CERCETĂRI HISTOLOGICE, HISTOCHIMICE ŞI ... - "Gr.T. Popa" Iasi
CERCETĂRI HISTOLOGICE, HISTOCHIMICE ŞI ... - "Gr.T. Popa" Iasi
CERCETĂRI HISTOLOGICE, HISTOCHIMICE ŞI ... - "Gr.T. Popa" Iasi
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ <strong>ŞI</strong> FARMACIE „GR. T. POPA ” IA<strong>ŞI</strong><br />
FACULTATEA DE MEDICINĂ<br />
<strong>CERCETĂRI</strong> <strong>HISTOLOGICE</strong>, <strong>HISTOCHIMICE</strong> <strong>ŞI</strong><br />
ELECTRONOMICROSCOPICE ÎN VENELE<br />
VARICOASE<br />
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT<br />
CONDUCĂTOR ŞTIIŢIFIC<br />
PROF. DR. DOC. GIOCONDA DOBRESCU<br />
PROF. DR. IRINA-DRAGA CĂRUNTU<br />
2010<br />
DOCTORAND<br />
FLORIN COMŞA
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT<br />
Capitolul 1<br />
SISTEMUL VENOS<br />
1<br />
1.1. Anatomia Sistemului venos al membrelor inferioare 1<br />
1.1.1. Elemente de anatomie clasică 1<br />
1.1.1.1. Sistemul venos superficial (sistemul venelor safene) 2<br />
1.1.1.2. Sistemul venos profund 3<br />
1.1.1.3. Sistemul venelor perforante 3<br />
1.1.1.4. Caractere structurale generale 8<br />
1.1.2. Concepte moderne în anatomia membrelor inferioare 9<br />
1.2. Histologia sistemului venos al membrelor inferioare 15<br />
1.3. Fiziologia circulaţiei venoase a membrelor inferioare 16<br />
1.3.1. Particularităţi funcţionale 16<br />
1.3.2. Factori negativi 16<br />
1.3.3. Factori pozitivi 17<br />
Capitolul 2<br />
BOALA VARICOASĂ: CLASIFICARE, ASPECTE ETIOLOGICE, PATOGENICE, CLINICE <strong>ŞI</strong> PARACLINICE<br />
21<br />
2.1. Clasificarea varicelor 21<br />
2.2. Etiopatogenia bolii varicoase 21<br />
2.3. Stadiile şi simptomatologia bolii varicoase 23<br />
2.3.1. Stările prevaricoase (sindromul prevaricos) 23<br />
2.3.2. Sindromul gambelor grele 24<br />
2.3.3. Dilataţiile varicoase primare 24<br />
2.3.4. Dilataţiile varicoase secundare 26<br />
2.3.5. Dilataţiile varicoase congenitale 26<br />
2.4. Stadializarea insuficienţei venoase cronice 26<br />
2.4.1. Stadializarea CEAP (clinic–etiologic–anatomic– fiziopatologic) 26<br />
2.4.2. Scorul de severitate a insuficienţei venoase cronice 28<br />
2.4.3. Corelaţii în stadializare 29<br />
Capitolul 3<br />
METODE MODERNE DE INVESTIGAŢIE <strong>ŞI</strong> TRATAMENT ÎN BOALA VARICOASĂ<br />
32<br />
3.1. Metode clinice de investigaţie a bolii varicoase 32<br />
3.2. Metode paraclinice de investigaţie a bolii varicoase 34<br />
3.2.1. Determinarea presiunii venoase la nivelul membrului inferior 34<br />
3.2.2. Explorarea ultrasonografică (ecografică) a sistemului venos 35<br />
3.2.2.1. Principii metodologice generale 36<br />
3.2.2.2. Aspectul ultrasonografic normal al venelor 37<br />
3.2.3. Flebografia 39<br />
3.3. Principii moderne de tratament 39<br />
3.3.1. Tratamentul conservator 39<br />
3.3.2. Tratamenul farmacologic 41<br />
3.3.3. Scleroterapia 42<br />
3.3.4. Tratamentul chirurgical 43<br />
3.3.5. Laserul transcutanat, radiofrecvenţa endovenoasă 46<br />
Capitolul 4<br />
MOTIVAŢIA <strong>ŞI</strong> OBIECTIVELE STUDIULUI PERSONAL<br />
48<br />
Capitolul 5<br />
STUDIU MORFOLOGIC MACROSCOPIC AL SISTEMULUI VENOS SUPERFICIAL <strong>ŞI</strong> AL VENELOR PERFORANTE<br />
50<br />
5.1. Introducere 50<br />
5.2. Material şi metodă 51<br />
5.2.1. Material 51<br />
5.2.2. Metodologia de investigaţie 51<br />
5.3. Rezultate 62<br />
5.3.1. Caracterizarea structurală a sublotului 1 62<br />
5.3.2. Caracterizarea structurală a sublotului 2 65<br />
5.3.3. Analiza de comparaţie a parametrilor structurali – sublot 1 versus sublot 2 67<br />
5.3.4. Caracterizarea funcţională a sublotului 1 68<br />
5.3.5. Caracterizarea funcţională a sublotului 2 69<br />
5.3.6. Analiza de comparaţie a parametrilor funcţionali – sublot 1 versus sublot 2 70<br />
5.4. Discuţii 71<br />
Capitolul 6<br />
STUDIU MORFOLOGIC MICROSCOPIC AL SISTEMULUI VENOS SUPERFICIAL <strong>ŞI</strong> AL VENELOR PERFORANTE<br />
75<br />
6.1. Introducere 75<br />
6.2. Material şi metodă 76<br />
6.3. Rezultate 78<br />
6.4. Discuţii<br />
Capitolul 7<br />
103<br />
STUDIU MORFOLOGIC MICROSCOPIC IMUNOHISTOCHIMIC AL SISTEMULUI VENOS SUPERFICIAL <strong>ŞI</strong> AL<br />
VENELOR PERFORANTE<br />
109<br />
7.1. Introducere 109<br />
7.2. Material şi metodă 110<br />
1
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
7.3. Evaluarea profilului colagenic şi lamininic 112<br />
7.3.1. Repere fundamentale 112<br />
7.3.2. Particularităţi ale metodei 112<br />
7.3.3. Rezultate 112<br />
7.3.3.1. Expresia colagenului şi lamininei în boala varicoasă – varice simple – stadiul CEAP 2-3 112<br />
7.3.3.2. Expresia colagenului şi lamininei în boala varicoasă – varice complicate – stadiul CEAP 4-6 114<br />
7.3.4. Discuţii 118<br />
7.4. Evaluarea elementelor microvasculare 121<br />
7.4.1. Repere fundamentale 121<br />
7.4.2. Particularităţi ale metodei 122<br />
7.4.3. Rezultate 122<br />
7.4.3.1. Expresia elementelor microvasculare, a VEGF şi NOS în boala varicoasă – varice simple– stadiul CEAP 2-3 122<br />
7.4.3.2. Expresia elementelor microvasculare, a VEGF şi NOS în boala varicoasă – varice complicate – stadiul CEAP 4-6 125<br />
7.4.4. Discuţii 128<br />
7.5. Evaluarea metaloproteinazelor şi a inhibitorilor specifici 130<br />
7.5.1. Repere fundamentale 130<br />
7.5.2. Particularităţi ale metodei 131<br />
7.5.3. Rezultate 131<br />
7.5.3.1. Expresia MMP-2, MMP-9, TIMP-1 în boala varicoasă - varice simple – stadiul CEAP 2-3 131<br />
7.5.3.2. Expresia MMP-2, MMP-9, TIMP-1 în boala varicoasă – varice complicate – stadiul CEAP 4-6 131<br />
7.5.4. Discuţii 136<br />
7.6. Evaluarea apoptozei 138<br />
7.6.1. Repere fundamentale 138<br />
7.6.2. Particularităţi ale metodei 139<br />
7.6.3. Rezultate 139<br />
7.6.3.1. Expresia Bax în boala varicoasă - varicele simple – stadiul CEAP 2-3 139<br />
7.6.3.2. Expresia Bax în boala varicoasă - varicele complicate – stadiul CEAP 4-6 140<br />
7.6.4. Discuţii 141<br />
7.7. Evaluarea populaţiei mastocitare 142<br />
7.7.1. Repere fundamentale 142<br />
7.7.2. Particularităţi ale metodei 143<br />
7.7.3. Rezultate 143<br />
7.7.3.1. Expresia populaţiei mastocitare în varicele simple – stadiul CEAP 2-3 143<br />
7.7.3.2. Expresia populaţiei mastocitare în varicele complicate – stadiul CEAP 4-6<br />
7.7.3.3. Expresia populaţiei mastocitare în boala varicoasă - varice simple versus varice complicate – stadiul CEAP 2-3 versus<br />
143<br />
stadiul CEAP 4-6 146<br />
7.7.4. Discuţii 146<br />
7.8. Evaluarea populaţiei limfocitare 148<br />
7.8.1. Repere fundamentale 148<br />
7.8.2. Particularităţi ale metodei 148<br />
7.8.3. Rezultate 148<br />
7.8.3.1. Expresia populaţiei limfocitare T în varicele simple – stadiul CEAP 2-3 148<br />
7.8.3.2. Expresia populaţiei limfocitare în varicele complicate – stadiul CEAP 4-6<br />
7.8.3.3. Expresia populaţiei limfocitare în boala varicoasă - varice simple versus varice complicate – stadiul CEAP 2-3 versus<br />
149<br />
stadiul CEAP 4-6 150<br />
7.8.4. Discuţii 152<br />
Capitolul 8<br />
STUDIU MORFOLOGIC ULTRASTRUCTURAL AL SISTEMULUI VENOS SUPERFICIAL<br />
154<br />
8.1. Introducere 154<br />
8.2. Material şi metodă 155<br />
8.3. Rezultate 155<br />
8.4. Discuţii 187<br />
Capitolul 9<br />
CONCLUZII<br />
192<br />
Bibliografie 193<br />
Anexa - Lucrări publicate în perioada studiilor doctorale 203<br />
Teza de doctorat conţine 235 de figuri şi 58 de tabele. Rezumatul include un număr limitat din totalul figurilor şi<br />
tabelelor, menţinând numerotarea din teză.<br />
2
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
CAPITOLUL 4. MOTIVAŢIA <strong>ŞI</strong> OBIECTIVELE STUDIULUI PERSONAL<br />
În alegerea subiectului de cercetare au existat câteva elemente definitorii:<br />
• flebologia, considerată mult timp o “Cenuşăreasă” a specialităţilor medicale, este la ora actuală relansată<br />
prin progresele aduse prin cercetare, medicină bazată pe dovezi şi tehnică de investigaţie diagnostică<br />
noninvazivă<br />
• în fluxul principal de publicaţii există o cantitate impresionantă de date referitoare la boala varicoasă, dar<br />
mecanismul etiopatogenic nu este elucidat, iar teoria inflamatorie nu este încă demonstrată;<br />
• datorită mijloacelor de investigaţie moderne, în paralel cu creşterea nivelului de educaţie sanitară a<br />
populaţiei, numărul cazurilor de boală varicoasă în stadii incipiente care se prezintă la medic este în<br />
creştere de la un an la altul;<br />
• în vederea stabilirii corecte a diagnosticului şi a stadiului bolii, la ora actuală elementele examenului clinic<br />
nu mai pot fi privite separat de noţiunile de morfologie, discutându-se despre impactul anatomiei,<br />
fiziologiei, histologiei şi histopatologiei în boala varicoasă.<br />
Lucrarea de faţă a urmărit, prin prisma unui chirurg vascular care a beneficiat nu numai de oportunităţile<br />
investigaţiilor paraclinice moderne, ci şi de accesul la tehnici performante de cercetare microscopică, penetrarea în<br />
substratul morfologic al acestui grup particular de afecţiuni, la nivel tisular, celular, ultrastructural şi molecular.<br />
Motivaţia acestui demers ştiinţific a fost fundamentată de posibilitatea identificării unor elemente noi, care<br />
să permită stabilirea unor asocieri obiective şi, mai ales, graduale, între simptomatologia cu care se confruntă<br />
clinicianul în practică şi secvenţa de instalare a leziunilor morfologice în peretele venos varicos, care susţine aceşti<br />
parametri. Pornind de la trecerea în revistă a literaturii de specialitate şi identificarea punctelor problematice aflate<br />
în atenţia cercetătorilor preocupaţi de studiul insuficienţei venoase, obiectivele personale au fost stabilite în raport<br />
de cele 4 direcţii de cercetare abordate, traversând, în dinamică, contextul macroscopic relevat prin ecografie,<br />
aspectele microscopice convenţionale, trăsăturile decelabile la nivel molecular şi, în final, caracteristicile<br />
ultrastructurale. În mod concret, obiectivele specifice urmărite au fost:<br />
• analiza macroscopică a sistemului venos superficial şi a venelor perforante, în baza informaţiilor structurale şi<br />
funcţionale rezultate din investigaţia ecografică, în scopul de a identifica un set de parametri operaţionali care,<br />
reflectând substratul morfologic al bolii, pot orienta chirurgul vascular asupra conduitei terapeutice;<br />
• analiza modificărilor histopatologice prezente în venele varicoase, în scopul de a stabili existenţa unor diferenţe<br />
în componentele structurale colagenice, elastice şi musculare, în corelaţie directă cu stadiile evolutive ale bolii şi<br />
teritoriile afectate;<br />
• analiza expresiei moleculare a componentelor structurale matriceale (colagen, elastină) şi celulare (mastocite,<br />
limfocite) din structura peretelui venos şi a unor procese dezvoltate prin comunicare celulară şi tisulară<br />
(vascularizaţie, remodelare, apoptoză), urmărind în paralel existenţa unor diferenţe între stadiile evolutive, din<br />
punct de vedere clinic, ale bolii varicoase, precum şi între diferite teritorii afectate;<br />
• analiza modificărilor ultrastructurale din venele varicoase, în scopul de a aprofunda profilul ultrastructural al<br />
celulelor şi al componentelor matriceale implicate în mecanismul patogenic.<br />
CAPITOLUL 5. STUDIU MORFOLOGIC MACROSCOPIC AL SISTEMULUI VENOS SUPERFICIAL<br />
<strong>ŞI</strong> AL VENELOR PERFORANTE<br />
5.1. INTRODUCERE<br />
Insuficienţa venoasă cronică este o afecţiune care evoluează progresiv şi diferenţiat în decursul vieţii<br />
populaţiei active (De Backer, 1997, Bradbury et al., 1999, Criqui et al., 2003, Rabe et al., 2003). Orice tentativă<br />
terapeutică – farmacologică sau chirurgicală urmăreşte să întârzie progresia insuficienţei venoase, acest lucru fiind<br />
dificil din cauza prezentării tardive la consultul medical, mult după instalarea modificărilor trofice cutanate (Chiesa<br />
et al., 2007a). Asemenea situaţii sunt relativ frecvente, cu şanse destul de scăzute de vindecare (Ruckley, 1997).<br />
Eliminarea refluxului venos superficial la cazurile cu sistem venos profund de dimensiuni normale scade riscul de<br />
recidivă a complicaţiilor insuficienţei venoase (Darke, Penfold, 1992, Scriven et al., 1997).<br />
