valoarea maximă antioxidativă s-a stabilit la experimentarea cu
asparagozida-H şi fracţia sumară Lilia-H. Utilizarea acestor preparate împreună cu componenţii
mediului crioprotector pentru cocoş permite de a majora indicele studiat cu 17,7% şi 17,8%,
corespunzător. De asemenea, ţine de menţionat, că asparagozida-H contribuie la majorarea
mobilităţii spermatozoizilor decongelaţi în limitele de concentraţii 1,25–0,156 mg% şi are
importanţă practică.
O activitate satisfăcătoare posedă şi triozida-Lilia (13,2%). În cazul folosirii asparagozidei-
C şi -B indicii fiziologici ai spermatozoizilor de cocoş după decongelare nu se ameliorează.
Prin urmare, activitatea antioxidativă a glicozidelor steroide depinde nu numai de
componenţa chimică, dar şi de particularităţile obiectului supus crioconservării.
Astfel, analiza studierii influenţei glicozidelor steroide (tabelele 4.9-4.15) asupra stării
morfo-funcţionale a spermei de cocoş permite de a concluziona, că dintre glicozidele steroide
studiate, cele mai eficiente la stabilizarea integrităţii morfologice şi activităţii funcţionale ale
spermatozoizilor în procesul crioconservării sau dovedit a fi Asparagozida-H şi Treozida-Lilia,
care au redus considerabil dinamica patologiilor şi au sporit mobilitatea rectilinie a
spermatozoizilor. În acelaşi timp, concentraţia optimală a glicozidelor steroide, studiate în
componenţa mediilor pentru crioconservarea spermei de cocoş, diferă semnificativ, ceea ce
determină variabilitatea activităţii antioxidative a lor.
4.2.2. Eficienţa influenţei vitaminelor la diferite etape tehnologice de crioconservare a
spermei de cocoş.
Vitaminele sunt substanţe chimice organice, necesare în cantităţi mici pentru procesele
vitale ale organismului. Ele influenţează activitatea organismului şi a sistemelor în ansamblu,
inclusiv şi a sistemululi reproductiv. S-a accentuat asupra faptului, că AO naturali (vitamina E,
143

acidul ascorbic) creează în materialul seminal un sistem integral de protecţie contra POL şi
produselor toxice ale metabolismului [171, 198, 223, 284].
Echilibru dintre producţia POL şi a AO protectori este considerat, ca factor determinant
important al calităţii materialului seminal, în special, a capacităţii de fertilizare [375]. Relaţiile
dintre POL şi statutul AO în sperma aviară au o importanţă considerabilă [386]. Antioxidanţii, în
general, pot fi împărţiţi în două grupe, şi anume, enzimatici şi nonenzimatici, iar rolul lor în
materialul seminal aviar este elucidat mai jos [147].
Este cunoscut, că vitaminele au proprietăţi antioxidative [143, 333]. Procesele de peroxidare
în obiectele biologice sunt reglate de AO endogeni. Însă, în condiţii nefavorabile, procesele de
peroxidare pot fi dereglate [204]. În legătură cu aceasta, cercetările noastre au avut ca scop
studierea influenţei vitaminelor, drept AO, asupra sanogenităţii spermatozoizilor.
O atenţie deosebită s-a atribuit AO dietetic – vitaminei E. A fost demonstrat, că 88% din
conţinutul vitaminei E din sperma de cocoş se află în spermatozoizi. În funcţie de dietă,
concentraţia vitaminei E în materialul seminal de cocoş variază între 0,46 micrograme/ml (fără
suplimentarea raţiei cu vitamina E), pînă la 1,04 micrograme/ml (cu suplimentarea raţiei cu
vitamina E la nivelul de 200 mg/kg) [386].
Vitamina E este formată din compuşi de tocoferoli şi tocotrienoli importanţi, mai cu seamă,
prin rolul lor în funcţiile antioxidative, rezistenţa la boli şi interacţiunile cu Se în integritatea
ţesutului. În plus, compuşii bioactivi ai vitaminei E sunt, la fel, implicaţi în stabilizarea
membranelor, reducerea reacţiilor oxidative, detoxificarea metalelor grele, sinteza
prostoglandinelor, sinteza si metabolismul unor vitamine şi metabolismul AA. [204, 284, 422].
Concomitent, conform lui Lin şi al. [284] fertilitatea şi durata de fertilitate sunt însuşirile
economie, cele mai importante pentru cocoşi, care pot fi influenţate de factorii de mediu, cum ar
fi temperatura şi iluminarea, precum şi aportul alimentar al vitaminei E [204].
O altă posibilitate pentru inhibarea POL se face prin includerea vitaminei E în solvenţii
spermei, eficienţa căreia a fost, mult mai joasă, decît integrarea ei în raţia alimentară [386, 387].
În cercetările noastre, în calitate de vitamină a fost folosită vitamina E (α-tocoferol acetat),
substanţă pe larg răspîndită în lumea vegetală şi animală. La deficitul tocoferolului în organism
au loc diferite schimbări patologice. Anume tocoferolul este o substanţă efectivă, care
preîntîmpină multe stări cu ar fi infertilitatea masculină, capacitatea imună a celulelor implicate
în răspunsul imun etc [25, 26], care pot apărea în celule în condiţii nefavorabile.
În prima experienţă a fost determinată concentraţia optimală a tocoferolului în componenţa
mediului pentru crioconservarea spermei de cocoş. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.16.
144

Tabelul 4.16. Eficienţa tocoferolului în componenţa mediului pentru crioconservarea spermei de
cocoş
Nr.
crt.
1.
Specificare
Mediul de bază +
Vitamina E – 0,1 mg%
Mobilitatea spermatozoizilor după, puncte
Diluare Refrigerare Decongelare
7,3 ± 0,32 7,2 ± 0,24 3,9 ± 0,20
2. _ „ _ + 0,2 _ „ _ 7,4 ± 0,28 7,2 ± 0,24 4,0 ± 0,31
3. _ „ _ + 0,3 _ „ _ 7,4 ± 0,28 7,2 ± 0,30 4,3 ± 0,31
4. _ „ _ + 0,4 _ „ _ 7,4 ± 0,32 7,2 ± 0,30 4,5 ± 0,28
5. _ „ _ + 0,5 _ „ _ 7,4 ± 0,40 7,2 ± 0,24 4,8 ± 0,28*
6. _ „ _ + 0,6 _ „ _ 7,4 ± 0,20 7,2 ± 0,24 4,3 ± 0,30
7. _ „ _ + 0,7 _ „ _ 7,4 ± 0,28 7,2 ± 0,30 4,1 ± 0,30
8. _ „ _ + 0,8 _ „ _ 7,3 ± 0,43 6,9 ± 0,41 3,8 ± 0,21
9. _ „ _ + 0,9 _ „ _ 7,3 ± 0,43 6,8 ± 0,40 3,7 ± 0,40
10. _ „ _ + 1,0 _ „ _ 7,3 ± 0,49 6,8 ± 0,40 3,5 ± 0,40
11. Mediul de bază 7,3 ± 0,32 7,0 ± 0,14 3,9 ± 0,20
Notă: *Diferenţa este statistic autentică.
Din tabelul 4.16 reiese, că tocoferolul acordă efecte diverse în mediile pentru sperma de
cocoş, în intervalul de concentraţii 0,1-1,0 mg%. Concentraţia optimală a tocoferolului în mediul
pentru diluarea şi congelarea spermei de cocoş este egală cu 0,5 mg%. Efectul preparatului este
mai evidenţiat după decongelarea spermei de cocoş, cînd mobilitatea spermatozoizilor a sporit cu
23%, de la 3,9±0,20 în varianta-martor pînă la 4,8±0,28 baluri în varianta experimentală.
Evoluţia procesului normal al spermatogenezei în organism are necesitatea de un anumit
conţinut de vitamine. În particular, dintre ele o semnificaţie deosebită au vitaminele E, C, A, PP
şi B1. Suplimentarea raţiei cu vitamina E pentru menţinerea şi ameliorarea productivităţii pe larg
este utilizată în creşterea intensivă a păsărilor, iar rezultatele variază în funcţie de nivelul şi
durata suplimentării cu această vitamină, rezervele genetice şi vîrstă [374].
Vitamina E (tocoferolul) stimulează structurile hipotalamo-hipofizare, care reglează
funcţiile testiculelor, procesele fiziologice ale epiteliului spermatic şi ale endocrinocitelor
interstiţiale, acţionează ca oxidant, care ameliorează calitatea spermei prin reducerea radicalilor
toxici pentru spermatozoizi. În procesul crioconservării activitatea acestei vitamine scade, ceea
ce a predeterminat includerea ei în componenţa mediilor crioprotectoare şi studierea influenţei
lui asupra stării morfologice a spermatozoizilor. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.17.
145

Datele prezentate în tabelul 4.17 demonstrează, că folosirea tocoferolului la diluare şi
refrigerare influenţează gametopatiile neesenţial şi, numai după decongelare se observă scăderea
gametopatiilor în varianta experimentală, unde conţinutul tocoferolului a constituit 0,4-0,5 mg%.
Tabelul 4.17. Influenţa vitaminei E asupra ratei celulelor seminale patologice în procesul
crioconservării, (%)
Nr.
ctr.
Specificare
Celule seminale patologice (%) apreciate după:
Diluare Refrigerare Decongelare
1. Mediul martor 19,4 ± 2,13 22,4 ± 4,10 30,4 ± 2,35
2.
Mediul martor +
Vitamina E – 0,3 mg%
20,3 ± 1,19 21,8 ± 5,04 28,4 ± 4,13
3. - „ - + 0,4 mg% 19,8 ± 3,83 20,3 ± 3,81 23,0 ± 1,35*
4. - „ - + 0,5 mg% 19,0 ± 1,80 19,8 ± 4,13 21,3 ± 2,14*
5. - „ - + 0,6 mg% 20,1 ± 2,34 20,4 ± 3,35 23,4 ± 3,02
Notă: *Diferenţa este statistic autentică.
Avînd în vedere, că vitamina E este considerată ca component principal al sistemului AO şi
acţionează ca sinergistă cu GSH-Px în procesul de protecţie a spermei de cocoş împotriva
stresului oxidativ [204], modificările înregistrate confirmă etapa vulnerabilă a crioconservării.
Vitamina C (acidul ascorbic) participă la reglarea sintezei hormonilor steroizi, activează
regenerarea fiziologică şi procesele de oxido-reducere, favorizează absorbţia microelementelor
(zinc, cupru, magneziu, potasiu, calciu), necesare pentru vitalitatea şi longevitatea
spermatozoizilor şi, în mod fiziologic normal, se sintetizează de către păsări. Astfel, a fost
recomandată în hrana păsărilor ca supliment pentru a atenua stresul, deoarece în timpul stresului
cerinţele pot depăşi capacitatea de sinteză [196, 231].
Stresul fiziologic, cum ar fi, căldura, bolile sau suprapopularea poate spori necesitatea
organismului în acid ascorbic [121]. Vitamina C este necesară pentru AA şi metabolismul
mineral, precum şi pentru sinteza testosteronului [311], care este esenţial în funcţiile de
reproducere a cocoşilor. Nowaczewski şi Kontecka [333] au documentat faptul, că acidul
ascorbic asigură 65% potenţialul antioxidativ al plasmei seminale şi au demonstrat, că
suplimentarea raţiei cu vitamina C, în rata de 200 mg/kg, acţionează benefic asupra proprietăţilor
de reproducere a cocoşilor în condiţii de stres termic.
Astfel, menţinerea spermatogenezei intense la păsări necesită includerea vitaminei C în raţia
alimentară a lor. Din aceleaşi considerente, această vitamină a fost inclusă în componenţa
mediilor sintetice pentru diluarea şi conservarea spermei de cocoş în condiţii hipotermale şi
studiată influenţa ei asupra mobilităţii şi longevităţii celulelor reproductive. Rezultatele sunt
prezentate în tabelul 4.18.
146

Nr.
ctr.
Tabelul 4.18. Studierea influenţei vitaminei C asupra capacităţilor funcţionale ale spermei de
cocoş
Specificare
147
Indicii spermei
Mobilitate, baluri Longevitate, ore
1. Soluţie fiziologică 5,8 ± 0,02 5,0 ± 0,61
2.
Soluţie fiziologică +
Vitamina C – 0,1 mg%
5,8 ± 0,02 4,2 ± 0,74
3. - „ - + 0,2 - „ - 5,6 ± 0,11 4,4 ± 0,77
4. - „ - + 0,3 - „ - 5,4 ± 0,11 3,1 ± 0,84
5. - „ - + 0,4 - „ - 4,9 ± 0,11 3,0 ± 0,35
6. - „ - + 0,5 - „ - 2,0 ± 0,53 2,2 ± 0,42
7. - „ - + 0,6 - „ - 1,7 ± 0,42 2,2 ± 0,42
8. - „ - + 0,7 - „ - 1,5 ± 0,40 1,6 ± 0,30
9. - „ - + 0,8 - „ - 1,2 ± 0,42 1,0 ± 0,10
10. - „ - + 0,9 - „ - 1,2 ± 0,84 0,2 ± 0,22
Datele prezentate în tabelul 4.18 demonstrează, că vitamina C în componenţa soluţiei
fiziologice cu concentraţia în limitele 0,1–0,9 mg% nu favorizează indicii spermatozoizilor.
Aceasta poate fi explicat prin faptul, că acţiunea vitaminei C a fost studiată numai în condiţiile
hipotermale ale mediului. La fel, se poate de lămurit şi prin eficienţa manifestată de către
vitaminele studiate la etapele de congelare-decongelare a spermei de cocoş, ceea ce rezultă din
datele prezentate în tabelele 4.16 şi 4.17.
Variabilitatea eficienţei vitaminelor studiate poate fi elucidată prin diferite mecanisme de
acţiune a lor asupra obiectelor biologice, ceea ce vine în concordanţă cu relatările privind
stabilizarea indicilor sanogeni ai spermei prin folosirea vitaminelor [122, 129].
Astfel, din contextul celor expuse reiese că vitamina E (α-tocoferol acetat) poate fi folosită
în componenţa mediilor sintetice ca un stabilizator al stării funcţionale şi structurilor morfologice
ale spermei de cocoş, chiar şi în condiţiile nefavorabile ale crioconservării. Totodată, efectul
antioxidativ şi membranotrop al vitaminelor cercetate poate fi realizat prin menţinerea şi
consolidarea statusului structural-funcţional al membranelor biologice ale spermatozoizilor, în
rezultatul cărora are loc sporirea mobilităţii şi diminuarea nivelului de spermatopatii.
4.2.3. Stabilizarea stării funcţionale a spermatozoizilor decongelaţi de cocoş prin utilizarea
substanţelor de diversă origine.
Vicasolul, strofantina şi glutationul au fost incluse în componenţa mediilor crioprotectoare
din considerentele, că vicasolul participă în procesele fermentative ale sistemului de generare a

ATP, strofantina inhibă accesul în celulă a Na + -ului şi efluxul K + -ului, creînd condiţii favorabile
pentru metabolismul acestor substanţe, iar glutationul participă în reglarea activităţii ATP-azelor
[131].
Studiind acţiunea strofantinei, vicasolului şi glutationului în sperma de cocoş, în
următoarele experienţe a fost determinată eficacitatea lor pentru stabilizarea indicilor fiziologici
ai materialului cercetat. În particular, în continuarea studiului influenţei glicozidelor steroide a
fost cercetată eficienţa steroidei cardiace (strofantinei) la crioconservarea spermei de cocoş.
Rezultatele studierii mobilităţii spermatozoizilor decongelaţi sunt prezentate în tabelul 4.19.
Tabelul 4.19. Acţiunea strofantinei asupra calităţii spermei congelate-decongelate de cocoş
Nr.
ctr.
Concentraţia strofantinei,
mg%
148
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelaţi, puncte
1. 12,500 4,25 ± 0,131
2. 1,250 4,18 ± 0,246
3. 0,125 4,21 ± 0,192
4. 0,062 4,46 ± 0,283
5. 0,031 4,68 ± 0,314
6. 0,016 4,53 ± 0,296
7. 0,008 4,32 ± 0,187
8. 0,004 4,32 ± 0,245
9. Martor ( mediul C-2) 4,24 ± 0,197
Datele expuse în tabelul 4.19 denotă, că concentraţia optimală a strofantinei în componenţa
mediului criprotector pentru sperma de cocoş constituie 0,031 mg%. Mobilitatea gameţilor
decongelaţi în acest caz constituie 4,7±0,31 puncte sau cu 0,4 puncte mai mult, comparativ cu
lotul-martor, unde strofantina nu s-a utilizat. În toate variantele experimentale valoarea indicilor
studiaţi nu s-a modificat la niveluri autentice, deoarece glicozida cardiacă blochiază Na + /K + -
ATP-aza transportatoare şi în rezultat conţinutul Na + în celule sporeşte ce provoacă deschiderea
Ca +2 -canalelor şi pătrunderea ionilor de Ca +2 în celule. În rezultat se produce inhibarea
interacţiunilor dintre compuşii structurali ai sistemelor intracelulare [236, 385].
Ulterior, în scopul prelungirii studierii eficacităţii vitaminelor şi reieşind din faptul, că
Vitamina K manifestă activitate, partcipînd în reacţiile fermentative ale sistemelor de generare
ale ATP-zelor [131], s-a cercetat influenţa ei asupra indicilor funcţionali ai spermei de cocoş la
crioconservare. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.20.
Din datele tabelul 4.20 urmează că vicasolul în concentraţie de la 1,6 pînă la 100 mg% nu
este toxic pentru sperma de cocoş, însă, schimbări esenţiale ale calităţii spermei decongelate nu
se observă. Aceasta poate fi explicat prin faptul, că vicasolul este o vitamină liposolubilă, funcţia

principală a căreia, fiind de participare în reacţiile de coagulare a sîngelui, asigurînd hemostaza
biologică, regenerarea ţesuturilor şi formarea ţesutului osos, însî, pe lîngă aceasta nu posedă
activităţi antioxidative. În spermă, în schimb, se desfăşoară multilateral, numai procese anabolice
[176, 180, 309, 401].
Tabelul 4.20. Eficacitatea vicasolului în componenţa mediului pentru crioconservarea spermei
de cocoş
Nr.
ctr.
Concentraţia vicasolului,
mg%
149
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelaţi, puncte
1. 100 4,16 ± 0,205
2. 50 4,00 ± 0,354
3. 25 4,33 ± 0,205
4. 12,5 4,00 ± 0,354
5. 6,25 4,16 ± 0,205
6. 3,125 4,33 ± 0,205
7. 1,602 4,33 ± 0,205
8. Martor (mediul C - 2) 4,00 ± 0,354
În contextul studierii acţiunii AO, a fost continuată cercetarea preparatelor cu proprietăţi
antioxidative. Una dintre substanţele cu proprietăţi antioxidative a fost glutationul – compus cu
structură chimică tripeptidică, care se sintetizează din cisteină, acidul glutamic şi glicină.
Este cunoscut, că adausul glutationului redus în mediu, modifică gradul de fragmentare a
cisteinei [341]. Glutationul intră în componenţa GSH-Px, enzimă, care joacă un rol-cheie în
detoxicarea produselor oxidative ale lipidelor în sperma de cocoş [223, 387] şi este un AO
deosebit, datorită rolului său de conversie a peroxidului de hidrogen în componente mai puţin
nocive [204, 284]. Acestui produs s-a atras o atenţie deosebită datorită efectului la utilizarea lui
în reproducere şi în gestionarea fertilităţii [147].
Proprietăţile glutationului au fost studiate la includerea lui în componenţa mediului pentru
crioconservarea spermei de cocoş. Rezultatele influenţei asupra indicilor fiziologici ai spermei
de cocoş sunt prezentate în tabelul 4.21.
Analiza datelor din tabelul 4.21 arată, că glutationul în componenţa mediilor pentru
crioconservarea spermei de cocoş, în diapazonul concentraţiilor de la 0,004 pînă la 12,500 mg%,
nu posedă proprietăţi stabilizatoare considerabile a indicilor de mobilitate ai spermatozoizilor.
Concomitent, se înregistrează o tendinţă de sporire a mobilităţii spermiilor decongelaţi, care
experimental a crescut cu 0,5 baluri sau 11% la o diferenţă neveridică. Eficienţa neautentică a
glutationului se explică prin faptul că în experienţele noastre sa utilizat forma oxidată a
glutationului, pe cînd proprietăţi membranotrope, posibil, are numai glutationul redus.

Nr.
ctr.
Tabelul 4.21. Activitatea glutationului asupra calităţii spermei decongelate de cocoş
Concentraţia glutationului,
mg%
150
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelaţi, puncte
1 12,500 4,33 ± 0,409
2 1,250 4,16 ± 0,204
3 0,125 4,33 ± 0,216
4 0,062 4,66 ± 0,205
5 0,031 4,66 ± 0,205
6 0,016 4,66 ± 0,205
7 0,008 4,33 ± 0,216
8 0,004 4,16 ± 0,204
9 Martor (mediul C - 2) 4,16 ± 0,204
Astfel, cercetarea empirică, care a fostutilizată de către noi la iniţierea acestor experienţe
este mai puţin eficientă decît cea planificată. La programarea utilizării preparatelor
membranotrope şi de altă natură, este necesar de a ţine cont de proprietăţile prioritare ale
substanţelor şi posibilităţile de manifestare ale acestor proprietăţi.
4.2.4. Indicii morfologici şi biochimici ai membranelor plasmatice şi acrozomale ale
spermatozoizilor de cocoş la acţiunea antioxidanţilor.
Pentru depăşirea problemelor de fertilitate din cauza performanţei slabe a efectivului
masculin, mai multe studii au arătat, că anume AO ar putea proteja membranele spermatozoizilor
şi creşterea viabilităţii spermatozoizilor. Ameliorarea fertilităţii masculine a fost în centrul
cercetărilor majore din domeniul conservării spermei de cocoş din ultimele decenii [264].
Componenţa lipidică a membranelor plasmatice, în mare măsură, determină activitatea
funcţională a celulelor. Fluiditatea membranelor, clasterizarea proteinelor receptoare, formarea şi
arhitectura matricelui exocelular depinde de componenţa şi structura lipidelor. Concomitent,
metabolismul lipidelor, activitatea fermenţilor lipid-dependenţi, viteza proliferării membranelor
depind de nivelul POL, care este un proces fiziologic normal. În acelaşi timp, ca consecinţă a
peroxidării extinse a lipidelor, reacţiile de POL în mod constant produc produse, care
influenţează în detrimentul capacităţii de fertilizare a spermei [148, 375, 387]. În condiţii
fiziologice normale, există un echilibru adecvat între ROS si AO [147].
Din aceste considerente, în următoarele experienţe s-a apreciat eficacitatea includerii AO în
componenţa mediului crioprotector pentru sperma de cocoş. Includerea în componenţa mediilor
a substanţelor biologice active, are un caracter secundar şi se foloseşte la dereglările pronunţate
ale homeostaziei celulelor. De exemplu, AO se utilizează pentru preîntîmpinarea POL din

structurile membranare ale spermatozoizilor, în care enzimele, care reglează POL au o activitate
scăzută. În acest scop, se foloseşte în componenţa mediilor pentru crioconservarea spermei
păsărilor inhibatorul fosfodiesterazei şi a enzimei discompunerii c-adenozinmonofosfatului (c-
AMP). S-a demonstrat, că influenţa dirijată a c-AMP, ca una dintre principalele nucleotide, care
aprovizionează bioenergetica celulei în mobilitatea şi supravieţuirea spermatozoizilor, se reflectă
pozitiv asupra rezultatelor crioconservării materialului seminal [83].
Cercetările ulterioare, destinate studierii mecanismelor de crioprotecţie şi criodeteriorare a
spermatozoizilor au fost consacrate studierii noilor AO, deoarece inducţia POL atinge structura
şi funcţia membranelor.
În conformitate cu concepţiile contemporane, POL decurge în cazul apariţiei radicalilor
specifici în sistemul biologic. Formarea radicalilor liberi şi a produselor POL, iniţiază schimbări
profunde de natură biochimică şi fiziologo-structurală în obiectele biologice, la diferite niveluri
de organizare a lor. Radicalii liberi, datorită electronilor necuplaţi, se includ în procesele
biochimice şi provoacă reacţii nespecifice de extragere a hidrogenului din compuşii chimici.
Intermediatorii iniţierii şi derulării reacţiilor de oxidare a radicalilor liberi, sunt radicalii, nu
numai a oxigenului dar şi ai lipidelor. Prin urmare, inhibarea acestor reacţii poate fi realizată
datorită interacţiunii cu radicalii de ambele forme. În conformitate cu aceasta, sunt necesari AO
cu o eficacitate înaltă, fapt ce a servit argumentare pentru studierea activităţii antioxidative a
glicozidelor steroide pentru crioconservarea spermei de cocoş.
Un rol semnificativ în procesul fecundării ovocitelor îndeplineşte aparatul acrozomal al
spermatozoizilor,iar cele mai sensibile structuri ale acestuia sunt membranele acrozomale, care
accelerat modifică structura şi componenţa lor. În legătură cu aceasta, au fost efectuate
experienţe, referitor la determinarea influenţei glicozidelor steroide asupra păstrării structurilor
morfologice la nivelul acrozomului. Rezultatele cercetărilor sunt expuse în tabelul 4.22.
Din datele tabelului 4.22 rezultă, că cel mai bine s-a păstrat integritatea acrozomului
spermatozoizilor de cocoş, cînd în componenţa mediului au fost incluse Asparagozida-H şi
Triozid-Lilia, în concentraţii, corespunzătoare de 0,624-0,312 şi 2,5-1,25 mg%. Datele obţinute
denotă eficienţa AO menţionaţi la stabilizarea structurilor morfologice ale spermiilor de cocoş.
Unul dintre indicii importanţi, care caracterizează calitatea materialului biologic este
raportul componenţilor principali din membrana plasmatică.
Conform datelor anterior obţinute în laborator, procesul crioconservării spermei animalelor
de fermă duce la diminuarea raportului proteine/lipide din membrana plasmatică a
spermatozoizilor. În experienţele efectuate a fost studiată posibilitatea comparativă a reglării
acestui raport, incluzînd în componenţa mediilor crioprotectoare preparate noi din grupa
151

glicozidelor steroide. Din această grupă s-a cercetat glucozdul steroid - petumozida. Rezultatele
sunt expuse în tabelul 4.23.
Tabelul 4.22. Acţiunea glicozidelor steroide asupra integrităţii acrozomului spermatozoizilor
decongelaţi de cocoş
Nr.
ctr.
Denumirea
antioxidantului
Concentraţia
antioxidantului,
mg%
Integritatea
acrozomului
spermatozoizilor, %
1. Asparagozida - C 0,078 40,5 ± 0,84
0,039 40,2 ± 0,84
0 - martor 41,1 ± 0,72
2. Asparagozida - B 0,312 41,0 ± 0,63
0,156 40,7 ± 0,97
0 - m 42,7 ± 0,97
3. Lilia - H 0,312 45,3 ± 1,16
0,156 45,7 ± 1,01
0 - martor 44,7 ± 0,46
4. Treozid - Lilia 2,5 50,8 ± 1,03*
1,25 49,5 ± 1,14*
0 - m 45,1 ± 0,34
5. Asparagozida - H 0,624 47,5 ± 0,55*
0,312 47,2 ± 0,33*
0 - martor 44,5 ± 0,61
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu lotul-martor.
Datele tabelului 4.23 denotă, că în membrana plasmatică a spermatozoizilor diferitor specii
de animale indicele studiat variază de la 0,21±0,09 la vier, pînă la 0,40±0,02 la taur, ce se
coincide cu gradul de criorezistenţă a spermei animalelor experimentate [92]. Utilizarea AO FH2
şi FH3 pentru crioconservarea spermei de taur, vier şi cocoş nu influenţează esenţial raportul
proteine/lipide din membrana plasmatică a spermatozoizilor.
Analiza rezultatelor expuse permite de a remarca, că AO în componenţa mediilor
crioprotectoare inhibă peroxidarea radicalilor liberi din spermă. Lipidele biocomplexelor
membranice sînt implicate în procesul peroxidării într-o măsură mai mică, datorită prezenţei
legăturilor puternice între componenţii structurali ai biocomplexelor. La POL din spermă, pot fi
prezenţi radicalii liberi sau lipide intercalate în biocomplexe, prin intermediul legăturilor slabe.
În acest fel, probabil, se produce peroxidarea preponderentă a lipidelor şi, prin urmare,
peroxidarea la acest nivel este inactivată de către AO.
152

Tabelul 4.23. Studierea influenţei antioxidative a Petumozida-2 (FH2) şi Petumozida-3 (FH3)
asupra raportului proteine/lipide din membranele plasmatice ale spermatozoizilor de cocoş şi ale
altor specii
Nr.
ctr.
1.
Varianta
experimentală
1. Sperma congelată în mediu fără
antioxidant
Sperma de cocoş
153
Raportul
proteine/lipide
0,22 ± 0,06
2. 2. Sperma congelată în mediu cu FH2 0,20 ± 0,07
3. 3. Sperma congelată în mediu FH3 0,23 ± 0,09
1.
1. Sperma congelată în mediu fără
antioxidant
Sperma de vier
0,21 ± 0,09
2. 2. Sperma congelată în mediu cu FH2 0,20 ± 0,04
3. 3. Sperma congelată în mediu FH3 0,18 ± 0,07
1.
1. Sperma congelată în mediu fără
antioxidant
Sperma de taur
0,40 ± 0,021
2. 2. Sperma congelată în mediu cu FH2 0,35 ± 0,030
Astfel, rezultatele obţinute permit de a menţiona, că substanţele membranotrope, inclusiv
AO cercetaţi, sunt preparate eficiente pentru crioconservarea spermei. Includerea acestora în
componenţa mediilor crioprotectoare pentru sperma animalelor permite de a majora indicii
fiziologici şi morfologici ai materialului deconservat. Acţiunea temperaturilor scăzute iniţiază
intensificarea semnificativă a reacţiei de POL, care este predeterminată, în primul rînd, de
sporirea activităţii fosfolipazelor.
Calitatea spermei decongelate de cocoş, paralel cu indicii funcţionali şi morfologici, este
caracterizată şi prin indicii biochimici. Importanţa proprietăţilor biochimice a determinat
iniţierea ulterioarelor experienţe, cu privire la studierea influenţei glicozidelor steroide asupra
conţinutului produselor primare, intermediare şi finale ale procesului POL la diferite etape a
tehnologiei de crioconservare a spermei de cocoş. Concomitent şi, la toate nivelele de organizare
a sistemelor biologice, la baza cărora se află sistemul fizico-chimic de reglare a POL prin
intraconexie cu principalele proprietăţi ale membranelor (permeabilitatea, viscozitatea şi starea
fazică) [284].
Pe parcursul derulării reacţiilor de POL, la etapa formării radicalilor liberi, în moleculele
acizilor graşi polinesaturaţi, cele mai labile componente ale lipidelor membranice [76], apare

sistemul legăturilor duble neconjugate, care este însoţit de apariţia maximelor în spectrul
fotometric la lungimea undelor de 233 nm. Modificarea conţinutului acizilor graşi, activaţi prin
receptorii intercelulari în procesul crioconservării, relevă despre derularea procesele reparative în
membranele spermatozoizilor [2]. Hidroperoxizii şi DAM se determină prin reacţia cu
tiocinamida amoniului şi acidul tiobarbituric, corespunzător. Experienţele au fost efectuate cu
folosirea în componenţa mediului sintetic a petumozidului, melangozidei şi rusticozidei.
Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.24.
Din datele tabelului 4.24 reiese, că substanţele studiate în calitate de AO nu influenţează
asupra conţinutului conjugatelor dienice nici la o etapă tehnologică de crioconservare a spermei
de cocoş. În acelaşi timp, este necesar de menţionat, că nici procesul de congelare-decongelare
nu influenţează asupra indicelui studiat. Rezultate analogice sunt obţinute şi la studierea
conţinutului produselor intermediare ale POL – hidroperoxizilor.
Glicozidele steroide cercetate au manifestat proprietăţi stabilizatoare asupra conţinutului
produselor finale ale POL – DAM, care semnificativ s-a redus sub influenţa tuturor preparatelor
studiate. Prin urmare, calitatea spermei este determinată, în primul rînd, de conţinutul DAM, care
poate fi reglat prin folosirea glicozidelor steroide.
Tabelul 4.24. Conţinutul produselor peroxidării lipidelor la diferite etape ale crioconservării
spermei de cocoş în dependenţă de folosirea glicozidelor steroide
Nr.
ctr.
Etapa
tehnologică a
crioconservării
1. Diluarea spermei
2.
3.
Refrigerarea
spermei
Decongelarea
spermei
Denumirea
preparatului
Petumozid-2
Melangozid
Rusticozid
Lotul martor
Petumozid-2
Melangozid
Rusticozid
Lotul martor
Petumozid-2
Melangozid
Rusticozid
Lotul martor
Conjugatele
dienice, u.e.
2,7 ± 0,28
3,8 ± 0,01
3,8 ± 0,26
3,8 ± 0,39
2,2 ± 0,08
2,1 ± 0,12
2,0 ± 0,11
2,1 ± 0,06
3,1 ± 0,36
3,4 ± 0,21
3,2 ± 0,33
4,0 ± 0,47
154
Produsele peroxidării lipidelor
Hidroperoxizii,
u.e.
0,20 ± 0,03
0,22 ± 0,011
0,23 ± 0,04
0,26 ± 0,02
0,21 ± 0,05
0,29 ± 0,07
0,25 ± 0,03
0,30 ± 0,02
0,53 ± 0,06
0,67 ± 0,06
0,66 ± 0,04
0,72 ± 0,02
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu mediul fără AO.
Dialdehida
malonică,
nMol/mlrd.
32,1 ± 8,01
34,1 ± 6,03
35,0 ± 6,07
38,6 ± 7,82
35,2 ± 2,12
35,1 ± 1,31
37,9 ± 1,76
40,2 ± 1,08
46,1 ± 3,61*
52,3 ± 3,74*
49,4 ± 0,63*
67,0 ± 2,48

