evaluari biochimice in explorarea hepatica

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMELOR CU IMPORTANŢĂ ÎN EXPLORAREA
HEPATICĂ
GENERALITATI
Datele de laborator care exploreaza afectarea hepatica sunt denumite in mod obisnuit –
teste functionale hepatice (TFH). Acestea cuprind o baterie de analize biochimice care susţin
diagnosticul de hepatopatie. Ficatul este sediul unor multitudini impresionanate de procese
biochimice, astfel încat nu există nici un test care sa poata fi considerat indicator unic pentru
disfunctia hepatică.
Astfel în cadrul testelor funcţionale hepatice un posibil profil biochimic ar avea
următoarea structură:
A. enzime hepatice: ALAT (alanin amino transferaza), ASAT(aspartat
aminotransferaza), ALP (fosfataza alcalină) , GGT (gamma glutamiltranspeptidaza), LDH (lactat
dehidrogenaza) etc.
B. bilirubină serică
C. proteine totale
D. albumină
E. uree
ENZIME HEPATICE CU ROL ÎN DIAGNOSTIC
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ALANIN AMINOTRANSFERAZEI (ALAT) – (GPT)
Principiul metodei:
Alanin aminotransferaza (ALAT) catalizează următoarea reacţie:
Acid
COOH
C=O
CH 2
CH 2
COOH
COOH
CH NH 2
COOH
ALAT
COOH
C NH 3
CH 2
CH 2
COOH
COOH
C=O
CH3

-cetoglutaric Alanină Acid glutamic Acid piruvic
Piruvatul format este transformat în lactat de către NADH+H + în reacţia catalizata de
LDH (lactat dehidrogenază) conform reacţiei:
CH 3 C COOH
NADH+H +
LDH
CH 3
CH
O NAD
OH
Acid piruvic Acid lactic
COOH
Se măsoară viteza de diminuare a concentraţiei NADH+H + pe măsură ce trece în NAD + ,
prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct proporţională cu activitatea ALAT.
Aparatură:
Spectrofotometru
Cronometru
Reactivi:
1. Soluţie substrat; L-alanina 800 mM in tampon fosfat 100 mM şi pH=7,4
2. Amestec de: -cetoglutarat 10 mM, NADH + +H + 0,2 mM, LDH 10mg/l în tampon
fosfat 100 mM, pH=7,4
Mod de lucru:
În momentul începerii determinărilor se amestecă soluţia 1 cu 2 (4 părţi reactiv 1 cu 1
parte reactiv 2 ).
Amestec de reactivi 1+2 (µl)
1000
Ser (µl)
250
µl)
Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de unda de 366 nm în cuve de l cm.
k3CI f syy) C
Citirea se face din minut în minut timp de 3 minute la 25 C
Calcularea rezultatelor:
Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se
notează cu ( A/min).
Concentraţia ALAT în UI/l = ( A/min) x 1520
Observaţii: dacă valoarea ( A/min) creşte mai mult de 0,08 se recomandă diluarea a 0,1
ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua şi la 30 C şi 37
C.

Intervale de referinţă:
25 C 30 C 37 C
Bărbaţi pînă la 22 UI/l pînă la 29 UI/l pînă la 40 UI/l
Femei pînă la 17 UI/l pînă la 22 UI/l pînă la 31 UI/l
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ASPARTAT AMINOTRANSFERAZEI (ASAT)-
(GOT)
Principiul metodei:
Alanin aminotransferaza (ASAT) catalizează următoarea reacţie:
COOH
CH 2
CH 2
C=O
COOH
COOH
CH 2
CH NH 2
COOH
ASAT
COOH
CH 2
CH 2
HC
NH 3
COOH
COOH
CH 2
C=O
COOH
Acid Acid Acid Acid
α cetoglutaric aspartic glutamic oxalacetic
Oxalacetatul format este transformat în malat de către NADH + + H + în reacţia catalizată
de MDH (malat dehidrogenază) conform reacţiei:
COOH
C=O
CH 2
COOH
MDH
NADH+H +
NAD
COOH
HC OH
CH 2
COOH
Acid oxalacetic Acid malic
Se măsoară viteza de diminuare a cantităţii de NADH+H + pe măsură ce trece în NAD + ,
prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct proporţională cu activitatea enzimei ASAT.
Aparatură:
Spectrofotometru
Cronometru