Pornind de la trecerea în revistă a literaturii de specialitate axate pe identificarea corelaţiilor clinicomorfologice,<br />
ca elemente cu semnificaţie diagnostică şi prognostică, obiectivul prezentului studiu a fost reprezentat<br />
de analiza macroscopică a sistemului venos superficial şi a venelor perforante, în baza informaţiilor structurale şi<br />
funcţionale rezultate din investigaţia ecografică, în scopul de a identifica un set de parametri operaţionali care,<br />
reflectând substratul morfologic al bolii, pot orienta chirurgul vascular asupra conduitei terapeutice.<br />
5.2. MATERIAL <strong>ŞI</strong> METODĂ<br />
5.2.1. MATERIAL<br />
Lotul de studiu a fost format din 100 de pacienţi cu boală varicoasă, diagnosticaţi prin investigaţii<br />
preoperatorii complexe şi trataţi chirurgical în Centrul de Diagnostic şi Tratament Dr. Victor Babeş Bucureşti în<br />
3
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
intervalul 01.06.2007 – 01.06.2010. Pacienţii incluşi în lot au fost informaţi în mod clar şi complet asupra<br />
particularităţilor investigaţiilor şi tratamentului, completând un consimţământ informat (tabelul 16). Studiul a fost<br />
avizat de Comisia de Etică a Centrului de Diagnostic şi Tratament Dr. Victor Babeş Bucureşti.<br />
5.2.2. METODOLOGIA DE INVESTIGAŢIE<br />
Metodologia de investigaţie a inclus: examen clinic general, examen clinic local, vascular şi examen ecografic.<br />
• Examenul clinic general<br />
Anamneza amănunţită a fost centrată pe factorul genetic şi factorii favorizanţi (activitate fizică în<br />
ortostatism, traumatismele repetate, stil de viaţa sedentar, numărul de sarcini, administrarea de medicamente<br />
anticoncepţionale orale), precum şi existenţa, în antecedente, a unei tromboflebite superficiale sau a unei tromboze<br />
venoase profunde. În cadrul examenul clinic general am urmărit prezenţa şi influenţa factorilor favorizanţi<br />
(obezitate, existenţa intervenţiilor chirurgicale în antecedente sau a eventualelor tratamente sclerozante, evoluţia<br />
edemelor şi a tulburărilor trofice cutanante) asupra bolii venoase. Evaluarea pacientului prin examen clinic general<br />
a fost completată prin informaţii furnizate de examenele paraclinice standard (biochimie, hematologie, radiografie<br />
toracică antero-posterioară, electrocardiogramă).<br />
• Examenul clinic local vascular<br />
Examenul local vascular s-a efectuat în ortostatism şi comparativ la ambele membre inferioare, fiind<br />
esenţial pentru stabilirea stadiului C (clinic) al clasificării CEAP. Am identificat şi urmărit vena safenă mare,<br />
respectiv vena safenă mică, de la origine până la abuşarea în sistemul profund, cu identificarea eventualelor<br />
modificărilor morfologice macroscopice (dilataţii sacciforme, tortuoase), afluenţi dilataţi şi poziţia acestora,<br />
realizând astfel o primă cartografiere a sistemului venos superficial al membrelor inferioare. Examenul clinic local<br />
vascular a fost finalizat prin consemnarea tipul de varice (tronculare, sistematizate sau nesistematizate), prezenţa<br />
edemelor, temperatura membrelor inferioare, modificări de culoare ale tegumentelor (hiperpigmentaţii), prezenţa<br />
dermatitei de stază sau a ulcerului venos, precum şi existenţa de cicatrici postoperatorii. Figurile 11-32 sunt<br />
elocvente pentru a ilustra elementele identificate în timpul examenului clinic local.<br />
Fig. 18. Varice voluminoase membrul pelvin<br />
stâng (detaliu)<br />
Fig. 26. Varice membrul pelvin stâng cu<br />
tulburări trofice cutanante gambiere (detaliu)<br />
4<br />
Fig. 28. Varice membrul pelvin stâng cu<br />
tulburări trofice cutanante şi ulcer activ<br />
gambier (detaliu)<br />
• Examenul ecografic<br />
Ecografia venoasă preoperatorie, realizată cu un echograf Siemens Sonoline G60S, a permis investigarea<br />
profilului morfologic macroscopic al patului venos în general şi al venelor perforante în particular. Ecografia<br />
venoasă la pacienţii cu boală venoasă cronică a relevat configuraţia anatomică a venelor şi anomaliile fluxului<br />
venos sanguin în membrele inferioare. În mod concret, am urmărit, ca şi criterii de evaluare: • care joncţiuni ale<br />
venei safene sunt incompetente, locaţiile lor şi diametrele; • diametrul şi gradul de reflux în venele safene la nivelul<br />
coapsei şi al gambei; • numărul, diametrul, gradul de reflux al venelor comunicante; • numărul, diametrul, gradul de<br />
reflux al venelor perforante; • prezenţa altor vene relevante pentru reflux; • sursa de umplere a tuturor varicelor<br />
superficiale, dacă aceasta nu a fost descrisă anterior; • venele cu elasticitate pierdută, venele colabate, absente sau<br />
eliminate chirurgical; • starea sistemului venos profund, inclusiv competenţa valvelor şi prezenţa unor vene<br />
trombozate. Examenul ecografic a permis cuantificarea unui set de parametri structurali şi funcţionali, detaliaţi în<br />
continuare. Pentru evaluarea gradului de afectare a sistemului venos superficial, am introdus următorii parametri<br />
structurali: • diametrul joncţiunii safeno-femurale (fig. 34, 35, 37);• diametru lumenului crosei venei safene internă<br />
şi/sau externă (după caz) (fig. 36); • diametrul lumenului venei safene la nivelul coapsei (două măsurători, prima în<br />
treimea superioară, a doua în treimea inferioară) (fig. 38-40); • diametrul lumenului venei safene la nivelul gambei<br />
(trei măsurători, prima în treimea superioară, a doua în treimea medie şi a treia în treimea inferioară) (fig. 41, 42); •<br />
diametrul pachetelor varicoase gambiere (fig. 43-49); • diametrul venelor perforante incontinente (fig. 50-55).
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
Fig. 35. Joncţiunea safeno-femurală Fig. 46. Pachet varicos 1/3 medie gambă Fig. 54. Perforantă 1/3 medie gambă<br />
Pentru evaluarea gradului de afectare a sistemului venos superficial, am introdus următorii parametri<br />
funcţionali: • prezenţa refluxului la nivelul joncţiunii safenofemurala şi/sau safenopoplitee (spontan sau la<br />
stimulare); • prezenţa refluxului la nivelul venei safene interne (spontan sau la stimulare); • prezenţa refluxului la<br />
nivelul venei safene externe (spontan sau la stimulare); • prezenţa refluxului la nivelul venelor perforante (spontan<br />
sau la stimulare); • tipul de reflux la nivelul venelor perforante (unidirecţional sau bidirecţional); • timpul de reflux<br />
la nivelul venelor perforante.<br />
5.3. REZULTATE<br />
În baza examenului clinic şi ecografic direcţionat pe investigarea sistemului venos, cazurile au fost<br />
încadrate în clase de diagnostic în conformitate cu stadiile definite prin Clasificarea CEAP. Pornind de la<br />
simptomatologia clinică şi concordanţa cu clasele CEAP - C, am realizat o evaluare a cazuisticii studiate pe două<br />
subloturi principale:<br />
- sublotul 1 ce include cazurile aflate în stadiile CEAP 2 şi 3;<br />
- sublotul 2 ce include cazurile aflate în stadiile CEAP 4, 5 şi 6.<br />
5.3.3. ANALIZA DE COMPARAŢIE A PARAMETRILOR STRUCTURALI – SUBLOT 1 vs. SUBLOT 2<br />
În comparaţia rezultatelor numerice obţinute în evaluarea joncţiunii safeno-femurale la cele două subloturi,<br />
analiza statistică a pus în evidenţă diferenţe semnificative pentru Diametrul 1 (p=0,002, GL=71) şi Diametrul M<br />
(p=0,003, GL=74) (tabel 31).<br />
Tabel 31. Joncţiunea safeno-femurală – parametri structurali – sublot 1 versus sublot 2<br />
Diametru<br />
(mm)<br />
Sublot Media -95% +95%<br />
Dev.<br />
std.<br />
5<br />
Er.<br />
std.<br />
Min Q25 Mediana Q75 Max<br />
Diametrul 1 10,72 11,267 3,567 3,268 0,402 5,9 8,07 10 12,65 20,2<br />
1 2 12,41 11,267 13,567 3,023 0,561 6 9,9 12,7 15,05 18,5<br />
Diametrul 1 8,57 8,507 10,354 2,46 0,303 5 6,97 8,05 9,45 18<br />
2 2 9,43 8,507 10,354 2,429 0,451 4,4 8 9,4 10,65 15,5<br />
Diametrul 1 9,65 9,978 11,870 2,687 0,331 5,5 7,65 9,17 11,4 19<br />
m 2 10,92 9,978 11,87 2,487 0,462 5,95 9,22 10,9 12,37 17<br />
Diametru<br />
(mm)<br />
Tabel 32. Vena safenă internă – parametri structurali – sublot 1 versus sublot 2<br />
Media -95% +95%<br />
Dev.<br />
std.<br />
Er.<br />
std.<br />
Min Q25 Mediana Q75 Max<br />
Sublot 1 10,89 10,19 11,607 2,992 0,355 6 9 10 12 24<br />
Sublot 2 12,51 11,540 13,487 2,559 0,475 8,2 10,5 12 14,5 18<br />
Tabel 33. Pachet varicos – parametri structurali – sublot 1 versus sublot 2<br />
Diametru<br />
(mm)<br />
Media -95% +95% Dev. std. Er. std. Min Q25 Mediana Q75 Max<br />
Sublot 1 12,56 11,774 13,352 3,333 0,396 7,2 10,7 12 13,8 28<br />
Sublot 2 13,99 12,999 14,98 2,604 0,484 9,5 12 13,3 15,8 19,3<br />
Tabel 34. Vene perforante – parametri structurali – sublot 1 versus sublot 2<br />
Diametru (mm) Sublot Media -95% +95% Dev.<br />
std.<br />
Er.<br />
std.<br />
Min Q25 Mediana Q75 Max<br />
Diametrumaxim<br />
1<br />
2<br />
4,97<br />
5,69<br />
4,760<br />
5,382<br />
5,183<br />
5,996<br />
0,894<br />
0,806<br />
0,106<br />
0,150<br />
4<br />
4<br />
4<br />
5<br />
5<br />
6<br />
6<br />
6<br />
7<br />
7<br />
0,000<br />
57<br />
Diametru 1 2,73 2,562 2,901 0,716 0,085 2 2 3 3 4 0,000<br />
minim 2 3,44 3,168 3,728 0,736 0,137 2 3 4 4 5 50<br />
Diametru<br />
di<br />
1 3,85 3,677 4,027 0,738 0,087 3 3 4 4,5 5,5 0,000<br />
57<br />
P<br />
GL<br />
0,008<br />
60<br />
P<br />
GL<br />
0,026<br />
66<br />
P<br />
GL<br />
0,002<br />
71<br />
0,016<br />
68<br />
0,003<br />
74<br />
P<br />
GL
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
mediu 2 4,56 4,316 4,821 0,644 0,123 3,5 4 5 5 6 57<br />
Analiza statistică a valorilor diametrului venei safene interne a relevat existenţa unor diferenţe între cele<br />
două subloturi, în sensul creşterii diametrului venei safene interne o dată cu avansarea bolii varicoase, dar fără<br />
confirmarea unei semnificaţii statistice (p=0,008, GL=60) (tabel 32). Deşi diametrul pachetelor varicoase creşte, în<br />
valori absolute, progresiv în cadrul evoluţiei bolii varicoase, analiza statistică nu a demonstrat şi o corelaţie<br />
semnificativ statistic în comparaţia sublot 1 versus sublot 2 (p=0,026, GL=66) (tabel 33). Analiza statistică de<br />
comparaţie între dimensiunile cuantificate la nivelul sistemului venelor perforante, sublot 1 versus sublot 2,<br />
demonstrează fără echivoc existenţa unei diferenţe semnificative statistic (tabel 34).<br />
5.3.6. ANALIZA DE COMPARAŢIE A PARAMETRILOR FUNCŢIONALI – SUBLOT 1 vs. SUBLOT 2<br />
Numărul de cazuri cu reflux spontan la nivelul joncţiunii safeno-femurale a crescut în sublotul 2 (26 cazuri<br />
din 29 - 89,65%) comparativ cu sublotul 1 (36 cazuri din 71 - 50,7%) (tabel 41). La nivelul tuturor zonelor studiate<br />
(sistem venos superficial şi profund) a fost evidenţiat reflux procentual într-un număr mai mare de cazuri în<br />
sublotul 2 comparativ cu sublotul 1 (tabelul 41): JSF 93,1% (sublot 1), respectiv 71,83% (sublot 2), JSP 34,48%<br />
(sublot 1), respectiv 1,4% (sublot 2), VSI 100% (sublot 1), respectiv 80,28% (sublot 1), VP 100% (sublot 1),<br />
respectiv 22,53% (sublot 1).<br />
Tabel 41. Distribuţia cazurilor de insuficienţă venoasă cronică<br />
– sublot 1 versus sublot 2<br />
Caracteristici Sublot Număr cazuri<br />
Reflux<br />
La stimulare<br />
Spontan<br />
1<br />
2<br />
1<br />
2<br />
35<br />
3<br />
36<br />
26<br />
JSF<br />
1<br />
2<br />
51<br />
27<br />
VSI<br />
1<br />
2<br />
57<br />
29<br />
Segment JSP<br />
1<br />
2<br />
1<br />
1<br />
VSE<br />
1<br />
2<br />
6<br />
2<br />
VP<br />
1<br />
2<br />
16<br />
29<br />
Venă<br />
perforantă<br />
6<br />
Tabel 42. Vene perforante - direcţia de reflux - sublot<br />
1 versus sublot 2<br />
Venă perforantă Sublot Cazuri<br />
Flux unidirecţional<br />
Flux bidirecţional<br />
Tabel 43. Vene perforante – timp de reflux – sublot 1 versus sublot 2<br />
Sublot Media -95% +95% Dev.<br />
std.<br />
Er.<br />
std.<br />
1 17<br />
2 1<br />
1 54<br />
2 28<br />
Min Q25 Mediana Q75 Max<br />
1 0,794 0,738 0,850 0,237 0,028 0,5 0,6 0,7 1 1,5 0,000<br />
Timp reflux (s)<br />
2 2,29 1,872 2,706 1,097 0,204 1,4 1,6 1,6 3,6 4,5 29<br />
Comparând tipurile de reflux la nivelul venelor perforante s-a observat creşterea numărului de vene<br />
perforante cu flux bidirecţional o dată cu avansarea bolii varicoase (tabel 42), tipul de informaţie obţinută neputând<br />