Variaţia activităţii diferitor glicozide steroide poate fi clarificată, reieşind din faptul, că
activitatea biologică a glicozidelor este determinată de interacţiunea directă a lor cu sterinele
libere sau membrano-dependente, care se încadrează în limitele ipotezei „sterine”. Conform
cercetărilor contemporane, în membranele biologice se formează biocomplexele glicozidelor cu
CS membranară, în particular se formează complexe intercolesterină şi partea aglicană a
moleculei glicozidelor. Astfel de complexe şi sistemul enzimatic asigură protecţie contra
peroxizilor lipidici din membranele celulelor spermatice prin blocarea progresivă a lanţului de
POL şi neutralizarea peroxidului de hidrogen, ca iniţiator în POL [204, 284].
În acelaşi timp, un rol decisiv în formarea biocomplexelor are dimensiunea lanţului
hidrocarbonic al moleculei glicozidelor şi, evident, moleculele glicozidelor steroide au diferite
dimensiuni, respectiv şi diverse proprietăţi, ceea ce a fost confirmat prin rezultatele cercetărilor
noastre. Altă latură, se explică prin faptul, că interacţiunea glicozidelor cu membrana biologică,
localizarea şi orientarea moleculelor în membrane este determinată de particularitatea structurală
a aglicanului, formarea lanţurilor hidrocarbonice, numărul lor şi locul de alipire la aglicanul
respectiv [120].
Astfel, analizînd rezultatele acţiunii glicozidelor steroide la stabilizarea stării funcţionale a
spermatozoizilor de cocoş putem concluziona, că AO, ca substanţe biologice active, în procesul
crioconservării manifestă proprietăţi selective, referitoare la stabilizarea indicilor morfofuncţionali
şi biochimici ai spermatozoizilor de cocoş la diferite nivele de organizare a lor.
Activitatea antioxidantă depinde de tipul, doza şi durata de acţiune a AO. Cea mai pronunţată
activitate a AO se înregistrează după congelarea-decongelarea materialului sminal de cocoş. De
asemenea, datele actuale demonstrează că în procesul de crioconservare a spermei de cocoş,
bariera fiziologică a AO poate fi dereglată, ceea ce predetermină folosirea suplimentară a AO în
componenţa mediilor sintetice.
4.3. Specificul modificării componenţei spermei de cocoş la congelare-decongelare sub
influenţa regimelor termice tehnologice.
Perfecţionarea remediilor crioprotectoare este unul dintre momentele principale, ce
influenţează asupra stării morfologice a spermatozoizilor în stare congelată. O condiţie, nu mai
puţin importantă, este alegerea parametrilor optimali de refrigerare, congelare şi decongelare,
capabili de a manifesta la maximum efectul protector al componenţilor remediului. Pentru o mai
bună eficienţă, în procesul soluţionării problemelor de crioconservare a materialului biologic,
este necesar de a se lua în calcul ambele momente menţionate, deoarece ele sunt elementele
principale ale tehnologiei crioconservării şi minimalizării criodeteriorărilor.
155

În procesul de crioconservare are loc polarizarea electrică a matricelui, care este însoţită de
iradierea electromagnetică. Un rol important în mecanismele criodeteriorării, aparţine gradului
de dezechilibrare termică a materialului congelat, în special, vitezei de scădere a temperaturii.
Fenomenul polarizării electrice este determinat de trei procese relaxante: relaxarea termică a
formaţiunilor cristalice; relaxarea, determinată de transformarea lichidului în starea amorfă şi
deschiderea matricei amorfe. Aportul fiecărui dintre aceste procese, depinde de corelaţia fazelor
cristalice şi amorfe în matricea congelată. Aceasta demonstrează, că macromoleculele biologice
sau celulele, care se află în zona tensiunii termice, suferă de deteriorări mecanice, provocate de
cîmpurile electrice. Astfel, în cazurile cînd crioconservarea este rezultativă şi celulele sunt
transformate complet în starea amorfă, tensiunea termo-mecanică provoacă deteriorări în bio-
obiectul congelat. Aceste efecte pot fi motivul principal al deteriorării materialului genetic [68].
În acelaşi timp, procesul de pregătire şi realizare a tehnologiilor de crioconservare a spermei
de cocoş, în calitate de element obligatoriu, include scăderea temperaturii optimale de menţinere
a indicilor vitali ai gameţilor pînă la temperatura gazelor lichifiate [273, 274].
Reieşind din cele expuse, a fost studiată influenţa regimurilor moderate şi accelerate de
crioconservare asupra conţinutului formelor patologice ale spermatozoizilor de cocoş. Viteze
înalte ale congelării au fost realizate prin picurarea directă a spermei refrigerate în azotul lichid.
Vitezele moderate de congelare s-au realizat prin picurarea materialului refrigerat pe suprafaţa
plăcii de fluoroplast la temperatura de 110-120°C, cu expoziţie timp de două minute. Rezultatele
cercetărilor sunt prezentate în tabelul 4.25.
Tabelul 4.25. Influenţa regimurilor de crioconservare asupra gametopatiilor la cocoş
Nr.
ctr.
Regimele de congelare
156
Spermatozoizi decongelaţi, %
Patologici Integri
1. Sperma brută (martor) 12,0 ± 1,45 88,0 ± 1,45
2. Regime moderate 26,2 ± 1,97* 73,8 ± 1,97*
3. Regime accelerate 41,6 ± 1,76* , ** 58,4 ± 1,86* , **
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu varianta-martor. ** Diferenţa este
statistic autentică între regimele aplicate.
Datele tabelului 4.25 demonstrează, că folosirea regimului moderat de congelare, cînd
viteza scăderii temperaturii era de 60 °C/min creează posibilitate de a obţine spermatozoizi
intacţi în mărime de 73,8±1,97%. Regimul accelerat (4–196 ºC timp de 10 sec. = 1600 ºC/min.)
provoacă o scădere a conţinutului spermatozoizilor integri cu 15,4% în comparaţie cu regimul
moderat. Această diferenţă denotă, că scăderea bruscă a temperaturii poate condiţiona formarea
rapidă a cristalelor de apă, care conform legităţilor fizice sunt consecinţa scăderii numărului de

spermatozoizi cu structură normală. Prin urmare, reducerea formării cristalelor este posibilă prin
modularea proceselor termodinamice a cristalelor de apă [255, 257, 349].
Indicii termodinamici ai sistemelor criobiologice pot fi folosiţi pentru interpretarea
rezultatelor obţinute. În acest sens, se elaborează conceptul despre diferite potenţiale ale apei şi
substanţelor dizolvate şi despre influenţa formei cristalelor asupra potenţialului lor [308].
Concomitent cu studierea conţinutului gametopatiilor şi a spermatozoizilor normali a fost
studiată şi starea fiziologică a spermatozoizilor de cocoş. Datele sunt prezentate în tabelul 4.26.
Tabelul 4.26. Acţiunea regimurilor termice asupra calităţii spermei crioconservate de cocoş
Nr.
ctr.
Regimele
Indicii fiziologici ai spermatozoizilor
congelării Mobilitatea, baluri Longivitatea, ore
1. Regimuri moderate 3,2 ± 0,12 4,3 ± 0,55
2. Regimuri accelerate 0,5 ± 0,16* 1,61 ± 0,24*
Notă: *Diferenţa este autentică în comparaţie cu regimul moderat.
Analiza datelor prezentate în tabelul 4.26 demonsterează, că folosirea regimului moderat de
congelare permite de a obţine mobilitatea spermatozoizilor decongelaţi de cocoş la nivel de
3,2±0,12 baluri. Valoarea acestui indice la regimul accelerat de congelare a constituit numai
0,5±0,16 baluri, adică s-a micşorat de 6 ori. În condiţiile experimentale aplicate longevitatea
celulelor decongelate a atins o durată de 4,3±0,55 ore la temperatura camerei, comparativ cu
1,61±0,24 ore în varianta de congelare accelerată şi reprezintă 37,2%.
Astfel, scăderea nivelului gametopatiilor în procesul crioconservării spermei de cocoş şi
sporirea indicilor fiziologici este posibilă prin folosirea vitezelor optimale de refrigerare şi
congelare, precum şi, implicit, sunt caracteristice speciei de animale, mediilor sintetice şi
modalităţii de preambalare a materialului seminal.
În componenţa mediilor sintetice pentru diluarea şi crioconservarea spermei sunt incluse
substanţe criofilactice, în legătură cu ce, este necesar de a ţine cont, că chiar şi componenţii
înalteficienţi, paralel cu proprietăţile lor protectoare, pot produce şi efecte toxice [83]. Aceste
efecte nocive pot influenţa asupra morfologiei şi indicilor funcţionali ai spermatozoizilor. În
această ordine de idei, o parte componentă foarte importantă în tehnologia crioconservării, este
determinarea parametrilor optimali de refrigerare a materialului spermatic (tabelul 4.27).
Datele tabelul 4.27 arată, că cele mai bune rezultate referitoare la restabilirea mobilităţii
spermatozoizilor pot fi obţinute în cazul cînd sperma se răceşte pe parcursul a 15 min pînă la
temperatura de – 4 ºC. Este necesar de accentuat, că această perioadă de refrigerare, esenţial
diferă de cea similară în procesul crioconservării spermei de taur, unde durata refrigerării
157

spermei, la congelarea ei în formă de granule constituie 4 ore [32], fapt ce demonstrează
particularităţi semnificative ale spermei speciilor menţionate.
Tabelul 4.27. Acţiunea duratei de refrigerare şi congelare a spermei asupra restabilirii mobilităţii
spermatozoizilor de cocoş
Nr.
crt.
Durata,
min.
Refrigerarea spermei
158
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelaţi, puncte
1. 5 4,1 ± 0,209*
2. 10 4,8 ± 0,285*
3. 15 5,1 ± 0,274*
4. 20 4,9 ± 0,326*
5. 25 4,5 ± 0,177*
6. 30 4,1 ± 0,209*
7. 35 3,8 ± 0,332*
8. 40 3,4 ± 0,209
9. 45 3,2 ± 0,137
10. 60 2,7 ± 0,317
Congelarea spermei
1. 1,0 2,4 ± 0,209
2. 1,5 3,4 ± 0,112
3. 2,0 5,3 ± 0,285*
4. 2,5 4,8 ± 0,224*
5. 3,0 4,4 ± 0,274
6. 4,0 4,0 ± 0,177
7. 5,0 3,7 ± 0,224
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu varianta experimentală maximală.
Referitor la durata congelării spermei de cocoş în vaporii de azot lichid putem remarca, că
acest indice constituie 2 minute. Prin urmare, în această perioadă, posibil, are loc îngheţarea apei
libere, ceea ce duce la distrucţii semnificative ale spermatozoizilor. Din aceste considerente,
parametrul tehnologic studiat are necesitate de respectare strictă.
Astfel, în baza rezultatelor cercetărilor expuse în acest subcapitol putem concluziona, că la
crearea mediilor sintetice noi pentru crioconservarea spermei de cocoş, în scopul obţinerii
efectelor performante, este obligatoriu de a determina condiţiile optimale preponderente de
manifestare a proprietăţilor protectoare ale lor. Sperma de cocoş manifestă o sensibilitate sporită
la influenţa factorilor mediului înconjurător, ceea ce este necesar de a se avea în vedere la toate
etapele de manipulare a ei.

4.4. Stabilizarea funcţiei de barieră a spermei de cocoş la crioconservare.
Dereglarea proprietăţilor de barieră ale membranelor plasmatice, în mare măsură, pot
determina modificările proceselor care au loc în celulă. Sub acest aspect, un interes deosebit
prezintă studierea stării funcţionale a membranelor plasmatice, care asigură unul din elementele
principale a homeostaziei celulare – repartizarea asimetrică a substanţelor extra- şi intracelulare.
Valoarea cercetărilor membranelor plasmatice pentru criobiologie se manifestă prin faptul, că
influenţa numeroşilor factori fizico-chimici în procesul croconservării: modificarea componenţei
membranei, pH-lui, forţelor ionice şi osmotice, scăderea temperaturii, deshidratarea şi,
concomitent, formarea gradienţilor termici în limitele de divizare a mediilor extra- şi
intracelulare, provoacă continuu deteriorări ale membranelor plasmatice, inclusiv permiabilitatea
lor, în diverse intensităţi, comparativ cu celelalte membrane celulare [61]. Factorul iniţial al
criodeteriorării celulelor în rezultatul dereglării funcţiilor de barieră ale membranelor plasmatice
este estimarea deshidratării [42, 89].
Reieşind din cele expuse, în cercetările efectuate am studiat concentraţia optimală a
preparatelor, care ar putea stabiliza starea barieră a membranelor plasmatice a spermatozoizilor
de cocoş în procesul de crioconservare.
În conformitate cu importanţa majoră a ionilor de Na + şi K + pentru menţinerea potenţialelor
electrochimice şi osmotice din celulă, a ionilor de Li + şi Ca 2+ pentru inducerera transformărilor
conformaţionale ale biopolimerilor şi a activităţii multor fermenţi [46, 61, 66, 108], în continuare
am studiat concentraţia ionilor de Na + , K + , Li +, Ca 2+ în sperma de cocoş decongelată, în
dependenţă de componenţa mediilor sintetice, în componenţa cărora au fost incluse vicasolul,
strofantina şi glutationul. Ionii de K + , Na + şi Li + pot avea interacţiuni specifice şi cu FL.
Aceste remedii au fost incluse în componenţa mediilor crioprotectoare, după cum s-a
menţionat mai sus, din considerentele, că vicasolul participă în numeroase reacţiile fermentative
ale sistemului de generare al ATP-ului, strofantina produce inhibarea accesului în celulă al Na + şi
efluxul K + -ului, creînd condiţii favorabile pentru metabolismul acestor substanţe, iar glutationul
participă în reglarea activităţii ATP-azelor [131, 141]. Rezultatele cercetărilor sunt prezentate în
tabelul 4.28.
Din tabelul 4.28 urmează, că conţinutul de Na + în spermatozoizii decongelaţi variază în
variantele experimentale în limitele 189,7±12,28 şi 201,2±10,52 mg%, corespunzător, preparatul
utilizat. Cea mai mare concentraţie de K + s-a înregistrat la folosirea glutationului. Avînd în
vedere, că în condiţiile crioconsevării spermei de cocoş are loc transportul K + -ului din celulă,
atunci rezultatul obţinut în cazul folosirii glutationului prezintă interes în sensul posibilităţilor de
reglare a concentraţiei de K + în spermatozoizi la crioconservarea lor.
159

Tabelul 4.28. Influenţa strofantinei, vicasolului şi a glutationului asupra concentraţiei ionilor de
Na + , K + , Li + , Ca 2+ în procesul de crioconservare a spermei de cocoş
Nr.
ctr.
Varianta
experimentală
Concentraţia ionilor, (mg%)
Na + K + Li + Ca 2+
Sperma decongelată
160
Raport
ul
Na + /K +
1. Sperma 259,3 ± 19,30 35,9 ± 4,03 0,60 ± 0,07 7,90 ± 0,25 7,22
2. Plasma 280,6 ± 19,00 47,8 ± 4,97 0,30 ± 0,07 7,66 ± 0,74 5,86
3. Spermatozoizi 182,6 ± 5,32 43,3 ± 4,58 0,17 ± 0,04 3,16 ± 0,36 4,21
Vicasol
1. Sperma 272,2 ± 9,11 47,0 ± 5,99 0,40 ± 0,07 7,50 ± 0,71 5,79
2. Plasma 283,4 ±11,7 58,8 ± 8,67 0,33 ± 0,04 6,50 ± 0,35 4,82
3. Spermatozoizi 189,7 ± 12,28 51,56 ±3,57 0,17 ± 0,04 3,16 ± 0,54 3,68
Strofantină
1. Sperma 250,0 ± 21,29 45,6 ± 11,16 0,63 ± 0,08 8,00 ±1,54 5,48
2. Plasma 266,6 ± 35,96 44,6 ± 13,05 0,47 ± 0,17 7,50 ±1,50 5,98
3. Spermatozoizi 201,2 ± 10,52 59,6 ± 3,90 0,17 ± 0,04 2,33 ± 0,54 3,38
Glutation
1. Sperma 272,2 ± 9,10 44,5 ± 5,84 0,60 ± 0,07 9,33 ± 0,74 6,12
2. Plasma 297,8 ± 9,52 51,6 ± 3,57 0,47 ± 0,04 8,17 ± 0,98 5,77
3. Spermatozoizi 191,3 ± 5,32 63,3 ±1,47* 0,13 ± 0,04 2,67 ± 0,41 3,03
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu folosirea vicasolului.
Faptul posibilităţilor de stabilizare a conţinutului ionilor de K + capătă o valoare
semnificativă, întrucît K + pe parcursul etapelor crioconservării continuu scade în spermatozoizi.
Diminuarea lui demonstrează, că membranele plasmatice păstrînd conductibilitatea, pierd ionii
de K + intracelular. Aceasta se explică prin faptul, că 20-30% din totalul ionilor de K + intracelular
se află în stare combinată şi numai o cantitate mică a lui este în starea disociată, care şi determină
proprietăţile lui osmotice. Derularea acestor procese pot avea un deosebit interes pentru starea
osmo-coloidală a proteinelor şi starea morfo-funcţională a membranelor plasmatice. În
particular, este cunoscut că scăderea concentraţiei ionilor de K + , în mediu, mai mult decît 20-30
mmol/l, provoacă dezacordarea interacţiunilor proteo-proteice şi lipo-proteice în biomembranele,
care sunt însoţite de pierderea proprietăţilor bariere [33, 61].
De asemenea, la folosirea glutationului s-a înregistrat o tendinţă de creştere a conţinutului
de Ca + în spermă şi în plasma seminală, care îndeplineşte funcţii importante de reglare. Reglarea
funcţiei proteinelor prin conţinutul Ca +2 are o semnificaţie deosebită pentru funcţionarea spermei

şi, în particular, hiperactivarea ei, hemotaxisul şi reacţia acrozomală [347]. Infertilitatea spermei
poate fi explicată şi prin diminuarea concentraţiei ionilor de Ca +2 [211], conţinutul cărora în toate
variantele experienţei este cel mai mic în spermatozoizi. Prezenţa lor poate fi predeterminată de
existenţa organelor spermatice, unde se depozitează Ca +2 [362]. În spermii ţesuturile depozitelor
de Ca +2 reglează pătrunderea sau eliminarea lor în spaţiu intra- sau extracelular [163, 356].
Modificarea conţinutului ionilor de Ca +2 în celulă, poate avea loc prin transportul lor din
citoplasmă, unde concentraţia este de zeci de mii de ori mai mare. Acest transport se produce
prin canalele membranare (Ca +2 ). Existenţa canalelor pentru Ca +2 este bine studiată. La
dereglarea permeabilităţii canalelor Ca +2 -conductoare are loc pierderea proprietăţilor de
fertilizare ale materialului seminal [260].
În conformitate cu rezultatele experienţelor efectuate, în continuare a fost studiată
posibilitatea stabilirii interdependenţei dintre mobilitatea gameţilor decongelaţi, vivacitatea lor,
IAS, concentraţia ionilor de Na + , K + , raportul proteine/lipide şi raportul Na + /K + , la fel, sub
influenţa strofantinei, vicasolului şi glutationului (tabelul 4.29).
Tabelul 4.29. Acţiunea strofantinei, vicasolului şi glutationului în procesul de crioconservare a
spermei de cocoş asupra indicilor morfo-funcţionali
Nr.
ctr.
Denumirea
substanţelor
1. Strofantină
2. Vicasol
3. Glutation
Mobilitatea,
puncte
4,4 ±
0,11*
4,25 ±
0,17*
4,8 ±
0,14
Indicii fiziologici ai
spermatozoizilor
Durata
vieţii,
ore
6,0 ±
0,35
5,75±
1,09
6,6 ±
0,47
IAS,
u.c.
13,2 ±
0,06
11,5 ±
2,0
13,75 ±
1,78
161
Concentraţia
Na + ,
mg%
201,2 ±
10,52
189,7 ±
19,28
191,3±
5,32
Concentraţia
K + ,
mg%
59,6 ±
3,90
51,56 ±
3,57
63,3 ±
1,47
Raportul
proteine
/
lipide
0,45 ±
0,09
0,47 ±
0,03
0,35 ±
0,13
Raportul
Na + /K +
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu glutationul.
Datele prezentate în tabelul 4.29 demonstrează despre existenţa interdependenţei directe
dintre indicii fiziologici ai spermatozoizilor şi conţinutul ionilor de K + în spermii decongelaţi. O
interdependenţa inversă s-a stabilit între mobilitatea spermatozoizilor şi conţinutul ionilor de
Na + , raportul protein/lipide şi Na + /K + .
Astfel, în sperma decongelată de cocoş concentraţia ionilor de Na + prevalează asupra celor
de K + şi acest raport nu suportă modificări în procesul de crioconservare, nici la folosirea în
componenţa mediilor a substanţelor biologice active.
3,38
3,68
3,03

Datele prezentate în subcapitolul prezent ne permit de a concluziona că:
1. Stabilizarea funcţiei bariere a membranei plasmatice şi echilibrului ionilor dintre mediul
ambiant şi spermatozoizii de cocoş în procesul crioconservării lor, poate fi realizată prin
includerea în componenţa mediilor sintetice a substanţelor biologice active cu proprietăţi de
blocare a activităţii radicalilor liberi.
2. S-a constatat o dependenţă directă dintre indicii caracteristici pentru starea funcţională a
spermatozoizilor de cocoş şi conţinutul ionilor de K + şi o interdependenţă inversă, cu privire la
ionii de Na + , raportul proteine/lipide şi Na + /K + .
3. În spermatozoizii de cocoş prevalează conţinutul ionilor de Na + asupra celor de K + şi
acest raport nu suportă modificări în procesul de crioconservare, nici la folosirea în componenţa
mediilor a substanţelor biologice active.
4.5. Influenţa substanţelor coordinative la stabilizarea şi fortificarea spermatogenezei la
cocoş.
Este cunoscut, că matricea structurală a spermatogenezei, care este condiţionată de
integritatea organogenezei a sistemului reproductiv, se află în corelaţie atît cu factorii genetici,
cît şi cu cei epigenetici [122]. Ultimii includ şi influenţe ale mediului, ca factori determinanţi ai
spermatogenezei (acţiuni teratogenice, remediile farmaceutice, dereglări alimentare etc).
Spermatozoizii se formează în procesul spermatogenezei, care durează la cocoşi 21-27 zile
şi include 3 perioade: dezvoltarea celulelor sexuale primare, prespermatogeneza sau
spermiogeneza şi spermatogeneza. Ultima include trei stadii: spermatogonială, meiotică şi
spermatidă. Durata spermatogenezei este determinată genetic şi nu se supune schimbărilor
esenţiale.
În acelaşi timp, factorii mediului intern şi extern influenţează spermatogeneza, derularea
căreia este reglată de sistemul neuroendocrin. La animalele domestice, inclusiv şi cocoşi se
deosebesc trei grupe de spermatozoizi, care diferă prin proprietăţile fiziologice: testiculare,
epididimale şi ejaculare [50, 92]. În perioada transportării celulelor productive prin canalele
sistemului reproductiv, are loc modificarea fiziologică şi ultrastructurală a celulelor, care sunt
determinate de maturizarea lor şi obţinerea proprietăţilor fecundative [30].
Menţinerea intensităţii spermatogenezei ca proces fiziologic, care cuprinde totalitatea
transformărilor prin care trec spermatogoniile, reprezintă una dintre sarcinile prioritare ale
sanocreatologiei şi se realizează prin formarea dirijată şi reglementarea statusului fiziologic,
inclusiv şi al cordului în condiţiile variabile ale mediului [135].
162

Membrana celulară, care are un caracter glicolipidic, condiţionează rezistenţa şi
supravieţuirea spermatozoizilor în epididium, unde ei se păstrează după maturizare. Însă,
depozitarea îndelungată provoacă deteriorarea şi moartea celulelor. Totodată, ejacularea activă,
care are loc la exploatarea intensă a reproducătorilor, diminuează calitatea materialului seminal,
întrucît aceasta duce la formarea celulelor nematurizate şi reducerea fertilităţii masculine [88].
Pentru depăşirea problemelor de fertilitate din cauza performanţei slabe a efectivului
masculin, mai multe studii au arătat, că anume influenţarea proceselor de spermatogeneză prin
intermediul factorilor esenţiali, participanţi în spermoproducţie ar putea reglementa creşterea
proprietăţilor biologice ale spermatozoizilor [122, 124, 125].
Reieşind din cele expuse reiese, că derularea spermatogenezei poate fi dirijată. În legătură
cu aceasta, în cercetările efectuate am studiat influenţa preparatelor coordinative asupra
spermatogenezei la cocoş. Aceste obiective vin în concordanţă cu principiile dezvoltării
ştiinţifice ale sanocreatologiei, care prevăd elaborarea teoriei şi practicii dirijate în formarea şi
menţinerea sănătăţii, nu numai a organismului integru, dar şi a tuturor structurilor morfofuncţionale,
inclusiv şi a sistemului reproductiv [126, 136].
Remediile coordinative au fost sintetizate în acest scop, la catedra de chimie anorganică a
USM. Rezultatele cercetărilor sunt prezentate în tabelul 4.30.
Tabelul 4.30. Modificarea volumului spermei pe parcursul evoluţiei spetrmatogenezei la cocoş
(ml)
Varianta
experi
enţei
I.
(martor)
Prepara-
Frecvenţa recoltării spermei de la cocoş
tul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
-
II. LAZ
III. TAS
IV.
LAZ +
TAS
0,27 ±
0,038
0,20 ±
0,001
0,23 ±
0,027
0,27 ±
0,038
0,30 ±
0,001
0,27 ±
0,038
0,23 ±
0,027
0,30 ±
0,001
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
0,30 ±
0,149
0,23 ±
0,027
0,30 ±
0,149
0,37 ±
0,027
163
0,30 ±
0,001
0,27 ±
0,028
0,30 ±
0,001
0,43 ±
0,027
0,33 ±
0,027
0,30 ±
0,001
0,33 ±
0,027
0,57 ±
0,027*
0,37 ±
0,027
0,30 ±
0,001
0,33 ±
0,027
0,50 ±
0,001*
0,33 ±
0,027
0,27 ±
0,038
0,33 ±
0,027
0,53 ±
0.027*

Datele tabelului 4.30 demonstrează, că în perioada preexperimentală volumul ejaculatului în
toate grupele a constituit de la 0,2±0,001 pînă la 0,27±0,38 ml. Această asociere este statistic
neautentică. Peste 21 zile după iniţierea experienţei volumul ejaculatului s-a mărit de la
0,27±0,38 pînă la 0,43±0,027 ml în varianta IV a experienţei. O majorare analogică se
înregistrează şi în varianta postexperimentală timp de o săptămînă. Majorarea volumului în
varianta IV poate fi determinată prin intensificarea spermatogenezei la aceşti cocoşi.
Mobilitatea spermatozoizilor este un indice, general acceptat, care caracterizează amplu
starea funcţională a lor şi este o funcţie obligatorie a spermatozoizilor, în absenţa cărora este
imposibila fecunditatea [252, 325, 354]. Reglarea mobilităţii poate fi realizată prin intermediul
unei varietăţi largi de factori atît cu acţiune endogenă, cît şi exogenă [287, 385, 392]. În acest
context, la următoarea etapă de cercetări a fost studiată anume mobilitatea spermatozoizilor.
Rezultatele se prezintă în tabelul 4.31.
Tabelul 4.31. Indicii mobilităţii spermatozoizilor în perioada spermatogenezei la cocoş (baluri)
Varianta
experi
enţei
I.
Martor
Prepa-
Frecvenţa recoltării spermei de la cocoş
ratul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
-
II. LAZ
III. TAS
IV.
LAZ +
TAS
7,2 ±
0,04
7,7 ±
0,27
7,3 ±
0,20
8,0 ±
0,47
7,8 ±
0,01
7,7 ±
0,27
7,7 ±
0,26
8,3 ±
0,27
7,7 ±
0,01
7,7 ±
0,27
8,0 ±
0,47
7,5 ±
0,24
164
7,5 ±
0,01
7,7 ±
0,27
8,8 ±
0,25*
8,2 ±
0,14
7,8 ±
0,16
8,7 ±
0,14
8,7 ±
0,27*
9,3 ±
0,14
7,7 ±
0,13
8,2 ±
0,36
8,7 ±
0,27*
8,3 ±
0,14
7,5 ±
0,23
8,0 ±
0,01
8,3 ±
0,27*
8,0 ±
0,01
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
Din rezultatele prezentate în tabelul 4.31 reiese, că mobilitatea spermatozoizilor pe
parcursul experienţei este reprezentată de la 7,2±0,04 pînă la 8,8±0,25 baluri, care se determină
în varianta trei, la administrarea preparatului TAS. Preparatul a fost suplimentat cu Se, ca
element esenţial, care are un rol important în reproducerea păsărilor [159, 195]. Seleniul organic,
ca de altfel toate mineralele organice, are o biodisponibilitate şi activitate biologică mult mai
mare, comparativ cu cea a Se anorganic.