Reactivi:
1. Soluţie substrat: aspartat 200 mM în tampon fosfat 100 mM şi pH =7,4
2. Amestec de: -cetoglutarat 12 mM, NADH + +H + 0,2 mM, LDH 10mg/l, MDH 10
mg/l în tampon fosfat 100 mM pH=7,4
Mod de lucru:
În momentul începerii determinărilor se amesteca soluţia 1 cu 2 (4 părţi reactiv 1 cu 1
parte reactiv 2 ).
Amestec de reactivi 1+2 (µl) 1000
Ser (µl) 250
Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de undă de 366 nm în cuve de 1 cm.
Citirea se face din minut în minut timp de 3 minute la 25 C
Calcularea rezultatelor:
Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute
citite. Se notează cu ( A/min). Concentraţia ALAT în U/l = ( A/min) x 1520.
Observaţii:
Dacă valoarea ( A/min) creşte mai mult de 0,08 se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu
0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua şi la 30 C şi 37 C.
Intervale de referinţă:
25 C 30 C 37 C
Bărbaţi pînă la 18 U/l pînă la 25 U/l pînă la 37 U/l
Femei pînă la 15 U/l pînă la 21 U/l pînă la 31 U/l
Interpretarea rezultatelor:
Permeabilitatea membranei celulare hepatice creşte gradat funcţie de suferinţă.
Investigaţiile biochimice evidenţiază creşteri în ser a unor enzime celulare (ALAT, ASAT, LDH,
etc.).Nivelul seric al acestor enzime de leziune, variază în funcţie denumărul de hepatocite
afectate, de gravitatea lezării fiecărei celule, de viteza cu care s-a produs leziunea şi de viteza de
eliminare din ser (t 1/2) a enzimelor respective.

Dozarea ALAT şi ASAT rămîne cea mai utilă şi sensibilă investigaţie biochimică în caz
de afectare hepatocelulară acută (virală, toxică, medicamentoasă), valori ≥ 500 U/l sugerînd acest
diagnostic.
Valori crescute:
cele mai mari creşteri 100-2000 U/l apar în hepatitele virale, intoxicaţia cu tetraclorură
de carbon, în leziuni induse de medicamente.
creşterea rapidă şi marcantă a ASAT şi ALAT (>600 U/l şi adesea >2000 U/l) urmată de
o scădere bruscă în primele 12-72 de ore de la debut este considerată specifică pentru
obstrucţia acută a ductelor biliare.
creşteri importante ale ASAT şi ALAT asociate cu creşteri ale fosfatazei alcaline indică
icter hepatocelular.
ASAT crescută (≤300 U/l) şi ALAT (≤200 U/l) se înregistrează în obstrucţia biliară
completă. Enzimele revin la normal în decurs de o săptămînă de la îndepărtarea
obstrucţiei.
o stare patologică particulară caracterizată prin creşterea marcantă a enzimelor hepatice
(ALAT, ASAT,OTC), a celor musculare (creatinkinaza CK), precum şi a -amilazei şi
lipazei pancreatice se întîlneşte în sindromul Reye.
creşteri moderate al ALAT şi ASAT, asociate cu creşteri ale fosfatazei alcaline
sugerează icter colestatic.
valori mai ridicate de 150 U/l apar în hepatitele alcoolice (mai ales dacă pacientul are şi
delirum tremens).
valori ≤ 100 UI/l apar în ciroza alcoolică, nivelul ALAT este normal în 50 % din cazuri,
iar ASAT în 25% din cazuri.
creşteri abia schiţate ale ALAT şi ASAT apar în procesele neoplazice ale ficatului, cînd
leziunile celulare hepatice se produc pe arii limitate în jurul infiltratului
malign.(ASAT>ALAT).
ALAT şi ASAT cresc în urma transplantului hepatic, după reperfuzia alogrefei (de 4-5 ori
limita superioară a intervalului de referinţă).
Creşterile persistente sau tardive se pot datora rejecţiei, infecţiilor virale, abcesului
hepatic sau ocluzia arterei hepatice.
creşteri moderate ale ALAT şi ASAT se evidenţiază în infecţiile cu virus Epstein-Barr,
precum şi în mononucleoza serică.
Alături de creşterile individuale ale enzimelor celulare se produc şi modificări ale
raportului dintre ele. Astfel raportul ASAT/ALAT (raport de Ritis) la subiecţii normali
este 1,3, dar poate fi modificat în funcţie de afecţiune.
ASAT/ALAT2, cu ALAT