a fi analizată şi interpretată sub raport statistic. Analiza statistică de comparaţie a timpul mediu de reflux la nivelul<br />
venelor perforante a relevat o diferenţă semnificativă statistic între cele două subloturi (p=0,000, GL=29) (tabel 43).<br />
5.4. DISCUŢII<br />
Din punctul de vedere al chirurgului vascular, abordarea insuficienţei venoase cronice presupune, în<br />
succesiune, examene clinice şi paraclinice pentru stabilirea diagnosticului, urmate de stabilirea conduitei<br />
terapeutice şi realizarea intervenţiei chirurgicale, dacă aceasta este necesară. Experienţa personală în diagnostic şi<br />
tratament a stat la baza deciziei de a mă angaja într-o cercetare doctorală şi a contribuit, în mod decisiv, în alegerea<br />
temei. Ulterior, efortul a fost concentrat pe depăşirea algoritmilor clasici de diagnostic, în tentativa de a identifica<br />
elemente şi/sau criterii obiective care să permită clinicianului o apreciere a substratului morfologic al leziunilor în<br />
corespondenţă cu tabloul clinic. Instrumentul principal utilizat a fost investigaţia ecografică, metodă extrem de<br />
fiabilă, non-invazivă, care oferă informaţii certe asupra parametrilor structurali şi funcţionali.<br />
• Examenul clinic local vascular<br />
În raport cu afectarea diferită a sexului feminin şi, respectiv, masculin, datele noastre au indicat că, în<br />
stadiile incipiente ale insuficienţei venoase (CEAP 2-3), cele mai afectate sunt femeile (80,28% în cadrul sublotului<br />
1, respectiv 57% în cadrul întregului studiu), iar în stadiile avansate distribuţia pe sexe se echilibrează, bărbaţii<br />
reprezentând 51,72% în cadrul sublotului 2, respectiv 15% în cadrul întregului studiu. Trebuie menţionat faptul că<br />
pacientele de sex feminin au dezvoltat predominant varice nesistematizate, iar pacienţii de sex masculin - varice<br />
P<br />
GL
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
tronculare. O particularitate a cazuisticii investigate şi analizate este legată de existenţa, în antecedente, a unui<br />
episod de tromboză. În lotul nostru, procentul pacienţilor cu istoric de tromboză a fost de 10% (7% femei, 3%<br />
bărbaţi), valoare care depăşeşte cu mult datele raportate în literatură – respectiv 1,33% femei şi 1,77% bărbaţi<br />
(Chiesa et al., 2007a). Tromboza veche (8% din cazuri) sau recentă – care a necesitat intervenţie chirurgicală de<br />
urgenţă (2% din cazuri) a afectat cel mai frecvent femeile din decada a 5-a şi bărbaţii din decada a 7-a, relaţia cu<br />
vârsta fiind concordantă cu rezultatele din literatură (Chiesa et al., 2007a). În baza experienţei personale, aceste<br />
rezultate denotă, din păcate, o lipsă de interes pentru evoluţia bolii şi a propriei stări de sănătate.<br />
• Examenul ecografic, valoarea cuantificării parametrilor structurali şi funcţionali<br />
Diagnosticul şi tratamentul insuficienţei venoase cronice a realizat un uriaş pas înainte în ultimele decade,<br />
acest lucru fiind datorat evoluţiei tehnice în domeniul ecografiei vasculare, a tehnicilor de examinare şi a<br />
standardelor de înregistrare şi comunicare a datelor de anatomie, patologie. În multe feluri, sistemul venos este<br />
considerat în prezent mult mai complex decât cel arterial. Tehnicile de cartografiere, înţelegerea refluxului de la<br />
nivelul sistemului venos superficial şi al venelor perforante sunt factori care condiţionează descoperirile ecografice<br />
şi care au un impact semnificativ în alegerea şi planificarea metodei terapeutice în vederea obţinerii unor rezultate<br />
imediate, şi mai ales la distanţă, bune, cu îmbunătăţirea şi păstrarea calităţii vieţii pacientului cu insuficienţă<br />
venoasă cronică (Zygmunt, 2009, Labropoulos et al., 2010, Obermayer, Garzon, 2010).<br />
O primă direcţie a studiului nostru a fost reprezentată de determinarea unor parametri structurali (mai<br />
precis diametre) pentru crosa safenei, vena safenă internă, pachetul varicos şi venele perforante, urmărind existenţa<br />
unor corelaţii între dimensiuni şi stadiul CEAP al insuficienţei venoase. Trebuie subliniat faptul că literatura de<br />
specialitate include doar 5 studii cu o oarecare similaritate – evaluarea vizând exclusiv venele perforante (van<br />
Bemmele et al., 1991, Hanrahan et al., 1991, Labropoulos et al., 1996, Ruckley, Makhdoomi, 1996, Stuart et al.,<br />
2000), al căror număr şi diametru decelat echografic este asociat cu creşterea stadiului CEAP al insuficienţei<br />
venoase cronice. Datele noastre indică faptul că insuficienţa safeno-femurală spontană a crescut de la 50,7% în<br />
sublotul 1 la 89,65% în sublotul 2, în paralel cu creşterea atât a numărului mediu, cât şi diametrului mediu al<br />
venelor perforante incompetente de la 4, respectiv 3,85 mm la 6, respectiv 4,56 mm. Astfel în opinia noastră,<br />
diametrul venos măsurat are valoare în orientarea deciziei terapeutice - scleroterapie, radiofrecvenţă, laser<br />
endovenos şi intervenţie chirurgicală.<br />
A doua direcţie a studiului nostru a fost reprezentată de determinarea unor parametri funcţionali, în<br />
corespondenţă cu refluxul venos. Extensia exciziei rezervorului venos reprezintă un factor cheie în determinarea<br />
eficacităţii clinice şi hemodinamice (Wong et al., 2003, Pittaluga et al., 2009). Conform datelor din literatură, 40%<br />
din populaţia examinată ecografic prezintă semne de insuficienţă venoasă, iar procentul de modificări<br />
hemodinamice creşte progresiv cu vârsta, astfel încât refluxul venos este prezent la aproximativ 50% din populaţia<br />
peste 50 ani (Evans et al., 1999, Lee et al., 2003, Chiesa et al., 2007a, Chiesa et al., 2007b). Rezultatele noastre au<br />
indicat creşterea numărului de vene perforante cu flux bidirecţional, o dată cu avansarea bolii varicoase. Această<br />
informaţie a fost completată de diferenţa semnificativă statistic între timpul mediu de reflux obţinut pentru cele<br />
două subloturi (p=0,000).<br />
Parametrii funcţionali analizaţi oferă o imagine reală a modificărilor patogenice în evoluţie: odată cu<br />
creşterea stadiului CEAP creşte şi capacitatea ca volume mari de sânge să fie expulzate cu gradient presional mare<br />
prin venele perforante dilatate, cu rezistenţă redusă în timpul contracţiei musculaturii gambei. Consecutiv, datele<br />
obţinute confirmă faptul că, la pacienţii cu insuficienţă venoasă cronică în stadii avansate, beneficii hemodinamice sau<br />
clinice pot fi atinse prin chirurgia perforantelor, mai mult decât prin chirurgia standard a safenei (Stuart et al., 2000).<br />
CAPITOLUL 6. STUDIU MORFOLOGIC MICROSCOPIC AL SISTEMULUI VENOS SUPERFICIAL <strong>ŞI</strong><br />
AL VENELOR PERFORANTE<br />
6.1. INTRODUCERE<br />
Accesul la mijloacele de investigaţie moderne, dublat de creşterea nivelului de educaţie medicală a<br />
populaţiei a condus la creşterea numărului de cazuri de boală varicoasă diagnosticate, prevalenţa raportată fiind<br />
între 10% şi 50% (Woodsite et al., 2003). Studiul patogeniei bolii varicoase prezintă numeroase lacune, deşi de-a<br />
lungul timpului au fost emise numeroase ipoteze. Concepţiile patogenice clasice (Malan, Giabbani, 1964) pot fi<br />
grupate în trei teorii esenţiale: parietală, valvulară şi anastomotică. La ora actuală, sub raport fiziopatologic, este<br />
unanim recunoscut rolul insuficienţei valvulare, a dilatării venelor şi a creşterii presiunii venoase, controversele<br />
vizând stabilirea factorului primordial (Kim et al., 2005, Jeanneret et al., 2007, Kurihara et al., 2007). Aceste<br />
modificări, care caracterizează instalarea şi evoluţia bolii varicoase, au însă un substrat patogenic mult mai profund,<br />
încă neelucidat.<br />
Obiectivul prezentului studiu a fost reprezentat de analiza modificărilor histopatologice prezente în venele<br />
varicoase, investigarea noastră fiind concentrată asupra componentelor structurale colagenice, elastice şi<br />
musculare al căror raport cantitativ modificat în comparaţie cu statusul de normalitate poate susţine afectarea<br />
fiziologiei venoase.<br />
7
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
6.2. MATERIAL <strong>ŞI</strong> METODĂ<br />
Lotul de studiu a fost constituit din 13 pacienţi cu boală varicoasă: 8 în stadiul CEAP 2-3 (sublot 1), 5 în<br />
stadiul CEAP 4-6 (sublot 2), internaţi în Centrul de Diagnostic şi Tratament Dr. Victor Babeş Bucureşti. Procesarea<br />
fragmentelor pentru examenul histopatologic a fost realizată în cadrul Departamentului de Patologie al Institutului<br />
Naţional de Cercetare-Dezvoltare în Domeniul Patologiei şi Ştiintelor Biomedicale "Victor Babeş” Bucureşti.<br />
6.3. REZULTATE<br />
• Tabloul morfologic pentru boala varicoasă – varice simple - stadiul CEAP 2-3<br />
Pentru crosa safenei, vena safenă internă şi pachetul varicos, examenul histopatologic în coloraţia standard<br />
HE a relevat îngroşarea segmentară a intimei şi mediei, fie cu distribuţie uniformă pe întregul fragment de venă<br />
examinat, fie în alternanţă cu segmente normale sub raportul grosimii peretelui venos – cu menţiunea că, în<br />
comparaţie cu zonele îngroşate, aceste segmente au fost considerate, iniţial, ca fiind caracterizate prin reducerea<br />
grosimii peretelui (subţiate). Pentru venele perforante, aspectul general a fost reprezentat de îngroşare<br />
circumferenţială a intimei şi mediei, uniformă de-a lungul întregului fragment recoltat.<br />
La nivelul intimei, profilul pavimentos al celulelor endoteliale a fost înlocuit cu un profil cuboidal. Pentru<br />
fragmentele îngroşate, coloraţiile speciale au permis identificarea ţesutului conjunctiv, cu evidentă creştere a<br />
cantităţii de matrice extracelulară nefibrilară. Tunica medie a prezentat hipertrofia şi hiperplazia celulelor<br />
musculare, fascicolele musculare netede cu dispoziţie concentrică în jurul lumenului devenind voluminoase. Şi la<br />
acest nivel, coloraţiile speciale au permis evidenţierea netă a ţesutului conjunctiv, cu importantă creştere a cantităţii<br />
de matrice extracelulară fibrilară şi nefibrilară. Componenta fibrilară colagenică, organizată în manieră cordonală,<br />
în fascicole compacte, cu rare fibrocite asociate, a inclus uneori vase de tip capilar (posibil neoformate prin<br />
angiogeneză). Componenta fibrilară elastică, extrem de bine reprezentată, a format condensări în grosimea peretelui<br />
venei, ca o reacţie la presiunea venoasă crescută. În paralel, au existat şi fibre elastice rupte, fragmentate, cu<br />
dispoziţie izolată printre celulele musculare netede sau fascicolele de colagen.<br />
• Tabloul morfologic pentru boala varicoasă – varice complicate - stadiul CEAP 4-6<br />
Modificările histologice anterior descrise la nivelul mediei au fost amplificate prin prezenţa colagenului în<br />
cantităţi mari, cu rezultat în dezorganizarea modelului celular muscular normal prin fragmentarea fascicolelor<br />
musculare şi separarea lor în insule, sau înlocuirea acestora prin componenta colagenică în exces (fleboscleroză),<br />
distribuită fie uniform, în stratul circular şi cel longitudinal al mediei, fie neuniform. Trebuie menţionat faptul că,<br />
deşi tunica media a avut dimensiuni mari, interpretate ca hipertrofie, numărul celulelor musculare netede a fost<br />
diminuat, comparativ cu structura normală, straturile musculare ale tunicii medii fiind mai subţiri decât normal.<br />
Fig. 73. Crosă safenă. Hipertrofie intimală<br />
marcată, tunică medie cu hiperplazie musculară<br />
şi proliferare colagenică (HE, x 20)<br />
Fig. 77. Venă safenă internă. Tunică medie cu<br />
colagenizare importantă (PAS, x 40)<br />
8<br />
Fig. 124. Venă perforantă: componentă<br />
elastică dezorganizată (van Gieson-<br />
Elastic, x 10)<br />
Consecutiv procesului de fibrozare a mediei, au fost înregistrate leziuni diferite determinate de invadarea<br />
progresivă a intimei şi adventicei. Afectarea intimei a fost severă, fiind observată detaşarea endoteliului şi<br />
înlocuirea ariei corespondente intimei prin fibre colagene dense, unele în curs de hialinizare, separate prin fibre<br />
elastice hiperplaziate. Aceste modificări de endoflebită au determinat evoluţia spre tromboză.<br />