La includerea Se organic în raţia alimentară a cocoşilor creşte, în mod semnificativ,
concentraţia GSH-Px în testicule, spermatozoizi şi plasma seminală, iar efectul AO al Se, a fost
explicat prin rolul său, ca parte componentă a enzimei antioxidante GSH-Px [204, 284, 387].
Rezultatele demonstrează, că administrarea acestui preparat, favorizează intensitatea
indicelui studiat. Aceasta se datorează faptului, că preparatul experimentat, posedă proprietăţi
mai eficiente şi participă la reglarea reacţiilor de oxidoreducere, care determină aprovizionarea
celulelor cu energia necesară pentru dinamica mişcării celulelor. Un efect analogic, se
înregistrează şi în varianta IV a experienţei.
Aşadar, mobilitatea spermatozoizilor determină starea funcţională a lor, iar în conformitate
cu datele literaturii de specialitate fecunditatea spermatozoizilor, în mai mare măsură depinde şi
de longevitatea lor [50, 92]. În acelaşi timp, este cunoscut, că nu toate celulele mobile păstrează
longevitatea spermatozoizilor după congelarea-decongelarea spermei de cocoş (tabelul 4.32).
Tabelul 4.32. Longevitatea spermatozoizilor în perioada spermatogenezei la cocoş (ore)
Varianta
experi
enţei
I.
Martor
Prepa-
Frecvenţa recoltării spermei de la cocoş
ratul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
-
II. LAZ
III. TAS
IV.
LAZ +
TAS
17,0 ±
0,47
19,0 ±
0,47
18,7 ±
0,54
19,7 ±
1,32
17,3 ±
0,27
20,3 ±
1,09
18,7 ±
0,72
18,7 ±
1,31
17,7 ±
0,27
20,3 ±
0,72
20,0 ±
0,94
19,7 ±
1,36
165
17,3 ±
0,54
20,3 ±
0,66
18,7 ±
0,72
18,0 ±
0,47
18,0 ±
0,01
22,7 ±
0,27*
18,7 ±
0,54
21,4 ±
1,19
17,7 ±
0,27
22,7 ±
0,27*
22,3 ±
1,87
23,0 ±
0,01
17,3 ±
0,27
22,0 ±
0,01*
21,3 ±
0,96
21,0 ±
0,47
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
Datele tabelului 4.32 demonstrează, că valoarea indicelui studiat la temperatura camerei
variază de la 7,0±0,45 pînă la 23,0±0,01 ore. Cele mai înalte rezultate au fost obţinute în varianta
II a experienţei, unde longevitatea spermatozoizilor a crescut, faţă de varianta-martor, deja în
decurs de două săptămîni de la începutul administrării cocoşilor a preparatului LAZ. Sporirea
acestui indice s-a păstrat şi în perioada postexperimentală timp de o săptămînă. Efectul
înregistrat poate fi explicat prin faptul, că Zn asimilat, participînd în reacţiile enzimatice şi alte

procese, a creat condiţii econome de folosire a energiei de către spermatozoizi. În particular,
unele cercetări au demonstrat, că sub influenţa Zn-ului se intensifică spermatogeneza, se înnoiesc
spermatogoniile, sporeşte meioza şi concentraţia celulelor germinale [197, 209].
Rezultate cercetărilor au arătat, de asemenea, că Zn are un rol important în sinteza ADNului
prin proliferarea celulelor şi meiozei, iar ATP sintetizat de către mitocondrii, cu participarea
Zn, este necesar pentru activitatea spermatozoizilor. Concomitent, s-a demonstrat, că
concentraţia de Zn în testicule creşte în timpul spermatogenezei şi, în general, Zn se acumulează
în celulele germinale, dar nu şi în celulele interstiţiale Sertoli [322].
Totodată, unele studii au arătat că o concentraţie mare de Zn este prezentă în testicule, iar un
deficit de Zn inhibă spermatogeneza şi produce anomalii ale spermei [315]. În prezent există
unele relatări, care vizează, în detalii, funcţia Zn-ului în procesul spermatogenezei. Sorensen şi
al. [381] au demonstrat, că Zn-ul este prezent în spermatogoniile şi spermatocitele primare. S-a
demonstrat, că Zn se acumulează în testicule în timpul spermatogenezei precoce şi poate juca un
rol-cheie în reglementarea proliferării spermatogoniilor şi în meioza celulelor germinale [208,
322].
În cercetările efectuate s-a urmărit ca scop, de a interveni şi a stimula anume această
perioadă de formare şi dezvoltare a spermatozoizilor. Rezultatele influenţei substanţelor
coordinative asupra concentraţiei celulelor reproductive de cocoş sunt prezentate în tabelul 4.33.
Tabelul 4.33. Concentraţia spermatozoizilor pe parcursul spermatogenezei la cocoş (mlrd/ml)
Varianta
experi
enţei
I.
Martor
Prepa-
Frecvenţa recoltării spermei de la cocoş
ratul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
-
II. LAZ
III. TAS
IV.
LAZ +
TAS
2,02 ±
0,082
2,27 ±
0,185
2,22 ±
0,121
2,11 ±
0,049
2,05 ±
0,117
2,10 ±
0,120
2,77 ±
0,113*
2,86 ±
0,028*
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
3,17 ±
0,297
2,56 ±
0,200
3,27 ±
0,200
3,27 ±
0,052
166
2,09 ±
0,145
3,21 ±
0,056
3,76 ±
0,078*
4,18 ±
0,107*
2,27 ±
0,130
3,09 ±
0,074
3,66 ±
0,173*
4,83 ±
0,059*
2,20 ±
0,295
3,12 ±
0,122
3,62 ±
0,137*
5,75 ±
0,071*
2,21 ±
0,204
3,13 ±
0,072
3,61 ±
0,092*
5,23 ±
0,059*

Din datele tabelului 4.33 reiese, că includerea suplimentară a preparatelor coordinative în
raţia cocoşilor benefic influenţează spermatogeneza la cocoş. Aceasta se manifestă prin sporirea
concentraţiei spermatozoizilor în ejaculat. Cea mai reprezentativă sporire s-a înregistrat în
varianta IV a experienţei, unde valoarea indicelui studiat a sporit de la 2,11±0,49 pînă la
5,75±0,07 mlrd/ml. S-a demonstrat, că nu numai Zn şi Se separat administrate influenţează
spermatogeneza, dar şi combinarea acestor elemente în complexele coordinative.
Efectele lor benefice au fost înregistrate, în special, în biotehnologiile de creştere a păsărilor
agricole. Unele dintre mineralele organice de mare importanţă pentru nutriţia păsărilor sunt: Se şi
Zn [25, 155, 386]. Influenţa preparatelor depinde şi de natura lor. Prin urmare, putem
concluziona că acţiunea preparatelor utilizate asupra concentraţiei spermatozoizilor în variantele
experimentale este sinergistă.
Pentru biotehnologia reproduceri animalelor agricole, o importanţă majoră are
spermoproductivitatea reproducătorilor, indice, care determină nu numai calitatea, dar şi
cantitatea materialului seminal, fiind rezultatul înmulţirii unui indice cu altul. Rezultatele
cercetării influenţei preparatelor coordinative asupra spermoproductivităţii cocoşilor sunt
prezentate în tabelul 4.34.
Tabelul 4.34. Influenţa preparatelor coordinative asupra spermoproductivităţii cocoşilor
Varianta
experi
enţei
I.
Martor
Prepa-
Frecvenţa recoltării spermei de la cocoş
ratul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
-
II. LAZ
III. TAS
IV.
LAZ +
TAS
0,54 ±
0,120
0,45 ±
0,186
0,51 ±
0,148
0,57 ±
0,087
0,61 ±
0,118
0,57 ±
0,158
0,64 ±
0,140
0,86 ±
0,029
0,93 ±
0,446
0,59 ±
0,227
0,98 ±
0,349
1,20 ±
0,079
167
0,63 ±
0,146
0,87 ±
0,084
1,13 ±
0,079*
1,39 ±
0,134*
0,75 ±
0,157
0,93 ±
0,075
1,21 ±
0,200
1,75 ±
0,186*
0,81 ±
0,322
0,94 ±
0,123
1,19 ±
0,164
1,87 ±
0,078*
0,73 ±
0,231
0,84 ±
0,110
1,19 ±
0,119
1,77 ±
0,086*
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
Datele tabelului 4.34 demonstrează, că spermoproductivitatea cocoşilor, incluşi în
experienţă variază în limitele 0,45±0,186 pînă la 1,87±0,078 mlrd/ejaculat. Acest indice sporeşte

semnificativ numai în varianta IV. La compararea datele din tabelele 4.30 şi 4.34 se constată, că
spermoproductivitatea în varianta IV este determinată atît de volumul spermei, care creşte pe
parcursul perioadei experimentale, cît şi de concentraţia sporită a spermatozoizilor. Prin urmare,
în varianta IV a experienţei, preparatele utilizate, favorizează nu numai cantitatea
spermatozoizilor, dar şi cantitatea plasmei seminale, care contribuie la realizarea activităţii
funcţionale a spermatozoizilor.
În acelaşi timp, spre deosebire de valorile indicilor din varianta IV, în cea de a II-a şi a III-a,
concentraţia spermatozoizilor, la fel, sporeşte, iar volumul nu suferă modificări esenţiale. Aceste
constatări demonstrează, că mecanismul acţiunii preparatelor coordinative studiate asupra
spermatogenezei la cocoş diferă multilateral, ceea ce condiţionează necesitatea cercetărilor
suplimentare de perspectivă.
Efectul preparatelor coordinatrive poate fi determinat din următoarele considerente. Zincul
este un element important în procesele de derulare a spermatogenezei. Rolul fiziologic al Zn-ului
este determinat de participarea lui în procesele fermentative, fiind component al circa 200 de
fermenţi intracelulari, care participă la replicarea şi transcripţia ADN şi ARN şi, totodată, el
asigură majorarea nivelului de hormoni reglatori ai spermatogenezei. Conţinutul de Zn în hrană
deseori este insuficient, de aceea se include suplimentar în raţia alimentară atît sub formă de
substanţe neorganice, cît şi organice. Problema constă în eficienţa asimilării Zn-ului, care la
păsări are loc în intestinul subţire, care reprezintă mediu acid. Zn neorganic formează în acest
mediu compuşi insolubili, care nu se asimilează. Un moment foarte important este, că sursele
organice, ce conţin Zn disociază în mediul acid cu un pH de la 2,0 pînă la 5,0 şi asimilarea Zn
din sursele organice, este efectiv superioară celei din sursele neorganice. Un interes deosebit
reprezintă formele organice ale Zn-ului în componenţa adausurilor biologice active, utilizate în
creşterea intensivă a păsărilor, însă aceste preparate sunt dificile şi costisitoare.
Este necesar de menţionat şi rolul biologic al Se. Seleniul, microelement cu valori biologice
antioxidative, care participă în diverse reacţii de oxidoreducere în organismul animalelor
homeoterme. Una dintre cele mai importante funcţii ale Se-ului în organism constă, după cum sa
subliniat deja anterior, în rolul său de AO. Acţiunea sa antioxidativă este potenţată de
interrelaţiile existente între Se şi vitamina E, vitamină liposolubilă existentă în membranele
celulare, cu rol de apărare în mecanismele celulare contra peroxidării FL membranice. Seleniul,
component al GSH-Px, acţionează printr-un mecanism secundar de apărare, ca urmare a
incapacităţii vitaminei E de a distruge toţi peroxizii metabolismului. Tot în calitate de component
intracelular al GSH-Px, Se acţionează împreună cu vitamina E pentru reducerea stresului celular.
Ca urmare a acţiunii sale de AO, prezenţa Se-ului suplimentar în alimentaţie are influenţe
168

enefice asupra ameliorării funcţionale a sistemului reproductiv şi asupra altor sisteme vitale ale
organismului [164, 203, 204].
Eficienţa Se-ului se datorează, în mare măsură, sinergiei masive dintre Se şi vitamina E care
nu funcţionează în lipsa Se-ului. Astfel, s-a constatat că un aport suplimentar al Se-ului organic
în organism este cel de participare în procesul de vindecare a infertilităţii masculine şi a altor
dereglări [25, 26]. De exemplu, Se participă în eritropoeză, contribuie la menţinerea şi
longevitatea activităţii sexuale. Circa jumătate din volumul Se se conţine în canalele seminifere
şi se elimină din organismul masculilor prin ejaculate. Prin urmare, recuperarea deficitului de Se
are o importanţă majoră pentru organismul cocoşilor, intensiv implicaţi în procesul de
reproducţie.
În acelaşi timp, în acest scop, este cunoscută utilizarea extractului tulpinei cianobacteriilor
Spirulina platensis, pentru optimizarea spermatogenezei la tauri reproducători [13]. Însă această
metodă nu poate fi folosită pentru cocoşi, deoarece acţiunea specifică a preparatelor asupra
activităţii spermatogenezei este condiţionată selectiv la diferite animale domestice.
Astfel, analizînd rezultatele cercetărilor prezentate în prezentul subcapitol putem
concluziona, că preparatele coordinative sintetizate direcţonat pentru sporirea asimilării Zn şi Se,
posedă proprietăţi spermatogenezostimulatoare. Preparatele LAZ şi TAS au proprietăţi
sinergiste, care se manifestă prin influenţa lor asupra spermatogenezei la cocoş. Preparatul LAZ,
fiind administrat în organism stimulează concentraţia şi longevitatea spermatozoizilor de cocoş.
4.6. Concluzii la capitolul 4.
Din datele prezentate în acest capitol este posibil de a concluziona, că la studierea rolului
proteinelor în stabilizarea indicilor morfo-funcţionali ai gameţilor de cocoş la crioconservare,
folosirea argininei în componenţa mediului C-2 influenţează indicii fiziologici după
crioconservarea spermei de cocoş, care poate fi explicată prin stabilizarea complexelor dintre
elementele structurale ale proteinelor, membranelor şi ale mediului crioprotector. În acelaşi timp,
proteinele din componenţa mediilor de crioconservare provoacă modificări evidente în structura
proteinelor plasmei seminale şi duc la prevalarea γ-globulinelor pe fonul scăderii albuminelor,
manifestînd efecte protectoare.
Lipidele exogene, folosite în procesul de crioconservare a materialului seminal de cocoş,
posedă proprietăţi protectoare numai asupra longevităţii spermatozoizilor decongelaţi, ceea ce
poate fi condiţionat prin proprietăţile lipidelor de a substitui şi economisi sursele energetice,
necesare pentru prelungirea activităţii vitale a lor.
În procesul de crioconservare, prezenţa glucidelor în componenţa mediilor pentru sperma de
cocoş iniţiază inhibarea procesului de POL din membrane şi diminuarea acumulării produselor
169

toxice ale acestui proces. În rezultat se ameliorează calitatea materialului seminal decongelat şi,
selectiv, se stabilizează indicii fiziologici ai spermatozoizilor de cocoş.
La cercetarea activităţii antioxidative a produselor steroide s-a stabilit, că dintre glicozidele
steroide studiate, cele mai eficiente la stabilizarea integrităţii morfologice şi activităţii
funcţionale ale spermatozoizilor în procesul crioconservării spermei de cocoş sau dovedit a fi
Asparagozida-H şi Treozida-Lilia, care au redus considerabil dinamica patologiilor şi au sporit
mobilitatea rectilinie a spermatozoizilor. În acelaşi timp, concentraţia optimală a glicozidelor
steroide studiate în componenţa mediilor pentru crioconservarea spermei de cocoş diferă
semnificativ, ceea ce determină variabilitatea activităţii antioxidative a lor.
Variabilitatea eficienţei vitaminelor studiate este elucidată prin mecanisme de acţiune a
vitaminei E (α-tocoferol acetat), care poate fi folosită în componenţa mediilor sintetice, ca un
stabilizator al stării funcţionale şi structurilor morfologice ale spermei de cocoş, chiar şi în
condiţiile nefavorabile ale crioconservării. Totodată, efectul antioxidativ şi membranotrop al
vitaminelor cercetate poate fi realizat prin menţinerea şi consolidarea statusului structuralfuncţional
al membranelor biologice ale spermatozoizilor, în rezultatul căruia are loc sporirea
mobilităţii şi diminuarea nivelului de spermatopatii.
Cercetarea empirică, care s-a utilizat de către noi la iniţierea experienţelor de stabilizare a
stării funcţionale a spermatozoizilor decongelaţi de cocoş prin utilizarea substanţelor de diversă
origine, este mai puţin eficientă decît cea planificată. La programarea utilizării preparatelor
membranotrope şi de altă natură, este necesar de a ţine cont de proprietăţile prioritare ale
substanţelor şi posibilităţile de manifestare ale acestor proprietăţi.
Analizînd rezultatele acţiunii glicozidelor steroide la stabilizarea stării funcţionale a
spermatozoizilor de cocoş putem menţiona, că AO ca substanţe biologice active, în procesul
crioconservării manifestă proprietăţi selective, referitore la stabilizarea indicilor morfofuncţionali
şi biochimici ai spermatozoizilor de cocoş la diferite nivele de organizare a lor.
Activitatea antioxidativă depinde de tipul, doza şi durata de acţiune a AO. Cea mai pronunţată
activitate a AO se înregistrează după congelarea-decongelarea materialului seminal de cocoş. De
asemenea, datele actuale demonstrează, că în procesul de crioconservare a spermei de cocoş,
bariera fiziologică a AO poate fi dereglată, ceea ce predetermină folosirea suplimentară a AO în
componenţa mediilor sintetice.
Ţine de menţionat, că la elaborarea mediilor noi pentru crioconservarea spermei de cocoş în
scopul obţinerii efectelor performante este obligatoriu de a determina condiţiile optimale
preponderente de manifestare a proprietăţilor protectoare ale lor. Sperma de cocoş manifestă o
170

sensibilitate sporită la influenţa factorilor mediului ambiant, ceea ce este necesar de a avea în
vedere la manipularea ei.
Datele prezentate în prezentul capitol ne permit de a conchide, că stabilizarea funcţiei
bariere a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor şi echilibrului ionilor dintre mediul
ambiant şi spermatozoizii de cocoş în procesul crioconservării lor poate fi realizată prin
includerea în componenţa mediilor sintetice a substanţelor biologice active, cu proprietăţi de
blocare a activităţii radicalilor liberi.
S-a constatat o dependenţă directă dintre indicii caracteristici pentru starea funcţională a
spermatozoizilor de cocoş şi conţinutul ionilor de K + şi o interdependenţă inversă, cu privire la
ionii de Na + , raportul proteine/lipide şi Na + /K + . În spermatozoizii de cocoş prevalează conţinutul
ionilor de Na + asupra celor de K + şi, acest raport, nu suportă modificări în procesul de
crioconservare, chiar nici la folosirea în componenţa mediilor a substanţelor biologice active.
La cercetarea influenţei substanţelor coordinative asupra stabilizării şi fortificării
spermatogenezei la cocoş s-a demonstrat, că preparatele coordinative sintetizate direcţonat
pentru sporirea asimilării Zn şi Se, posedă proprietăţi spermatogenezostimulatoare. Preparatele
LAZ şi TAS au proprietăţi sinergiste, care se manifestă prin influenţa lor asupra spermatogenezei
la cocoşi. Preparatul LAZ, fiind administrat în organism stimulează concentraţia şi mobilitatea
spermatozoizilor de cocoş.
5. ELABORAREA TEHNOLOGIILOR DE CONSERVARE, PĂSTRARE, UTILIZARE A
SPERMEI DE COCOŞ ŞI IMPLEMNTAREA REZULTATELOR OBŢINUTE
5.1. Elaborarea principiilor de creare a mediilor sintetice crioprotectoare.
În baza cercetărilor proprii şi analizei factorilor, care provoacă criodeteriorarea celulelor
a fost elaborat un concept nou, conform căruia, stabilitatea morfo-funcţională a spermei de cocoş
este predeterminată atît de procesele biochimice ale plasmei, cît şi ale membranelor spermiilor,
inclusiv spectrul proteic şi lipidic, raportul proteine/lipide, nivelul de POL, permeabilitatea
membranelor pentru ionii de Na + , K + , Li + , Ca 2+ , Mg 2+ , pH-ul plasmei, gradientul osmotic, iar
menţinerea integrităţii structurale şi capacităţilor funcţionale ale spermei în procesul de
crioconservare poate fi realizată prin selectarea direcţionată şi utilizarea substanţelor cu
proprietăţi de a menţine procesele biochimice în plasmă şi spermii la nivelul stării native şi prin
alimentarea cocoşilor cu preparate, care favorizează spermatogeneza sanogenă.
Una dintre problemele principale ale cercetărilor fundamentale şi aplicative în domeniul
criobiologiei materialului seminal al animalelor domestice este determinarea psibilităţii
stabilizării activităţii funcţionale a spermatozoizilor după prelucrarea lor tehnologică. Rezolvarea
171

acestei probleme este posibilă prin intermediul nivelului de cunoaştere a mecanismelor de
criodeteriorare şi elaborarea, în baza lui, a procedeelor de prevenire a criodeteriorărilor.
O altă posibilitate de soluţionare a acestei probleme, este studierea interdependenţei
corelative dintre modificările morfologice, biochimice, fizico-chimice ale spermatozoizilor în
dependenţă de factorii mediului ambiant şi indicii păstrării proprietăţilor funcţionale ale spermei.
Este necasar de menţionat, că stabilizarea activităţii funcţionale a spermatozoizilor după
decongelare, în mare măsură, este determinată de proprietăţile protectoare ale componentelor
mediilor sintetice.
În conformitate cu practica laboratorului şi comunicările literaturii de specialitate [3, 32, 78,
81, 109, 174] la crioconservarea spermei de cocoşi (şi altor obiecte biologice) este necesar, în
primul rînd, de a determina modificările criogenice şi numai, după care, este posibilă selectarea
optimală a componentelor necesare ale mediilor. Reieşind din aceste considerente au fost
elaborate principiile de creare a mediilor crioprotectoare, care sunt prezentate în tabelul 5.1.
Numărul
principiului
Tabelul 5.1. Principiile de bază ale elaborării mediilor sintetice crioprotectoare
Denumirea
principiului
I Stabilizator
II Inhibitor
III Reglator
Prevederile principiului Posibilitatea de realizare
prin folosirea
Menţinerea:
1. Osmolarităţii Sărurilor organice,
neorganice, glucidelor
2. Tamponării Sistemelor de tamponare
3. pH-ul mediului
Substanţelor organice şi
neorganice
Blocarea:
1. Formării cristalelor Metodei vitrificării
2. Evoluţiei microorganizmelor Preparatelor antimicrobiene
3. Formării radicalilor liberi Preparatelor antioxidative
4. Formării substanţelor toxice Antidoţilor
5. Proceselor metabolice Diminuării gazelor organice
şi a altor antimetaboliţi
172
Dirijarea:
1. Activităţii fermenţilor Inhibitorilor revesibili ai
sărurilor metalice bivalente
2. Permiabilitatea membranelor Protonoforilor
IV Combinator Utilizarea:

V Modificator
VI Stimulator
1. Crioprotectorilor
2. Cristaloprotectoarelor
3. Substanţelor cu acţiune
endocelulară
173
Alcoolilor, amidelor,
sulfoxidelor
Combinării componenţilor
mediului cu diferite
mecanisme de acţiune
Substanţelor cu masa
moleculară mică
4. Substanţelor cu acţiune
exocelulară.
Substanţelor polimerice
5. Substanţelor biologic active Fermenţii, vitaminele
6. Componenţilor mediului
Electroliţilor,
biologic
neelectroliţilor, substanţellor
biologice active
Schimbarea:
1. Structurii cristalelor de
Polimerilor sintetici
gheaţă
2. Limitele eutectice Agenţilor crioprotectori
1. Fortificării de energie
2. Formării biocomplexelor
dintre mediul şi membranelor
plasmatice
3. Formării structurilor
criorezistente
Stimularea:
Glucidelor, inhibitorilor
reacţiilor fermentative
Proteinelor, lipidelor
Antifrizelor
4. Activităţii funcţionale a Activatorilor sistemelor
spermatozoizilor după
fermentative, substanţelor
deconservarea lor
macromoleculare
Principiile elaborate pot orienta cercetătorii spre posibilitatea corectării dereglărilor concrete
în structura şi funţia celulelor, pot simplifica investigaţiile direcţionate, însă nu oferă răspuns la
întrebarea despre posibilitatea utilizării fixe a anumitor substanţe la crioconservarea
bioobiectelor concrete, ceea ce este imposibil. Determinarea varietăţilor de aplicare rămîne de
perspectivă în limitele creatoare ale cercetătorilor.
5.2. Elaborarea metodelor de stabilizare şi fortificare a spermatogenezei la cocoş.
Rezolvarea cu succes a problemelor de crioconservare şi păstrare hipotermală a spermei de
cocoş, în mare măsură, depinde de calitatea iniţială a materialului seminal, care este determinată,

preponderent, de derularea spermatogenezei [122, 124, 125, 324].
Reieşind din cele expuse mai sus, scopul cercetărilor ulterioare a fost cercetarea
posibilităţilor de influenţă dirijată asupra procesului de spermatogeneză.
În calitate de factor, care determină calitatea spermei a fost selectat factorul alimentar. În
legătură cu aceasta, în componenţa raţiei alimentare, general acceptate, a fost inclusă substanţa
coordinativă, cu conţinut de Zn şi de acid tricloracetic (LAZ). Acest remediu a fost sintetezat
direcţionat la catedra de chimie anorganică a USM (şeful catedrei, academician al AŞM A.
Gulea) şi cu amabilitate oferit pentru a fi utilizat în experienţe. Rezultatele acţiunii acestui
preparat sunt prezentate în tabelul 5.2.
Tabelul 5.2. Influenţa preparatului coordinativ LAZ asupra spermatogenezei la cocoş
Nr.
ctr.
Indicii studiaţi ai spermei
174
Variantele experienţei
Martor Experimentală
1. Volumul spermei, ml. 0,37 ± 0,027 0,30 ± 0,001
2. Concentraţia spermatozoizilor, mlrd/ml. 2,20 ± 0,295 3,12 ± 0,122*
3. Mobilitatea spermatozoizilor, baluri. 7,7 ± 0,13 8,2 ± 0,36
4. Longevitatea spermatozoizilor, ore 17,7 ± 0,27 22,7 ± 0,27*
5. Spermoproductivitatea, mlrd/ejaculat 0,814 ± 0,161 0,937 ± 0,061
Notă: *Diferenţa este statistic autentică.
Rezultatele prezentate în tabelul 5.2 denotă, că folosirea substanţei coordinative în
componenţa raţiei cocoşilor în cantitate de 1 ml/cocoş, timp de 35 de zile influenţează benefic
spermatograma cocoşilor şi, îndeosebi, concentraţia şi longevitatea spermatozoizilor.
Efectul stimulator al preparatului coordinativ LAZ la spermatogeneza cocoşilor este
condiţionat prin asimilarea efectivă a Zn-ului. Aceasta provoacă sporirea indicilor cantitativi şi
calitativi ai producţiei spermatice, comparativ cu varianta-martor. În particular, concentraţia
spermatozoizilor în ejaculat prevalează cu 41% (3,1 faţă de 2,2mlrd/ml), spermoproductivitatea
sporeşte cu 15% (0,937 faţă de 0,814 mlrd), mobilitatea spermatozoizilor se majorează cu 6%
(8,2 faţă de 7,7 baluri), iar longevitatea cu – 28% (22,7 faţă de 17,7 ore).
Eficienţa obţinută este predeterminată prin faptul, că preparatul studiat influenţează prin
intermediul mecanismelor de stimulare a epiteliului germinativ şi sinteza ADN-ului, precum şi
prin reglarea acţiunii enzimelor zincdependente [208, 345, 351]. Zincul se acumulează în
celulele germinative, în special, în mitocondriile spermatogoniilor şi spermatozoizilor [416],
participă în reglementarea proliferării spermatogoniilor şi în meioza germinală [322].
Astfel, spermatogeneza poate fi stimulată prin perfecţionarea raţiei alimentare a cocoşilor,
folosind Zn-ul organic în forme uşor asimilabile de către organism.

5.3. Explorarea mediilor pentru diluarea şi conservarea hipotermală în scopul menţinerii
integrităţii morfo-funcţionale a spermei de cocoş.
5.3.1. Elaborarea mediilor sintetice în baza neelectroliţilor pentru diluarea şi conservarea
spermei de cocoş.
Situaţiile create în ultimii ani, legate de riscul răspîndirii gripei aviare şi altor maladii
infecţioase, reducerea importurilor de ouă pentru incubaţie şi pui de o zi, au reorientat crescătorii
de păsări din R. Moldova la creşterea tineretului avicol autohton [28].
Un rol important în această privinţă îl ocupă reproducerea intensivă a păsărilor, bazată pe
realizările biotehnologiilor moderne. În acest context, însămînţarea artificială a păsărilor cu
spermă diluată şi conservată, poate contribui la ameliorarea substanţială a sectorului avicol.
Reieşind din condiţiile general acceptate, în elaborarea unor noi reţete de medii diluante şi
conservante, un rol important îl prezintă unele caracteristici biofizice ale mediilor respective. În
legătură cu aceasta, au fost efectuate experienţe conform schemei prezentate în tabelul 5.3.
Tabelul 5.3. Schema experienţelor pentru determinarea acţiunii substanţelor incluse în
componenţa mediilor sintetice pentru diluarea şi păstrarea hipotermală a spermei de cocoş asupra
indicilor fiziologici ai spermatozoizilor
Nr.
crt.
Varianta
experienţei
Substanţele incluse în mediul sintetic
pentru diluarea spermei de cocoş
175
Tehnica pregătirii
soluţiilor
1. I Soluţie izotonică de lactoză 0,6 g +5 ml Bi H2O
2. II Soluţie izotonică de glucoză 0,3 g + 5 ml Bi H2O
3. III Soluţie izotonică de fructoză 0,3 g + 5 ml Bi H2O
4. IV-martor Sperma nativă -
5. V Soluţie izotonică de zaharoză 0,3 g + 5 ml Bi H2O
6. VI Soluţie izotonică de sorbit 0,3 g + 5 ml Bi H2O
Pentru determinarea acţiunii unor substanţe în componenţa mediilor sintetice pentru diluarea
şi conservarea spermei de cocoş asupra calităţii spermei s-au utilizat metode de laborator
macroscopice, microscopice şi fizice. În acest scop, au fost cercetate soluţiile izotonice de
glucoză anhidrată, lactoză, fructoză, zaharoză şi sorbit.
Rezultatele obţinute (tabelul 5.4) au constatat sporirea indicilor funcţionali ai spermiilor de
cocoş în condiţiile diluării şi păstrării lor în mediile sintetice pe bază de diverse glucide.
Datele tabelului denotă, că supravieţuirea şi IAS al spermatozoizilor în sperma brută
constituie, respectiv, 2,4±0,273 ore şi 2,7±0,379 u.c., care comparativ cu valorile acestora în
sperma diluată este de la două, pînă la zeci de ori mai mică. Aceasta se explică prin următoarele.
În primul rînd, plasma seminală nu serveşte în calitate de mediu ideal pentru păstrarea spermiilor
în afara căilor genitale ale organismului. În al doilea rînd, mobilitatea şi menţinerea viabilităţii

spermiior este însoţită de distrugerea tegumentului lipoproteic al spermatozoizilor sub acţiunea
radicalilor liberi, care se activează în condiţiile aerobe de păstrare a spermei [50, 92].
Tabelul 5.4. Indici fiziologici ai spermatozoizilor diluaţi şi conservaţi în diverse medii sintetice
pe baza neelectroliţilor
Indicii spermatozoizilor
Nr. Varianta
Mobilitatea, baluri: Supravieţuirea, IAS,
crt. experienţei
După recoltare După diluare ore
u.c.
1. I 8,3 ± 0,136 6,0 ± 0,612 1,0 ± 0,612 5,5 ± 1,262
2. II 8,3 ± 0,136 7,2 ± 0,379 11,4 ± 0,273* 30,0 ± 2,795*
3. III 8,3 ± 0,136 6,9 ± 0,447 7,0 ± 0,790* 14,5 ± 2,121*
4. IV-martor 8,3 ± 0,136 - 2,4 ± 0,273 2,7 ± 0,379
5. V 8,3 ± 0,136 7,0 ± 0,136* 7,0 ± 1,274* 15,8 ± 3,923*
6. VI 8,3 ± 0,136 7,0 ± 0,136* 7,4 ± 0,447* 17,5 ± 1,802*
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu sperma brută.
Rezultatele diluării şi conservării spermei de cocoş în mediile, care includ glucide de
diversă structură şi greutate moleculară au determinat o valoare sporită a indicilor fiziologici ai
spermatozoizilor. În particular, în cazul conservării spermei în mediul diluant cu soluţie
izotonică de glucoză, respectînd valoarea pH-lui de 6,8-6,9 mobilitatea spermatozoizilor, practic,
este la nivelul spermei brute, iar supravieţuirea şi IAS constituie, respectiv, 11,4±0,273 ore şi
30,0±2,795 u.c. În varianta-martor valoarea acestor indici este autentică mai mică.
De asemenea, semnificaţii spermatice satisfăcătoare sunt constatate la diluarea şi
conservarea spermei în mediul cu soluţie izotonocă de sorbit, unde valorile indicilor studiaţi au
constituit 7,0±0,136 baluri, 7,4±0,447 ore şi 17,5±1,802 u.c., corespunzător, pentru mobilitate,
supravieţuire şi IAS, în timp ce, în varianta-martor aceşti indici au constituit numai 2,4±0,273
ore şi 2,7±0,379 u.c.
Astfel, adaosul de glucoză şi a altor glucide în componenţa mediului pentru sperma de cocoş
reprezintă substratul energetic pentru metabolismul anaerob al celulelor spermatice. Ele,
concomitent cu ingredientele componente, benefic acţionează asupra indicilor fiziologici,
asigurînd favorabilitatea prin prelungirea semnificativă a duratei de viaţă a spermatozoizilor.
În acelaşi timp, a fost studiat nivelul de gametopatii în unele soluţii de neelectroliţi, în
variantele experienţelor, rezultatele cărora sunt prezentate în tabelul 5.5.
Din datele tabelului reiese, că cele mai multe gametopatii s-au constatat la folosirea soluţiei
izotonice de lactoză şi zaharoză, însă numărul de spermatozoizi patologici este mai mic la diluare
şi conservare în soluţiile izotonice ale sorbitului.
176