Valori scăzute :
deficit de piridoxal fosfat ce apare în sarcină, afecţiuni hepatice secundare
consumului de alcool.
neoplazii
infecţii urinare
În majoritatea afecţiunilor hepatice sunt necesare dozări seriate ale enzimelor, valoarea
acestora indicînd evoluţia clinică .
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII GAMMA-GT ( -GT) (metoda cinetică)
Principiul metodei:
Determinarea activităţii -GT se face folosind ca substrat L- - glutamil-3-carboxi-4nitroanilida.
Reacţia este următoarea:
HOOC CH CH2 NH 2
CH 2
C=O
NH NO 2
H2N CH2 C=O
CH 2
L-Gama-glutamil p-nitro-anilida Glicil-glicina
HOOC CH CH2 CH2 C=O
NH 2
NH CH2 C=O
HN
CH 2
COOH
HN
COOH
H2N NO 2
L-Gama-glutamil glicil-glicina p-nitro-anilina
Creşterea absorbanţei pe măsură ce se formează 4-nitroanilina este direct proporţională
cu activitatea -GT. Citirile se efectuează la 405 nm.

Aparatură:
Spectrofotometru
Cronometru
Cronometru
Reactivi:
1. Soluţie glicilglicina in tampon TRIS pH=8,25, 100 mmol
2. Soluţie substrat L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida, de concentraţie 2,9 mmol/1
Mod de lucru:
1. Prepararea soluţiei de lucru:
Se amestecă 5 părţi reactivul 1 cu o parte reactiv 2. Această soluţie este stabilă 7 zile la
temperatură de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.
2. Dozarea propriu-zisă:
Soluţie de lucru ( l) 500
Ser ( l) 50
Se agită şi citesc absorbantele la 1, 2 şi 3 minute
la
Calcularea rezultatelor:
1,
Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se
2 si 3
notează cu ( A/min). Concentraţia -GT (U/l) = ( A/min) x 1152.
minute
Intervale de referinţă:
25 C 30 C 37 C
Bărbaţi 6-28 U/l 8-38 U/l 11-50 U/l
Femei 4-18 U/l 5-25 U/l 7-32 U/l
Observaţii:
Serul folosit trebuie să fie proaspăt şi nehemolizat, iar recoltarea se face pe citrat, oxalat
sau EDTA.
Linearitatea reacţiei se menţine până la valori de 280 U/l. Peste aceste valori se
recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10.

Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:
Dozarea γ-GT este cel mai sensibil indicator şi un test de screening folosit uzual
pentru determinarea alcoolismului. În acest caz creşterea γ-GT o depăşeşte pe cea a
celorlalte enzime hepatice dozate în mod curent. Gradul de creştere a γ-GT la un
alcoolic variază de la caz la caz şi depinde mai mult de persistenţa îndelungată a
consumului decît de cantitatea ingerată. S-a demonstrat că o încărcare suplimentară
cu alcool la un caz de alcoolism cronic produce în decurs de 24 de ore o creştere mult
mai accentuată a activităţii serice a γ-GT (3,5x LSN), comparativ cu o acceaşi
încărcare cu alcool la un subiect sănătos consumator ocazional de alcool.
Pacienţii alcoolici trataţi cu anticonvulsivante au valori ale γ-GT de 50 de ori
valoarea normală. La pacienţii trataţi cu anticonvulsivante, dar care nu consumă
alcool creşterile pentru γ-GT sunt modeste.
În icterul obstructiv creşterile pentru γ-GT sunt mai rapide şi mai importante decît
cele pentru ALP şi LAP.
În colestaza mecanică şi virală γ-GT creşte cam în aceeaşi proporţie cu ALP şi LAP,
pe cînd în colestaza medicamentoasă creşterea pentru γ-GT este mult mai mare.
În neoplasmul hepatic nivelul γ-GT creşte progresiv de la o examinare la alta.
În ciroza biliară primară valorile pentru γ-GT sunt de aproximativ 13x LSN (limita
superioară normală).
În hepatita acută creşterile sunt mai puţin marcante decît a celorlalte enzime hepatice,
dar este ultima care revine la normal, indicînd covalescenţa.
În hepatita cronică activă valorile pot atinge 7x LSN. În stadiul asimptomatic al bolii
poate fi singura enzimă hepatică ce prezintă valori serice crescute.
γ-GT reprezintă markerul cel mai sensibil al rejectului (după transplant hepatic),
nivelul enzimei creşte precoce înaintea ALP şi bilirubinei.
γ-GT prezintă creşteri importante alături de cele ale ALP în leptospiroza
icterohemoragică (boala Weil).
Valori crescute se înregistrează în tumori primitive sau metastatice ale ficatului
În intoxicaţia cu clorpromazină valorile pentru γ-GT cresc semnificativ.