La nivel adventicial, au fost prezente modificări ale terminaţiilor nervoase (nevrită difuză) şi ale vasa<br />
vasorum. Vasa vasorum au prezentat un aspect dilatat si anastomozat, uneori înconjurând vena lezată şi<br />
imprimându-i un aspect cavernos. Un caz a fost caracterizat prin expansiunea spre interior a vasa vasorum,<br />
penetrând în structura mediei şi determinând leziuni de mezoflebită vegetantă. Prin prisma examenului calitativ, nu<br />
au fost identificate diferenţe majore între leziunile prezente la nivelul crosei, a venei safene interne, a pachetului<br />
varicos şi, respectiv, a venelor perforante – toate zonele fiind caracterizate fie prin hipertrofie concentrică, omogenă,<br />
fie prin hipertrofie excentrică. Imaginile următoare sunt relevante pentru a ilustra modificările morfologice<br />
prezente la nivelul peretului venos, în succesiunea teritoriilor venoase investigate: crosa venei safene interne (fig. 56-<br />
73), vena safenă internă (fig. 74-98), pachetul varicos (fig. 99-116), venele perforante (fig. 117-128).<br />
6.4. DISCUŢII<br />
Mecanismul patogenic al bolii varicoase trebuie privit unitar, în toată complexitatea lui, ca rezultat al<br />
intricării a numeroase verigi patogenice, substratul morfologic lezional determinând tulburările funcţionale<br />
specifice, traduse prin simptomatologia clinică. Dezvoltarea tehnicilor de biologie celulară şi moleculară au permis
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
aprofundarea modificărilor structurale ale componentelor tisulare endoteliale, conjunctive şi musculare din<br />
peretele venos, având drept rezultat un concept modern al etiopatogeniei bolii varicoase (Bergen, Pascarella, 2007).<br />
Structurile morfologice la nivelul cărora se instalează leziuni majore sunt tunica intimă şi tunica medie.<br />
Modificările morfologice principale care caracterizează boala varicoasă sunt rezultatul interferenţelor<br />
între lezarea endotelială, hipertrofia intimală, prin creşterea matricei extracelulare conjunctive şi modificările<br />
celulelor musculare.<br />
• Lezare endotelială, hipertrofie intimală<br />
În studiul nostru, în ambele subloturi, venele varicoase au prezentat o creştere a lumenului cu hipertrofia<br />
(elongarea şi invaginarea) intimei, prin creşterea importantă a matricei extracelulare fibrilare prezente la acest<br />
nivel. În paralel, alte leziuni evidenţiate pentru sublotul corespunzător cazurilor cu varice simple au fost<br />
reprezentate de activarea celulelor endoteliale, tradusă prin creşterea dimensiunilor şi profilul proeminent<br />
intraluminal, asociat cu prezenţa de vacuole intracitoplasmatice. Pentru sublotul corespunzător cazurilor cu varice<br />
complicate, leziunile au inclus degenerarea marcată a celulelor endoteliale şi descuamarea stratului endotelial.<br />
• Modificările matricei extracelulare fibrilare: colagen, elastină<br />
În studiul nostru, în ambele subloturi venele varicoase au prezentat o dezvoltare marcată a matricei<br />
extracelulare fibrilare atât la nivelul intimei, cât şi la nivelul mediei. Pentru sublotul 1 – varice simple, dacă la nivel<br />
intimal fibrele de colagen au fost dispuse compact, în tunica medie aranjamentul lor a fost fascicular, printre<br />
celulele musculare netede, uneori invadând şi rupând stratul muscular al mediei. Pentru sublotul 2 - varice<br />
complicate, colagenul produs a determinat îngroşarea evidentă a intimei, pe fondul hiperplaziei colagenice,<br />
instalându-se transformarea hialină. În paralel, a fost prezentă şi hiperplazia fibrelor elastice. Mai mult, în tunica<br />
medie, hiperplazia fibrelor de colagen a condus la disocierea fascicolelor musculare şi/sau înlocuirea acestora în<br />
totalitate, cu instalarea flebosclerozei.<br />
• Modificările celulelor musculare<br />
În studiul nostru, în ambele subloturi venele varicoase au fost caracterizate prin hipertrofia şi hiperplazia<br />
celulelor musculare în tunica medie. Aceste modificări au fost mai evidente în sublotul 1, comparativ cu sublotul 2<br />
– la nivelul căruia s-a înregistrat, pe fondul unei fragmentări a continuităţii celulelor musculare, un proces de<br />
transformare fibroasă.<br />
• Sinopsis al modificărilor morfologice<br />
Evaluarea elementelor morfologice identificate în studiul nostru a relevat prezenţa constantă a aceloraşi<br />
leziuni la nivelul segmentelor recoltate din teritorii venoase diferite, iar comparaţia între cele două stadii – varice<br />
simple (sublotul 1), varice complicate (sublotul 2) a confirmat evoluţia graduală a leziunilor, dinamica lor fiind în<br />
corespondenţă directă cu tabloul clinic. În boala varicoasă, leziunile endoteliale, caracterizate prin activare,<br />
degenerare şi descuamare, expun componentele peretelui şi accelerează evoluţia modificărilor morfologice ale<br />
celorlalte componente. Pentru ţesutul muscular neted al tunicii medii, procesele de hipertrofie şi hiperplazie pot<br />
asocia modificări în structura celulelor musculare, prezenţa de vacuole sugerând un posibil rol secretor şi fagocitar<br />
al acestora, ceea ce poate explica funcţia contractilă anormală a celulelor musculare netede din peretele venos. În<br />
ţesutul conjunctiv al intimei şi mediei creşte proporţia de matrice extracelulară nefibrilară (amorfă) şi fibrilară, şi<br />
apar modificări structurale ale fibrelor elastice şi de colagen. Alternanţa de zone de hipertrofie şi atrofie la nivelul<br />
peretelui venos este considerată ca o reacţie la presiunea şi perfuzia deficitară de la acest nivel sau o consecinţă a<br />
modificărilor cantitative şi calitative ale celulelor musculare netede.<br />
CAPITOLUL 7. STUDIU MORFOLOGIC MICROSCOPIC IMUNOHISTOCHIMIC AL SISTEMULUI<br />
VENOS SUPERFICIAL <strong>ŞI</strong> AL VENELOR PERFORANTE<br />
7.1. INTRODUCERE<br />
Insuficienţa venoasă cronică este o boală inflamatorie cronică determinată de acţiunea persistentă şi<br />
constantă a hiperpresiunii venoase, cu impact direct asupra structurii morfologice a peretelui venos.<br />
În acest context, obiectivul studiului imunohistochimic a fost reprezentat de analiza expresiei moleculare a<br />
componentelor structurale matriceale şi celulare din structura peretelui venos şi a unor procese dezvoltate prin<br />
comunicare celulară şi tisulară, urmărind în paralel existenţa unor diferenţe între stadiile evolutive, din punct de<br />
vedere clinic, ale bolii varicoase, precum şi între diferite teritorii afectate.<br />
În mod concret, analiza calitativă şi cantitativă a vizat: • profilul structural şi histoarhitectonic (de<br />
distribuţie) al componentelor matriceale fibrilare, relevat prin intermediul colagenului I, III, IV şi lamininei; •<br />
profilul microvascularizaţiei, relevat prin intermediul markerilor endoteliali (CD31) şi de activare endotelială<br />
(VEGF, NOS); • procesul de remodelare, relevat prin intermediul metaloproteinazelor matriceale (MMP2, MMP9)<br />
şi a inhibitorilor specifici acestora (TIMP1); • procesul apoptotic, relevat prin intermediul Bax; • profilul<br />
histoarhitectonic (de distribuţie) al mastocitelor – relevat prin intermediul triptazei mastocitare; • profilul celular şi<br />
histoarhitectonic (de distribuţie) al limfocitelor T – relevate prin intermediul markerilor CD4 – limfocite T helper şi<br />
CD8 – limfocite CD8 citotoxice;<br />
9
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
7.2. MATERIAL <strong>ŞI</strong> METODĂ<br />
Investigaţia imunohistochimică a fost realizată pe acelaşi lot de studiu care a făcut obiectul analizei<br />
morfologice în microscopie optică, caracteristicile lotului fiind prezentate în Capitolul 6. Procesarea fragmentelor<br />
prelevate a fost realizată în Departamentul de Patologie al Institutului Naţional de Cercetare-Dezvoltare în Domeniul<br />
Patologiei şi Ştiintelor Biomedicale "Victor Babeş” Bucureşti. Analiza calitativă şi semi-cantitativă pentru interpretarea<br />
rezultatelor a fost realizată în cadrul Disciplinei Histologie, Universitatea de Medicină şi Farmacie „<strong>Gr</strong>. T. Popa” Iaşi.<br />
7.3. EVALUAREA PROFILULUI COLAGENIC <strong>ŞI</strong> LAMININIC<br />
7.3.1. REPERE FUNDAMENTALE<br />
Literatura de specialitate include rezultate contradictorii asupra concentraţiei de ţesut conjunctiv în venele<br />
varicoase, în comparaţie cu venele normale. Astfel, există date care susţin reducerea cantităţii/proporţiei<br />
colagenului (Svejcar et al., 1963, Andreotti et al., 1978, Psaila, Melhuish, 1989, Jurukova, Milenkov, 1982),<br />
creşterea cantităţii/proporţiei colagenului (Rose, Ahmed, 1986, Maurel et al., 1990, Waksman et al, 1997), fără<br />
(Travers et al., 1996) sau cu (Gandhi et al., 1993, Sansilvestri-Morel et al., 2001) reducerea conţinutului în elastină,<br />
precum şi date care indică absenţa diferenţelor între raportul colagen-proteine totale între venele normale şi venele<br />
varicoase (Travers et al., 1996, Venturi et al., 1996, Travers et al., 1992). A fost raportată şi reducerea conţinutului<br />
în elastină (Venturi et al., 1996, Gandhi et al., 1993, Kockx et al., 1998), cu conţinut colagenic normal, în venele<br />
varicoase comparativ cu venele normale (Kockx et al., 1998). Literatura de specialitate nu oferă date structurale<br />
comparative bolilor varicoase asociate incompetenţelor valvulare versus celor dezvoltate pe fondul unui aparat<br />
valvular normal. Totuşi, cele mai multe studii pledează pentru existenţa unei cantităţi mai mari de colagen în venele<br />
varicoase, comparativ cu normalul. Această creştere este mult mai evidentă în medie, determinând separarea<br />
celulelor musculare netede. Contradicţiile din literatură asupra cantităţii de colagen pot fi explicate prin ipoteza<br />
conform căreia colagenizarea nu este factorul unic pentru dezvoltarea bolii varicoase, varicele putând fi dezvoltate<br />
şi în alt context patogenic (Elsharawy et al, 2007), sau prin posibilitatea existenţei unor diferenţe segmentare, deşi<br />
cantitatea totală, absolută, este crescută (Travers et al., 1996). Laminina, moleculă glicoproteică de adeziune<br />
prezentă în matricea extracelulară amorfă a ţesutului conjunctiv, este recent introdusă în sfera de interes a bolii<br />
varicoase (Kirsch et al., 2000, Aunapuu, Arend, 2005, Sansilvestri-Morel et al., 2007), evaluarea profilului său<br />
contribuind la înţelegerea modificărilor structurale care pot fundamenta patogenia apariţiei şi progresiei varicelor.<br />
7.3.2. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI<br />
Pentru evaluarea expresiei colagenului I, II, III, IV şi a lamininei am utilizat un scor semicantitativ bazat pe<br />
intensitatea reacţiei imunhistochimice, adaptat după un scor utilizat recent într-o cercetare axată pe studiul<br />
componentei colagenice (Glazebrook et al., 2008). Scala de gradare a avut următoarea semnificaţie: + pentru<br />
intensitate scăzută, ++ pentru intensitate moderată, +++ pentru intensitate crescută. Cazurile pentru care reacţia<br />
imunohistochimică a fost absentă (în condiţiile existenţei unui control pozitiv) au fost considerate negative.<br />
7.3.3. REZULTATE<br />
7.3.3.1. EXPRESIA COLAGENULUI <strong>ŞI</strong> LAMININEI ÎN BOALA VARICOASĂ – VARICE SIMPLE – STADIUL CEAP 2-3<br />
Pentru toate cele 8 cazuri investigate, la nivelul tuturor segmentelor recoltate, reacţiile pentru colagenul tip<br />
I au fost pozitive, de intensitate medie, iar cele pentru colagen tip III – pozitive, de intensitate scăzută (tabelul 44).<br />
Distribuţia componentei colagenice tip I şi, respectiv, tip III a fost identificată la nivelul tuturor celor 3 tunici.<br />
Reacţiile pentru colagenul tip II au fost negative în toate cele 8 cazuri (tabelul 44). Reacţiile pentru colagenul tip IV<br />
au fost pozitive în toate cele 8 cazuri, la nivelul tuturor segmentelor recoltate. Intensitatea reacţiei a fost slabă în<br />
două cazuri şi moderată în 6 cazuri (tabelul 45). Sub raportul distribuţiei, colagenul tip IV a fost identificat la<br />
nivelul membranei bazale endoteliale, dar şi în tunica medie, în jurul celulelor musculare netede.<br />
7.3.3.2. EXPRESIA COLAGENULUI <strong>ŞI</strong> LAMININEI ÎN BOALA VARICOASĂ – VARICE COMPLICATE – STADIUL CEAP 4-6<br />
Pentru toate cele 5 cazuri investigate, la nivelul tuturor segmentelor recoltate, reacţiile imunohistochimice<br />