Tabelul 5.5. Formele patologice ale spermatozoizilor nativi şi crioconservaţi în mediul sintetic pe
bază de neelectroliţi
Nr.
crt.
Varianta
experienţei
Starea spermatozoizilor
Anomalii ale spermatozoizilor
Spermatozoizi
cercetaţi Categoria I Categoria II
Spermatozoizi
patologici, %
1. I 1000 22,4 ± 1,32* 22,4 ± 1,32* 44,8 ± 1,31*
2. II 1000 13,4 ± 1,07* 21,4 ± 1,29* 34,8 ± 1,18*
3. III 1000 14,8 ± 1,12* 19,0 ± 1,24* 33,8 ± 0,18*
4. IV-martor 1000 6,0 ± 0,75 11,6 ± 1,01 17,6 ± 1,20
5. V 1000 20,2 ± 1,26* 22,2 ± 1,30* 42,4 ± 1,28*
6. VI 1000 13,4 ± 1,07* 12,6 ± 1,05* 26,0 ± 1,06*
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu sperma brută.
Scopul cercetărilor ulterioare a fost studierea acţiunii gumiarabicului asupra mobilităţii,
longevităţii şi IAS a spermatozoizilor la temperatură hipotermală. Rezultatele acestor cercetări
sunt prezentate în tabelul 5.6.
Tabelul 5.6. Studierea influenţei gumiarabicului în componenţa mediului de conservare
hipotermală a spermei de cocoş
Nr.
crt.
ExperienţaGumiarabic
1%,
ml
Indici studiaţi ai spermatozoizilor
Mobilitatea, baluri Longevitatea,
nativi diluaţi ore
IAS,
u.c.
1. I 1,0 8,0 ± 0,10 3,6 ± 1,55 0,2 ± 0,18 4,1 ± 1,95
2. II 0,8 8,0 ± 0,10 4,2 ± 1,37 0,7 ± 0,52 5,10 ± 1,78
3. III 0,6 8,0 ± 0,10 4,8 ± 1,14 3,2 ± 1,32 11,4 ± 2,70
4. IV 0,4 8,0 ± 0,10 6,3 ± 0,61 7,0 ± 0,40 22,7 ± 2,26
5. V 0,2 8,0 ± 0,10 7,7 ± 0,22 8,7 ± 0,46 35,4 ± 1,53
6. VI 0,1 8,0 ± 0,10 8,0 ± 0,10 10,2 ± 0,18* 30,0 ± 2,795*
7. VII – m. 0,0 8,0 ± 0,10 8,0 ± 0,10 8,0 ± 0,28 31,1 ± 2,78
Notă: *Diferenţa statistic autentică în comparaţie cu varianta VII.
Datele prezentate în tabelul 5.6 demonstrează, că includerea gumuarabicului, în concentraţie
de 0,1% permite de a majora esenţial longevitatea şi IAS a spermei de cocoş în condiţiile
temperaturii hipotermale.
În cercetările ulterioare a fost realizată experienţa consacrată studierii eficienţei amidonului
la conservarea hipotermală a spermei de cocoş.
Experienţa a fost efectuată cu folosirea spermei de cocoşi, întreţinuţi în condiţiile de vivariu
al Institutului. În calitate de mediu de bază (martor) a fost folosită soluţia izotonică de glucoză.
177

Pentru sporirea eficienţei acestui mediu în componenţa lui a fost introdus amidon în concentraţie
de la 0,1% pînă la 1%. Rezultatul acestei experienţe este prezentat în tabelul 5.7.
Tabelul 5.7. Studierea influenţei amidonului în componenţa mediului de conservare hipotermală
a spermei de cocoş.
Nr.
ctr.
Varianta
experienţei
Mediul de
bază cu
conţinut de
amidon, %
Mobilitatea
spermei native,
baluri
Indicii studiaţi
Mobilitatea
spermei diluate,
baluri
Longevitatea
spermatozoizil
or, ore
1. I 1,0 8,0 ± 0,23 4,5 ± 0,38 7,5 ± 0,63
2. II 0,8 8,0 ± 0,23 5,5 ± 0,32 9,0 ± 0,56
3. III 0,6 8,0 ± 0,23 6,0 ± 0,30 8,5 ± 0,42
4. IV 0,4 8,0 ± 0,23 6,5 ± 0,35 10,2 ± 1,58
5. V 0,2 8,0 ± 0,23 6,5 ± 0,53 12,0 ± 1,63
6. VI 0,1 8,0 ± 0,23 7,0 ± 0,23 13,3 ± 1,25
Datele tabelului 5.7 demonstrează, că cea mai înaltă calitate a spermei a fost obţinută în
varianta experimentală, unde se conţine 0,1% de amidon, anume în varianta, unde a fost cea mai
mică concentraţie a poliglucidului. Aceasta demonstrează, că amidonul influenţează indicii
sanogeni ai spermei de cocoş la temperatura camerei, însă există necesitatea cercetări de mai
departe, în scopul determinării concentraţiei optimale de amidon.
În următoarea experienţă a fost continuată cercetarea amidonului în componenţa mediului
de diluare şi păstrarea în condiţii hipotermice a spermei de cocoş. Rezultatele sunt prezentate în
tabelul 5.8.
Tabelul 5.8. Studierea influenţei amidonului în componenţa mediului de conservare hipotermală
a spermei de cocoş
Nr.
ctr.
Concentraţia
amidonului,
%
Mobilitatea
spermei
native,
baluri
Mobilitatea
spermei
diluate,
baluri
Longevitatea,
ore
Indicii sanogeni
I.A.S., Supravieţui-
u.c. rea, (%)
1. 0,05 7,6 ± 0,2 7,0 ± 0 8,0 ± 0,35 79,3 ± 7,66 113,35
2. 0,1 7,6 ± 0,2 7,6 ± 0,28 9,2 ± 0,22* 122,8 ± 4,39* 206,73*
3. 0,2 7,6 ± 0,2 7,0 ± 0,10 7,4 ± 0,27 80,8± 10,71 138
4. 0,3 7,6 ± 0,2 7,2 ± 0,23 6,8 ± 0,42 61,0 ± 9,72 102,69
5.
Glucozagălbenuş
(GG) –mart.
7,6 ± 0,2 7,2 ± 0,23 6,8 ± 0,22 59,4 ± 4,46 100
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu martorul.
178

Din datele tabelului 5.8 putem menţiona, că folosirea amidonului în componenţa mediului
pe baza neelectroliţilor face posibilă sporirea indicilor, care caracterizează sanogenitatea spermei
de cocoş după conservarea ei în condiţii hipotermale. Sporirea longevităţii şi I.A.S. în varianta
experimentală poate fi detereminată prin sporirea viscozităţii mediului elaborat.
Efectul folosirii neelectroliţilor, ca componente a mediilor pentru diluarea şi păstrarea
spermei de cocoş, poate fi lămurit prin faptul, că neelectroliţii contribuie la diminuarea
electroconductibilităţii şi stabilizarea presiunii osmotice [92].
Astfel, poliglucidele şi gumiarabicul în componenţa mediilor pentru conservarea spermei de
cocoş stabilizează longevitatea spermatozoizilor şi, respectiv, au o semnificaţie deosebită la
organizarea reproducerii păsărilor prin metoda de însămînţare artificială. Totodată, s-a stabilit, că
la includerea în componenţa mediilor sintetice a electroliţiilor şi neelectroliţiilor indicii
funcţionali ai spermei de cocoş nu suportă modificări semnificative.
5.3.2 Elaborarea mediilor sintetice în baza electroliţilor pentru diluarea şi conservarea
spermei de cocoş.
Printre metodele biotehnice şi biotehnologice de mare actualitate şi de perspectivă în
optimizarea şi dirijarea procesului de reproducţie la animale, concomitent cu accelerarea ritmului
de ameliorare a acestora se află şi însămînţările artificiale.
În prezent, în practica reproducţiei animalelor şi, concret a suinelor, ovinelor şi păsărilor s-a
creat o situaţie, cînd însămînţarea lor artificială cu sperma congelată pînă la -196 ºC nu creează
posibilităţi de a obţine rezultatele dorite. În prezent, pentru sporirea eficienţei însămînţării
artificiale, intensiv se elaborează metode de conservare a spermei la temperaturile hipotermale
(18-20 ºC).
Experienţele efectuate au demonstrat, că pentru conservarea hipotermală este necesar de
inclus în componenţa mediilor pentru sperma de cocoş substanţe electrolitice şi combinaţiile lor.
Rezultatele cercetărilor sunt prezentate în tabelul 5.9.
Datele tabelului 5.9 relevă, că acţiunea unor combinaţii de electroliţi asupra indicilor
sanogeni ai spermei de cocoş (soluţiile izotonice de hiposulfit de sodiu şi clorură de potasiu) s-a
studiat în ordinea combinării cantităţii izotonice conform sistemului stabilit al biocomponenţilor
mediilor sintetice (de la 0,1 pînă la 1,0 şi invers).
Rezultatul diluării şi conservării spermei de cocoş în mediile respective au demonstrat o
influenţă benefică asupra mobilităţii spermatozoizilor conservaţi. Valoarea mobilităţii maximale
a atins nivelul de 7,8±0,48 baluri. În acest caz, longevitatea spermatozoizilor a constituit 12,3
ore. Intensitatea indicilor menţionaţi în celelalte variante experimentale treptat a diminuat.
179

Varianta
experienţei
Tabelul 5.9. Eficienţa combinării electroliţilor la păstrarea hipotermală a spermei de cocoş
Volumul soluţiei izotonice (ml) de:
Hiposulfit de
natriu
Clorură de caliu
180
Mobilitatea
gameţilor
(baluri)
Longevitatea
gameţilor (ore)
1. 0,1 0,9 6,3 ± 0,41 8,3 ± 0,50*
2. 0,2 0,8 6,5 ± 0,53 8,3 ± 0,26*
3. 0,3 0,7 7,0 ± 0,38 9,0 ± 0,38*
4. 0,4 0,6 7,1 ± 0,61 9,3 ± 0,40*
5. 0,5 0,5 7,0 ± 0,50 10,5 ± 0,53*
6. 0,6 0,4 7,6 ± 0,39* 10,8 ± 0,41*
7. 0,7 0,3 7,8 ± 0,48* 12,3 ± 0,36*
8. 0,8 0,2 7,4 ± 0,46* 11,5 ± 0,25*
9. 0,9 0,1 6,2 ± 0,37 8,6 ± 0,30*
10. 1,0 – mator - 5,5 ±, 051 6,5 ± 0,27
Notă: *Diferenţa este statistic autentică comparativ cu varianta-martor.
În scop bine determinat, a fost studiată şi eficienţa Se-ului din componenţa preparatului
„selen normolaizer” la păstrarea hipotermică a spermei de cocoş (tabelul 5.10).
Tabelul 5.10. Studierea influenţei seleniului organic în componenţa mediului pentru conservarea
hipotermică a spermei de cocoş
Nr.
ctr.
Gluco
-za,
ml
Seleniu,
ml
Concen
-traţia
Se, mg
Mobilitatea,
baluri
Indicii spermatozoizilor
I.A.S.,
u.c.
Longevitatea,
ore
Supravieţuirea,
%
1. 1 0 0 – m. 7,4 ± 0,25 46,3 ± 2,059 10,8 ± 0,58 100
2. 0,8 0,2 0,001 7,4 ± 0,025 40,1 ± 3,25 10,2 ± 0,20 86,6
3. 0,6 0,4 0,002 7,0 ± 0,32 32,1 ± 6,71 7,4 ± 1,44* 69,33
4. 0,4 0,6 0,003 6,6 ± 0,32 25,5 ± 5,64 6,4 ± 1,44* 55,08
5. 0,2 0,8 0,004 6,0 ± 0,01* 15,5 ± 3,46* 4,4 ± 1,12* 33,48
6. 0 1 0,005 5,0 ± 0,32* 12,7 ± 2,01* 4,0 ±1,01* 27,43
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu varianta-martor.
Rezultatele cercetărilor prezentate în tabelul 5.10 demonstrează, că Se din componenţa
preparatului normolaizer, în concentraţii minimale egale cu 0,001 mg/% manifestă proprietăţi
toxice pentru sperma de cocoş. Rezultatul negativ al eficienţei Se-ului poate fi explicat prin
multicomponenţa substanţială a preparatului, care include elemente de diversă origine.

În concordanţă cu posibilitatea utilizării glucidelor compoziţionale în metabolismul
spermatozoizilor şi potrivit rezultatelor obţinute în urma multiplelor cercetări pe mediile sintetice
s-a convenit la realizarea altor experienţe direcţionate. În particular, s-au efectuat cercetări cu
mediile, în componenţa cărora, au fost incluse substanţe, cu diversă polaritate şi cu proprietăţi de
electroliţi, precum şi a substanţelor biologice active. În acest scop, au fost folosite clorura de
sodiu, calciu şi kaliu, hiposulfitul de natriu şi combinaţii ale lor conform schemei prezentate în
tabelul 5.11.
Tabelul 5.11. Schema de determinare a acţiunii substanţelor, electrolite şi combinării lor în
componenţa mediilor sintetice pentru diluarea spermei de cocoş
Nr.
crt.
Varianta
experienţei
Substanţele incluse în mediul sintetic
pentru diluarea spermei de cocoş
181
Tehnica pregătirii
soluţiilor
1. I Soluţie izotonică de clorid de kaliu 0,08 g + 5 ml Bi H2O
2. II Soluţie izotonică de hiposulfit de natriu 0,1 g + 5 ml Bi H2O
3. III Soluţie izotonică de clorură de natriu 0,045 g + 5 ml Bi H2O
4. IV
Soluţie izotonică de clorid de kaliu +
Soluţie izotonică de clorură de natriu
Raport 1:1
5. V
Soluţie izotonică de clorură de natriu +
clorid de calciu
Raport 1:0,1 (0,6 g + 5 ml Bi
H2O)
6. VI – martor Sperma nativă -
Rezultatele cercetărilor influenţei electroliţilor şi combinarea lor asupra indicilor funcţionali
ai spermei de cocoş sunt prezentate în tabelul 5.12.
Tabelul 5.12. Acţiunea mediilor sintetice cu electroliţi asupra indicilor spermatozoizilor de cocoş
Nr.
ctr.
Experienţa
Indici ai gameţilor
Mobilitatea (baluri) după: Longevitatea
Recoltare Diluare
(ore)
IAS,
(u.c.)
1. I 8,7 ± 0,136 6,5 ± 0,279* 6,6 ± 0,273* 11,90 ± 0,647*
2. II 8,7 ± 0,136 7,0 ± 0,306* 11,0 ± 0,500* 30,30 ± 2,133*
3. III 8,7 ± 0,136 8,4 ± 0,111 18,6 ± 0,447* 68,50 ± 2,113*
4. IV 8,7± 0,136 6,7 ± 0,335* 7,2 ± 0,223* 16,00 ± 0,750*
5. V 8,7 ± 0,136 6,6 ± 0,273* 6,4 ± 0,273* 13,80 ± 0,977*
6. VI-m. 8,7 ± 0,136 8,7 ± 0,136 2,4 ± 0,273 3,40 ± 0,539*
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu datele variantei martor.
Rezultatele prezentate în tabelul 5.12 demonstrează, că dintre electroliţi experimentaţi, cel
mai favorabil influenţează soluţia de clorură de natriu, în cazul cărei mobilitatea, supravieţuirea
şi IAS constituie, corespunzător, 8,4±0,11 baluri, 18,6±0,45 ore şi 68,5±2,11 u.c. O eficienţă
mai scăzută s-a înregistrat în variantele 1 şi 5.

Lipsa unor corelaţii între caracteristicile producţiei spermatice diluate şi conservate şi indicii
de fecunditate şi eclozionare denotă, că pentru aprecierea obiectivă a unor reţete de medii
sintetice sunt necesare şi teste in vivo, în condiţii de teren.
În continuare a fost studiat nivelul de gametopatii la utilizarea soluţiilor de electroliţi şi
combinaţiilor lor în variantele experienţelor, care sunt prezentate în tabelul 5.13.
Tabelul 5.13. Determinarea formelor patologice ale spermatozoizilor din sperma de cocoş nativă
şi diluată în medii cu electroliţi
Nr.
crt.
Experienţa
Număraţi
total
Starea spermatozoizilor
Anomalii ale spermatozoizilor, %
Categoria I Categoria II
Spermatozoizi
patologici,
%
1. I 1000 18,2 ± 1,22 21,9 ± 1,30 40,1 ± 1,54
2. II 1000 17,9 ± 1,21 23,6 ± 1,34 41,5 ± 1,57
3. III 1000 11,7 ± 1,01* 13,1 ± 1,06* 24,8 ± 1,36*
4. IV 1000 17,3 ± 1,19 21,4 ± 1,29 38,7 ± 1,54
5. V 1000 21,8 ± 0,30** 26,3 ± 1,39** 48,1 ± 1,58**
6. VI-m. 1000 7,2 ± 0,81 11,5 ± 1,01 18,7 ± 1,23
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice dintre datele variantei-martor şi valoarea indicelui
minimal. ** Diferenţele sunt statistic autentice dintre datele variantei-martor şi valoarea indicelui
maximal.
Datele prezentate în tabelul 5.13 demonstrează, că diluarea spermei prin folosirea mediilor
pentru păstrarea ei hipotermală, provoacă sporirea conţinutului spermatozoizilor patologici. Cel
mai favorabil mediul este cel, pe baza soluţiei de clorură de natriu, cînd spermopatiile ating
numai 24,8±1,36%, atunci cînd în varianta V, spermopatiile constituie 48,1±1,58%. Diferenţa
este statistic autentică.
Această diferenţă poate fi determinată, dintr-o parte, prin stabilizarea presiuni osmotice de
către componenţa soluţiei de clorură de natriu şi, din altă parte, de formarea canalelor Ca +2
independente, care sporesc permeabilitatea membranelor [287, 385].
Conform concepţiilor recunoscute, permeabilitatea sporită a membranelor în condiţiile
hipotermale, depinde de influenţa lor liotropă asupra lipidelor şi lipoprodeidelor membranare, ce
duce la solubilizarea parţială a CS şi FL, care provoacă dereglarea integrităţii bistratului lipidic
[61, 291].
Pe baza cercetărilor prezentate în ultimele două subcapitole a fost elaborat un mediu nou
pentru diluarea şi păstrarea hipotermală a spermei de cocoş cu următoarea compoziţie, la
182

ecalcularea raportului de volum la masa substanţelor: clorură de natriu – 1 g; amidon
hidrosolubil – 0,1 g; apă distilată pînă la 100 ml.
Acest mediu a fost folosit pentru diluarea spermei în raport de 1:1, ceea ce a predeterminat
îndeplinirea următoarei experienţe, în care s-a studiat influenţa gradului de diluare asupra
indicilor fiziologici ai spermei. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 5.14.
Tabelul 5.14. Gradul optimal de diluare a spermei de cocoş
Nr. Gradul Mobilitatea spermatozoizilor, Longevitatea
ctr. de diluare
baluri
spermatozoizilor, ore
1. 1:1 8,2 ± 0,30 19,5 ± 1,15
2. 1:2 8,0 ± 0,26 23,3 ± 1,20
3. 1:4 8,0 ± 0,31 26,4 ± 1,13
4. 1:8 7,5 ± 0,26 24,3 ± 2,16
5. 1:10 7,0 ± 0,42 21,0 ± 2,50
6. Sperma nativă 8,5 ± 0,62 2,9 ± 0,36
Datele prezentate în tabelul 5.14 demonstrează faptul posibilităţii diluării spermei de cocoş
cu mediul propus, fără diminuarea calităţii ei pînă la 1:4. Devierea de la acest raport, provoacă
scăderea indicilor studiaţi, care se produce prin sporirea conţinutului produselor activităţii vitale
sau a activităţii metabolice.
Astfel, combinarea soluţiilor hiposulfitului de natriu şi clorurei de caliu influenţează pozitiv
asupra mobilităţii şi longevităţii spermatozoizilor de cocoş, iar Se organic, ca component al
preparatului „Selen normalaizer”, la conservarea hipotermică a spermei de cocoş nu favorizează
indicii fiziologici a ei. În acelaşi timp, diluarea spermei de cocoş prin utilizarea mediilor
optimale pe baza electroliţilor, precum şi combinării lor cu cele pe bază de neelectroliţi, sporeşte
variabil indicii caracteristici ai stării funcţionale a spermatozoizilor.
5.4. Acţiunea mediilor integrate pentru diluarea şi crioconservarea spermei de cocoş.
Însămînţarea artificială în avicultură cu sperma conservată, oferă posibilitatea de a lărgi
posibilităţile creării raselor şi liniilor de păsări, de a obţine un număr maximal de descendenţi de
la reproducătorii preţioşi, în aspect de prăsilă. Aceasta permite de a prelungi termenul de păstrare
a produselor sexuale, a majora numărul de găini însămînţate şi de a micşora efectivul de cocoşi
la întreprinderile de prăsilă.
În scopul folosirii raţionale a cocoşilor pentru însămînţarea artificială a găinilor, o
importanţă deosebită are elaborarea mediilor crioprotectoare.
Cu toate succesele obţinute în domeniul crioconservării spermei de cocoş [78, 109],
problema elucidării unor crioprotectori, mai efectivi, rămîne nerezolvată din cauza toxicităţii
183

amidelor în componenţa mediului şi necesităţii purificării lor permanente. Adăugător, în
componenţa majorităţii mediilor figurează componenţi deficitari, cum sunt, glutamatul de natriu
(producţie Ungaria), sulfatul de natriu protaminic şi polivinilpirolidina. Aceste circumstanţe reţin
aplicarea largă a metodei de crioconservare a materialului seminal de cocoş în procesul
reproducerii păsărilor.
S-a demonstrat, că folosirea soluţiilor izotonice de neelectroliţi pentru crioconservarea
spermei de cocoş permite de a obţine indici înalţi ai mobilităţii spermatozoizilor după
decongelare. În cazul includerii în componenţa mediului a dizaharidului – maltoza, au fost
obţinute cele mai înalte rezultate, comparativ cu alte variante experimentale.
Folosirea lactozei în scopuri analogice, diminuează calitatea materialului deconservat.
Aceste date au permis de a concluziona, că calitatea materialului seminal de cocoş după
decongelare depinde nu numai de cantitatea resturilor glucozidice în molecula glucidului, dar şi
de natura lui chimică.
În acelaşi timp, a fost demonstrat, că majorarea mobilităţii spermei de cocoş după
decongelare este posibilă datorită utilizării în componenţa mediului crioprotector a glicozidului
steroid -Petumozida, ca reprezentat al AO.
Pe baza datelor obţinute a fost elaborată o nouă variantă de mediu crioprotector pentru
sperma de cocoş (tabelul 5.15).
Tabelul 5.15. Mediul crioprotector pentru sperma de cocoş
Nr.
ctr.
Denumirea substanţei folosite Cantitatea
1. Maltoză 11,5 g
2. Petumozidă 0,05 mg%
3. Glicerină 7 ml
4. Apă distilată Pînă la 100 ml
Notă: pH-ul mediului (6,8 - 6,9) sa reglat cu soluţie izotonică de arginină.
Folosind mediul prezentat în tabelul 5.15, în continuare a fost determinată influenţa
optimală a nivelului de diluare a materialului seminal asupra calităţii spermei de cocoş după
decongelarea ei (tabelul 5.16).
Din datele tabelul 5.16 urmează, că cele mai bune rezultate referitor la restabilirea
mobilităţii spermatozoizilor după decongelare sunt obţinute în varianta a III-a experimentală, în
cazul diluării în raport de 1/3 cu mediul nou elaborat. Majorarea raportului mai sus de 1/5 este
însoţită de diminuarea treptată a mobilităţii gameţilor, ceea ce poate fi lămurit prin transformările
proprietăţilor de bufer ale mediului în procesul de formare a cristalelor de gheaţă.
184

Nr.
ctr.
Tabelul 5.16. Acţiunea nivelului de diluare asupra restabilirii mobilităţii spermatozoizilor de
cocoş după decongelare
Varianta
experimentală
Raportul de diluare
185
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelaţi, puncte
1. I 1 : 1 4,3 ± 0,137
2. II 1 : 2 4,1 ± 0,209
3. III 1 : 3 4,6 ± 0,112
4. IV 1 : 4 4,4 ± 0,112
5. V 1 : 5 4,3 ± 0,137
6. VI 1 : 6 4,1 ± 0,106
7. VII 1 : 7 4,0 ± 0,177
8. VIII 1 : 8 3,2 ± 0,137
9. IX 1 : 9 3,0 ± 0,177
10. X 1 : 10 3,0 ± 0,177
Din datele tabelul 5.16 urmează, că cele mai bune rezultate referitor la restabilirea
mobilităţii spermatozoizilor după decongelare sunt obţinute în varianta a III-a experimentală, în
cazul diluării în raport de 1/3 cu mediul nou elaborat. Majorarea raportului mai sus de 1/5 este
însoţită de diminuarea treptată a mobilităţii gameţilor, ceea ce poate fi lămurit prin transformările
proprietăţilor de bufer ale mediului în procesul de formare a cristalelor de gheaţă.
Folosind varianta optimală a mediului de refrigerare, diluare şi congelare a fost efectuată o
experienţă comparativă de evaluare a calităţii spermei congelate (tabelul 5.17).
Tabelul 5.17. Influenţa petumozidei-2 în componenţa mediilor crioprotectoare asupra indicilor
fiziologici ai spermatozoizilor de cocoş
Nr.
ctr.
Varianta
experienţei
Mediul crioprotector
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelaţi, puncte
1. I Mediul Watanabe-Teroda (martor) 6,1 ± 0,11
2. II Maltoză-arginină-glicerină 6,3 ± 0,13
3. III Maltoză-arginină-glicerină-petumozida-2 6,8 ± 0,14*
4. IV Mediul C-2 (martor-IUCŞGAA) 6,1 ± 0,11
5. V Mediul C-2 -petumozida-2 6,6 ± 0,11*
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu lotul-martor.
Datele prezentate în tabelul 5.17 relevă, că folosirea petumozidei-2 sporeşte esenţial
mobilitatea spermatozoizilor după crioconservarea lor.
În următoarea experienţă a fost studiată eficienţa petumozidei, fracţia 3 în componenţa
mediilor de crioconservare. Rezultatele cercetărilor sunt prezentate în tabelul 5.18.

Tabelul 5.18. Influenţa petumozidei-3 în componenţa mediilor crioprotectoare asupra indicilor
fiziologici ai gameţilor de cocoş
Nr.
ctr.
Varianta
experienţei
Mediul crioprotector
186
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelaţi, puncte
1. I Mediul Watanabe-Teroda (martor) 6,2 ± 0,13
2. II Maltoză-arginină-glicerină 6,3 ± 0,13
3. III Maltoză-arginină-glicerină-petumozida-3 6,6 ± 0,11*
4. IV Mediul C-2 (martor-IUGAA) 6,2 ± 0,13
5. V Mediul C-2 – petumozida-3 6,4 ± 0,21
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice în comparaţie cu mediile-martor.
Rezultate demonstrează sporirea mobilităţii spermei decongelate pînă la 6,6±0,13 baluri la
folosirea petumozidei-3. În celelalte variante experimentale, astfel de sporire nu s-a înregistrat.
Rezultatele experienţelor prezentate în tabelul 5.17 şi 5.18 demonstrează activitatea antioxidativă
a pentumozidei, care mai evidenţiată este prezentă la pentumozida-2.
Concomitent cu indicii fiziologici au fost estimaţi selectiv şi indicii păstrării structurilor
acrozomice în procesul crioconservării spermei de cocoş, în diferite medii (tabelul 5.19).
Tabelul 5.19. Integritatea acrozomului spermatozoizilor de cocoş crioconservaţi în diferite medii
Nr.
ctr.
1.
2.
3.
Mediul crioprotector
1. Mediul Watanabe-Teroda
(martor)
2. Maltoză-arginină-glicerinăpetumozida-3
3. Maltoză-arginină-glicerinăpetumozida-2
Total capuri Starea acrozomului
integre Deteriorat, % Integru, %
54,4 ± 2,01 24,0 ± 1,96 30,4 ± 1,03
55,4 ± 3,52 20,2 ± 1,66 35,2 ± 1,64
55,8 ± 2,21 16,8 ± 1,55 39,0 ± 0,93*
Notă: *Diferenţa este statistic autentică în comparaţie cu lotul-martor.
Datele tabelului 5.19 indică, că în condiţiile crioconservării spermei cu medii sintetice
elaborate se poate de obţinut rezultate mai înalte, referitor la integritatea acrozomului,
comparativ cu mediul Watanabe-Teroda. Astfel, păstrarea acrozomului spermatozoizilor în
condiţiile criconservării în mediile experimentale 2 şi 3 este mai mare de 1,18 şi 1,28 ori, faţă de
lotul-martor. Diferenţele dintre indicii grupelor-martor şi experimentale sunt statistic autentice.