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII FOSFATAZEI ALCALINE (ALP) (metoda cinetică)
Principiul metodei:
Fosfataza alcalina (ALP), în mediu alcalin (pH=8,6), catalizează hidroliza pnitrofenilfosfatului
în p-nitrofenol şi fosfat. Reacţia este următoarea:
O P
NO 2
OH
OH
O
ALP
H2O NaOH
O
HO P OH
OH
OH
NO2
p-nitrofenilfosfat Acid fosforic p-nitrofenol
Creşterea absorbanţei la 405 nm a p-nitrofenolului pe măsură ce se formează este direct
proporţională cu activitatea ALP.
Aparatura:
Spectrofotometru
Cronometru
Reactivi:
1. 2-amino-2-metil-1-propanol, pH 10,4; 0,90 mol/L
Acetat de magneziu 1,6 mmol/L
Sulfat de zinc 0,4 mmol/L
2. p-nitrofenilfosfat 16 mmol/L
3. Ser sau plasma (recoltate pe heparină)
4. Mod de lucru
a. Prepararea soluţiei de lucru: se amestecă 4 părţi reactiv 1 cu o parte reactiv 2. Această
soluţie este stabilă 5 zile la temperatură de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.

. Dozarea propriu-zisa:
Reactivi ( l) Probă ( l) Blanc ( l)
Soluţie de lucru 100 100
Ser 20 -
Apă distilată - 20
Se agită şi citesc absorbanţele la 1, 2 şi 3 minute
5. Calcularea rezultatelor:
Se face diferenţa între prima şi ultima citire atât pentru probă cât şi pentru blanc şi se
împarte la numărul de minute cronometrate. Se notează cu ( A/min probă) şi ( A/min
blanc). ( A/min)=( A/min probă)-( A/min blanc).
Activitatea ALP (U/l) = ( A/min) x 2757
6. Intervale de referinţă:
Adulţi:
Copii:
Observaţii:
ALP (U/l)
Femei 20-50 ani 42-98
Bărbaţi 20-50 ani 53-128
Femei > 60 ani 53-141
Bărbaţi > 60 ani 56-119
Fete Băieţi ALP (U/l)
1-30 zile 48-106 75-319
1 lună-1 an 124-341 82-383
1-3 ani 108-317 104-345
4-6 ani 96-297 93-309
7- 9 ani 69-325 86-315
10-12 ani 51-332 42-362
13-15 ani 50-162 74-390
16-18 ani 47-119 52-171
Testul este realizat pentru a determina activităţile ALP care corespund unei A/min.,
maxime de 0.25. Peste aceasta valoare se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se
înmulţeşte rezultatul cu 10.

Nu s-au observat interferenţe pentru următoarele substrate: acid ascorbic până la 30
mg/dl, bilirubină conjugată până la 60 mg/dl, bilirubină neconjugată până la 25 mg/dl,
trigliceride pînă la 2000 mg/dl. Limita minimă de detecţie este de 2 U/l.
Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:
obstrucţie biliară − (este considerată cel mai bun marker al obstrucţiei biliare, dar nu
diferenţiază colestaza intrahepatică de obstrucţia extrahepatică). În boala
hepatobiliară obstructivă nivelul seric al ALP creşte în paralel cu cel al 5 -NT (5
nucleotidazei) şi LAP (leucin aminopeptidazei).
creşteri ale ALP în paralel cu -GT şi 5 -NT apar în ciroza biliară primară.
raportul -GT/ALP 5 susţine diagnosticul de boală hepatică alcoolică. Creşteri ale -
GT determinate de alcool sau anticonvulsivante nu sunt însoţite de creşterea ALP.
Stabilirea cauzei creşterii ALP este extrem de utilă în vederea diferenţierii
diagnosticului.
Enzima
serică
Obstrucţie
biliară
Afecţiune
osoasă
Copilărie Sarcină
ALP C C C C
5 -NT C N N N
LAP C N N C
-GT C N N N
Unde: C = valori crescute; N = valori normale
nivelul ALP creşte înaintea apariţiei icterului
nivele marcat crescute ale ALP apar la sugarii cu atrezie biliară intrahepatică, dar
mult mai scăzute în caz de atrezie extrahepatică.
creşteri modeste (cam de 3 ori valoarea normală) sunt specifice şi pot fi întîlnite în
orice afecţiune hepatică (hepatită virală, hepatită cronică, ciroză hepatică, afecţiuni
hepatice infiltrative), dar şi în alte boli cu interesare hepatică (ex. insuficienţa
cardiacă congestivă).
Valori scăzute:
Scăderi ale ALP apar în glicogenoza de tip I (deficit de glucozo-fosfataza).