pentru colagenul tip I au fost pozitive, de intensitate crescută, iar cele pentru colagen tip III – pozitive, de<br />
intensitate scăzută (tabel 47). Distribuţia componentei colagenice tip I şi, respectiv, tip III a fost identificată la<br />
nivelul tuturor celor 3 tunici, fiind însă în mod evident mai pronunţată la nivelul tunicii medii, printre celulele<br />
musculare netede. Reacţiile imunohistochimice pentru colagenul tip II au fost negative în toate cele 8 cazuri (tabel<br />
47). Reacţiile imunohistochimice pentru colagenul tip IV au fost pozitive, de intensitate moderată, în toate cele 5<br />
cazuri, la nivelul tuturor segmentelor recoltate (tabel 48). Sub raportul distribuţiei la nivelul celor 3 tunici,<br />
colagenul tip IV a prezentat localizări similare sublotului 1, respectiv în membrana bazală endotelială şi în<br />
membranele bazale adiacente fibrelor musculare netede.<br />
Reacţiile imunohistochimice pentru laminină au fost pozitive, în toate cele 5 cazuri, la nivelul tuturor<br />
segmentelor recoltate (tabel 49). Intensitatea reacţiei imunohistochimice a fost crescută şi, respectiv, moderată în<br />
crosă, vena safenă internă şi pachet varicos, şi moderată la nivelul venelor perforante. Sub raportul localizării,<br />
laminina a fost prezentă nu numai în tunica intimă (cu distribuţie continuă, în terioriul membranei bazale<br />
endoteliale), cât şi în tunica medie (cu distribuţie neomogenă, fie tapetând celulele musculare netede, fie dispersat<br />
în matricea extracelulară care a separat componenta musculară).<br />
10
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
Prezenţa diferitelor tipuri de colagen şi a lamininei, la nivelul peretelui venos, este ilustrată prin imaginile<br />
următoare (fig. 129-137).<br />
Fig. 129. Reacţie imunohistochimică pozitivă, de intensitate<br />
crescută, pentru colagenul tip I, prezent la nivelul intimei<br />
hipertrofiate şi al mediei (IHC, Ac-anti colagen tip I, x 20 )<br />
11<br />
Fig. 133. Reacţie imunohistochimică pozitivă pentru<br />
laminină, cu intensitate marcată la nivelul membranei bazale<br />
endoteliale – sublot 1 (IHC, Ac-anti laminină, x 10)<br />
7.3.4. DISCUŢII<br />
• Profilul colagenic<br />
Colagenul joacă un rol cheie în elasticitatea tisulară şi rezistenţa la întindere. Aceste proprietăţi, cruciale în<br />
menţinerea statusului funcţional normal în peretele venos, sunt afectate încă din stadiile precoce de apariţie a<br />
venelor varicoase.<br />
Datele contradictorii din literatură, referitoare la creşterea, menţinerea normală sau scăderea proporţională<br />
a colagenului, posibil explicabile prin rezultatele dependente de regiunea de venă eşantionată, trebuie tratate cu<br />
precauţie, deoarece în toate aceste situaţii poate exista o creştere a cantităţii absolute de colagen (Travers et al.,<br />
1996, Sansilvestri-Morel et al., 2001). Totuşi, cele mai multe studii susţin faptul că, în comparaţie cu regiunile<br />
echivalente normale, venele varicoase safene conţin cantităţi semnificativ crescute de colagen în întregul perete, în<br />
tunica medie şi în tunica intimă, deopotrivă proximal şi distal. Consecutiv, ar fi benefic să putem aprecia / evalua<br />
concentraţia de colagen şi elastină ca un index pentru conţinutul general.<br />
Pentru ambele loturi, rezultatele noastre au relevat, în baza evaluării calitative şi semi-cantitative, prezenţa<br />
unei cantităţi importante de colagen tip I, în paralel cu o cantitate redusă de colagen tip III. Nu au fost observate<br />
diferenţe semnificative între cele două loturi. Marcarea imunohistochimică a permis nu numai urmărirea localizării<br />
la nivelul tuturor celor 3 tunici, ci şi aprecierea diferenţelor de organizare: în manieră fasciculară, disecând<br />
structura musculară compactă a mediei, pentru colagenul tip I, şi în manieră singulară, ca fibre izolate în matrice,<br />
fără caracterul anastomozant specific, pentru colagenul tip III. Cuantificarea semi-cantitativă nu a relevat diferenţe<br />
majore între segmentele recoltate, fapt care indică o afectare a ansamblului structural venos – de la crosă la<br />
perforante – în momentul în care boala varicoasă este evidentă clinic. Aceste date sunt în consens cu teoria<br />
patogenică modernă care include, ca secvenţă a mecanismului patogenic, modificări ale matricei extracelulare<br />
fibrilare şi nefibrilare. Introducerea în panelul de colagen analizat a colagenului tip II a fost realizată în baza<br />
structurii sale fibrilare fine, suple, izolate, existând similitudini morfologice cu fibra de elastină. Testarea<br />
imunohistochimică a colagenului tip II a fost negativă. Acest rezultat nu a surprins, prezenţa colagenului tip II în<br />
venele varicoase nefiind raportată în literatură.<br />
Rezultatele noastre completează datele din literatură, relevând prezenţa colagenului tip IV, nefibrilar, atât<br />
la nivelul intimei, cât şi al tunicii medii. Dată fiind calitatea de component major al membranelor bazale,<br />
identificarea imunohistochimică a permis evaluarea continuităţii membranei bazale care susţine endoteliul şi a<br />
modului în care celulele musculare netede sunt separate prin componenta colagenică, aspectul compact al tunicii<br />
medii fiind înlocuit de un pattern fragmentat, prezent în principal la nivelul crosei safenei şi al venei safene interne.<br />
• Profilul lamininic<br />
Revista literaturii în contextul laminină – boală varicoasă include 11 studii, patru dintre acestea fiind publicate<br />
după anul 2000 (Kirsch et al., 2000, Stacey et al., 2000, Aunapuu, Arend, 2005, Sansilvestri-Morel et al., 2007), parte<br />
dintre ele vizând însă modificările matriceale şi, implicit, ale lamininei exclusiv la nivel cutanat, ca răspuns al<br />
dermului în teritoriul venelor varicoase (Herrick et al., 1992, Stacey et al., 2000, Sansilvestri-Morel et al., 2007).<br />
Considerăm astfel rezultatele noastre ca semnificative ştiinţific pentru stadiul actual al cunoaşterii, în<br />
principal prin faptul că investigarea prezenţei lamininei a fost realizată comparativ în stadii CEAP diferite,<br />
evaluarea semicantitativă relevând diferenţe semnificative. Astfel, laminina a fost identificată predominant la<br />
nivelul intimei, la nivelul membranei bazale endoteliale, în cantitatite redusă, cu o intensitate de reacţie slabă,<br />
pentru sublotul 1 (varice simple, stadiul CEAP 2-3). Pentru sublotul 2 (varice complicate, stadiul CEAP 4-6),<br />
laminina a fost prezentă deopotrivă la nivelul intimei şi mediei, cu o foarte bună reprezentare cantitativă şi<br />
intensitate moderată/crescută. Aceste rezultate susţin implicarea matricei extracelulare amorfe, prin modificările la<br />
nivelul componentelor sale structurale (inclusiv glicoproteinele de adeziune) cu rezultat în proliferare excesivă, în<br />
cauzalitatea bolii varicoase. Creşterea cantităţii de laminină şi prezenţa sa la nivelul tunicii medii poate fi
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
interpretată ca indicator obiectiv pentru procesul de consolidare a matricei extracelulare care, odată produsă în<br />
exces, modifică histologia peretelui venos.<br />
7.4. EVALUAREA ELEMENTELOR MICROVASCULARE<br />
7.4.1. REPERE FUNDAMENTALE<br />
În descrierea structurii histologice a venelor, elementelor care asigură vascularizaţia li se acordă un spaţiu<br />
limitat, informaţia fiind redusă la menţionarea prezenţei vasa vasorum la nivelul adventicei (Lullmann-Rauch,<br />
2008) şi a rolului în asigurarea nutriţiei în teritoriul extern al peretlui. În relaţie cu patologia bolii varicoase,<br />
trecerea în revistă a datelor din literatură relevă faptul că particularităţile de morfologie microscopică a<br />
microvascularizaţiei peretelui venos au fost extrem de puţin studiate, deşi posibilele conexiuni patogenice nu sunt<br />
de neglijat (Lefebvre, Lescalie, 1996) – inclusiv prin producerea recurenţelor determinate de neovascularizaţie (van<br />
Rij et al., 2004), prin reactivitatea la deformarea elastică şi rezistenţa vasculară (Maurice et al., 1998), sau prin<br />
riscul de afectare a viabilităţii venoase în chirurgia in situ pentru grefe vasculare (Chung et al., 2007). Datele<br />
existente indică, pentru vasa vasorum din vena safenă varicoasă, creşterea numărului de vase mici localizate în<br />
adventice şi în treimea externă a mediei, la care se adaugă dezvoltarea capilarelor în relaţie strânsă cu tunica intimă<br />
(Bigel, Taccoen, 1996, Lametschwandtner et al., 2004, Kachlik et al., 2007).<br />
Cercetarea asupra structurilor vasculare a beneficiat în mod incontestabil de dezvoltarea tehnicilor<br />
imunohistochimice. În venele varicoase, intervenţia VEGF (eng. Vascular Endothelial <strong>Gr</strong>owth Factor – factorul de<br />
creştere endotelial vascular) şi a NOS (eng. Nitric Oxide Synthase – sintaza oxidului nitric), prin prisma<br />
mecanismului de activare care poate determina angiogeneză de novo, a fost investigată exclusiv prin determinări<br />
ale nivelelor plasmatice (Hollingsworth et al., 2001, Howlader et al., 2004), şi nu prin studii imunohistochimice.<br />
Pornind de la numărul limitat de cercetări asupra microvascularizaţiei peretelui venos în boala varicoasă,<br />
am urmărit studiul vasa vasorum la nivelul venei safenei interne corespondente cazurilor diagnosticate ca varice<br />
simple (stadiul CEAP 2-3) şi, respectiv, complicate (stadiul CEAP 4-6), pentru a stabili un profil morfologic şi dacă<br />
există o asociere cu severitatea, respectiv progresia leziunilor specifice bolii varicoase, inclusiv prin implicarea<br />
VEGF şi NOS.<br />
7.4.2. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI<br />
Evaluarea elementelor microvasculare, în asociere cu evaluarea VEGF şi NOS, a fost realizată sub raport<br />
calitativ, în baza pozitivităţii reacţiei imunohistochimice la anticorpii anti-CD34, anti-VEGF şi anti-NOS, urmărind<br />
distribuţia şi intensitatea reacţiilor pozitive, fără însă a aplica un scor de cuantificare.<br />
7.4.3. REZULTATE<br />
7.4.3.1. EXPRESIA ELEMENTELOR MICROVASCULARE, A VEGF <strong>ŞI</strong> NOS ÎN BOALA VARICOASĂ – VARICE<br />
SIMPLE– STADIUL CEAP 2-3<br />
Examenul calitativ a evidenţiat existenţa unei reţele vasa vasorum reduse la nivelul adventicei, cu extindere<br />
modestă în treimea externă a tunicii medii, iar la nivelul intimei s-a observat o marcare intensă a endoteliului<br />
vascular. VEGF şi NOS au fost slab pozitive la nivelul vasa vasorum. Imaginile următoare sunt elocvente pentru a<br />
demonstra profilul microvascularizaţiei, a VEGF şi NOS (fig. 138-145).<br />
7.4.3.2. EXPRESIA ELEMENTELOR MICROVASCULARE, A VEGF <strong>ŞI</strong> NOS ÎN BOALA VARICOASĂ – VARICE<br />
COMPLICATE – STADIUL CEAP 4-6<br />
Examenul calitativ a relevat existenţa unei reţele vasa vasorum puternic dezvoltate la nivelul adventicei, cu<br />
extindere marcată în interiorul tunicii medii. Intima hiperplazică a conţinut numeroase elemente vasculare. În cazul<br />
venelor complicate prin tromboză, prezenţa elementor vasculare în trombusul recanalizat a fost evidentă. VEGF a<br />
fost puternic exprimat la nivelul vasa vasorum, al capilarelor intimale şi al trombusului. NOS a fost intens pozitiv,<br />
marcând evident endoteliul. Imaginile următoare sunt elocvente pentru a susţine profilul microvascularizaţiei, a<br />
VEGF şi NOS (fig. 146-154).<br />
7.4.4. DISCUŢII<br />
Studiul modificărilor microcirculaţiei în boala varicoasă a fost axat iniţial, în anii 80, asupra teritoriului<br />
cutanat corespondent teritoriului venos afectat. Astfel, microangiopatia cutanată asociată bolii venoase cronice este<br />
caracterizată, în raport de severitatea bolii, prin creşterea numărului de capilare lărgite, dilatate, glomerulate şi<br />
ramificate, înconjurate de spaţii pericapilare largi, urmată de diminuarea numerică a componentei capilare,<br />
tromboze microvasculare, obliterare şi creştere a permeabilităţii microlimfaticelor (Burnand et al., 1981, Haselbach<br />
et al., 1986, Bollinger et al., 1995, Bollinger et al., 1997). Studii imunohistochimice au completat informaţiile<br />
morfologice microscopice, prin investigarea prezenţei activatorilor plasminogenului derivat tisular şi, respectiv,<br />