Valoarea biologică a spermatozoizilor după conservarea şi deconservarea spermei
animalelor agricole, în multe aspecte, se determină de conţinutul şi proprietăţile mediilor
crioprotectoare, dar şi, într-o măsură semnificativă, de specia animalelor.
Prin urmare, folosirea AO în componenţa mediului sintetic a favorizat îmbunătăţirea
mobilităţii spermei de cocoş după congelare-decongelare. În legătură cu aceasta, la a doua etapă,
de către noi, în colaborare cu cercetătorii Institutului de Avicultură al Academiei Naţionale
Agrare a Ucrainei au fost efectuate cercetări privind acţiunea AO (glutation, asparagozida-H,
baclanozida) în componenţa mediului sintetic pentru crioconservarea spermei de cocoş, cu
următorul conţinut: glutamat de natriu – 2,87 g, glucoză – 0,5 g, inozit – 0,25 g, acetat de
magneziu 4H2O – 0,07 g, acetat de kaliu – 0,5 g şi apă pînă la 100 ml [365], conţinînd 21% de
DMF [116]. În experienţele efectuate, spermatozoizii cu membranele intacte şi deteriorate au
fost determinate după metoda W. Halangk şi R. Bohnensock [238], modificat pentru analiza
spermei cocoşului la fluorometru [116], prin folosirea fluorocromei etidium bromidă. Pentru
determinarea spermatozoizilor cu membranele acrozomale deteriorate şi intacte, au fost coloraţi
spermatozoizii vii cu vopsea fluoriscentă – roşu de tiozină (tabelul 5.20).
Tabelul 5.20. Acţiunea antioxidanţilor asupra indicilor morfofuncţionali ai spermei de cocoş la
congelarea-decongelarea ei
Nr.
ctr.
Experienţa
1. I
2. II
3. III
4. IV
Mediul
crioprotector
Mediul Watanabe
– Teroda (martor)
Madiul Schramm
+ glutation
Madiul Schramm
+ asparagozida-H
Mediul Schramm
+ baclanozidă
Mobilitatea după
decongelare,
baluri
187
Spermatozoizi cu capuri intacte, %
Total
Acrozom
deteriorat
Acrozom
intact
4,1 ± 0,36 40,5 ± 3,17 27,5 ± 3,90 12,2 ± 2,80
5,2 ± 0,21 42,3 ± 3,33 26,5 ± 2,5 15,8 ± 2,05
5,4 ± 0,38* 56,1 ± 5,26 35,1 ± 4,4
21,1 ±
3,90
4,2 ± 0,42 45,8 ± 3,71 38,8 ± 3,6 13,0 ± 1,38
Notă: *Diferenţa este statistic autentică.
Datele tabelului 5.20 indică, că mobilitatea spermatozoizilor de cocoş după refrigerare,
congelare şi decongelate în mediul sintetic, care conţine AO, este mai înaltă la folosirea în
componenţa ei a asparagozidei-H. Acest indice constituie 5,4±0,38 baluri. În cazul folosirii în
componenţa mediului a glutationului şi baclanozidului, mobilitatea spermatozoizilor congelaţidecongelaţi
constituie, corespunzător, 5,2±0,21 şi 4,2±0,42 baluri. După crioconservarea spermei
în varianta mediului, la folosirea în componenţa lui a asparagozidei-H, se conţin spermatozoizi

cu capuri intacte, în mărime de 56,1±5,26%. În cazul folosirii glutationului şi baclanozidului,
conţinutul capurilor integre se afla, practic, la acelaşi nivel (42,3±3,3 şi 45,8±3,7%,
corespunzător). Totodată, conţinutul acrozomilor deterioraţi şi integri în varianta II constituie,
corespunzător, 26,5±2,50 şi 15,8±2,05%. Spermatozoizii cu capuri şi membrane acrozomale
intacte, constituie la folosirea în componenţa mediului a asparagozidei-H 21,1±3,9%, iar la
folosirea baclanozidului şi glutationului - 13,0±1,38 şi 15,8±2,05%, corespunzător.
Astfel, în rezultatul cercetărilor efectuate este stabilită concentraţia optimală a AO –
glutationului, asparagozidei-H şi baclanozidei. De asemenea, s-a dovedit, că dintre AO folosiţi în
componenţa mediilor sintetice pentru diluarea şi congelarea spermei de cocoş, cele mai bune
rezultate sunt obţinute în rezultatul folosirii asparagozidei-H. De exemplu, mobilitatea
spermatozoizilor congelaţi-decongelaţi la folosirea mediului Schramm, Hubner, [365],
suplimentat cu asparagozida-H este mai înaltă cu 22,8 şi 3,7%, în comparaţie cu variantele
experienţei 2 şi 4. Adăugător, în aceste condiţii mai mult se conţin spermatozoizi cu capuri şi
membrane acrozomale intacte.
În acelaşi timp, datele prezentate în acest subcapitol demonstrează, că sporirea indicilor
morfo-funcţionali ai spermatozoizilor de cocoşi este posibilă prin elaborarea mediilor noi, care
includ în calitate de glucide – maltoza, iar în calitate de AO – concentraţiile optimale ale
glicozidelor steroide. Drept model serveşte mediul, componenţa căruia este prezentată în tabelul
5.15. Acest mediul poate fi folosit prin procedeele, care includ următoarele etape:
a) Diluarea componenţilor mediului în apă distilată la temperatura 40 ºC;
b) Diluarea spermei de cocoş în raport de 1:1 – 1:3;
c) Refrigerarea materialului seminal, etapa:
1. de la 18-20 ºC la +2-4 ºC, timp de 10 minute cu viteza răcirii de - 1,6 ºC/min.
2. de la 2-4 ºC pînă la -110 ºC, timp de 3 minute cu viteza răcirii 35 ºC/min.
d) Congelarea finală în formă de pastile, la scufundarea lor în azotul lichid;
e) Fasonarea şi ambalarea în tuburi de aluminiu cu marcarea necesară.
5.5. Experimentarea şi implementarea rezultatelor cercetărilor în condiţii practice de
întreţinere a găinior şi de creştere intensivă a păsărilor.
5.5.1. Organizarea şi implementarea însămînţării artificiale a efectivului de găini cu
spermă conservată în condiţii hipotermale.
Cercetările cu privire la organizarea şi implementarea însămînţării artificiale a găinilor s-au
desfăşurat în condiţii de producţie intensivă a păsărilor la întreprinderea avicolă „Orhidea-Nani”
ÎI din com. Chetrosu, r-l Criuleni în perioada februarie-mai 2007.
188

Întreprinderea de păsări este situată la o distanţă de 2 km de la traseul Chişinău-Criuleni.
Teritoriul fermei pe tot perimetrul este îngrădit. În teritoriul întreprinderii sunt amplasate 6 hale
pentru păsări (creştere, întreţinere şi obţinere producţie), incubatorul, blocul de păstrare şi
preparare a hranei pentru păsări, abatorul cu frigorifer, blocul tehnic, blocul administrativ şi alte
spaţii, încăperi auxiliare necesare procesului de producţie.
Iniţial, ca obiect de studiu au servit condiţiile de întreţinere şi alimentare a păsărilor
destinate reproducţiei -11000 de găini de rasa „Hay-Line”, care erau întreţinute într-o singură
hală, în baterei piramidale pe 3 nivele pentru ouă de consum (tip BP-3).
Ulterior prin achiziţie, s-a completat septelul de păsări cu cocoşi B-Ross-308, pentru
întreţinerea cărora, au fost create condiţii comfortogene pe nivelul superior al batareilor
piramidale, în aceiaşi hală cu găinile destinate însămînţării artificiale.
În sistemul măsurilor de organizare a însămînţărilor artificiale ale găinilor şi de pregătire a
cocoşilor au fost parcurse următoarele etape:
I. Organizarea şi instruirea corespunzătoare a grupului de specialişti, angajaţi pentru
pregătirea cocoşilor şi a găinilor, pentru recoltarea spermei şi însămînţarea artificială a găinilor.
II. Pregătirea cocoşilor. Pentru obţinerea unui material de calitate, după acomodarea şi
adaptarea cocoşilor, s-a efectuat tualeta specială a regiunii precloacale a lor prin zmulgerea
penelor, tunderea pufului şi igienizarea ţesutului cutanat şi a perinajului adiacent.
Cocoşii s-au supus manipulaţiilor corespunzătoare pentru obişnuirea deprinderii actului
copulativ şi a reflexului de ejaculare în condiţiile inexistente ale aparatului genital femel.
Obişnuirea propriu-zisă s-a produs prin executarea masajului abdominal şi prin presiuni ritmice
pe pereţii cloacii pentru formarea reflexului de ejaculare de 3 ori pe săptămînă.
Efectivul de cocoşi în perioada de pregătire a fost supus aplicării măsurilor sanitare
veterinare corespunzătoare, inclusiv parenteral cocoşii au fost injectaţi de două ori, cu intervalul
de 10 zile, cu soluţie standardă de trivitamină şi Sel-E-Vit în doze prevăzute. Raţia zilnică
general acceptată a cocoşilor, a fost suplimentată, în esenţial, cu proteină nativă prin includerea
ouălor cu defecte externe ale învelişului dur, rebutate din comercializare (~5%). Raţia cocoşilor,
concomitent, a fost completată cu grîu încolţit în proporţie de 40 g/cocoş.
În perioada respectivă s-au întreprins măsurile multilaterale de determinare a proceselor de
ejaculare/neejaculare a cocoşilor, ejaculare insuficientă, cu resturi sanguine, seroase, impurităţi
etc. Ejaculatele obţinute au fost examinate macro- şi microscopic şi au fost supuse investigaţiilor
morfo-bio-fizico-chimice, în vederea determinării indicilor cantitativi şi calitativi ai materialului
seminal, precum şi a selectării şi includerii cocoşilor, în grupul efectivului pentru reproducţie
biotehnologică. Este necesar de menţionat, că dintre cei 350 de cocoşi achiziţionaţi, nu toţi au
189

devenit apţi pentru includerea în grupul de reproducţie din diverse cauze. În particular, au fost
excluşi cocoşii, care au înregistrat diverse abateri: imposibilitatea recoltării spermei, volumul
mic al ejaculatului (sub 0,1 ml), mobilitatea redusă a spermiilor (sub 6 baluri) şi alte cauze
absolute şi relative. Drept cauză principală, a devierilor constatate, credem, şi este firesc, că a
fost vîrsta foarte mică a cocoşilor, numai de 120 zile la achiziţie. De asemenea, este necesar de
menţionat, că practic, ejaculatele fiecărui cocoş în parte au fost examinate macro- şi microscopic,
în vederea aprecierii calităţii spermei.
III. Recoltarea spermei. Recoltarea spermei de la cocoşi s-a realizat în felul următor: În
poziţia aşezat pe un taburet/scăunel, operatorul fixează cocoşul în decubit sterno-abdominal pe
coapsa stîngă, cu mîna dreaptă, ţinînd fluierile cocoşului pe faţa mediană a coapsei stîngi. Prin
trecerea piciorului stîng al operatorului peste piciorul drept se stabileşte poziţia „în foarfecă”, sau
prin apropierea maximă a picioarelor şi genunchilor, fiecărui operator după comoditate, care
imobilizează picioarele cocoşului şi fixează cocoşul într-o poziţie comodă. În acest fel/metodă
mîinele operatorului rămîn libere. Masajul cu ambele mîini se efectuează în felul următor: cu
mîna stîngă se masajează uşor regiunea sacrală în sus cranio-caudal, iar mîna dreaptă masajează
regiunea abdominală în direcţia de la apendicele xifoid spre apofizele pubiene. Momentul
ejaculării se remarcă/stabileşte prin deschiderea orificiului cloacal şi evidenţierea pliului
cupulator, timp în care, operatorul cu mîna stîngă presează rapid/accelerat zona precloacală. În
acest timp, masajul abdominal încetează. Cu mîna dreaptă materialul seminal se recoltează în
paharul/flaconul colector de sticlă sau de sterol. Manipulaţiile descrise se repetă de 2-3 ori,
pentru obţinerea unei cantităţi maxime de spermă. În unul şi acelaşi flacon s-a recoltat sperma
mai multor cocoşi. La finisarea perioadei de pregătire a cocoşilor volumul mediu al unui ejaculat
a constituit 0,2-0,3 ml/cocoş.
IV. Organizarea, amenajarea şi aprovizionarea laboratorului specializat pentru manipularea
şi investigarea produsului seminal destinat însămînţării artificiale.
În încăperile antreului halei de întreţinere a păsărilor prevăzute pentru desfăşurarea
însămînţării artificiale s-a organizat şi amenajat un laborator, care s-a dotat cu termostat, masă de
laborator, termometre, microscop cu dispozitivele luminescente, lame şi lamele, sterilizator,
veselă de laborator pentru recoltarea şi diluarea spermei, precum şi cu veselă de măsurare şi
dozare fixă, instrumentar necesar pentru dozarea şi inocularea spermei, apă bidistilată, medii
sintetice pentru diluarea spermei, alcool etilic, soluţii antiseptice, dezinfectante, detergente etc.
Notă: Perioada de pregătire a fost de lungă durată din motivul, că la momentul achiziţionării
cocoşilor, ei aveau vîrsta mică şi de necesitate s-au aplicat unele măsuri amelioratoare medicale
veterinare, s-a suplinit considerabil raţia cocoşilor şi argumentat s-a temporizat începutul ciclului
190

iotehnologic de reproducţie a păsărilor prin însămînţări artificiale, pînă la vîrsta cocoşilor,
apropiată de ceea a maturităţii sexuale şi fiziologice.
V. Realizarea tehnicii de însămînţare artificială a găinilor. Pentru aplicarea tehnicii
inoculării materialului seminal la găini, este necesară intervenţia a doi operatori: unul pentru
contenţie, iar celălalt pentru însămînţarea propriu-zisă. Găina este prinsă de către operator cu
mîna dreaptă de fluiere, în poziţie de contenţie obişnuită şi fixată la nivelul celulei de întreţinere
a batareii piramidale. Găina se fixează cu partea posterioară în afara celulei sau la marginea
batereei. Cu mîna stîngă se răsfrînge coada pe spate, în felul, în care se asigură deschiderea
cloacei. Concomitent, cu mîna dreaptă se apasă din partea stîngă a găinii abdomenul. Cu degetele
mîinii stîngi se facilitează evidenţierea deschiderii oviductului, care apare în partea stîngă a
cloacei. Imediat, după evidenţierea deschiderii oviductului, operatorul însămînţător introduce
pipeta de însămînţare, adoptată la seringa de însămînţare, pe o adîncime de aproximativ 3-4 cm
şi inoculează întreaga doză de material spermiatic. În acelaşi timp, presiunea asupra
abdomenului nu se mai exercită, pentru ca sperma inoculată să nu fie expulzată în exterior.
Timpul optim de însămînţare a găinilor, este a doua jumătate a zilei (după orele 14.00). În
această perioadă în oveducte la majoritatea găinilor lipsesc ouăle cu coajă tare, care pot constitui
obstacole în drumul spermatozoizilor spre infundibil.
În scopul diluării şi conservării hipotermale, menţinerea valorilor biologice şi sporirea
proprietăţilor fecundative sanogene ale spermei cocoşilor-reproducători s-a utilizat mediul pentru
conservare cu următoarea componenţă: clorură de sodiu (1,0 g); amidon hidrosolubil (0,1 g); apă
distilată (100 ml).
Cantitatea de material seminal diluat şi conservat, care se inoculează este, în mediu, de 0,02-
0,03 ml la o găină, cu o concentraţie de aproximativ 150 mln de spermatozoizi, cu o mobilitate
nu mai puţin de 7 baluri. Diluarea şi conservarea spermei, cu mediu sintetic s-a efectuat în raport
de 1:1, 1:2, 1:3 şi mai mult, în dependenţă de concentraţia spermei.
Sperma de la cocoşii-reproducători s-a recoltat de cinci ori pe săptămînă.
Efectivul de găini s-a divizat în 4 grupe. Primele două zile ale începutului ciclului de
reproducţie biotehnologică a păsărilor, găinile au fost însămînţate zilnic în scopul saturaţiei
căilor sexuale ale lor cu spermatozoizi viabili. Ulterior, găinile primelor 3 grupuri s-au
însămînţat la ziua a 4, 5 şi 6 cu doze de spermă de 0,03 ml. Găinile grupului 4 s-au însămînţat la
ziua a 7 cu doze de spermă de 0,05 ml. Sîmbătă şi duminica au rămas zile libere.
Pe parcursul realizării însămînţării artificiale au fost respectate următoarele cerinţe: 1.
Pentru realizarea însămînţării artificiale a găinilor au fost organizate condiţii satisfăcătoare
zooigienice de întreţinere şi alimentaţie a păsărilor, implicate în reproducţie, care, întocmai, au
191

asigurat bunăstarea lor; 2. Continuu s-au respectat condiţiile optime de recoltare a spermei de la
cocoşi şi de însămînţare artificială a găinilor; 3. Întocmai au fost îndeplinite exigenţele sanitare
veterinare de reproducţie a păsărilor în flux tehnologic intensiv; 4. S-a menţinut neîntreruptă
schema de însămînţare a găinilor pe toată perioada de reproducţie; 5. Fluxul biotehnologic de
însămînţare artificială a găinilor, permanent a fost aprovizionat cu cantitatea necesară a mediului
sintetic pentru diluarea spermei de cocoş şi conservarea ei; 6. În scopul dozării fixe a
materialului spermatic mascul şi inoculării lui în aparatul genital femel, în condiţii
biotehnologice aproximate de actul sexual fiziologic, a fost multilateral experimentată şi
modernizată, ulterior selectată cea mai optimă varietate a instrumentarului pentru însămînţarea
artificială a găinilor în condiţiile tehnologice intensive de reproducţie.
Rezultatele generalizate ale testării în condiţii industriale a însămînţării artificiale a găinilor
cu spermă supusă conservării hipotermale se prezintă în tabelul 5.21. Pentru stabilirea eficienţei
aplicării biotehnologiei şi excluderii erorii la evidenţierea rezultatelor incubării ouălor s-au
realizat investigaţii timp de cinci zile pe cîte un număr standard de ouă zilnic.
Tabelul 5.21. Rezultatele incubării ouălor la aplicarea însămînţării artificiale a găinilor cu
spermă supusă conservării hipotermale
Nr.
Ctr.
Zilele
experienţei
Ouă recoltate şi incubate
Total, Fecundate Nefecundate puilor neeclozionaţi
bucăţi Bucăţi % Bucăţi % Capuri % Capuri %
192
Eclozionarea
1. I 5000 4733 94,7 267 5,3 4331 86,6 669 13,4
2. II 5000 4786 95,7 214 4,3 4327 86,5 673 13,5
3. III 5000 4790 95,8 210 4,2 4347 86,9 653 13.1
4. IV 5000 4943 98,9 57 1,1 4366 87,3 634 12,7
5. V 5000 4698 94,0 302 6,0 4304 86,1 696 13,9
86,7
13,1
95,8 ± 4,2 ±
Total 25000 23950
1050 21675 ± 3325 ±
0,13
0,13
0,21
0,21
Datele tabelului 5.21 denotă, că fecunditatea ouălor variază în limitele 94,0-98,9% şi
constituie 95,8±0,13%. La eclozionarea puilor s-a stabilit variabilitate zilnică şi valoare medie de
86,7±0,21%.
5.5.2. Implementarea însămînţării artificiale a găinilor cu spermă crioconservată în condiţii
practice.
La următoarea etapă de cercetări a acţiunii AO în componenţa mediului sintetic pentru
diluarea şi congelarea spermei de cocoş, a fost efectuată o experienţă ştiinţifico-practică pentru
Pui

determinarea calităţii spermei congelate-decongelate de cocoş în mediul sintetic, care conţine
glutation, asparagozida-H şi baclanozidă. Experienţa a fost efectuată pe găini de rase
colecţionate, care se întreţineau în Întreprinderea experimentală a Institutului de Avicultură al
Academiei Naţionale Agrare a Ucrainei. Pentru aceasta au fost formate trei grupe de găini, care
s-au însămînţat cu spermă congelată-decongelată în mediul, care conţinea AO cercetaţi. Prima şi
a doua însămînţare a găinilor s-a petrecut cu interval de 24 ore, iar următoarele însămînţări – o
dată la trei zile, pe parcursul a două săptămîni. Colectarea ouălor s-a început peste o zi de la a
doua însămînţare. Rezultatele însămînţării găinilor au fost determinate după totalizările incubării
ouălor, cu evidenţa ouatului, fecundităţii şi a eclozionării ouălor (tabelele 5.22 şi 5.23).
Tabelul 5.22. Acţiunea mediilor crioprotectoare, care conţin antioxidanţi asupra capacităţilor
fecundative ale spermatozoizilor de cocoş congelaţi-decongelaţi
Nr.
ctr.
1.
2.
3.
Varianta
experienţei
Mediul Schramm +
glutation
Mediul Schramm +
asparagozida-H
Mediul Schramm +
baclanozidă
193
Ouă incubate
Total, Nefecundate Fecundate
bucăţi Bucăţi % Bucăţi %
195 103 62,8 ± 3,46 92 47,2 ± 3,57
191 85 44,5 ± 3,59 106 55,5 ± 3,59
136 71 52,8 ± 4,28 65 47,8 ± 4,28
Din datele tabelului 5.22 se vede, că dintre indicii grupelor experimentale, sunt primite
rezultate, mult mai înalte, la însămînţarea găinilor cu spermă congelată-decongelată, în mediul cu
asparagozida-H. De exemplu, fecunditatea ouălor constituie 55,5±3,59%, contra la 47% în
ambele grupe de însămînţare a găinilor cu spermă deconservată, la folosirea glutationului şi
baclanozidului. Concomitent, conţinutul procentual de ouă nefecundate, în cazul folosirii în
componenţa mediului crioprotector a asparagozidei-H este mai mic şi constituie 44,5±3,59%, în
comparaţie cu 62,8±3,46 şi 52,8±4,28% la folosirea, corespunzător, a glutationului şi
baclanozidului.
În cercetările ulterioare s-au continuat experienţele în condiţii de producere, rezultatele
cărora sunt prezentate în tabelul 5.23.
Analiza datelor tabelei 5.23 demonstrează, că valoarea indicelui ouatului în rezultatul
folosirii glutationului şi asparagozidei-H la crioconservarea spermei de cocoş, practic, se află la
acelaşi nivel. În varianta 2, cînd s-a folosit baclanozida, valoarea acestui indice a fost mai înaltă
cu 2,5 şi 3,2%, comparativ cu nivelul înregistrat în prima şi a doua variantă.

Nr.
ctr.
1.
2.
3.
Tabelul 5.23. Rezultatele experienţei efectuate în condiţii practice, obţinute în rezultatul
însămînţării găinilor cu spermă congelată-decongelată
Varianta
experienţei
Mediul Schramm +
glutation
Mediul Schramm +
asparagozida-H
Mediul Schramm +
baclanozidă
Ouă
fecundate,
bucăţi
194
Pui
eclozinaţi,
capuri
92 77
Indicii eclozionării
Ciocnirea
ouălor, %
83,7 ± 2,64
Eclozionarea
puilor, %
39,5 ± 3,50
106 88 83,0 ± 2,71 46,1 ± 3,60
65 56 86,2 ± 2,95 41,24 ± 4,22
În acelaşi timp, s-a stabilit, că eclozionarea puilor, în cazul însămînţăii găinilor cu spermă
congelată-decongelată în mediul cu adaos de asparagozidă-H este mai majorată cu 7,5%, în
comparaţie cu varianta folosirii glutationului şi cu 5% - la folosirea glucozidului steroid –
baclanozida-H.
Astfel, în rezultatul experienţei de producere, pentru însămînţarea găinilor cu spermă
congelată-decongelată în mediul Schramm, Hubner [365] s-a stabilit, că dintre oxidanţii cercetaţi
cele mai bune rezultate după indicii investigaţi sunt obţinute la folosirea în componenţa mediului
crioprotector a asparagozidei-H. În acelaşi timp, în rezultatul cercetărilor efectuate a fost
dovedită interacţiunea pozitivă între indicii morfo-funcţionali ai spermatozoizilor deconservaţi
de cocoş şi rezultatele însămînţării găinilor cu spermă congelată-decongelată.
În următoarele experienţe, a fost studiată capacitatea de fertilitate a spermei congelate de
cocoş la folosirea mediului elaborat, pe baza maltozei, argininei, glicerinei şi petamozidei-2.
Datele obţinute sunt expuse în tabelul 5.24.
Datele tabelului 5.24 demonstrează că crioconservarea spermei de cocoş în paiete cu
utilizarea atît în varianta-martor, cît şi în cea experimentală a mediilor experimentate, duce la
diminuarea bruscă a fecundităţii ouălor. Totodată, se observă tendinţa de ameliorare a
fecundităţii ouălor, în cazul includerii în componenţa mediului a AO petumozida-2.
Mediul maltozic elaborat, a fost evaluat şi într-o experienţă de producere pentru
însămînţarea găinilor cu spermă de cocoş, congelată în granule (tabelul 5.25).
Din datele tabelului 5.25 se vede, că utilizarea mediului maltoză-arginină-glicerină cu
petumozida-2 permite de a obţine o fecunditate a ouălor egală cu 70,86±6,56%. În variantamartor,
indicele evaluat este cu 23% mai scăzut. Analogic ca şi în experienţele, rezultatele căror
sunt expuse în tabelul 5.24, s-a stabilit, că aplicarea AO majorează fecunditatea ouălor.

Concomitent, este necesar de menţionat că efectul pozitiv al petumozidei-2 este observat în
ambele variante ale mediilor.
Tabelul 5.24. Rezultatul incubării ouălor obţinute de la găinile însămînţate artificial cu sperma
congelată-decongelată de cocoş
Nr.
ctr.
1.
2.
3.
Mediul
Ouă incubate
crioprotector Total, Fecundate Nefecundate
buc. Buc. % Buc. %
Mediul
Watanabe –
Terode (martor)
Maltoză –
arginină –
glicerină
Maltoză –
arginină –
glicerină –
petumozida-2
24 6
24 5
24 9
25,0 ±
8,84
20,8 ±
8,28
37,5 ±
9,88
195
18
19
15
75,0 ±
8,84
79,2 ±
8,28
62,5 ±
9,88
Ciocnirea
ouălor
Bucăţi %
6
4
8
25,0 ±
8,84
16,7 ±
7,61
33,3 ±
9,62
Eclozionarea
ouălor,
%
100,0 ±
0,00
80,0 ±
8,16
88,9 ±
6,41
Tabelul 5.25. Rezultatele incubării ouălor, obţinute de la găinile însămînţate artificial cu sperma
congelată-decongelată de cocoş în granule
Nr.
ctr.
1.
2.
3.
Varianta mediului
crioprotector
Maltoză – arginină –
glicerină
Maltoză – arginină –
glicerină cu
petumozida-2
C–2 (IUCŞGAA)
(martor)
Ouă incubate
Total, Fecundate
bucăţi Bucăţi %
48 19
48 34
48 23
39,6 ±
7,06
70,8 ±
6,56*
47,9 ±
7,21
Pui vii,
capete
19
33
20
Eclozionarea
ouălor, %
100,0 ±
0,00
97,1 ±
2,42
87,0 ±
4,85
Ieşirea
puilor,
%
39,6 ±
7,06
68,8 ±
0,69*
41,7 ±
7,12
C–2 (IUCŞGAA) cu
64,6 ±
100,0 ± 64,6 ±
4. 48 31
31
petumozida-2
6,90
0,00 6,90
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
Reieşind din eficienţa petamozidei-2, în continuare au fost studiate proprietăţile glicozidelor
steroide de origine organică (tabelul 5.26).

Tabelul 5.26. Rezultatele însămînţării artificiale a găinilor cu spermă crioconservată la
includerea în componenţa mediilor a Triozidei Lilia şi Asparogozidei-H
Varianta
experimentală,
AO - concentraţia
Ouă Fecundarea Ciocnirea Eclozionarea
incubate, ouălor
ouălor
ouălor
buc. buc. % buc. % buc. %
I - (Maltoza- Triozid
88,0 ±
99,0 ±
88,0 ±
150 132
132
116
Lilia) - 2,5 mg%
2,65
0,145
2,65
II - (Maltoza-
91,3 ±
97,8 ±
89,3 ±
Asparogozida-H) - 150 137
134
120
2,30
1,22
2,52
0,625 mg%
III - Martor
(Maltoza-arginină-
86,7 ±
98,5 ±
84,6 ±
150 130
128
108
glicerină
2,77
0,99
2,95
petumozida-2)
Notă: *Diferenţele sunt statistic autentice.
Datele tabelului 5.26 demonstrează, că glicozizii steroizi studiaţi, posedă o capacitate
antioxidativă mai eficientă decît petamozida-2, manifestînd efecte pozitive asupra fecundităţii,
ciocnirii, eclozionării şi ieşirii puilor vii.
Efectul mediului elaborat poate fi determinat prin faptul că include maltoza în calitate de
glucid, care participă la reglarea tensiunii osmotice [81] şi poate exercita funcţia de crioprotector
[92], precum şi arginina – cu proprietăţi de a forma biocomplexe cu componentele membranare
[50] şi AO, care blochează POL [55].
Este cunoscut [18], că fertilitatea reprezintă un proces de prima necesitate şi este cea mai
importantă în creşterea păsărilor. Numărul de ouă fertile, produse pentru incubaţie, elucidează
rentabilitatea finală a găinilor de prăsilă. În acelaşi timp, rezultatele cercetărilor prezentate
demonstrează insuficienţa acestor cerinţe, deoarece la fecunditatea înaltă a ouălor, în realitate,
putem obţine descendenţi mai puţini, comparativ cu cele fecundate. Concomitent, nici
descendenţii nu răspund la întrebarea, sunt sănătoşi sau nu!
5.4. Concluzii la capitolul 5
Reieşind din rezultatele expuse şi în conformitate cu relatările menţionate în reviul
literaturii, indiscutabilă este eficacitatea folosirii în componenţa mediilor crioprotectoare pentru
diluarea şi conservarea spermei de cocoş a substanţelor, care posedă proprietăţi AO.
Concomitent cu aceasta, avînd în vedere instabilitatea mediilor existente pentru conservarea
spermei de cocoş la temperaturi scăzute şi dificultăţile tehnologice de utilizare a spermei în
condiţii practice, rămîne în continuare o necesitate vădită perfecţionarea lor prin prisma
196

sanocreatologiei avansate. Mai mult ca atît, însămînţarea artificială devine biotehnologia de bază
a lucrului de selecţie în domeniul aviculturii şi metoda principală în ameliorarea calităţilor de
prăsilă, precum şi în realizarea însuşirilor biologice reproductive ale păsărilor.
CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI
CONCLUZII GENERALE
1. Specificul modificărilor morfo-funcţionale şi structurilor acrozomale ale spermatozoizilor
de cocoş, comparativ cu cele ale spermatozoizilor de taur, berbec şi vier în procesul de diluare,
refrigerare, congelare şi decongelare se exprimă prin predominarea deteriorărilor morfofuncţionale
la etapa de congelare-decongelare, manifestarea mai sporită a rezistenţei la factorii
tehnologici decît cele de vier şi mai scăzută decît cele de om şi prin expresarea mobilităţii la
nivelul celor de taur, fiind mult mai exprimată decît cele de berbec şi vier, urmate de modificări
structural-morfologice semnificative ale spermatozoizilor, inclusiv de creşterea semnificativă a
indicelui-B teratologic al spermei.
2. Funcţionalitatea spermei de cocoş depinde de valoarea pH-lui mediului de diluare, fiind
mai optimală în limitele slab acide şi slab alcaline ale mediului, scăzînd în condiţiile de deviere
ca rezultat a ruperii legăturilor slabe prevalente în proteinele membranare ale spermatozoizilor
de cocoş, ceea ce mărturiseşte despre necesitatea de utilizare la crioconservare a mediilor cu pHul
6,0-8,0.
3. Modificările integrităţii membranelor spermatozoizilor de cocoş în procesul de
crioconservare, în mare măsură, sunt determinate de schimbările raportului proteine/lipide, în
defavoarea lipidelor şi colesterină/fosfolipide, de condiţiile variabile ale osmolarităţii şi
permeabilitatea selectivă a membranelor pentru ionii de Na + , K + , Li + şi Ca 2+ , în special, în
perioada de congelare-decongelare, precum şi de micşorarea conţinutului colesterinei,
trigliceridelor şi sporirea concentraţiei fosolipidelor şi digliceridelor în ele.
4. Cele mai sensibile componente structurale ale membranelor plasmatice ale spermatozoizilor
de cocoş în procesul de crioconservare sunt fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, cerebrozidele
fracţiile 3 şi 5, trigliceridele şi colesterina, modificările cărora se manifestă prin reacţiile de
compensare directă şi invers proporţională conţinutului lor şi prin reacţii de oxidoreducere.
5. În procesul de diluare, refrigerare şi congelare-decongelare dintre produsele peroxidării
lipidelor în sperma de cocoş cele mai esenţiale modificări suportă dialdehida malonică, care
serveşte ca marker specific al intensităţii procesului de peroxidare a lipidelor.
6. Pool-ul grupelor de AA în membranele plasmatice şi spermatozoizii nativi de cocoş în
procesul criocoservării şi modificările lui, în mare măsură, depinde de particularităţile de specie:
197