urokinazic, a inhibitorilor acestora şi a factorului von Willebrand, rezultatele relevând un dezechibru local în<br />
balanţa coagulare – fibrinoliză care contribuie la lezarea microcirculaţiei (Kolbach et al., 2004). Mai mult, s-a emis<br />
ipoteza conform căreia producţia concomitentă de VEGF în epiderm ar putea explica proliferarea capilară (Pardoe<br />
et al., 1996). Cu referire strictă la peretele venos, trebuie subliniat faptul că date extrem de detaliate asupra<br />
microcirculaţiei au fost obţinute prin studii microanatomice asupra venei safene mari, normale şi varicoase<br />
(Kachlik et al., 2003, Lametschwandtner et al., 2004, Kachlik et al., 2007, Kachlik et al., 2008).<br />
12
Fig. 141. Detaliu evidenţiind endoteliu<br />
intens pozitiv – sublot 1 (IHC, Ac-anti<br />
CD34, x 20)<br />
Fig. 149. Reacţie imunohistochimică intens<br />
pozitivă pentru CD34: reţea de vasa<br />
vasorum extinsă în mijlocul tunicii medii –<br />
sublot 2 (IHC, Ac-anti CD34, x 10)<br />
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
Fig. 143. Reacţie imunohistochimică moderat<br />
pozitivă pentru VEGF, la nivelul microvaselor<br />
dintre straturile musculare ale mediei – sublot 1<br />
(IHC, Ac-anti VEGF, x 10)<br />
Fig. 152. Detaliu pentru pozitivitatea VEGF în<br />
zona adiacentă procesului de tromboză (IHC,<br />
Ac-anti VEGF, x 10)<br />
13<br />
Fig. 145. Reacţie imunohistochimică slab<br />
pozitivă pentru NOS, la vasa vasorum<br />
din medie – sublot 1 (IHC, Ac-anti NOS, x 20)<br />
Fig. 154. Reacţie imunohistochimică intens<br />
pozitivă pentru NOS în capilare<br />
prezente în ţesutul subendotelial – sublot 2<br />
(IHC, Ac-anti NOS, x 40)<br />
Realizarea studiul imunohistochimic a fost justificată de interesul nostru în a caracteriza, prin prisma unei<br />
aprecieri calitative a localizării şi densităţii, microvascularizaţia peretelui venos corespondent venelor varicoase<br />
simple (stadiul CEAP 2-3) şi, respectiv, complicate (stadiul CEAP 4-6). Analiza preparatelor microscopice în care<br />
identificarea structurilor vasculare a fost evidentă, datorită marcajului pozitiv ale endoteliului vascular cu<br />
anticorpul anti-CD34, a relevat diferenţe nete între cele două subloturi. Comparativ cu venele varicoase simple, la<br />
nivelul venelor varicoase complicate, s-a remarcat o dezvoltare semnificativă a microvascularizaţiei la nivelul<br />
adventicei, asociată cu prezenţa de vase mici în treimea internă a mediei şi în intimă.<br />
Evaluarea nivelelor plasmatice ale VEGF (Howlader, Coleridge Smith, 2004), la pacienţii cu boală<br />
varicoasă în diferite stadii clinice CEAP, în comparaţie cu un lot martor, relevă o tendinţă spre creştere a VEGF în<br />
toate stadiile insuficienţei venoase cronice, semnificaţia statistică fiind prezentă numai în asociere cu ulceraţiile;<br />
edemul este asociat cu nivele VEGF crescute, dar nu şi simptomele subiective asociate celor obiective, în boala<br />
varicoasă, reprezentate de senzaţia de greutate, crampele şi paraesteziile. După cunoştinţele noastre, în raport cu<br />
documentarea realizată, literatura de specialitate nu include o evaluare imunohistochimică a VEGF la nivel tisular,<br />
în boala varicoasă. Consecutiv, studiul nostru aduce o contribuţie ştiinţifică importantă pentru dezvoltarea<br />
cunoaşterii în domeniu. Conform rezultatelor, au fost semnalate diferenţe marcate şi în raport cu prezenţa VEGF în<br />
cele două subloturi. Pozitivitatea redusă a reacţiei imunohistochimice, pe foarte puţine elemente vasculare din<br />
peretele venelor simple, în contrast cu pozitivitatea intensă şi extinsă a reacţiei în venele complicate indică, în mod<br />
cert, că activarea endotelială care se reflectă în proliferare vasculară se instalează în paralel cu progresia celorlaltor<br />
leziuni morfologice care caracterizează etapele evolutive ale bolii varicoase.<br />
Modificările morfologice semnificative ale microcirculaţiei în venele varicoase, inclusiv cele trombozate,<br />
aduc în discuţie implicarea lor în patogeneza bolii varicoase. Rezultatele evaluării nivelelor plasmatice VEGF şi<br />
NOS vene normale versus vene varicoase, după inducerea experimentală a stazei venoase, relevă faptul că<br />
pierderea capacităţii de sinteză pentru VEGF şi scăderea producţiei de NOS, determinate de staza venoasă, pot<br />
constitui secvenţe în mecanismul patogenic al bolii varicoase primare (Hollingsworth et al., 2001). Din această<br />
perspectivă, rezultatele noastre relevă, prin caracteristicile NOS, un status funcţionabil al endoteliului vascular şi,<br />
consecutiv, al microvascularizaţiei. Considerăm că pozitivitatea redusă a reacţiei imunohistochimice pentru NOS în<br />
vasa vasorum şi, respectiv, intensă la nivel capilar sunt argumente în favoarea ideei că reactivitatea vasa vasorum<br />
se datorează hipoxiei specifice bolii varicoase, fiind un efect, şi nu o cauză patogenică.<br />
7.5. EVALUAREA METALOPROTEINAZELOR <strong>ŞI</strong> A INHIBITORILOR SPECIFICI<br />
7.5.1. REPERE FUNDAMENTALE<br />
La nivelul venelor varicoase apare un dezechilibru major în sinteza şi degradarea componentelor<br />
structurale ale matricei extracelulare a ţesutului conjunctiv prezent la acest nivel, în cele trei tunici. Pierderea<br />
tonusului venos, urmată de dilatare şi elongare venoasă, poate fi datorată acestui dezechilibru. În procesele de<br />
sinteză şi degradare a proteinelor matriciale, metaloproteinazele matriceale (MMPs) şi inhibitorii tisulari ai
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
metaloproteinazelor matriciale (TIMPs) au un rol important (Travers et al., 1996, Venturi et al., 1996, Kockx et al.,<br />
1997, Michiels et al., 1997, Verbeuren et al., 1998, Badier-Commander et al., 2000, Gillespie et al., 2002). Trecerea<br />
în revistă a literaturii relevă scăderea MMP-2 şi creşterea TIMP-1 în venele varicoase, comparativ cu venele<br />
normale (Porto et al., 1995), nivele scăzure de MMP-1 şi MMP-13 în venele localizate inferior, comparativ cu cele<br />
localizate superior (Gillespie et al., 2002), rezultate contradictorii referitoare la prezenţa şi nivelul TIMP-1, TIMP-2<br />
(Johnson et al., 2001), precum şi diferenţe legate de nivelul de exprimare şi localizarea MMPs şi TIMPs în teritorii<br />
venoase diferite (Woodside et al., 2003)<br />
În acest context, obiectivul urmărit a fost reprezentat de investigarea expresiei MMPs şi TIMPs în venele<br />
varicoase corespondente stadiilor CEAP 2-3 (varice simple) şi CEAP 4-6 (varice complicate), urmărindu-se profilul<br />
distribuţiei markerilor, în raport cu morfologia asociată stadiului clinic.<br />
7.5.2. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI<br />
Pentru evaluarea expresiei MMP-2, MMP-9 şi TIMP-1 am utilizat un scor semicantitativ bazat pe<br />
intensitatea reacţiei imunohistochimice, adaptat după scoruri utilizate în patologia tumorală în cuantificarea MMPs<br />
şi TIMPs (Zucker, Vacirca, 2004) şi a altor biomarkeri (Zlobec et al., 2007b). Scala de gradare a avut următoare<br />
semnificaţie: + pentru intensitate scăzută, ++ pentru intensitate moderată, +++ pentru intensitate crescută. Cazurile<br />
pentru care reacţia imunohistochimică a fost absentă (în condiţiile existenţei unui control pozitiv) au fost<br />
considerate negative.<br />
7.5.3. REZULTATE<br />
7.5.3.1. EXPRESIA MMP-2, MMP-9, TIMP-1 ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE SIMPLE – STADIUL CEAP 2-3<br />
Reacţiile pentru MMP-2 (tabel 50) au fost negative în 6 din cele 8 cazuri investigate, la nivelul tuturor<br />
segmentelor recoltate. Pozitivitate de intensitate scăzută a fost prezentă doar în două cazuri, în manieră discontinuă<br />
la nivel endotelial şi dispersat, la nivelul vasa vasorum adventiceale. Reacţiile pentru MMP-9 şi inhibitorul<br />
specific, TIMP-1 au fost prezente, cu intensitate moderată şi crescută, în toate cele 8 cazuri (tabel 50). Din punctul<br />
de vedere al localizării, reacţiile au fost identificate la nivelul endoteliului şi ţesutului subendotelial, în jurul<br />
celulelor musculare din tunica medie şi adventiceal, în vasa vasorum şi celulele conjunctive adiacente. Nu au fost<br />
observate diferenţe majore de intensitate şi localizare între crosă, vena safenă internă, pachetul varicos gambier şi<br />
venele perforante. Imaginile din figurile 155-159 ilustrează profilul MMP-2, MMP-9 şi TIMP-1 pentru sublotul 1.<br />
Fig. 155. Reacţie imunohistochimică slab<br />
pozitivă pentru MMP-2 la nivel endotelial –<br />
sublot 1 (IHC, Ac-anti MMP-2, x 40)<br />
Fig. 156. Reacţie imunohistochimică foarte<br />
slab pozitivă şi discontinuă pentru MMP-9<br />
la nivel endotelial – sublot 1 (IHC, Ac-anti<br />
MMP-9, x 40)<br />
14<br />
Fig. 157. Reacţie imunohistochimică slab<br />
pozitivă pentru TIMP-1 în capilarele<br />
prezente intramural în număr foarte mic –<br />
sublot 1 (IHC, Ac-anti TIMP-1, x 10)<br />
7.5.3.2. EXPRESIA MMP-2, MMP-9, TIMP-1 ÎN BOALA VARICOASĂ – VARICE COMPLICATE – STADIUL CEAP 4-6<br />
Reacţiile pentru MMP-2 au fost negative în 3 din cele 5 cazuri investigate, la nivelul tuturor segmentelor<br />
recoltate (tabel 51). Pozitivitate de intensitate scăzută şi medie a fost prezentă în celelalte două cazuri, în capilarele<br />
de neoformaţie dezvoltate în intimă şi în ţesutul conjunctiv al mediei, şi la nivelul vasa vasorum adventiceale.<br />
Reacţiile pentru MMP-9 şi inhibitorul specific, TIMP-1 au fost prezente în toate cele 5 cazuri, intensitatea fiind<br />
variabilă (tabel 51). MMP-9 a fost pozitiv la nivel endotelial, discotinuu, intensitatea de colorare fiind scăzută,<br />
precum şi la nivelul capilarelor de neoformaţie intramurale şi în adventice, intensitatea de colorare fiind medie.<br />
TIMP-1 a fost absent la nivel endotelial şi prezent, cu intensitate crescută, în capilarele de neoformaţie intramurale,<br />
vasa vasorum şi celulele adventiceale. Nu au fost observate diferenţe majore de intensitate şi localizare între crosă,<br />
vena safenă internă, pachetul varicos gambier şi venele perforante. Imaginile din figurile 160-167 ilustrează profilul<br />
MMP-2, MMP-9 şi TIMP-1 pentru sublotul 2.<br />
7.5.4. DISCUŢII<br />
Perturbarea echilibrului între activitatea MMPs şi TIMPs a fost propusă ca mecanism pentru acumularea<br />
matricei extracelulare, în venele varicoase (Woodside et al., 2003). Trecerea în revistă a literaturii de specialitate,<br />
axată pe studiul MMPs şi TIMPs în boala varicoasă, a permis o evaluare a rezultatelor obţinute de grupuri de<br />
cercetători interesaţi de acest subiect. Trebuie menţionat faptul că există foarte puţine studii axate pe investigaţii<br />
imunohistochimice, iar rezultatele sunt controversate. Sunt raportate nivele MMP-1 şi TIMP-1 crescute, şi nivele<br />
MMP-2 scăzute la nivelul joncţiunii safeno-femurale în comparaţie cu venele control (Parra et al, 1998). Sunt<br />
demonstrate diferenţe regionale în componentele matricei extracelulare şi în activitatea MMP-1 şi MMP-13, între<br />
segmentele proximale şi distale ale venelor varicoase (Shireman et al., 1996, Gillespie et al., 2002). Alte diferenţe
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
au fost obţinute între distribuţia MMP-1 şi MMP-9 (Woodside et al, 2003), venele normale şi cele varicoase<br />
exprimând ambele MMPs la nivelul celulelor endoteliale, celulelor musculare netede şi fibroblastelor, dar reacţia<br />
endotelială la nivelul microvaselor adventiceale, în venele normale, fiind mai puternică, sub raport calitativ şi<br />
cantitativ. Studii asupra stadiilor avansate ale bolii varicoase, complicate cu ulcer, relevă că MMP-2, MMP-9 şi<br />
TIMP-1 au avut nivele crescute în exudatul pacienţilor cu ulcer venos activ faţă de cei cu plăgi traumatice<br />
(Wysocki et al, 1993, Bullen et al 1995, Weckroth et al, 1996).<br />
Pentru ambele loturi, rezultatele noastre au relevat diferenţe evidente între cele două MMPs studiate. Pe de<br />
o parte, am evidenţiat o prezenţă inconstantă, la un număr mic din cazurile analizate, a MMP-2. Pe de altă parte,<br />
MMP-9 a fost exprimat în toate cazurile, în paralel cu TIMP-1. Considerăm astfel că expresia MMP2 nu<br />
caracterizează procesul de remodelare matriceală la nivelul peretelui venos afectat. În schimb, implicarea MMP-9<br />
este certă, intervenţia sa fiind contrabalansată de cea a inhibitorului specific, TIMP-1, mult mai puternic exprimat<br />
sub raportul intensităţii de colorare imunohistochimică. Din acest punct de vedere, distribuţia MMP-9 şi TIMP-1<br />
aduce informaţii importante. Datele noastre au indicat prezenţa MMP-9 la nivel endotelial, nivel la care TIMP-1 a<br />
fost absent. Această constatare susţine rolul lezării endoteliale, o posibilă explicaţie fiind faptul că sinteza MMPs<br />
de către celulele endoteliale nu este oprită de inhibitorul specific. În tunica medie, MMP-9 a fost evidenţiat prioritar<br />
în jurul celulelor musculare, iar TIMP-1, în capilarele de neoformaţie. Localizarea diferită sugerează implicarea în<br />
paralel a celor două populaţii celulare, producerea de MMPs de către celulele musculare fiind controlată prin<br />
producerea de TIMP-1 de către celulele endoteliale. La nivel adventiceal, expresia MMP-9 şi TIMP-1 a fost<br />
prezentă atât la nivelul vasa vasorum, cât şi în celulele de tip fibroblastic. Consecutiv, apreciem că la nivelul<br />
adventicei modificările matriceale sunt mai puţin influenţate de acţiunea MMPs şi TIMPs, între care există încă un<br />
echilibru. Totuşi, urmare a acţiunii MMPs, ţesutul conjunctiv adventiceal va evolua spre transformare de tip fibros.<br />
Din compararea rezultatelor obţinute pentru lotul 1 şi, respectiv, lotul 2, a rezultat absenţa unor diferenţe<br />
semnificative între profilul MMPs şi TIMPs, pentru varicele simple şi varicele complicate. Este astfel susţinută<br />
ideea că modificările morfologice (la nivel tisular, celular şi molecular) nu pot fi individualizate şi corelate precis<br />
cu stadiul clinic al bolii (Saito et al., 2001).<br />
În literatura de specialitate există puţine studii comparative pe regiuni diferite ale sistemului venos al<br />
membrului inferior cu insuficienţă venoasă (Shireman et al., 1996), cu rezultate care raportează nivele scăzute ale<br />
MMPs în regiunea inferioară (proximală), faţă de regiunea superioară (distală). Spre deosebire de aceste rezultate,<br />
datele noastre susţin absenţa unor diferenţe majore în profilului MMPs şi TIMPs între crosă, vena safenă internă,<br />
pachetul varicos gambier şi venele perforante. Modificările similare în profilul MMPs şi TIMPs, în diferite<br />
segmente, indică afectarea completă a sistemului venos, care poate fi corelată cu predispoziţia genetică. În pofida<br />
diferenţelor existente între diferitele studii, este cert că alterările în producţia MMPs şi TIMPs pot modula, în<br />
stadiile precoce de insuficienţă venoasă, remodelarea tisulară şi determină, în stadiile avansate, apariţia fibrozei<br />
tisulare.<br />
7.6. EVALUAREA APOPTOZEI<br />
7.6.1. REPERE FUNDAMENTALE<br />
Apoptoza, definită ca moartea programată a celulelor, constituie o secvenţă normală în dezvoltare,<br />
morfogeneză şi homeostazia tisulară. În condiţiile unor deficienţe de reglare, care determină perturbarea<br />
mecanismului de reparare al ADN-ului şi modificarea ciclului celular, apoptoza contribuie la instalarea unor<br />
condiţii patologice. Apoptoza este un fenomen multifactorial, produs prin activarea specifică a unei familii de<br />
proteinaze cisteinice intracelulare numite caspaze (Alnemri et al., 1996).<br />
Apoptoza influenţează dezvoltarea şi remodelarea peretelui vascular, prin reglarea cantitativă şi calitativă a<br />
componentelor tisulare şi, consecutiv, a histoarhitecturii caracteristice (Fisher et al., 2000, Haunstetter, Izumo,<br />
1998, Walsh et al., 2000). Procesul are implicaţii nu numai fiziologice (Walsh et al., 2000, Bennett, 1999, Intengan,<br />
Schiffrin, 2001), dar şi patologice – fiind o trăsătură a remodelării peretelui vascular în ateroscleroză, boli<br />
inflamatorii sau anevrisme (Lopez-Candel et al., 1997, Walsh et al., 2000, Bennett, 1999). Dovezi recente<br />
sugerează că defectele peretelui în venele varicoase, prin înlocuirea treptată a componentelor normale, este asociată<br />
cu dezechibrul procesului apoptotic (Ascher et al., 2000, Ascher et al., 2001, Bujan et al., 2000, Urbanek et al.,<br />
2004, Ducasse et al., 2005). Apoptoza a fost analizată la nivelul populaţiilor celulare endoteliale, inflamatorii şi<br />
musculare netede, datele obţinute indicând că modificările celulelor musculare netede, în context apoptotic, sunt<br />
importante pentru arhitectura şi tonusul venos.<br />
Trecerea în revistă a literaturii dedicate acestui subiect relevă însă faptul că sunt puţine date despre rolul morţii<br />
celulare programate în leziunile peretelui venei varicoase. Pornind de la datele existente în literatură, obiectivul urmărit a<br />
fost reprezentat de investigarea activităţii apoptotice la nivelul celulelor musculare netede din tunica medie a peretelui<br />
venos. Trebuie menţionat faptul că am considerat relevantă exclusiv analiza profilului pro-apoptotic, în condiţiile în care<br />
fluxul principal de publicaţii nu raportează diferenţe între profilul anti-apoptotic al venelor normale şi al celor varicoase.<br />
7.6.2. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI<br />
Pentru evaluarea expresiei Bax am utilizat un scor semicantitativ, adaptat după scoruri operaţionale în<br />
literatura dedicată patologiei tumorale, pentru analiza valorii prognostice a unor biomarkeri (Zlobec et al., 2007b).<br />
15
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
În raport de intensitatea de colorare imunohistochimică, cazurile au fost încadrate în 3 clase: intensitate<br />
slabă (+), intensitate moderată (++) şi intensitate puternică (+++). Cazurile pentru care reacţia imunohistochimică a<br />
fost absentă (în condiţiile existenţei unui control pozitiv) au fost considerate negative.<br />
7.6.3. REZULTATE<br />
7.6.3.1. EXPRESIA BAX ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE SIMPLE – STADIUL CEAP 2-3<br />
Reacţiile imunohistochimice pentru Bax (tabelul 52) au fost pozitive, la nivelul tuturor segmentelor<br />
recoltate, în 7 din cele 8 cazuri investigate. Un caz a prezentat reacţie imunohistochimice Bax negativă. Intensitatea<br />
reacţiei, apreciată pentru celulele musculare din tunica medie, a fost crescută în 3 cazuri, şi moderată în 4 cazuri.<br />
7.6.3.2. EXPRESIA BAX ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE COMPLICATE – STADIUL CEAP 4-6<br />
Reacţiile imunohistochimice pentru Bax (tabelul 53) au fost negative, la nivelul tuturor segmentelor<br />
recoltate, în 4 din cele 5 cazuri investigate. Un singur caz a prezentat reacţie imunohistochimică pozitivă, de<br />
intensitate scăzută, la nivelul celulelor musculare din tunica medie. În cazurile în care, la nivelul crosei lumenul a<br />
fost obstruat, trombusul intraluminal a relevat o expresie Bax intens pozitivă (fig. 168-169).<br />
Fig. 168. Reacţie imunohistochimică intens pozitivă pentru Bax la nivelul<br />
trombusului intraluminal, moderat pozitivă pentru Bax în medie şi adventice<br />
(IHC, Ac-anti Bax, x 2,5)<br />
16<br />
Fig. 169. Detaliu pentru pozitivitatea Bax la nivelul<br />
trombusului şi mediei (IHC, Ac-anti Bax, x 10)<br />
7.6.4. DISCUŢII<br />
Dezechibrul procesului apoptotic este considerat, la ora actuală, ca posibil mecanism patogenic pentru<br />
diferite leziuni vasculare. Date recente arată că apoptoza este invers corelată cu restenozarea legată de hiperplazia<br />
intimală arterială după angioplastie şi grefă venoasă (Durand et al., 2002, Mayr et al., 2002). Investigaţiile asupra<br />
activităţii apoptozice în leziunile aterosclerotice avansate, în fragmente ale arterelor carotidiene, coronariene şi<br />
renale, relevă apoptoză crescută, pe calea intrinsecă, incluzând Bax (Saxena et al. 2002).<br />
Rezultatele raportate în literatură, vizând relaţia apoptoză – boală varicoasă, sunt puţine şi controversate.<br />
Prezenţa expresiei Bax scăzute, în paralel cu expresia Bcl-2/Bcl-x crescută şi, consecutiv, numărul mai mic de<br />
celule apoptotice în tunica medie a venelor varicoase, comparativ cu venele normale, pledează pentru ipoteza<br />
conform căreia procesul morţii programate a celulelor este inhibat în venele varicoase (Ascher et al., 2000). Alte<br />
date relevă fie o activitate apoptotică intensă în media venelor varicoase (Bujan et al., 2000), posibil limitată la<br />
segmentele distale, fără afectarea segmentelor proximale (Urbanek et al., 2004), fie o scădere statistic semnificativă<br />
a indexului apoptotic cuantificat în stratul adventiceal al venelor varicoase, comparativ cu venele de control, şi<br />
absenţa diferenţelor la nivelul mediei (Ascher et al., 2001). Neconcordanţele ar putea fi datorate sensibilităţii<br />
anticorpilor folosiţi pentru investigaţia imunohistochimică.<br />
Rezultatele personale se individualizează, în contextul datelor din literatură, prin două elemente distincte,<br />
legate de analiza profilului pro-apoptotic, în segmente diferite ale traiectului venos afectat şi, respectiv, în grupuri<br />
încadrate în categorii diferite de diagnostic, în conformitate cu clasificarea CEAP (varice simple versus varice<br />
complicate). Atrage atenţia faptul că activitatea pro-apoptotică, în condiţiile în care a fost identificată, a avut un<br />
caracter constant la nivelul crosei, al venei safene, al pachetului varicos şi al venelor perforante. Uniformitatea<br />
reacţiei imunohistochimice pentru Bax sugerează că modificările tisulare, celulare şi moleculare apar şi se dezvoltă<br />
concomitent de-a lungul unui traiect venos, fără a fi influenţate – în mod pozitiv sau negativ, cu reflectare în gradul<br />
lor de severitate – de factorul anatomic şi, implicit, de încărcarea hemodinamică. Această observaţie susţine<br />
implicarea factorului genetic în patogenia bolii varicoase. Mai mult, sub raport clinic, constatările noastre impun ca<br />
abordarea terapeutică să aibă în vedere întotdeauna sistemul venos ca ansamblu, o leziune decelabilă<br />
clinic/ecografic într-un anumit teritoriu semnalând că procesul patogenic, odată declanşat, acţionează şi în teritorii<br />
care nu au, încă, manifestări clinice evidente.<br />
Compararea profilului Bax în varicele simple (în ansamblu prezent, cu intensitate crescută şi medie) şi,<br />
respectiv, complicate (în ansamblu absent) a evidenţiat faptul că activitatea pro-apoptotică scade odată cu progresia<br />
bolii, echilibrul balanţei apoptozei fiind perturbat. Consecutiv, aceste rezultate susţin ipoteza inhibării procesului de<br />
moarte celulară programată în boala varicoasă, ca verigă de legătură spre transformarea de tip fibros.<br />
7.7. EVALUAREA POPULAŢIEI MASTOCITARE<br />
7.7.1. REPERE FUNDAMENTALE<br />
Conform datelor recente din literatura de specialitate, se consideră că, prin eliberarea de substanţe<br />
vasoactive, mastocitul poate avea un rol important în iniţierea răspunsului inflamator implicat în patogenia bolii
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
varicoase (Yamada et al., 1996, Sayer, Smith, 2004, Pascual et al., 2007). Triptaza este o serin-protează cu<br />
activitate biologică direcţionată în general împotriva proteinelor de coagulare (Craig, Schwarty, 1989), capabilă să<br />
fragmenteze diferite componente matriceale ca elastina, colagenul IV, fibronectina şi proteoglicanii extracelulari, şi<br />
să activeze formele latente de colagenază – cu rezultat în modificarea arhitecturii peretelui venos. Alţi mediatori<br />
(chimaza, elastaza, hidrolaza, enzimele oxidative, factorii chemotactici) pot contribui la maturarea sau activarea TGFbeta<br />
1 (eng. Transforming <strong>Gr</strong>owth Factor – factorul transformant al creşterii), care poate menţine sau potenţa, prin<br />
nivelul său crescut, lezarea tisulară (Taipale et al., 1995, Pascual et al., 2007).<br />
Deşi aprecierile calitative susţin o creştere a numărului de mastocite în venele varicoase, comparativ cu<br />
venele de control, normale (Yamada et al., 1996, Haviarová et al., 2002, Sayer, Smith, 2004, Pascual et al., 2007),<br />
nu toate diferenţele înregistrate prin analiză cantitativă sunt semnificative statistic (Haviarová et al., 2002), şi nu<br />
este încă clar stabilit care sunt factorii ce stimulează localizarea mastocitelor în peretele venos (Sayer, Smith,<br />
2004). Consecutiv, studiul mastocitelor în boala varicoasă, în vederea stabilirii de corelaţii patogenice directe,<br />