în membranele plasmatice native de cocoş, comparativ cu cele de vier predomină AA acidici,
neutri şi hidrofobi, în spermatozoizi un conţinut mai mare revine AA hidrofobi, iar mic – celor
neutri, acidici şi bazici; în procesul de croiconservare specificul modificărilor de specie a
conţinutului de aminoacizi la cocoş se manifestă prin sporirea aminoacizilor hidrofobi în
membranele native, iar în spermatozoizi – atît a celor hidrofobi, cît şi a celor acidici şi bazici.
7. În plasma seminală de cocoş aminoacizii liberi prin conţinutul sporit al grupelor bazice,
acidice, în special, a glutaminei şi grupei neutre diferă considerabil de cel de vier, în particular, a
aminiacizilor acidici, iar în procesul de congelare-decongelare conţinutul tuturor grupelor de
aminoacizi în plasma seminală de cocoş sporeşte, pe cînd în grupele similare de aminoacizi ai
plasmei de vier se micşorează; dintre aminoacizii legaţi în plasma nativă preponderent se
depistează grupa hidrofobă, iar în condiţiile de crioconservare conţinutul grupelor hidrofobe,
neutre şi acidice, în mare măsură, se egalează, pe cînd cea bazică – se manifestă la un nivel
scăzut.
8. Influenţa diluării, congelării şi decongelării spermei, în cea mai mare măsură, se reflectă
asupra membranelor plasmatice comparativ cu nucleul spermatozoizilor, despre ce denotă
nivelul de modificări al activităţii Мg +2 (Na + +К + )-ATP-azei, 5 1 -nucleotidazei, fosfatazei alcaline
şi a conţinutului ADN-lui în membranele plasmatice izolate şi nucleele, atît ale spermei de
cocoş, cît şi de vier, precum şi asupra plasmei seminale şi spermatozoizilor prin modificările
albuminelor, α-, β- şi γ-globulinelor spermei, produse de reacţiile de adaptare şi labilizare ale
proceselor compensatoare, preponderent, la nivelul spermatozoizilor.
9. Fortificarea activităţii fiziologice a spermei supuse crioconservării poate fi asigurată din
contul includerii în mediul crioprotector a argininei, maltozei şi a unor fracţii de lipide.
10. Fortificarea integrităţii morfologice şi stabilizarea funcţională a spermei de cocoş în
condiţii de crioconservare poate fi obţinută prin utilizarea în calitate de crioprotector a
glicozidelor steroide - Asparagozid-H, Lilia-H şi Triozid-Lilia.
11. Algoritmul tehnologiei de crioconservare a spermei de cocoş prevede de rînd cu
regimurile optimale de prelucrare tehnologică şi utilizarea mediului perfecţionat de diluare şi
congelare cu crioprotectori (Petumozid, Asparagozid-H, Lilia-H, Triozid-Lilia) şi alimentaţia
cocoşilor pe parcursul perioadei ciclului de spermatogeneză cu raţie bogată şi suplimentată cu
substanţe coordinative (LAZ, TAS) şi fosfosan.
12. Administrarea glucidelor în componenţa mediilor crioprotectoare pentru sperma de
cocoş previne epuizarea rezervelor energetice proprii ale spermiilor şi constituie substratul
energetic pentru metabolismul anaerob al celulelor spermatice contribuind la inhibarea
procesului de peroxidatre a lipidelor din membranele spermatozoizilor prin diminuarea
198

acumulării produselor toxice ale acestui proces, la menţinerea arhitectonicii structurilor
extramembranare şi la stabilizarea indicilor fiziologici ai spermatozoizilor decongelaţi, asigurînd
o sanogenitate favorabilă a prolongării semnificative a longevităţii spermatozoizilor.
13. Cercetările de perspectivă vor avea succes în cazul axării lor spre descifrarea
mecanismelor, ce stabilizează starea morfo-funcţională a spermei de cocoş, care este
predeterminată atît de procesele biochimice ale plasmei, cît şi ale membranelor spermiilor,
inclusiv spectrul proteic şi lipidic, raportul proteine/lipide, nivelul de peroxidare a lipidelor,
permeabilitatea membranelor pentru ionii de Na + , K + , Li + , Ca 2+ , Mg 2+ , pH-ul plasmei, gradientul
osmotic şi menţinerea integrităţii structurale şi capacităţilor funcţionale ale spermei în procesul
de crioconservare, care poate fi realizată prin selectarea şi utilizarea substanţelor cu proprietăţi
de a stabiliza procesele biochimice în plasmă şi spermii la nivelul stării native, precum şi prin
alimentarea cocoşilor cu preparate, care favorizează spermatogeneza sanogenă.
14. Mediile crioprotectoare pentru sperma de cocoş, elaborate prin includerea substanţelor
compoziţionale cu variabilitate de provenienţă organică şi anorganică; metodele, regimele şi
principiile propuse pentru conservarea materialului spermatic şi însămînţarea artificială a
găinilor au asigurat obţinerea rezultatelor semnificative în condiţii de producere a fecundităţii
ouălor, eclozionării şi obţinerii puilor sănătoşi.
RECOMANDĂRI PRACTICE
1. În scopul majorării eficienţei reproducerii şi realizării selecţiei genotipice în avicultură se
propune de a folosi pentru îsămînţarea artificială a găinilor, sperma de cocoş criocoservată prin
utilizarea mediului crioprotector în următoarea componenţă: maltoză - 11,5 g; glicerină – 7 ml;
petumozidă - 0,05 mg%; arginina - pînă la pH-ul mediului 6,8 -6,9; apă distilată - pînă la 100 ml.
Mediul elaborat poate fi aplicat în criotehnologii la congelarea materialului seminal în
formă de granule „Mediul crioprotector pentru sperma de cocoş”, Brevet de invenţie. 639 G2,
Int. Cl. 6 : A 61 D 19\02 (BOPI, nr. 12/96).
2. Pentru reglarea procesului de peroxidare a lipidelor membranare ale spermatozoizilor, în
componenţa mediului pentru diluarea şi criconservarea spermei de cocoş, se recomandă de a
include steroidul glicozidic “Triozida (25R)-spirost-5-en-3β,27-diol-27-O-(3-hidroxi-3metilglutaroil)
ce posedă proprietate antioxidantă”, Brevet de invenţie. 1156 G2, Int. Cl. 6 : C 07
H 3/06; C 07 J 71/00 (BOPI, nr. 2/99).
3. În scopul diluării şi conservării hipotermale, menţinerea valorii biologice şi sporirea
proprietăţilor fecundative sanogene ale spermei cocoşilor-reproducători se propune mediul
199

pentru conservare cu următoarea componenţă: soluţie izotonică de clorură de sodiu - 1,0 g;
amidon hidrosolubil - 0,1 g; apă distilată - pînă la 100 ml.
4. La elaborarea mediilor sintetice pentru crioconservarea spermei de aplicat următoarele
principii: stabilizator, inhibitor, reglator, combinator, modificator şi stimulator, care,
corespunzător, prevăd menţinerea fiziologică a proprietăţilor bio-fizico-chimice, blocarea
derulării proceselor bio-fizico-chimice nocive, dirijarea activităţii compuşilor structurali şi
permiabilităţii membranelor, utilizarea substanţelor de diversă origine cu acţiune exo- şi
endocelulară, schimbarea structurilor cristalice şi limitelor eutectice şi stimularea proceselor
menţinerii energiei, formării biocomplexelor, structurilor criorezistente şi activităţii funcţionale a
spermatozoizilor după deconservarea lor.
5. Pentru sporirea eficienţei activităţii întreprinderilor de prăsilă, se propune de a aplica
schema de organizare a reproducerii artificiale ale găinilor cu spermă conservată de cocoş, care
include următoarele elemente:
a) Organizarea şi instruirea grupului de specialişti angajaţi pentru pregătirea cocoşilor şi
găinilor, recoltarea spermei şi însămînţarea artificială a găinilor;
b) Pregătirea cocoşilor pentru obţinerea unui material de calitate după acomodarea şi
adaptarea lor;
c) Organizarea, amenajarea şi aprovizionarea laboratorului specializat pentru manipularea şi
investigarea produsului seminal destinat insămînţării artificiale;
d) Recoltarea spermei de la cocoşi prin masajarea uşoară a regiunii sacrale în sus craniocaudal
şi masajarea regiunii abdominale în direcţia de la apendicele xifoid spre apofizele
pubiene;
e) Prepararea mediilor, diluarea şi conservarea spermei de cocoş după recoltare cu mediile
specifice preparate în acest scop;
f) Realizarea tehnicii de însămînţare artificială a găinilor şi evidenţă ei conform schemei
aplicării la ziua a 4, 5, 6 şi 7 sau la ziua a 7, cu sîmbătă şi duminica - zile libere;
j) Recoltarea şi incubarea ouălor.
6. Metoda de menţinere şi fortificare a spermatogenezei la cocoşi prin administrarea în
componenţa raţiei alimentare a substanţelor coordinative care contribuie la sporirea indicilor
spermatogenezei. Brevet de invenţie. 4166 B1 MD, A01K 67/00; A23K 1/16; C01G 9/00; A61P
15/08, BOPI nr. 5/2012 şi Brevet de invenţie. 4193 B1 MD, A61D 19/00; A01K 67/00; A61P
15/08; C01G 9/00; C01B 19/00, BOPI nr. 1/2013.
200

BIBLIOGRAFIE
1. Balan I. Crioactivitatea enzimelor membranodependente şi starea acidului dezoxiribonucleic
în procesul spermatogenezei. În: Revista Română de Medicină Veterinară, 2012, Serie nouă,
vol. 22, nr. 3, p. 39-48.
2. Balan I. Coerenţa factorilor de mediu, structură şi calitate a materialului seminal de cocoş la
crioconservare. În: Mediul ambiant, 2012, nr. 4, p. 34-38.
3. Balan I. Actualităţi în modificările moleculare si morfologice dirijate ale celulelor spermatice
în progresia spermatogenezei. În: Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii, 2012, nr. 1, p. 65-82.
4. Balan I. Criolabilitatea stării morfo-fiziologice şi diversitatea rezistenţei spermei de cocoş.
În: Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii, 2012, nr. 2, p. 37-47.
5. Balan I. Aspecte membrano-structurale în păstrarea biodiversităţii prin crioconservare. În:
Studia Universitatis, Ştiinţe ale naturii, 2012, nr. 1, p. 101-105.
6. Balan I. Rolul glucidelor în stabilizarea stării morfo-funcţionale a spermei de cocoş în
procesul de crioconnservare. În: Studia Universitatis, Ştiinţe ale naturii, 2012, nr. 1, p. 96-100.
7. Balan I., Boronciuc Gh., Roşca N. Unele caracteristici sanogene ale materialului seminal în
corelaţie cu statusul homeostazic al organismului. În: Medicina tradiţională şi
sanocreatologică, Buletinul Asociaţiei MT RM, Chişinău, 2006, vol. 9, p. 33-36.
8. Boronciuc Gh., Balan I., Roşca N. şi al. Modificări de conformaţie ale gameţilor de cocoş
sub influienţa factorilor stresogeni. În: Lucrări ştiinţifice, Medicină veterinară, Chişinău, 2008,
vol. 19, p. 137-140.
9. Boronciuc Gh., Balan I., Roşca N. Interacţiunea lipoproteică şi posibilitatea stabilizării ei în
procesul crioconservării spermei animalelor agricole. În: Materialele Congresului al IX-lea
Naţional cu participare internaţională al Geneticienilor şi Amelioratorilor. Chişinău, 2010, p.
154.
10. Ciochină V., Furdui V. Dezvoltarea fiziologiei şi sanocreatolgiei. Rezultate şi perspective.
În: Buletinul Academiei de ştiinţe a Moldovei, 2006, nr. 1, p. 12-18.
11. Ciofu C. Nutritie si alimentaţie. In: Pediatrie, ed. I, 2001, p. 90-92.
12. Crivoi A., Bacalov Iu., Cojocari L. şi al. Aspectul bioetic al stimulării rezervelor funcţionale
ale proceselor adaptative. În: Materialele Conferinţei a XV-a ştiinţifice internaţionale: bioetica,
filosofia, economia şi medicina în strategia de asigurare a securităţii umane. Chişinău, 2010, p.
28-33.
13. Darie G., Rudic V. şi al. „Procedeu de optimizare a spermatogenezei taurilor reproducători”.
Brevet de invenţie Nr. 3226 / 2007. 01. 31.
201

14. Darie Gr, Marandici Elena. Biotehnologia însămînţării artificiale a taurilor: (recomandări).
Ch.: S. n., Tipogr. „Print - Caro”, 2011. 59 p.
15. Gudumac V., Niguleanu V., Rîvneac V. şi al. Examenul lichidului spermatic (ghid practic).
Chişinău, 2010. 50 p.
16. Marandici E. Dinamica modificării cantităţii şi calităţii spermei în funcţie de vîrstă, mediu
ambient şi impactul preparatelor microbiene la vieri. Autoref. tez. de dr. şt. biologice.
Chişinău, 2008. 26 p.
17. Miclea V., Ladosi D., Ladosi I., Zahan M. The influence of inducing early reproductive
activity in young hens and roosters of egg-laying type breed. In: Journal of Central European
Agriculture, 2002, vol. 3, no. 4, p. 353-362.
18. Miclea V., Zahan M., Miclea Ileana. Reproducţia animalelor de fermă. Cluj-Napoca: Accent,
2010. 334 p.
19. Păcală N. şi al. Îndrumător lucrări practice de Biologia reproducerii animalelor. Timişoara:
Eurobit, 2002. 46 p.
20. Raicu Florina şi al. Rolul proteinelor de legare la ARN în spermatogeneză şi infertilitatea
masculină. În: Progrese în Biotehnologie. Editura Ars Docendi, 2002, vol. 2, p. 133-141.
21. Roşca N. Modificările morfofuncţionale ale gameţilor de tauri şi cocoşi în dependenţă de
modalitatea stresării animalelor. Autoref. tezei de dr. şt. biologice. Chişinău, 2000. 22 p.
22. Roşca N. et al. Morfopatiile spermei de taur la influienţa factorilor stresogeni de
crioconservare. În: Simpozion ştiinţific intrnaţional „35 ani de învăţămînt superior medical
veterinar din Republica Moldova”, Chişinău: Centrul Ed. al UASM, 2009, p. 182-185.
23. Roşca N. şi al. Morfologia şi activitatea funcţională a spermatozoizilor de taur şi cocoş sub
influienţa diferitor factori. În: Lucrări ştiinţifice, UASM, Zootehnie şi biotehnologii, Chişinău,
2010, vol. 26, p. 323-328.
24. Roşca N. şi al. Spectrul proteic în procesul criconservării sprmei de tauri şi cocoşi. În:
materialele Congresului al IX-lea Naţional cu participare internaţională al Geneticienilor şi
Amelioratorilor, Chişinău, 2010, p. 165.
25. Şara A. et al. Efectele utilizării mineralelor organice în nutriţia animalelor. În: Buletinul
USAMVCN, 2004, vol. 60, p. 100-103.
26. Şara A., Antonina Odagiu. Disponibilitatea probioticelor şi mineralelor în creşterea
ecologică a animalelor. În: ProEnvironment, 2008, vol. 2, p. 89-93.
27. Şumanschii A., Bularga I. Nutriţia şi alimentaţia animalelor domestice. Chişinău, 2009. 326
p.
202

28. Şumanschii A. Studiul dezvoltării sectorului avicol la nivel naţional şi internaţional. În:
Realizări şi perspective în zootehnie şi biotehnologii. Simpozion ştiinţific internaţional,
UASM. Chişinău, 2010, p. 122-126.
29. Zamfirescu S. şi al. Rezultate privind pretabilitatea la congelare a spermei de ţap şi
fecunditatea obţinută după inseminarea artificială a caprelor. În: Lucrări ştiinţifice, Ed.
Universităţii „Lucian Blaga”, Sibiu, 2007, vol. 5, p. 127-132.
30. Zamfirescu S., Anghel A. Researches regarding the ultrastructural modifications of sperm
cells before and after freezing in different media. În: Lucrări ştiinţifice, Seria Zootehnie, 2010,
vol. 53, no. 15, p. 67-74.
31. Балан И.В. Барьерные свойства плазматических мембран при криоконсервации генома
петуха. În: Materialele congresului VI al fiziologilor din Moldova cu participare
internaţională. Chişinău, 2005, p. 115-116.
32. Балан И.В., Борончук Г.В. Криомембранология. К.: Типогр. А.Н. Респ. Молдова, 2003.
336 c.
33. Балан И.В. Изменения механизмов белок-белковых взаимодействий в биологических
системах при криоконсервации. În: Studia universitatis, Ştiinţe ale naturii, 2012, nr. 1, p.
106-118.
34. Балан И.В., Борончук Г.В. Криогенные изменения акросомальных мембран гамет
петуха в процессе криоконсервации. În: Problemele actuale ale geneticii, biotehnologiei şi
ameliorării. Chişinău, 2005, p. 221-225.
35. Балан И.В., Борончук Г.В. Сульфгидрильно-дисульфидные взаимодействия на этапах
криоконсервации семени сельскохозяйственных животных. În: Studia universitatis, Ştiinţe
ale naturii, 2005, p. 93-97.
36. Балан И.В., Борончук Г.В. Межмолекулярные взаимодействия в фермент-субстратных
комплексах плазматических мембран гамет сельскохозяйственных животных. În: Studia
universitas, Ştiinţe ale naturii, 2007, nr. 1, p. 29-31.
37. Балан И.В., Борончук Г.В., Бузан В.И и др. Барьерно-траспортные свойства
биологических мембран гамет петуха. B: Акт. пробл. интенсификации произв. прод.
животноводства. Тезисы докл. межд. н.-произв. конф., Жодино, 2005, c. 45-46.
38. Балан И.В., Борончук Г.В. и др. Массоперенос через мембраны в процессе
криконсервации гамет петуха. În: Realizări şi perspective în creşterea animalelor. Mat. simp.
şt. cu participare internaţională, Maximovca, 2006, p. 302-306.
203

39. Балан И.В., Борончук Г.В., Тодераш И.К. Фазовые переходы в биологических
мембранах в процессе криоконсервации. În: Analele ştiinţifice ale USM, ştiinţe chimicobiologice,
Chişinău, 2006, p. 103-114.
40. Балан И.В., Борончук Г.В. и др. К проблеме создания криобанков. În: Problemele
actuale ale protecţiei şi valorificării durabile a diversităţii lumii animale. Mat. conf. intern.,
Chişinău, 2007, p. 151-153.
41. Балан И.В. и др. Белковый спектр на этапах криоконсервации спермы животных. În:
Diversitatea, valorificarea raţională şi protecţia lumii animale, I.E.-P. „Ştiinţa”, Chişinău, 2009,
p. 13-16.
42. Белоус А.М., Бондаренко В.А. Cтруктурные изменения биологических мембран при
охлаждении. Киев: наукова думка, 1982. 256 c.
43. Белоус А. М., Грищенко В. И. Криобиология. Киев: Наукова думка, 1994. 432 c.
44. Белоусов В.П., Панов М.Ю. Термодинамика водных растворов неэлектролитов.
Ленинград: Химия, 1983. 265 c.
45. Бергельсон В.И. Биологические мембраны. Москва: Наука, 1975, 183 c.
46. Болдырев А.А. Введение в мембранологию. Москва: МГУ, 1990, 209 c.
47. Борончук Г.В. Специфика изменений физиолого–биохимических реакций спермы
различных видов животных в процессе криоконсервации и разработка методов
повышения ее криорезистентности: Автореф. дис. докт. хаб. биол. наук. К., 1998, 32 c.
48. Борончук Г.В., Балан И.В. Функциональная активность репродуктивных клеток
животных после криоконсервации в средах на основе гликолипидпереносящих липосом.
În: Analele ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Moldova. Seria "Ştiinţe chimico-biologice".
Chişinău, 2006, p. 115-120.
49. Борончук Г.В., Балан И.В. Применение веществ различной природы в составе
криоконсервантов гамет сельскохозяйственных животных. În: Studia universitatis. Ştiinţe
ale naturii, 2007, nr. 1, p. 32-35.
50. Борончук Г.В., Балан И.В. Структурно-функциональные и биохимические изменения
в биологических системах при криоконсервации. Сhişinău: Tipografia AŞM, 2008. 633 c.
51. Борончук Г.В., Балан И.В. и др. Проницаемость плазматических мембран гамет петуха
и возможности его регулирования. În: Lucrări ştiinţifice, UASM, Zootehnie şi biotehnologii,
Chişinău, 2008, vol. 18, p. 177-180.
52. Борончук Г.В. и др. Основные критерии саногенности спермы человека. B: Научные
труды II-го съезда физиологов СНГ, Москва-Кишинев, 2008, c, 167.
204

53. Борончук Г.В. и др. Гидрофобно-гидрофильное соотношение аминокислот плазмы в
процессе криоконсервации спермы различных видов животных. Diversitatea, valorificarea
raţională şi protecţia lumii animale, Chişinău: I.E.-P. „Ştiinţa”, 2009, p. 19- 22.
54. Борончук Г.В. и др. Kриогенные изменения гидрофобно-гидрофильного соотношения
аминокислот плазмы спермы различных видов животных. În: Lucrări ştiinţifice, UASM,
Zootehnie şi biotehnologii, Chişinău, 2010, vol. 26, p. 254-257.
55. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических
мембранах. Москва: Наука, 1972. 348 c.
56. Вишневский В.М. Температурные остановки и выживаемость клеток при
замораживании. В: Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических
структур. Киев, Наукова думка, 1977, c. 11-12.
57. Геннис Р. Биомембраны, молекулярная структура и функции. М: Мир, 1997. 622 c.
58. Гранач В.Г. Соотношение белок/липид в плазматических мембранах и
функциональные показатели гамет в зависимости от содержания в рационе быковпроизводителей
бета-каротина, витаминов, протеина и антиоксидантов. Автореф. дис.
канд. биол. наук. Львов, 1989. 18 c.
59. Грищенко В.И. и др. Испоьзование перфторана для гипотермического хранения
спермиев человека. В: Биофизика живой клетки, 2006, том. 8, с. 88-92.
60. Гулевский А.К. и др. Барьерные свойства биомембран при низких температурах. Киев:
Наук.думка, 1988. 208 с.
61. Гулевский А.К., Релина Л.И. Антифризные белки. Сообщение I. Класификация и
механизм действия. В: Проблемы криобиологии, 2009, том. 19, № 1, с. 18-24.
62. Гулевский А.К., Релина Л.И. Антифризные белки. Сообщение II. Распространение в
природе. В: Проблемы криобиологии, 2009, том. 19, № 2, с. 121-136.
63. Гулевский А.К., Релина Л.И. Антифризные белки. Сообщение III. Регуляция,
происхождение, стабильность и применение. В: Проблемы криобиологии, 2009, том. 19,
№ 3, с. 273-282.
64. Давыдова Е.В., Осецкий А.И. Кластерная кристаллизация водных растворов
глицерина. В: Проблемы криобиологии, 2011, том. 21, № 2, с. 200.
65. Дарий Г.Е. Адаптивный потенциал и воспроизводительная функция животных.
Автореф. дис. д-ра биол. наук, Дубровицы, 1993. 30 с.
66. Дворецкий И.А. и др. Tрансмембранный перенос ионов при действие ионицирующей
радиации на организм. Киев: Наукова Думка, 1990. 136 с.
205

67. Дрокин С.И. и др. Особенности кристаллизации суспензии клеток, содержащих
осмотически неактивные внутриклеточные структуры. В: Мат. межд. конф. «Сохранение
генетических ресурсов», СПБ, 2004, с. 787-788.
68. Зинченко А.В. и др. О возможных факторов повреждения биоогических объектов и их
ДНК при криоконсервации. В: Мат. межд. конф. «Сохранение генетических ресурсов»,
СПБ, 2004, с. 796-797.
69. Ипатова О.М. Фосфоглив: механизм действия и применение в клинике. Москва: Издво
МГУ, 2005. 318 с.
70. Ивахник Г.В. Селен и витамин е в комбикормах для яичных кур: Автореф. дис. канд.
биол. наук. Сергиев Посад, 2007. 21 с.
71. Ивков В.Г., Берестовскийй Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. Москва:
Наука, 1982. 224 с.
72. Казаков Ю.М. Влияние антиоксидантов на морфофункциональное состояние гамет
баранов и быков, разработка синтетических сред и приемов их консервации. Автореф.
дис. канд. биол. наук. Кишинев, 1992. 18 с.
73. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. В: СПБ, Питер
Пресс, 1995, c. 304.
74. Коваленко И.Ф. и др. Проницаемость мембран клеток СПЭВ для молекул воды и
ДМСО. В: Проблемы Криобиологии, 2009, том. 19, № 1, с. 25-31.
75. Козикова Л.В., Яковлев А.Ф. Цитогенетический анализ эмбрионов кур, полученных
путем искусевенного осеменения криоконсервированной спермой разных сроков
хранения. В: Мат. межд. конф. «Сохр. ген. ресурсов», СПБ, 2004, с.803.
76. Крепс Е.М. Липиды клеточных мембран. Ленинград: Наука, 1981. 340 с.
77. Кричевская Л.В. Применение антиоксидантных препаратов при холодовой адаптации.
В: Проблемы криобиологии, 2001, № 2, с. 45-48.
78. Курбатов А.Д. и др. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных.
Ленинград: Агропромиздат, 1988. 256 с.
79. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва: Высшая школа, 1980. 296 с.
80. Лесникова Л.Н. Стрессорные изменения физиологических свойств эритроцитов и их
коррекция с помощью экстракта из туники асцидии пурпурной (Halocynthia aurantium),
Автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток, 2006. 16 с.
81. Ліннік Т.П. Фізико-хімічні фактори кріопошкоджень і кріозахисту сперматозоїдів
півнів у циклі низькотемпературного консервування: Автореф. дис. докт. біол. наук.
Харків, 2003. 36 с.
206

82. Линник Т.П. и др. Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных
липидов спермиев петуха. В: Проб. криобиологии, 2010, том. 20, № 1, с. 34-46.
83. Линник Т.П., Мартынюк И.Н. Подходы к созданию криозащитных сред при
криоконсервировании спермы птиц. В: Проб. криобиол., 2010, том. 20, № 1, с. 109-122.
84. Лозина–Лозинский Л.К.. Очерки по криобиологии. Ленинград: Наука, 1972. 289 с.
85. Максимов Н.А. О вымерзании и холодостойкости растений. В: Известия СПБ лесного
института, 1913, том. 25, с. 300-330.
86. Максудов Г.Ю., Артюшкова В.А. Физиологическая консервация спермы позвоночных.
Пущино, 1989. 120 с.
87. Мелехов Е.И. О возможном принципе регуляции повреждений и защитной реакции
клетки. В: Журнал общей биологии, 1983, том. 44, № 3, с. 386-397.
88. Милованов В.К. Биология воспроизводства и искусственного осеменения животных.
Москва: Сельхозиздат, 1962. 696 с.
89. Мороз Л.Г. Теоретические аспекты низкотемпературной консервации спермы с-х
животных. Криоконсервация спермы с-х животных. Л: Агропромиздат, 1988, с. 7-65.
90. Нарубина Л.Е. Разработка способов длительного хранения спермы петухов и их
использование при воспроизводстве птицы: Дис. д-ра с-х наук. С-Петербург, 1998. 40 с.
91. Наук В.А. Структурно–функциональные особенности сперматозоидов с-х животных
при криоконсервации и разработка эффективных способов их длительного хранения:
Автореф. дис. д-ра биол. наук. Харьков, 1987. 32 с.
92. Наук В.А. Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при
криоконсервации. Кишинев: Штиинца, 1991. 200 с.
93. Наук В.А., Борончук Г.В. Методика выделения плазматических мембран гамет
сельскохозяйственных животных. Известия АН МССР. Сер. биол. и хим. наук, 1993, №
1, с. 50-53.
94. Наук В.А. и др. Проблемы и перспективы консервации генома сельскохозяйственных
животных. В: С-х биология, 1989, № 2, с. 15-22.
95. Наук В.А. и др. Длительное сохранение спермы сельскохозяйственных животных. В:
Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1991, с. 35-81.
96. Новиков Е.А. Применение методов вариационной статистики в биологии и медицине.
В: Проблемы репродукции, 1995, № 1, с. 20-22.
97. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы
производителей. Киев: Урожай, 1978. 255 с.
207

98. Осташко В.Ф., Осташко Ф.И. Температурный шок клеток как гидравлический удар в
резонансной системе. В: Mат. междунар. конф. «Сохранение генетических ресурсов»,
СПБ, 2004, с. 831-832.
99. Петрик М.А., Мартынюк И.Н. Снижение цитотоксичности мембранотропных
криопротекторов до замораживания спермы индюка в присуствии белковых добавок. В:
Проблемы криобиологии, 2011, том. 21, № 2, с. 199.
100. Покровский А.А. Определение активности щелочной и кислой фосфатаз сыворотки
крови (по Боданскому). Биохимические методы исследования в клинике. М.: Медицина,
1969, с. 159-160 / 93 c.
101. Пономаренко Ю. А. и др. Корма, кормовые добавки, биологически активные
вещества для сельскохозяйственной птицы. Москва, 2009. 655 c.
102. Прошин С.Н. и др. Оценка влияния криоконсервации на целостность ДНК
сперматозоидов быков. В: Mат. междунар. конф. «Сохранение генетических ресурсов»,
СПБ, 2004, c. 844-845.
103. Пушкарь Н.С. и др. Криопротекторы. Киев: Наук. думка, 1978. 204 c.
104. Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Проявление и устранение эффекта “упаковки” в
средах с непроникающими и проникающими криопротекторами. В: Проблемы
Криобиологии, 2009, том. 19, № 3, с. 312-323.
105. Романова Л., Стальная И.Д. Метод определения гидроперекисей липидов с помощью
тиоционата аммония. В: Современные методы в биохимии, М.: Медицина, 1977, с. 64-
66.
106. Рошка Н.В. и др. Cаногеность спермы – одно из условий санокреатологической
репродукции потомства. В: Научные труды III Съезда физиологов С.Н.Г. Москва-Ялта,
2011, с. 275.
107. Рустенова Р.М. Влияние состава среды и технологических приемов на качество
спермы хряков при криоконсервации: Автореф. дис. канд. с-х наук. Л-П, 1982. 22 с.
108. Рыбальченко В.К., Курский М.Д. Структура и функция мембран. Киев: Высшая
школа, 1988. 312 с.
109. Сахацкий Н.И. Сохранение генофонда птиц. Автореф. дис. д-ра биол. наук. Москва,
1990. 32 с.
110. Скатков С.А. Полиненасыщенный фосфатидилхолин и мужская фертильность. В:
Проблемы репродукции, 2003, № 1, с. 84-91.
111. Скороход В.И., Стефаник М.Б. Методы исследования липидов в органах и тканях
животных. Львов, 1983. 23 с.
208

112. Смирнов Л.П., Богдан В.В. Липиды в физиолого-биохимических адаптациях
эктотермных организмов к абиотическим факторам среды. Москва: Наука, 2007. 182 с.
113. Снурников А.С. Криоконсервация эмбрионов крупного рогатого скота. В: Мат.
межд. конф. «Сохранение генетических ресурсов», СПБ, 2004, с. 859.
114. Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных жирных
кислот. В: Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977, с. 63-64.
115. Струтинскй Ф. А. Физиологически адекватное питание и здоровье. Chişinău:
Tipografia A.Ş.M, 2006. 408 р.
116. Терещенко А.В. Сохранность сперматозоидов петухов в зависимости от условий
криоконсервации: Автореф. дис. канд. биол. наук. Харьков, 1988. 16 с.
117. Титов В.Н., Лисицин М.Д. Содержание спиртов холестерина в плазме крови зависит
от количества двойных связей жирных кислот в пуле липидов липопротеинов. B: Бюл.
экспер. биологии и медицины, 2006, № 11, с. 521-524.
118. Тодрин А.Ф. и др. Теплофизические свойства криопротекторов. II Динамическая
вязкость ряда криопротекторов, их растворов и смесей. B: Проблемы криобиологии,
2010, том. 20, № 3, с. 266-281.
119. Фисинин В.И. и др. Кормление с-х птицы. Сергиев Посад, 2003. 375 с.
120. Толкачева Н.В. и др. Строение основного стероидного гликозида соцветий allium
cyrillii (alliaceae). B: Уч. записки Тавр. Нац. Универ. им. В. И. Вернадского, Серия
«Биология, химия», 2011, том. 24, (63), № 2, с. 390-395.
121. Фурдуй Ф.И. Физиологические механизмы стресса и адаптации при остром действии
стресс-факторов. Кишинев: Штиинца, 1986. 240 с.
122. Фурдуй Ф.И. Проблемы стресса и преждевременной биологической деградации
человека. Санокреатология. Их настоящее и будущее. B: Современные проблемы
физиологии и санокреатологии. Сhişinău: Tipografia AŞM, 2005, р. 16-35.
123. Фурдуй Ф.И., Чокинэ В.К., Фурдуй В.Ф. Понятие здоровье – отправная точка
санокреатологии: cтресс, адаптация, функциональные нарушения и санокреатология.
Кишинев: Картя Молдовеняскэ, 1999, с. 44-51.
124. Фурдуй Ф.И., Чокинэ В.К., Вуду Г.А. и др. Гаметогенез как начальный этап закладки
генетических механизмов здоровья. În: Buletinul Academiei de ştiinţe a Moldovei, 2002, nr.
2, p. 30-39.
125. Фурдуй Ф.И., Чокинэ В.К., Вуду Г.А. и др. Оплодотворение как завершающий этап
закладки генетических механизмов здоровья и нарушающие их факторы. În: Buletinul
Academiei de ştiinţe a Moldovei, 2002, nr. 2, p. 40-45.
209

126. Фурдуй Ф.И., Чокинэ В.К., Фурдуй В.Ф. Концепция о санокреатологии
респираторной системы. În: Buletinul Academiei de ştiinţe a Moldovei, 2008, nr. 1, p. 4-14.
127. Фурдуй Ф.И., и др. Здоровье человека – важнейшая комплексная задача многих
биологических и медицинских наук. În: Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii. 2005, nr. 1, p. 4-14.
128. Фурдуй Ф.И., Чокинэ В.К., Фурдуй В.Ф. Принципы преждевременной
общебиологической деградации человека, пути её предупреждения и решения проблемы
здоровья с позиции санокреатологии. În: Buletinul AŞM. Ştiinţele vieţii, 2011, nr. 2, p. 4-
15.
129. Фурдуй Ф.И., Чокинэ В.К., Фурдуй В.Ф. и др. Предпосылки и основные положения
санокреатологической теории питания человека. II. Постулаты санокреатологической
теория питания. În: Buletinul AŞM, Ştiinţele vieţii, 2011, nr. 1, p. 4-14.
130. Цуцаева А.А. и др. Механизмы индукции нелетальных криоповреждений. B: Мат.
межд. конф. «Сохранение генетических ресурсов», СПБ, 2004. p. 879.
131. Чекман И.С. и др. Справочник по клинической фармакологи и фармакотерапии.
Киев: Здоровья, 1986. 736 c.
132. Чернобай Н.А. и др. Зависимость проницаемости мембран клеток СПЭВ для молекул
этиленгликоля и 1,2-бутандиола от температуры. B: Проблемы криобиологии, 2009, том.
19, № 2, с. 137-142.
133. Чернобай Н.А. и др. Зависимость проницаемости мембран клеток интерстиция
тестисов для молекул ряда криопротекторов от температуры. B: Проблемы
криобиологии, 2010, том. 20, № 2, с. 153–158.
134. Чернобай Н.А. и др. Зависимость проницаемости мембран клеток СПЭВ для молекул
криопротекторв от температуры. B: Проблемы криобиологии, 2011, том. 21, № 1, с. 46-
51.
135. Чокинэ В.К. Саногенические системы регуляции ритмики сердца. În: Buletinul
Academiei de ştiinţe a Moldovei, 2002, nr. 4, p. 45-60.
136. Чoкинэ В.К. Физиологические основы кардиосанокреатологии. B: Современные
проблемы физиологии и санокреатологии. Сh.: Tipografia AŞM, 2005, p. 234-242.
137. Чокинэ В.К. и др. Использование серосодержащих аминокислот для диагностики,
целенаправленного поддержания и формирования здоровья. În: Buletinul AŞM, Ştiinţele
vieţii, 2011, nr. 3, p. 15-35.
138. Шапиев И.Ш. и др. Влияние охлаждения и замораживания-оттаивания на дыхание
сперматозоидов. B: Мат. межд. конф. «Сохранение генетических ресурсов», СПБ, 2004,
c. 883-884.
210

139. Швец В.И. и др. Миоинозит и фосфоинозитиды. Москва: Наука, 1987. 248 c.
140. Шептицкий В.А. Роль катехоламинов в перестройке мембранного гидролиза и
всасывания углеводов в тонкой кишке при кратковременном срессе и пути реализации
их эффектов. În: Bulet. Acad. de ştiinţe a Moldovei, 2003, nr. 2, p. 54-69.
141. Шергин Н.П. Биохимия сперматозоидов сельскохозяйственных животных. Москва:
Колос, 1967. 232 c.
142. Шишкина Л.Н., Шевченко О.Г. Липиды эритроцитов и их функциональная
активность. В: Успехи современной биологии, 2010, том. 130, № 6, с. 587-602.
143. Шубин Н.А. и др. Новый подход к проблеме криоконсервации и деконсервации
биологических объектов. B: Мат. межд. конф. «Сохранение генетических ресурсов»,
СПБ, 2004, с. 887-888.
144. Abe Y. et al. Cryopreservation of canine embryos. In: Biology of Reproduction, 2011, vol.
84, no. 2, p. 363-368.
145. Adabi S.G. et al. L.carnitine effects on quantity and quality of African black neck ostrich
sperm. In: Journal of Veterinary and Animal Advance, 2008, vol. 7, no. 1, p. 51-55.
146. Adam Z. et al. Curve fitting approach for measurement of cellular osmotic properties by
the electrical sensing zone method. In: Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 2, p. 117-128.
147. Agarwal A. and Prakaran S.A. Oxidative stress and antioxidants in male fertility: a difficult
balance. In: Iranian Journal of Reproductive Medicine, 2005, vol. 3, no. 1, p. 1-8.
148. Agarwal A. and Saleh R.A. Role of oxidants in male infertility: rationale, significance, and
treatment. In: Urologic Clinics of North America, 2002, vol. 29, no. 4, p. 817-827.
149. Aisen E. et. al. Ultramicroscopic and biochemical changes in ram spermatozoa
cryopreserved with trehalose-based hypertonic extenders. In: Cryobiology, 2005, vol. 50, no. 3,
p. 239-249.
150. Aitken R. J. et al. Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation and human
sperm function. In: Biol. Reprod., 1989, vol. 40, no. 1, p. 183-197.
151. Alkan, I. et. al. Reactive oxygen species production by the spermatozoa of patients with
idiopathic infertility: relationship to seminal plasma antioxidations. In: Journal of Urology,
1997, vol. 157, no. 1, p. 140-143.
152. Allen W. R. Sex, science and satisfaction: aheadybrew. In: Animal Reproduction Science.
2010, vol. 121, no. 1, p. 262–278.
153. Almodin CG. et al. Embryo development and gestation using fresh and vitrified oocytes.
In: Human Reproduction, 2010, vol. 25, no. 5, p. 1192-1198.
211

154. Alvarez J.G. and Storey B.T. Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative
loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. In: Molecular Reproduction and
Development, 1995, vol. 42, no. 3, p. 334-346.
155. Anciuti M.A. et al. Effect of dietary inorganic by organic selenium ( Sel-plex) on
performance of broilers. In: Nutritional Biotechnology in the Feed and Food Industry.
Proceedings of the 20th Annual Symposium, Lexington, Kentucky, USA, 2004, p. 14.
156. Ardon F. et al. Mitochondrial inhibitors activate influx of external Ca2+ in sea urchin
sperm. In: Biochimica et Biophysica Acta, 2009, vol. 1787, no. 1, p. 15-24.
157. Arruda J.S. et al. Influence of replacing dietary inorganic selenium (Sel-plex) on
performance of broilers. In: Proceedings of the 20th Annual Altech Symposium Re-immaging
the Feed Industry, Kentucky, USA, suppl., 2004, vol. 11, p. 13.
158. Bah G.S. et al. Semen characteristics of local breeder cocks in the Sahel region of
Nigeria. In: Revue Elev. Med. Vet. Pays. Trop., 2001, vol. 54, no. 2, p. 153-158.
159. Barber S.J. et. al. Broiler breeder semen quality as affected by trace minerals in vitro. In:
Poultry Science, 2005, vol. 84, no. 1, p. 100-105.
160. Barcelo-Fimbres M , et al. Effects of phenazine ethosulfate during culture of bovine
embryos on pregnancy rate, prenatal and postnatal development. In: Theriogenology, 2009,
vol. 71, no. 2, p. 355-368.
161. Bartsevich V.V. et al. Engineered zinc finger proteins for controlling stem cell fate. In:
Stem Cells, 2003, vol. 21, no. 6, p. 632-637.
162. Bedwal R.S., Bahuguna A. Zinc, copper, and selenium in reproduction. In: Cell Mol Life
Sci., 1994, vol. 50, p. 624-640.
163. Benoff S. et al. Voltage-dependent calcium channels in mammalian spermatozoa revisited.
In: Front Biosci, 2007, vol. 12, p. 1420-1449.
164. Benson E. et al. Life in the Frozen State. In: Ed: Taylor and Francis Group, London (GBR),
2004, Chap. 12, p. 371-392.
165. Berdanier C.D. Advanced Nutrition and Human Metabolism. In: Ed. III, Belmont,
California, Wadsworth, Thomson Learning, 1999, p. 87-105.
166. Berlinguer F. In vitro oocyte maturation, fertilization and culture after ovum pick-up in an
endangered gazelle. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of humanoocytes
(Gazella dama mhorr). In: Theriogenology, 2008, vol. 69, no. 3, p. 349–359.
167. Bianchi K. et al. Calcium and mitochondria: mechanisms and functions of a
traubledrelationship. In: Biochimica et Biophyzica Acta, 2004, vol. 1742, p. 119-131.
212

168. Black M.M. Zinc dificiency and child development. In: Am J Clin, Nutr., 2000, vol. 68, p.
4645-4695.
169. Blackburn H. D. The national animal germplasm program: challenges and opportunities for
poultry genetic resources. In: Poultry Science, 2006, vol. 85, no. 2, p. 210-215.
170. Blanco J. M. et al. Osmotic tolerance of avian spermatozoa: Influence of time, temperature,
cryoprotectant and membrane ion pump function on sperm viability. In: Cryobiology, 2008,
vol. 56, no. 1, p. 8-14.
171. Blesbois E. Current status in avian semen cryopreservation. In: Worlds Poultry Science
Journal, 2007, vol. 63, no. 2, p. 213-222.
172. Blesbois E. et al. Membrane fluidity and the ability to survive cryopreservation in domestic
bird spermatozoa. In: Reproduction, 2005, vol. 129, no. 3, p. 371–378.
173. Blesbois E. et al. Cryopreservation of avian spermatozoa and predictors of ability to
freezing. In: Les actes du BRG, 2006, vol. 6, p. 415-431.
174. Blesbois, E., et al. Semen cryopreservation for ex-situ management of genetic diversity in
chickens; creation of the French Avian Cryobank. In: Poultry Science, 2007, vol. 86, no. 3, p.
555–564.
175. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification. In: Can. J.
Biochem. Phisiol., 1959, vol. 37, no. 8, p. 911-917.
176. Booth S.L, A.l Rajabi A. Determinants of vitamin K status in humans. In: Vitam. Horm.,
2008, vol. 78, p. 1-22.
177. Boran C., Ozkan K.U. The effect of zinc therapy on damaged testis in prepubertal rats. In:
Pediatr Surg Int., 2004, vol. 20, no. 6, p. 444–448.
178. Boronciuc Gh. Status of lipoproteins complexes in process of cryopreservation of a seed of
a bull. In: A Magyar Buiatricus Tarsasag. 20th Jubileumi International Congressof the
Hungarian, Eger, 2010, p. 186.
179. Boronchuk Gh. et al. The state of glicoproteic biocomplexes criopreservation of
reproductive cells of ram animals. In: The 37 international session of scientific
communications of the faculty of animal science. Bucureşti, 2008, p. 222-224.
180. Bugel S. Vitamin K and bone health in adult humans. In: Vitam Horm., 2008, vol. 78, p.
393-416.
181. Burlacova E. et. al. Membrane Lipid Oxidation. In: CRC Press, Boston, 1991, vol. 3, p.
209-237.
182. Buss E. G. Cryopreservation of rooster sperm. In: Poultry Science, 1993, vol.72, no. 5, p.
944-954.
213

183. Buzan V. The role of phospholipids in activity of animal reproduction and there
modifications under hypothermal stress of the bull’s seed material. In: Folia Veterinaria 53,1
Supplementum, LIII – 10th Jubilee Middle European Buiatrics Congress; The scien. Jour. of
the Univ. of Vet. Med. in Kosice - The Slovak Republic, 2009, vol. 2, p. 118-121.
184. Cabrita E. et al. Preliminary studies on thecryopreservationof gilthead seabream (Sparus
aurata) embryos. In: Aquaculture, 2006, vol. 251, no. 2-4, p. 245-255.
185. Calcraft P.J. et al. NAADP mobilizes calcium from acidic organelles through two – pore
channels. In: Nature, 2009, vol. 459, no. 7246, p. 596-600.
186. Castillo C. et. al. Importancia del estrés oxidativo en ganado vacuno: en relación con el
estado fisiológico (preñez y parto) y la nutrición. In: Archivos de medicina veterinaria, 2001,
vol. 33, no. 1, p. 5-20.
187. Chen S-U & Yang Y-S. Slow freezing or vitrification of oocytes: their effects on survival
and meiotic spindles, and the time schedule for clinical practice. In: Journal of Obstetrics &
Gynecology, 2009, vol. 48, no. 1, p. 15-22.
188. Chen P.S. et. al. Microdetermination of phosphorus. In: Analyt. Chem., 1956, vol. 28, no.
11, p. 1756-1758.
189. Chi Z.H. et al. ZNT7 and Zn2+ are present in different cell populations in the mouse testis.
In: Histol Histopathol., 2009, vol. 24, p. 25–30.
190. Churchill G.C. et al. NAADP mobilizes Ca2C from reserve granules, lysosome related
organelles, in sea urchin eggs. In: Cell, 2002, vol. 111, p. 703-708.
191. Costello S. et. al. Calcium stores in sperm: their identities and functions. In: Reproduction,
2009, vol. 138, no. 3, p. 425-437.
192. Cristiano L. Dias et al. The hydrophobic effect and its role in cold denaturation. In:
Thermodynamic aspects of Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 91-99.
193. Darszon A. et al. Sperm channel diversity and functional multiplicity. In: Reproduction,
2006, vol. 131, no. 6, p. 977-988.
194. Dejian Ren and Jingsheng Xia. Calcium Signaling Through CatSper Channels. In:
Mammalian Fertilization Physiology, 2010, vol. 25, no. 3, p. 165-175.
195. Dimitrove S.G. et.al. Effect of organic selenium on turkey semen quality during liquid
storage. In: Animal Reproduction Science, 2007, vol. 100, no. 3, p. 311-317.
196. Dobrescu O. Vitamin C addition to breeder diets increase turkey semen production. In:
Feedstuffs, 1987, vol. 59, p. 18.
197. Dong Z. et al. Calcium in cell innjury and death. In: Annual Review of patology, 2006, nr.
1, p. 405- 434.
214

198. Donoghue A. M. and Wishart, G. J. Storage of poultry semen. In: Animal Reproduction
Science, 2000, vol. 62, p. 313–232.
199. Douard V. et al. Impact of changes in composition of storage medium on lipid content and
quality of turkey spermatozoa. In: Theriogenology, 2004, vol. 61, no.1, p. 1-13.
200. Dumpala, P.R. et al. The effect of semen storage temperature and diluent type on the
sperm quality index of broiler breeder semen. In: Poult. Sci., 2006, vol. 5, no. 9, p. 838-845.
201. Echevarria D. et al.Neuroepithelial secondary organizers andcell fate specification in the
developing brain. In: Brain Research Reviews, 2003, vol. 43, no. 2, p. 179-191.
202. Edashige K. et al.Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) embryos are difficult to
cryopreserve by vitrification. In: Cryobiology, 2006, vol. 53, no. 1, p. 96-106.
203. Edens F.W. et al. Influence of selenium yest (Sel-plex) on performance and carcass yeld of
broiler males grown in e cage environment. In: Proceedings of the 20th Annual Alltech
Symposium Re-immaging the Feed Industry, 2004, vol. 11, p. 31.
204. Eid Y. et. al. Vitamin E supplementation reduces dexamethasone-induced oxidative stress
in chicken semen. In: British Poultry Science, 2006, vol. 47, no. 3, p. 350-356.
205. Eisenbach M., and Giojalas L. 2006. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the
egg. In: Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006, vol. 7, no. 4, p. 276-285.
206. Elansary E. et al. Effect of ascorbic acid on semen characteristics of Alexandria cockerels
under hot ambient temperatures. In: Abstr. Poul. Scien. Assoc., 1999, vol. 78, p. 35.
207. Elena N. Physical states of aqueous solutions of oxyethylated glycerol with polymerization
degree of N=30 at temperatures lower than 283 K. In: CryoLetters, 2007, vol. 28, no. 4, p. 261-
270.
208. Elgazar V. et al. Zinc-regulating proteins, ZnT-1, and Metallothionein I/II are present in
different cell populations in the mouse testis. In: J. Histochem Cytochem., 2005, vol. 53, no. 7,
p. 905-912.
209. El-Tawil A.M. Zinc deficiency in men with Crohn's disease may contribute to poor sperm
function and male infertility. In: Andrologia. 2003, vol. 35, no. 6, p. 337–341.
210. Erenpreiss, J. et al. Sperm chromatin structure and male fertility: Biological and clinical
aspects. In: Asian J. Androl., 2006, vol. 8, no. 1, p. 11-29.
211. Espino J. Reduced levels of intracellular calcium releasing in spermatozoa from
asthenozoospermic patients. In: Reprod. Biol. and Endocrin., 2009, vol. 7, no. 1, p.11.
212. Etches R. J. Reproduction in Poultry. In: Britich Poult. Sci., 1996, vol. 19, p. 187-194.
215

213. FAO. Classification and characterization of world livestock production systems. Update of
the 1994 livestock production systems dataset with recent data, by J. Groenewold. Unpublished
report. Rome, 2004.
214. FAO. World agriculture: towards 2030/2050. Interim report. Rome, 2006. 78 p.
215. FAO. Global Plan of Action for Animal Genetic Resources and the Interlaken Declaration.
Rome, 2007. 48 p.
216. FAO. The State of Food and Agriculture. Livestock in the balance. Rome, 2009. 180 p.
217. FAO. The State of Food Insecurity in the World 2010. Addressing food insecurity in
protracted crises. Rome, 2010. 62 p.
218. Farrant J. et al. Use of two-step cooling procedures to examine factors influencing cell
survival following freezing and thawing. In: Cryobiology, 1977, vol. 14, no. 3, p. 273-286.
219. Farrant J. General observations on cell preservation. In: Low Temperature Preservation in
Medicine and Biology. Pitman Medical, Tonbridge Wells, UK, 1980, p. 1-18.
220. Felix R. Molecular physiology and pathology of Ca2+-conducting channels in the plasma
membrane of mammalian sperm. In: Reproduction, 2005, vol. 129, no. 3, p. 251-262.
221. Figueiuredo E. A. P. et al. Effects of composition of diluents, dilutions and storage time of
heavy broiler breeder semen on fertility, hatchability and chick production.In: Revista
Brusileria de Zootecnia, 1999, vol. 25, p. 1239-1244.
222. Freedman L.P. Anatomy of the steroid receptor zinc finger region. In: Endocrine Rev.,
1992, vol. 13, no. 2, p. 129-145.
223. Froman D.P. Dediction of a model for sperm storage in the oviduct of the domestic fowl
(Gallus domesticus). In: Biology of Reproduction, 2003, vol. 69, no. 1, p. 248-253.
224. Froman D.P., and Kirby J.D. Sperm mobility: phenotype in rosters (Gallus domesticus)
determined by mitochondrial function. In: Biol. Reprod., 2005, vol. 72, no. 3, p. 562-567.
225. Fulton J. E. Avian Genetic stock preservation: an industry perspective. In: Poultry Science,
2006, vol. 85, no. 2, p. 227–231.
226. Gee G. F. et al. Reproduction in non-domestic birds: phisyology, semen collection,
artificial insemination and cryiopreservation. In: Avian Poult. Biol. Rev., 2004, vol. 15, p. 47-
101.
227. Gerasimenko JV. et al. NAADP mobilizes Ca2C from a thapsigargin-sensitive store in the
nuclear envelope by activating ryanodine receptors. In: Journal of Cell Biology, 2003, vol.
163, no. 2, p. 271-282.
216

228. Gomez E. et. al. Evaluation of a spectrophotometric assay for the measurement of
malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals in human spermatozoa: relationships with semen
quality and sperm function. In: Int. Jour. of Androl., 1998, vol. 21, no. 2, p. 81-94.
229. Goni F.M. et. al. Molecular and acell Biology of Lipids. In: Biochim. Biofiz. Acta., 2008,
vol. 1781, no. 11-12, p. 665-684.
230. Gordienko O.I. et al. Mechanisms of cryoprotectant permeation via erythrocytes
membranes. In: Problems of Cryobiology, 2002, no. 4, p. 9-16.
231. Gous R.M. and Morris T.R. Nutritional interventions in alleviating the effects of high
temperatures in broiler production. In: World's Poultry Sci. J., 2005, vol. 61, no. 3, p.463-475.
232. Govin J. et al. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian
spermiogenesis. In: Eur. J. Biochem., 2004, vol. 271, no. 17, p. 3459-3469.
233. Graham L.A., Marshall C.B., Lin F.H. et al. Hyperactive antifreeze protein from fish
contains multiple ice-binding sites. In: Biochemistry, 2008, vol. 47, no. 7, p. 2051–2063.
234. Gregory M. Fahy. Cryoprotectant toxicity neutralization. In: Cryobiology, 2010, vol. 60, p.
45-53.
235. Gropper S.S. et al. Advanced Nutrition and Human Metabolism. In: 4th ed., Wadsworth,
Belmont, 2005, p. 205-206.
236. Guerrero A., et al. Tuning sperm chemotaxis by calcium burst timing. In: Dev. Biol., 2010,
vol. 344, p. 52–65.
237. Gunter TE. et al. Calcium and mitochondria. In: FEBS Letters, 2004, vol. 567, p. 96-102.
238. Halangk W., Bohnensack R. A quick test for the simultaneous determination of
intactnessand concentrations of spermatozoa. In: Acta. biol. med. Germ., 1982, vol. 41, no. 10,
p. 899-905.
239. Hans R. et al. Antifreeze glycoproteins from the antarctic fish Dissostichus mawsoni
studied by differential scanning calorimetry (DSC) in combination with nanolitre osmometry.
In: Cryoletters, 2005, vol. 26, no. 2, p. 73-84.
240. Hemingway R.G. The influences of dietary intakes and supplementation with selenium and
vitamin E on reproduction diseases and reproductive efficiency in cattle and sheep. In: Vet.
Res. Comm., 2003, vol. 27, no. 2, p. 159-174.
241. Henkel R. et al. Molecular aspects of declining sperm motility in older man. In: Fert Ster.,
2005, vol. 84, no. 5, p. 1430-1437.
242. Hermes R. et al. Ovarian superstimulation, transrectal ultrasound-guided oocyte recovery,
and in rhinoceros. In: Theriogenology, 2009, vol. 72, p. 959–968.
217

243. Hiemstra S.J. The potential of cryoconservation and reproductive technologies for animal
genetic resources conservation strategies. In: The role of biotechnology in exploring and
protecting agricultural genetic resources. Rome: FAO, 2006. 187 p.
244. Hirano T. et al.Improvement and biological applications of fluorescent probes for zinc,
ZnAFs. In: J. Am Chem Soc., 2002, vol. 124, p. 6555–6562.
245. Ho L.H. et al. Labile zinc and zinc transporter ZnT4 in mast cell granules: Role in
regulation of caspase activation and NF-κB translocation. In: J. Immunol. 2004, vol. 172, p.
7750–7760.
246. Hoffmann I. Research and investment in poultry genetic resources – challenges and options
for sustainable use. In: World's Poultry Science Journal, 2005, vol. 61, p.57-70.
247. Hoffmann I. The global plan of action for animal genetic resources and the conservation of
poultry genetic resources. In: World's Poultry Science Journal, 2009, vol. 65, p. 286-297.
248. Holt W. V. Basic aspects of frozen storage in semen. In: Animal Reproductive Science,
2000, vol. 62, p. 3–22.
249. Horvath G & Seidel GE. Vitrification of bovine oocytes after treatment with cholesterolloaded
methyl-beta-cyclodextrin. In: Theriogenology, 2006, vol.66, p.1026-1033
250. Hubel et. al. Cell partitioning during the directional solidification of trehalose solutions. In:
Cryobiology, 2007, vol. 55, p. 182-188.
251. Hudson B.P. et al. Live performance and immune responses of straight-run broilers:
influences of zinc sourcein broiler breeder hen and progeny diets and ambient temperature
during the broiler production period. In: J. of Appl. Poult. Res., 2004, vol. 13, p. 291-301.
252. Ishikawa M., et al. Strategies for sperm chemotaxis in the siphonophores and ascidians: a
numerical simulation study. In: Biol. Bull., 2004, vol. 206, no. 2, p. 95-102.
253. Ivanov N., Profirov J. Isolation of plasma membranes from ram spermatozoa by a twophase
polymer System. In: Reprod. Fert., 1981, vol. 63, p. 25-29.
254. James D. et al. Melting point equations for the ternary system water/sodium
chloride/ethylene glycol revisited. In: Cryobiology, 2010, vol. 61, no. 3, p. 352-356.
255. Janet AW Elliott. Introduction to the special issue: Thermodynamic aspects of cryobiology.
In: Cryobiology, 2010, vol 60, no. 1, p. 1-3.
256. Jennen D.G.J. et. al. M.A.M., Confirmation of quantitative trait loci affecting fatness in
chickens. In: Genet. Sel. Evol., 2005, vol. 37, p. 215-228.
257. Jens OM Karlsson. Effects of solution composition on the theoretical prediction of ice
nucleation kinetics and thermodynamics. In: Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 43-51.
218

258. Jessica A. Preciado et. al. Isochoric preservation: A novel characterization method. In:
Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 23-29.
259. Jeulin C. et. al. Catalase activity in human spermatozoa and seminal plasma. In: Gamete
Research 1989, vol. 24, p. 185-196.
260. Jimenez-Gonzalez C. et al. Calcium signalling in human spermatozoa: a specialized
‘toolkit’ of channels, transporters and stores. In: Hum Reprod Update, 2005, vol. 12, no. 3, p.
253-267.
261. John G. Day and Glyn N. Stacey. Methods in Molecular Biology. In: Cryopreservation
and Freeze-Drying Protocols, sec. ed., 2007, vol. 368, p. 141-151
262. Joseph S. and Amir A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow
freezing and vitrification. In: Reproduction, 2011, vol. 141, no. 1, p. 1-19.
263. Kaupp, U. B. et al. Mechanisms of sperm chemotaxis. In: Annu. Rev. Physiol., 2008, vol.
70, p. 93–117.
264. Khan R.U. Antioxidants and poultry semen quality. In: World,s Poultry Science Journal,
2011, vol. 67, p. 297-308.
265. Kidd M.T. Vitamins, Minerals and Micronutrients. In: Biology of breeding poultry. Poultry
science symposium series, 2009, vol. 29, p. 361-373.
266. Kinnear NP. et al. Lysosome-sacroplasmic reticulum junctions. A triggerzone for calcium
signaling by nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate and endothelin-1. In: Journal of
Biological Chemistry, 2004, vol. 279, no. 52, p. 54319-54326.
267. Kiyoshi Kawai and Toru Suzuki. Effect of tetrasodium tripolyphosphate on the freezeconcentrated
glass-like transtion temperature of sugar aqueous solutions. In: CryoLetters,
2006, vol. 27, no. 2, p. 107-114.
268. Kowalczyk Artur. The effect of cryopreservation process on morphology and fertilising
ability of japanese quail ( coturnix japonica ) spermatozoa. In: CryoLetters, 2008, vol. 29, no.
3, p. 199-208.
269. Koyanagi F. et. al. Acrosome reaction of cock spermatozoa incubated with the perivitelline
layer of the hen's ovum. In: Poultry Science, 1988, vol. 67, p. 1770-1774.
270. Krug P.J. et al. Endogenous signaling pathways and chemical communication between
sperm and egg. In: J. Exp. Biol., 2009, vol. 212, no. 8, p. 1092-1100.
271. Kuwayama M. et al. Comparison of open and closed methods for vitrification of potential
contamination. In: Reproductive Biomedicine Online, 2005, vol. 11, p. 608-614.
272. Lachaud С. et al. Apoptosis and necrosis in human ejaculated spermatozoa. In: Hum
Reprod., 2004, vol. 19, no. 3, p. 607-610.
219

273. Lake P. E. The male in reproduction. In: Physiology and Biochemistry o the Domestic
Fowl (ed. Freeman, B.M.). In: Academic Press, London, 1984, vol. 5. p. 381–405.
274. Lake P.E. The history and future of the cryopreservation of avian germ plasm. In: Poultry
Sci., 1986, vol. 65, p. 1–15.
275. Larman MG. et al. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona
pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. In: Reproduction, 2006,
vol. 131, p. 53-61.
276. Latif A. et. al. Effect of osmotic pressure and pH on the short-term storage and fertility of
broiler breeder sperm. In: Vet. J., Pakistan, 2005, vol. 25, no. 4, p. 179-182.
277. Leduc F. et al. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating
spermatids of mice. In: Biol Reprod., 2008, vol. 78, no. 2, p. 324-32.
278. Lee Fong Siow et. al. Cryo-responses of two types of large unilamellar vesicles in the
presence of non-permeable or permeable cryoprotecting agents. In: Cryobiology, 2008, vol. 57,
no. 3, p. 276-285.
279. Lee Т.К. Radioprotective potential of ginseng. Mutagenesis. In: Cryobiology, 2005, vol.
20, no. 4, p. 237-243.
280. Lemoine M. et al. Abilitz of chichen spermatozoa to undergo acrosome reaction after liquid
storage or cryopreservation. In: Theriogenology, 2011, vol. 75, no. 1, p. 122-130.
281. Leng R. et al. Comparative metabolic and immune responses of chickens fed diets
contining inorganic selenium and Sel-plex M organinic selenium. In: Nutritional
Biotechnology in the Feed and Food Industries, Lyons, T.P. and Jaques K.A. Eds, 2003, p.
131-145.
282. Levis Sheena E.M. Is sperm evaluation useful in predicting human fertilyty? In:
Reproduction, 2007, vol. 134, no. 1, p. 31-40.
283. Levitt J. A sulphydryl-disulphyde hypothesis of frest injury and resistance in plants. In: J.
Theoret. Biol., 1962, vol. 3, no. 2, p. 355-391.
284. Lin Y.F. et al. Effects of supplemental vitamin E during the mature period on the
reproduction performance of Taiwan native chicken cockerels. In: British Poultry Science
2005, vol. 46, no. 3, p. 366-373.
285. Lindeberg H. Surgical recoveryandsuccessful surgical transferof conventionally frozen–
thawed embryos in the farmed European polecat (Mustela putorius). In: Theriogenology, 2003,
vol. 60, no. 8, p. 1515-1525.
220

286. Lindsay L. L., et al. Cross-fertilization and structural comparison of egg extracellular
matrix glycoproteins from Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. In: Comp. Biochem.
Physiol. A Mol. Integr. Physiol., 2003, vol. 136, no. 2, p. 343–352.
287. Lishko P. V. et al. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. In:
Nature, 2011, vol. 471, no. 7338, p. 387–391.
288. Livera G. Et al. Inactivation of the mouse adenylyl cyclase 3 gene disrupts male fertility
and spermatozoon function. In: Mol. Endocrinol, 2005, vol. 19, no. 5, p. 1277-1290.
289. Long J. A. and Kulkarni G. An effective method for improving the fertility of glycerolexposed
poultry semen. In: Poultry Science, 2004, vol. 83, p. 1594–1601.
290. Long J. A. Avian semen cryopreservation: what are the biological challenges? In: Poultry
Science, 2006, vol. 85, p. 232–236.
291. Lovelock T.E. Denaturation of lipid-protein complexes as a cause of damage by freezing.
In: Proc. Roy. Soc. London B., 1957, vol. 47, no. 3, p. 427-433.
292. Lowry O.H. et al. Protein measurements with the Folin phenol reagent. In: J. Biol. Chem.,
1951, vol. 193, no. 1, p. 265-275.
293. Luyet B. J. and Gehenio P. M. Life and Death at Low Temperatures. In: Biodynamic
Normandy, MO, USA, 1940, p. 341.
294. Luz M. R. et. al. Survival rate and in vitro development of in vivo-produced and
cryopreserved dog embryos. In: Reprod., Fertil. and Develop, 2009, vol. 22, p. 208–209.
295. Maddalena Bayer-Giraldi et al. Characterization of an antifreeze protein from the polar
diatom Fragilariopsis cylindrus and its relevance in sea ice. In: Cryobiology, 2011, vol. 63, p.
210-219.
296. Madura J.D., et al. Molecular recognition and binding of thermal hysteresis proteins to ice.
In: J. Mol. Recognition, 2000, vol. 13, no. 2, p. 101-113.
297. Makhafola М. В. Et al. The effect of breed on the survivability and motility rate of
cryopreserved cock semen. In: South African J. of Animal Sci., 2009, vol. 39, p. 242-245.
298. Malecki I. A. et al. Hypo-osmotic swelling test for measuring integrity of the emu sperm
membrane. In: Avian Poult. Biol. Rev., 2005, vol. 16, p. 175-197.
299. Malo C. et al. Anti-oxidant supplementation improves boar sperm characteristics and
fertility after cryopreservation: Comparison between cysteine and rosemary (Rosmarinus
officinalis). In: Cryobiology, 2010, vol. 61, no. 1, p. 142-147.
300. Marchiani S. et al. Characterization of M540 bodies in human semen: evidence that they
are apoptotic bodies. In: Mol. Hum. Reprod., 2007, vol. 13, no. 9, p. 621-31.
221

301. Marcon L, Boissonneault G. Transient DNA strand breaks during mouse and human
spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling. In: Biol
Reprod, 2004, vol. 70, no. 4, p. 910-918.
302. Marquez B. et al. Contributions of extracellular and intracellular Ca2C to regulation of
sperm motility: release of intracellular stores can hyperactivate CatSper1 and CatSper2 null
sperm. In: Developmental Biology, 2007, vol. 303, p. 214-221.
303. Massip A. et al. Cryobiology and the breeding of domestic animals. In: Life in the Frozen
State; Benson, E.; Fuller, B.; Lane, N. ed. Taylor and Francis Group, London (GBR), 2004,
vol. 12, p. 371–392.
304. Mastromonaco GF & King WA. Cloning in companion animal, non- domestic and
endangered species: can the technology become a practical reality? In: Reproduction, Fertility,
and Development, 2007, vol. 19, no. 6, p. 748-761.
305. Matejtschuk P. Lyophilization of Biological Standards. In: CryoLetters, 2005, vol. 26, no.
4, p. 223-230.
306. Mathew Tomlinson. RISK management in cryopreservation associated with assisted
reproduction. In: CryoLetters, 2008, vol. 29, no. 2, p. 165-174.
307. Mazur P., Cole K.W. Influence of cell concentration on the contribution of un frozen
fraction and salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. In:
Cryobiology, 1985, vol. 22, no. 6, p. 509-536.
308. Mazur Peter. A biologist's view of the relevance of thermodynamics and physical
chemistry to cryobiology. In: Thermodyn. Asp. of Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 4-10.
309. McCormick RK. Osteoporosis: integrating biomarkers and other diagnostic correlates into
the management of bone fragility. In: Altern. Med. Rev. 2007, vol. 12, no. 2, p. 113-145.
310. McDaniel. An attempt to alleviate heat stress infertility in male broiler breeder chicken
with dietary ascorbic acid. In: Intern. J. of Poult. Sci., 2004, vol. 3, p. 593-602.
311. McDowel L. R. Minerals in Animal and Human Nutrition. In: Academic Press, Inc., San
Diego, 1992, 524 p.
312. Mereuta I. et al. Determination of nitrogen-containing substances in sperm: the metod of
ion exehange liquid chromatography. In: XXV Jubilee World Buiatrices Congress, Budapest,
2008, p. 211-212.
313. Mereuţă I. et al. Plasma amino acids of semenof bulls. In: A Magyar Buiatricus Tarsasag.
19th International Congressof the Hungarian, Debrecen, 2009, p. 198.
222

314. Mereutsa I. et al. The impact of stress on the temperature range of free amino acides bull
semen. In: The 37 international session of scientific communications of the faculty of animal
science, Bucureşti, 2008, p. 196-199.
315. Merker H.J., Günther T. Testis damage induced by zinc deficiency in rat. In: J. Trace
Element, 1997, vol. 11, no. 1, p. 19–22.
316. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing of glycerol. In: Cryobiology,
1981, vol. 18, no. 3, p. 221-228.
317. Meyer-Ficca M L. et al. Poly(ADP-ribose) polymerases PARP1 and PARP2 modulate
topoisomerase II beta (TOP2B) function during chromatin condensation in mouse
spermiogenesis. In: Biol Reprod, 2011, vol. 84, p. 900-909
318. Michelangeli F. et al. Aplethoraof interacting organellar Ca2C stores. In: Current Opinion
in Cell Biology, 2005, vol. 17, p. 135-140.
319. Misro M..M. et. al. Use of hydrogen peroxide to assess the sperm susceptibility to
oxidative stress in subjects presenting a normal semen profile. In: International Journal
Andrology, 2004, vol. 27, p. 82-87.
320. Missiaen L. et al. Calcium release from the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum
in HeLa cells stably expressing targeted aequorin to these compartments. In: Cell Calcium,
2004, vol. 36, p. 479-487.
321. Miura T. et al. Comparative studies between in vivo and in vitro spermatogenesis of
Japanese eel (Anguilla japonica). In: Zool Sci., 2002, vol. 19, p. 321–329.
322. Miura T. et al. Progestin is an essential factor for the initiation of the meiosis in
spermatogenic cell of the eel. In: Proc Natl Acad Sci USA., 2006, vol. 103, p. 7333–7338.
323. Mocé E. et al. Cryoprotectant and freezing-process alter the ability of chicken sperm to
acrosome react. In: Animal Reproduction Science, 2010, vol. 122, p. 359-366.
324. Morisawa M., Yoshida M. Activation of motility and chemotaxis in the spermatozoa: From
invertebrates to humans. In: Reprod Med Biol., 2005, vol. 4, p. 101–114.
325. Morita M. et. al. Regulation of sperm flagellar motility activation and chemotaxis caused
by egg-derived substance(s) in sea cucumber. In: Cell Motil. Cytoskelet, 2009, vol. 66, p. 202-
214.
326. Mustafa N. et al. Effects of antioxidants on post-thawed bovine sperm and oxidative stress
parameters: Antioxidants protect DNA integrity against cryodamage. In: Cryobiology, 2010,
vol. 61, no. 3, p. 248-253.
327. Muthukumar K. et al. Blastocyst cryopreservation: vitrification or slow freeze. In: Fertility
and Sterility, 2008, vol. 90, p. 426-427.
223

328. Narahari D. et al. Sel-plex spares vitamin E in egg yolk of commercial layers, Proceedings
of the 20th. In: Annual Altech Symposium Re-immaging the Feed Industry, Kentucky, USA.,
2004, vol. 11, p. 18.
329. Nathan Tholl. et al. Swimming of Xenopus laevis Sperm Exhibits Multiple Gears and Its
Duration Is Extended by Egg Jelly Constituents. In: Biol. Bull., 2011, vol. 220, no. 3, p. 174-
185.
330. Navarro B. et al. Ion channels that control fertility in mammalian spermatozoa. In:
International Journal of Developmental Biology, 2008, vol. 52, no. 5-6, p. 607-613.
331. Neuman S.L. et al. The effect of dietary carnitine on semen trait of white leghorn roosters.
In: Poultry Science, 2002, vol. 81, no. 4, p. 495-503.
332. Neve J. et al. Selenium supplementation in healthy Belgian adults: response in platelet
glutathione peroxidase activity and other blood indices. In: Am J. Clin Nutr, 1988, vol. 48, no.
1, p. 139-143.
333. Nowaczewski S. and Kontecka, H. Effect of dietary vitamin C supplement on reproductive
performance of aviary pheasants. In: Czech Journal of Animal Science, 2005, vol. 50, no. 5, p.
208-212.
334. Olesen C. et al. Tesmin transcription is regulated differently during male and female
meiosis. In: Mol Reprod Dev., 2004, vol. 67, no. 1, p. 116–126.
335. Osetsky А.I. Thermodynamic aspects of cluster crystallization in cryoprotective solutions.
In: CryoLetters, 2011, vol. 32, no. 3, p. 216-224.
336. Pappas A.C. et al. Maternal organo-selenium compounds and polyunsaturated fatty acids
affect progeny performance and levels of selenium and docosahexaenoic acid in the chick
tissues. In: Poultry Science, 2006, vol. 85, p. 1610–1620.
337. Perdichizzi A. et al. Effects of tumour necrosis factor-alpha on human sperm motility and
apoptosis. In: J. Clin Immunol, 2007, vol. 27, no. 2, p. 152-162.
338. Peters S.O. et al. Semen quality traits of seven strain of chickens raised in humid tropics
Int. In: J. Poult. Sci., 2008, vol. 7, no. 10, p. 949-953.
339. Petite J. N. Avian germplasm preservation: embryonic stem cells or primordial germ cell?
In: Poultry Science, 2006, vol. 85, no. 2, p. 237–242.
340. Petyim S. et al. The successful pregnancy and birth of a healthy baby after human
blastocyst vitrification using Cryo-E, first case in Siriraj Hospital. In: Journal of the Medical
Association of Thailand, 2009, vol. 92, no. 8, p. 1116-1121.
341. Pingsheng Tian et. al. Cryosolvent interaction with cellular actin using 3T3-LI cells as a
model system. In: Cryobiology, 2010, vol. 61, no. 3 , p. 2010, 357-359.
224

342. Pizzari T. et. al. Sperm competition dynamics: ejaculate fertilising efnciency changes
differentially with time. In: BMC Evolutionary Biology, 2008, vol. 8, p. 332-338.
343. Polge C. and Parkes A. S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low
temperatures. In: Nature, 1949, vol. 164, no. 4172, p. 666-668.
344. Portmann M. et. al. Evaluation of blastocyst survival following vitrification/warming using
two different closed carrier systems. In: Human Reproduction, 2010, vol. 25, p. 261.
345. Prasad A. Zinc deficiency. In: British Med. J., 2008, vol. 326, p. 409–410.
346. Prieto M. T. et al. Relationship among fluctuating asymmetry, morphological traits, and
sperm quality in layers. In: Poult. Sci., 2011, vol. 90, p. 2845-2854.
347. Publicover S. et al. [Ca2+]i signaling in sperm: making the most of what you've got. In:
Nat Cell Biol, 2007, vol. 9, p. 235-242.
348. Ralf Spindler et. al. Dimethyl sulfoxide and ethylene glycol promote membrane phase
change during cryopreservation. In: CryoLetters, 2011, vol. 32, no. 2, p. 148-157.
349. Ram V. Devireddy. Statistical thermodynamics of biomembranes. In: Cryobiology, 2010,
vol. 60, no. 1, p. 80-90.
350. Ramon Risco et. al. Thermal performance of quartz capillaries for vitrification. In:
Cryobiology, 2007, vol. 55, no. 3, p. 222-229.
351. Rana U. et al. Zinc binding ligands and cellular zinc trafficking: Apo- metallothionein,
glutathione, TPEN, proteomic zinc, and Zn-sp1. In: J. Inorg Biochem., 2008, vol. 102, no. 3, p.
489–499.
352. Ranjan Sitaula et al. A study of the effect of sorbitol on osmotic tolerance during partial
desiccation of bovine sperm. In: Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 3, p. 331-336.
353. Richelle C. Prickett et al. Application of the osmotic virial equation in cryobiology. In:
Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 30-42.
354. Riffell J. A., et al. The ecological and evolutionary consequences of sperm
chemoattraction. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2004, vol. 101, p. 4501–4506.
355. Rimessi A. et al. The versatility ofmitochondrial calcium signals: from stimulation of cell
metabolism to induction of cell death. In: Biochimica et Biophysica Acta, 2008, vol. 1777, no-
7-8, p. 808-816.
356. Robles V. et al. Vitrification of turbot embryos: preliminary assays. In: Cryobiology, 2003,
vol. 47, no. 1, p. 30–39.
357. Rodrigues BA & Rodrigues JL Responses of canine oocytes to in vitro maturation and in
vitro fertilization outcome. In: Theriogenology, 2006, no. 6-7, p. 1667-1672.
225

358. Rotruck I. I. Descovery of the role of selenium in glutathione peroxidase. In: Selen in
biology and medicine. Spallholz I., Martin I., Ganther H. (eds.), 1981, p. 10-15.
359. Santiago-Moreno et al. Use of the hypo-osmotic swelling test and aniline blue staining to
improve the evaluation of seasonal sperm variation in native Spanish free-range poultry. In:
Poultri Sciens, 2009, vol. 88, no. 12, p. 2661-2669.
360. Satish Ingale and Shrivastava. S.K. Amino Acid Profile of Some New Vartieties of Oil
Seeds. In: Advance Journal of Food Science and Technology, 2011, vol. 3, no. 2, p. 111-115.
361. Saragusty J. et al. Do physical forces contribute to cryodamage? In: Biotechnology and
Bioengineering, 2009, vol. 104, no. 4, p.719-728.
362. Sarah Costello, et al. Ca2+-stores in sperm: their identities and functions. In: Society for
Reproduction and Fertility, 2009, vol. 138, p. 425-427.
363. Sarica S. et. al. The effect of dietary L.carnitine supplementation on semen trait,
reproductive parameter and testicular histology of Japanese quail breeders. In: Journal of
Applied Poultry Research, 2007, vol. 16, no. 2, p. 178-186.
364. Schlegel P.N., Paduch D.A. Yet another test of sperm chromatin structure. In: Fertil Steril.,
2005, vol. 84, no. 4, p. 854-859.
365. Schramm G. P., Hubner R. Konservierung Von Gefugelsperma. In: Arch. Tiery., 1989, vol.
32. no. 1, p. 51-61.
366. Seigneurin F. and Blesbois E. The first method of cryopreservation of guinea fowl semen.
In: World Poultry Science Association, 2006, vol. 23, p. 1-2.
367. Seki S & Mazur P. The dominance ofwarming rateover cooling rate in survival of mouse
oocytes subjected to a vitrification procedure. In: Cryobiology, 2009, vol. 59, no. 1, p. 75-82.
368. Sexton T. J. et al. A new poultry semen extender: 2. Effect of the extender components on
the fertilizing capacity of chicken semen stored at 5 °C. In: Poult. Sci., 1978, vol. 57, no. 1, p.
277-284.
369. Sexton T. J. et al. A new poultrysemen extender. 4. Effects of antibacterial in the control of
bacterial contamination in chicken semen. In: Poultry Sci., 1980, vol. 59, no. 1, p. 274-281.
370. Shaffner C. S., et al. Viability of spermatozoa of the chicken under various environmental
conditions. In: Poultry Science, 1941, vol. 20, p. 259–265.
371. Sharma R.K. and Agarwal A. Role of reactive oxygen species in male infertility. In:
Journal of Urology, 1996, vol. 48, no. 6, p. 835-850.
372. Sherry Y. et al. A re-evaluation of the role of type IV antifreeze protein. In: Cryobiology,
2008, vol. 57, no. 3, p. 292-296.
226

373. Shiba K., et al. Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and
trigger sperm chemotactic response. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2008, vol. 105, no. 49, p.
19312–19317.
374. Siegel P.B. et al. Performance of pureline broiler breeders fed two levels of vitamin E. In:
Poultry Science, 2001, vol. 80, no. 9, p. 1258-1262.
375. Sikka, S.C. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function. In: Current
Medicinal Chemistry, 2001, vol. 8, no.7, p. 851-862.
376. Simianer, H. and Weigend, S. Konzept für die Planung von Maßnahmen zur Erhaltung der
genetischen. In: Genetische Ressourcen. Unpublished report, 2007. 60 p.
377. Simon L. et al. Sperm DNA damage measured by the alkaline Comet assay as an
independent predictor of male infertility and in vitro fertilization success. In: Fertil Steril.,
2011, vol. 95, no. 2, p. 652-657.
378. Siudzinska A. and Lukaszewicz E. Effect of Semen Extenders and Storage Time on Sperm
Morphology of Four Chicken Breeds. In: J. Appl. Poult. Res. Spring, 2008, vol. 17, no. 1, p.
101-108.
379. Smith A.U. Same in vitro studies on rabbit corneal tissue. In: Exp. Eye Res., 1963, vol. 2,
p. 71-87.
380. Soler A. J. et al. Characteristics of Iberian red deer (Cervus elaphus hispanicus)
spermatozoa cryopreserved alter storage at 5°C in the epididymis for several days. In:
Theriogenology, 2005, vol. 64, p. 1503-1517.
381. Sørensen M.B. et al. Chelation of intracellular zinc ions affects human sperm cell motility.
In: Mol. Human Reprod., 1999, vol. 5, no. 4, p. 338–341.
382. Stamboulian S. et al. Biophysical and pharmacological characterization of spermatogenic
T-type calcium current in mice lacking the Ca V 3.1 (α1G) calcium channel: Ca V 3.2 (α1H) is
the main functional calcim channel in wild-type spermatogenic cellsu. In: Journal of Cellular
Physiology, 2004, vol. 200, p. 116-124.
383. Stoltenberg M., et al. Autometallographic demonstration of zinc ion in rat sperm cell. In:
Mol. Hum Reprod., 1997, vol. 3, no. 9, p. 763–767.
384. Stradaioli G. et. al. Zellieffect of L.carnitine administration on the seminal characteristics
of oligoasthenospermic stallions. In: Theriogenology, 2004, vol. 62, p. 761-777.
385. Strünker T. et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in
human sperm. In: Nature, 2011, vol. 471, no. 7338, p. 382–386.
227

386. Surai P.F. et al. Selenium distribution in the eggs of ISA Brown commercial layers. In:
Proceedings of the 20th Annual Alltech. Symposium Reimmaging the Feed Industry,
Kentucky, USA, 2004, vol. 11, p. 17.
387. Surai P.F. Mineral and anti-oxidants. In: Redefining Mineral Nutrition. Nottingham
University Press, Nottingham, UK, 2005, p. 147-177.
388. Suzuki H. et al. Successful deliveryof pups from cryopreserved canine embryos. In:
Biology of Reproduction, 2009, vol. 81, p. 619-627.
389. Tabatabaci S. et al.Comparison of semen quality in indigenous and Ross broiler breeder
roosters. In: J. Anim. Vet. Adv., 2009, vol. 8, no. 1, p. 90-93.
390. Tajima A. Production of germ-line chimeras and their application in domestic chicken. In:
Avian and Poultry Biology Review, 2002, vol. 13, p. 15–30.
391. Tamburrino Lara et al. Mechanisms and clinical correlates of sperm DNA damage. In:
Asian Journal of Andrology, 2012, vol. 14, no. 1, p. 24-31.
392. Teves M. E., et al. Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by
progesterone. In: PLoS One, 2009, vol. 4, no. 2, p. 8211.
393. Tharasanit T, Colenbrander B & Stout TAE Effect of cryopreservation on the cellular
integrity of equine embryos. In: Reproduction, 2005, vol. 129, p. 789–798.
394. Thatohatsi Madaniel Bernice Mosenene. Characterization and cryopreservation of semen of
four south african chicken breeds. In: Bloemfontein, 2009, 114 p.
395. Thibier M. Data Retrieval Committee statistics of embryo transfer year 2008. The
worldwide statistics of embryo transfers in farm animals. In: International Embryo Transfer
Society Newsletter, 2009, vol. 27, p. 13-19.
396. Tixier-Bichard M. et al. Biodiversity of domestic birds. In: British Poultry Science, 2001,
vol. 42, p. S29–31.
397. Trevino C. L. et al. Expression and differential cell distribution of low-threshold Ca2+
channels in mammalian male germ cells and sperm. In: FEBS Letters, 2004, vol. 563, no. 1-3,
p. 87-92.
398. Truong-Tran A.Q. et al. The role of zinc in caspase activation and apoptotic cell death. In:
Biometals, 2001, vol. 14, no. 3-4, p. 315–330.
399. Tsang WH & Chow KL. Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity
vitrification spatula. In: BioTechniques, 2009, vol. 46, no. 7, p. 550-552.
400. Tselutin K., et al. Comparison of cryoprotectants and methods of cryopreservation of fowl
spermatozoa. In: Poultry Science, 1999, vol. 78, no. 4, p. 586–590.
228

401. Tucker K.L. Osteoporosis prevention and nutrition. In: Curr Osteoporos Rep., 2009, vol. 7,
no. 4, p. 111-117.
402. Tuncer P.B. et al. Evaluation of some spermatological characteristics in Gerze cocks. In:
Univ. Vet. Fak. Derg., Ankara, 2008, vol. 55, p. 99-102.
403. Ueda Y. et al. Characterization of the acrosome reaction-inducing substance in Xenopus
(ARISX) secreted from the oviductal pars recta onto the vitelline envelope. In: Dev. Biol.,
2003, vol. 64, p. 289–298.
404. Urso M. and Clarkson, P.M. Oxidative stress, exercise, and antioxidant supplementation.
In: Toxicology, 2003, vol. 189, no. 1-2, p. 41-54.
405. Van de Lavoir M. C. et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ
cells. In: Nature, 2006, vol. 441, no. 7094, p. 766–769.
406. Vance J.E., Steenbergen R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. In: Progress
in Lipid Research., 2005, vol. 44, no. 7, p. 207-234.
407. Vilfan I.D. et al. Formation of native-like mammalian sperm cell chromatin with folded
bull protamine. In: J. Biol Chem., 2004, vol. 279, no. 9, p. 20088-20095.
408. Wang H. et al. The novel, single-transmembrane protein CATSPERG is associated with
mouse CATSPER1 channel protein. In: Bio Reprod., 2009, vol. 81, no. 3, p. 539-544.
409. Watanabe T., et al. Identification of the sperm motility-initiating substance in the newt,
Cynops pyrrhogaster, and its possible relationship with the acrosome reaction during internal
fertilization. In: J. Dev. Biol., 2010, vol. 54, p. 591–597.
410. Watson P.F., Holt W.V. Cryobanking the genetic resource. In: Wildlife conservation for
the future?. London, New York, 2001, p. 423.
411. Wishart, G.J. Cryopreservation of avian spermatozoa. In: Methods in Molecular Biology
Humana Press, 1995, vol. 38, p. 167–177.
412. Wishart, G.J. Liquid semen storage: current status and where do we go from here?
Proceedings of the 22nd. In: World’s Poultry Congress, Istanbul, Turkey, 2004, p. 1801.
413. Woelders H., et al. Animal genetic resources conservation in the Netherlands and Europe:
poultry perspective. In: Poultry Science, 2006, vol. 85, no. 2, p. 216–222.
414. Wood C. D. Et al. Real-time analysis of the role of Ca2+ in flagellar movement and
motility in single sea urchin sperm. In: J. Cell Biol., 2005, vol. 169, no. 5, p. 725-731.
415. Xia J. & Ren D. Egg coat proteins activate calcium entry into mouse sperm via CATSPER
channels. In: Biology of Reproduction, 2009, vol. 80, no. 6, p. 1092-1098.
416. Yamaguchi S. et al. Zinc is an essential trace element for spermatogenesis. In: Proc. Natl.
Acad. Sci. U S A., 2009, vol. 106, no. 26, p. 10859-10864.
229

417. Yan J. et al. Cryo-survival, fertilization and early embryonic development of vitrified
oocytes derived from mice of different reproductive age. In: Journal of Assisted Reproduction
Genetics, 2010, vol. 27, no. 11, p. 605-611.
418. Yaroshenko F.O. et al. Selenium-enriched chicken production in Ukraine, Proceedings of
the 20th. In: Annual Alltech Symposium Re-immaging the Feed Industry, Kentucky, USA,
suppl., 2004, vol. 11, p. 131.
419. Yavin S. & Arav A. Measurement of essential physical properties of vitrification solutions.
In: Theriogenology, 2007, vol. 67, no. 1, p. 81-89.
420. Ying Son et al. The future potential of cryopreservation for assisted reproduction. In:
Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 3, p. 60-65.
421. Yoneda A. et al. Effects of delipidation and oxygen concentration on in vitro development
of porcine porcine embryos. In: Journal of Reproduction and Development, 2004, vol. 50, no.
3, p. 287-295.
422. Zaniboni L. et. al. Combined effect of DHA and a-tocopherol enrichment on sperm quality
and fertility in the turkey. In: Theriogenology, 2006, vol. 65, no. 9, p. 1813-1827.
423. Zarelli V.E. et al. PTB1B dephosphorylates NSF elicits SNARE complex disassembly
during human sperm exocytosis. In: J. of Biol. Chemistry, 2009, vol. 284, p. 10491-10503.
424. Zhai W. et. al. The effect of dietary L-carnitine on semen traits of White Leghorns. In:
Poultry Science, 2007, vol. 86, no. 10, p. 2228-2235.
230

ANEXE
Anexa 1.
Brevete de invenţie
231

232

233

234

235

236

237

238

239

240

Anexa 2.
Acte de implementare a rezultatelor ştiinţifico-practice
241

242

243

244

Anexa 3.
Materiale expoziţionale
245

246

247

248

249

250

DECLARAŢIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII
Subsemnatul, Balan Ion, declar pe răspundere personală că materialele prezentate în teza de
doctorat sunt rezultatul propriilor cercetări şi realizări ştiinţifice. Conştientizez că, în caz contrar,
urmează să suport consecinţele în conformitate cu legislaţia în vigoare.
Balan Ion
Semnătura
Data
251

CV-ul AUTORULUI
Numele de familie şi prenumele: Balan Ion
Data şi locul naşterii: 29 septembrie 1964, satul Slobozia, raionul Ştefan Vodă, R. Moldova.
Cetăţenia: Republica Moldova
STUDII:
1983 – 1988 - Universitatea Agrară de Stat din Moldova, Facultatea de Medicină Veterinară.
(Specialitatea – medicină veterinară).
1988 – 1991 - Aspirantura, Academia de Ştiinţe a Moldovei.
(Specialitatea – fiziologia omului şi animalelor).
2009 – 2011 – Postdoctornatura, Academia de Ştiinţe a Moldovei.
(Specialitatea – fiziologia omului şi animalelor).
DOMENIILE DE INTERES ŞTIINŢIFIC:
Fiziologia, sanocreatologia, criobiologia, reproducţia animalelor agricole, criochirurgia,
membranologia, citologia.
ACTIVITATEA PROFESIONALĂ:
1988 – 1991 - aspirant, Academia de Ştiinţe a Moldovei;
1991 – 1993 - cercetător ştiinţific, Institutul de Fiziologie al AŞM;
1993 – 1999 - cercetător ştiinţific superior, Institutul de Fiziologie al AŞM;
1999 – 2010 - cercetător ştiinţific superior, Institutul de Fiziologie şi Sanocreatologie al AŞM;
2011 – prezent - cercetător ştiinţific coordonator, Institutul de Fiziologie şi Sanocreatologie al
AŞM;
PARTICIPĂRI ÎN PROIECTE ŞTIINŢIFICE NAŢIONALE ŞI INTERNAŢIONALE:
2001 – 2005 - proiectul instituţional “Evaluarea rolului diferitor factori în geneza spermei
sanogene şi patogene în perioada postnatală”.
2006 - 2010 – proiectul instituţional „Dezvoltarea bazelor ştiinţifice ale menţinerii sănătăţii
organismului uman prin consolidarea funcţiilor unor organe şi sisteme în limite
sanogene”.
2011 - prezent – proiectul instituţional „Elaborarea metodelor fiziologice de fortificare şi
menţinere a sănătăţii somatice şi psihice”.
PARTICIPĂRI LA FORURI ŞTIINŢIFICE (naţionale şi internaţionale):
2012 - Congresul VII al fiziologilor din Moldova cu participare internaţională. Chişinău,
R.Moldova.
2011 - European exhibition of creativity and innovation “Euroinvent”, Iaşi, România.
- Salaon international des inventions, Geneve, Switzerland.
252

- Expoziţia Internaţională Specializată “Euroinvent”, Chişinău, R.Moldova.
- The belgian and international trade fair for technological innovation „Brussels Eureka”,
Belgium.
- III Съезд физиологов С.Н.Г., Москва-Ялта, Украина.
- Simpozionul ştiinţific cu participare internaţională, Maximovca, R.Moldova.
2010 - Congresul al IX-lea Naţional cu participare internaţională al Geneticienilor şi
Amelioratorilor, Chişinău, R.Moldova.
- A Magyar Buiatricus Tarsasag. 20 th Jubileumi International Congressof the Hungarian,
Eger, Hungary.
- Conferinţa ştiinţifică, Zootehnie şi biotehnologii, Chişinău, R.Moldova.
2009 - Simpozion ştiinţific intrnaţional „35 ani de învăţămînt superior medical veterinar din
Republica Moldova”, Chişinău, R.Moldova.
- A Magyar Buiatricus Tarsasag. 19 th International Congressof the Hungarian, Debrecen,
Hungary.
- Conferinţa internaţională „Diversitatea, valorificarea raţională şi protecţia lumii
animale”, Chişinău, R.Moldova.
2008 - II съезд физиологов СНГ, Москва-Кишинев, Молдова.
- XXV Jubilee World Buiatrices Congress, Budapest, Hungary.
- The 37 international session of scientific communications of the faculty of animal
science, Bucureşti, România.
- Conferinţa ştiinţifică, Zootehnie şi biotehnologii, Chişinău, R.Moldova.
- Conferinţa ştiinţifică, Medicină veterinară, Chişinău, R.Moldova.
LUCRĂRI ŞTIINŢIFICE ŞI ŞTIINŢIFICO-METODICE PUBLICATE:
Peste 200 de lucrări ştiinţifice, inclusiv 4 monografii ştiinţifice, 7 brevete de invenţii şi un
manual.
PREMII, MENŢIUNI, DISTINCŢII, TITLURI ONORIFICE ETC:
1. Silver medal - European exhibition of creativity and innovation “Euroinvent”, Iaşi,
2011.
2. Medaille de bronze - Salaon international des inventions, Geneve, 2011.
3. Medalia de bronz - Expoziţia Internaţională Specializată “Euroinvent”, Chişinău, 2011.
4. Bronze medal - The belgian and international trade fair for technological innovation
„Brussels Eureka”, Brussels, 2011.
5. Silver medal - European exhibition of creativity and innovation “Euroinvent”, Iaşi,
2012.
APARTENENŢA LA SOCIETĂŢI/ASOCIAŢII ŞTIINŢIFICE NAŢIONALE,
INTERNAŢIONALE:
1. Membru al societăţilii fiziologilor din Moldova şi ţările CSI.
2. Membru al societăţii geneticienilor şi amelioratorilor din Moldova.
3. Membru al societăţii Internaţionale “Conservarea resurselor genetice”.
4. Member of the World’s Poultry Science Association (WPSA).
5. Membru al asociaţiei medicilor veterinari din Republica Moldova.
CUNOAŞTEREA LIMBILOR :
Româna, rusa – fluent; engleza, franceza - cu dicţionarul.
DATE DE CONTACT:
MD 2028, Chişinău, str. Academiei, 1, tel. 069124702, tel. serv. 022737138,
e-mail: balanion@rambler.ru
253