constituie un subiect deschis cercetării.<br />
Din acest motiv, obiectivul urmărit a fost reprezentat investigarea expresiei mastocitare la nivelul venei<br />
safene interne corespondente varicelor simple (stadiul CEAP 2-3) şi, respectiv, complicate (stadiul CEAP 4-6), pentru<br />
a stabili dacă există o corespondenţă între prezenţa acestor celule şi severitatea, respectiv progresia leziunilor specifice<br />
bolii varicoase.<br />
7.7.2. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI<br />
Evaluarea calitativă a urmărit stabilirea localizării preferenţiale a mastocitelor, în peretele venelor<br />
varicoase. Evaluarea cantitativă a fost realizată prin numărarea celulelor pozitive imunohistochimic pentru<br />
anticorpul anti-triptază, prezente în peretele venelor varicoase, preluând şi adaptând o metodologie de cuantificare<br />
utilizată în analiza biomarkerilor prognostici specifici patologiei tumorale (Zlobec et al., 2007a). Valoarea medie<br />
raportată pentru fiecare caz a rezultat ca urmare a cuantificării celulelor prezente în 5 câmpuri microscopice cu<br />
densitate celulară crescută, la magnificaţie x 200.<br />
7.7.3. REZULTATE<br />
7.7.3.1. EXPRESIA POPULAŢIEI MASTOCITARE ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE SIMPLE – STADIUL CEAP 2-3<br />
Examenul calitativ a evidenţiat prezenţa mastocitelor în mod preferenţial la nivelul adventicei, localizarea<br />
difuză alternând cu localizarea concentrată în jurul vasa vasorum adventiceale (fig. 170-172). Examenul cantitativ a<br />
relevat, pe ansamblul celor 8 cazuri analizate, o valoare medie de 23,52 mastocite (tabelul 53).<br />
7.7.3.2. EXPRESIA POPULAŢIEI MASTOCITARE ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE COMPLICATE – STADIUL CEAP 4-6<br />
Examenul calitativ a evidenţiat prezenţa mastocitelor predominant la nivelul adventicei, existând însă un<br />
număr important de mastocite şi la nivelul tunicii medii. Sub raportul distribuţiei, mastocitele au fost identificate în<br />
principal în relaţie cu capilare din tunica medie şi, respectiv, vasa vasorum adventiceale. Examenul cantitativ a<br />
relevat, pe ansamblul celor 5 cazuri analizate, o valoare medie de 43,24 mastocite (tabelul 54).<br />
7.7.3.3. EXPRESIA POPULAŢIEI MASTOCITARE ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE SIMPLE VERSUS VARICE<br />
COMPLICATE – STADIUL CEAP 2-3 VERSUS STADIUL CEAP 4-6<br />
Analiza statistică a numărului mediu de mastocite, comparativ sublot 1 versus sublot 2, a relevat existenţa<br />
unei diferenţe semnificative statistic (p < 0,0001).<br />
Fig. 174. Reacţie imunohistochimică intens pozitivă pentru triptaza Fig. 175. Detaliu pentru pozitivitatea şi distribuţia mastocitelor<br />
mastocitară, evidenţiind prezenţa mastocitelor în adventice şi medie<br />
(IHC, Ac-anti triptază, x 20)<br />
(IHC, Ac-anti triptază, x 2,5)<br />
7.7.4. DISCUŢII<br />
Pentru boala varicoasă, mastocitele au fost studiate iniţial, în anii 90, în contextul leziunilor tegumentare<br />
din cadrul insuficienţei venoase cronice. Sub raport patogenic, hipertensiunea venoasă produce extravazarea de<br />
fibrinogen şi de hematii, care acţionează ca mediatori puternici ai inflamaţiei, determinând prin feedback pozitiv<br />
expresia moleculelor de adeziune şi expresia unor factori de creştere (PDGF, VEGF), care determină activarea<br />
leucocitară. Fibroblastele, monocitele şi mastocitele sunt recrutate la nivelul zonelor tegumentare corespondente<br />
teritoriilor varicoase, reglând reparaţia şi remodelarea tisulară (Pappas et al., 1997). La nivelul tegumentelor<br />
gambei şi coapsei din teritoriile varicoase, datele publicate indică o populaţie celulară mastocitară de două până la<br />
patru ori mai mare la pacienţii cu varice stadiul CEAP 4 şi 5, comparativ cu subiecţii control (Shields et al., 1994,<br />
17
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
Pappas et al, 1997). Ulterior, cercetările au fost orientate asupra mastocitelor prezente în venele varicoase, în scopul<br />
de a stabili care sunt factorii care stimulează localizarea lor în peretele vascular, şi care este mecanismul prin care<br />
sunt implicate în dezvoltarea leziunilor histologice.<br />
Deşi întrebările asupra mecanismului patogen care determină insuficienţa venoasă sunt încă fără răspuns,<br />
câteva studii calitative şi cantitative au confirmat că trăsăturile histologice ale incompetenţei valvulare sunt în mod<br />
clar asociate cu prezenţa mastocitelor în peretele venelor varicoase. Conform datelor din literatură (Prokopová et<br />
al., 1998, Haviarová et al., 2002, Sayer, Smith, 2004, Pascual et al., 2007), mastocitele sunt localizate predominant<br />
în adventice, frecvent în vecinătatea vasa vasorum, rar fiind prezente în partea externă a tunicii medii. Există<br />
diferenţe (semnificative sau nu, din punct de vedere statistic) între numărul mastocitelor din venele varicoase şi<br />
venele normale, identificate deopotrivă la persoane tinere şi la vârstnici. Rezultatele relativ diferite în raport cu<br />
semnificaţia statistică a diferenţelor numerice înregistrate pot fi explicate prin detaliile legate de eşantionare –<br />
trebuie menţionat faptul că se recomandă ca numărul de eşantioane (fragmente) venoase şi numărul de secţiuni<br />
pentru fiecare eşantion trebuie să fie mare (Haviarová et al., 2002), pentru a putea cuantifica numărul real al<br />
mastocitelor prezente şi, consecutiv, a putea demonstra implicarea lor în patogenie.<br />
Rezultatele noastre susţin rolul mastocitelor în iniţierea răspunsului inflamator, prin eliberarea de substanţe<br />
vasoactive. În mod concret, deşi modalitatea de cuantificare a fost diferită, valorile obţinute sunt relativ<br />
comparabile cu raportările din literatură (valoare medie 9 mastocite/5,5 mm 2 în venele normale, 24 mastocite/5,5<br />
mm 2 în venele varicoase (Sayer, Smith, 2004), densitatea medie 0,86 mastocite/mm 2 în venele varicoase, 1,23<br />
mastocite/mm 2 în venele normale (Haviarová et al., 2002)). Considerăm că demonstrarea diferenţelor cantitative<br />
semnificative statistic, între stadiile evolutive ale bolii varicoase, constituie un element de originalitate al studiului<br />
doctoral, cu valoare la dezvoltarea stadiului actual al cunoaşterii pentru insuficienţa venoasă cronică.<br />
Identificarea populaţiei mastocitare, extrem de bine reprezentată în venele varicoase, permite formularea<br />
unei ipoteze patogenice pentru boala varicoasă, în contextul proprietăţilor funcţionale ale acestor celule, datorate<br />
conţinutului granular – care ar putea dezvolta capacitate autoimună, explicând astfel predispoziţie individuală a<br />
unor subiecţi pentru boala varicoasă.<br />
7.8. EVALUAREA POPULAŢIEI LIMFOCITARE<br />
7.8.1. REPERE FUNDAMENTALE<br />
În fiziopatologia încă neelucidată a bolii venoase cronice, prezenţa constantă a modificărilor inflamatorii a<br />
determinat concentrarea specialiştilor interesaţi de acest subiect asupra investigării procesului inflamator, ca şi<br />
cauză patogenică majoră (Weninger et al., 2002, Bergan, 2007, Zamboni et al., 2008, Sprague, Khalil, 2009).<br />
Raportările din literatură vizează rolul leucocitelor, în principal a monocitelor – macrofagelor (Saharay et al., 1997,<br />
Takase et al., 1999, Chester et al., 1998, Ono et al., 1998, Tran, Meissner, 2002) care, prin capacitatea lor de a<br />
produce enzime proteolitice, radicali liberi, factori de creştere şi citokine, pot fi responsabile de remodelarea<br />
tisulară a peretelui venos şi a valvelor, cu rezultat în distrugerea peretelui şi incompetenţă valvulară (Langer,<br />
Chavakis, 2009).<br />
Deşi infiltratul inflamator conţine şi numeroase limfocite, despre evaluarea lor morfologică (ca şi subtipuri<br />
celulare) şi în relaţie cu funcţionalitatea acestora, în boala varicoasă, există extrem de puţine date în fluxul principal<br />
de publicaţii (Sayer, Smith, 2004). Recent, rezultatele unui studiu bazat pe determinarea subtipurilor limfocitare B<br />
şi T prin flow-citometrie au condus la ipoteza conform căreia modificările cantitative limfocitare asociate cu boala<br />
varicoasă sunt expresia memoriei imunologice a limfocitelor (Ojdana et al., 2009).<br />
Pornind de la absenţa datelor din literatură referitoare la populaţiile limfocitare prezente în venele<br />
varicoase, obiectivul urmărit a fost reprezentat de investigarea limfocitelor T4 helper şi T8 supresor la nivelul<br />
venei safene interne corespondente varicelor simple (stadiul CEAP 2-3) şi, respectiv, complicate (stadiul CEAP 4-<br />
6), pentru a stabili un profil al expresiei subtipurilor limfocitare T şi dacă există o corespondenţă între acestea şi<br />
severitatea, respectiv progresia leziunilor specifice bolii varicoase.<br />
7.8.2. PARTICULARITĂŢI ALE METODEI<br />
Evaluarea calitativă a urmărit stabilirea localizării preferenţiale a limfocitelor T4 şi T8, în peretele venelor<br />
varicoase. Evaluarea cantitativă a fost realizată prin numărarea celulelor pozitive imunohistochimic pentru anticorpii<br />
anti-CD4, respectiv anti-CD8, prezente în peretele venelor varicoase, preluând şi adaptând o metodologie de<br />
cuantificare utilizată în analiza biomarkerilor prognostici specifici patologiei tumorale, inclusiv limfocitelor T asociate<br />
proliferărilor tumorale (Zlobec et al., 2007a). Valoarea medie raportată pentru fiecare caz a rezultat ca urmare a<br />
cuantificării celulelor marcate imunohistochimic prezente în 5 câmpuri microscopice, la magnificaţie x 200.<br />
7.8.3. REZULTATE<br />
7.8.3.1. EXPRESIA POPULAŢIEI LIMFOCITARE T ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE SIMPLE – STADIUL CEAP 2-3<br />
Examenul calitativ a evidenţiat prezenţa limfocitelor T4 şi T8 la nivelul tunicii medii, cu localizare difuză în<br />
interiorul componentei colagenice care separă celulele musculare netede. Examenul cantitativ a relevat, pe ansamblul<br />
celor 8 cazuri analizate, o valoare medie de 25,67 limfocite T4, şi 10,60 limfocite T8 (tabel 55). Analiza statistică a<br />
demonstrat diferenţe semnificative statistice între limfocitele T4 şi, respectiv, T8, în cadrul sublotului 1 (fig. 177).<br />
18
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
7.8.3.2. EXPRESIA POPULAŢIEI LIMFOCITARE ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE COMPLICATE – STADIUL CEAP 4-6<br />
Examenul calitativ a evidenţiat aceeaşi distribuţie a limfocitelor ca şi varicele simple, şi anume dispersate<br />
în interiorul cadrului colagenic prezent în tunica medie. Examenul cantitativ a relevat, pe ansamblul celor 5 cazuri<br />
analizate, o valoare medie de 42,80 limfocite T4 şi, respectiv, 18,56 limfocite T8 (tabelul 56). Analiza statistică a<br />
demonstrat diferenţe semnificative statistice între limfocitele T4 şi, respectiv, T8, în cadrul sublotului 2 (fig. 178).<br />
7.8.3.3. EXPRESIA POPULAŢIEI LIMFOCITARE ÎN BOALA VARICOASĂ - VARICE SIMPLE VERSUS VARICE<br />
COMPLICATE – STADIUL CEAP 2-3 VERSUS STADIUL CEAP 4-6<br />
Analiza statistică a numărului mediu de limfocite T4, comparativ sublot 1 versus sublot 2, a relevat<br />
prezenţa de diferenţe semnificative statistic (p = 0,0005) (fig. 179). Analiza statistică a numărului mediu de<br />
limfocite T8, comparativ sublot 1 versus sublot 2, a relevat prezenţa de diferenţe semnificative statistic (p = 0,03)<br />
(fig. 180). Imaginile următoare ilustrează prezenţa limfocitelor T4 şi, respectiv, T8, la nivelul peretelui varicos (fig.<br />
180-183).<br />
Fig. 180. Reacţie imunohistochimică intens pozitivă evidenţiind<br />
prezenţa limfocitelor T4 (IHC, Ac-CD4, x 20)<br />
19<br />
Fig. 181. Reacţie imunohistochimică intens pozitivă<br />
evidenţiind prezenţa limfocitelor T8 (IHC, Ac-CD8, x 20)<br />
7.8.4. DISCUŢII<br />
Teoria inflamatorie câştigă teren în patogenia insuficienţei venoase cronice (Schmid-Schonbein et al.,<br />
2001, Nicolaides, 2005, Bergan, 2007), inclusiv prin demonstrarea prezenţei şi intervenţiei limfocitelor T în<br />
procesele inflamatorii care apar în timpul dezvoltării bolii ulceroase (Nicolaides, 2005, Ojdana et al., 2009),<br />
activarea lor fiind rezultatul creşterii cronice a presiunii sângelui venos (Bergan et al., 2006, Bergan, 2007).<br />
Subpopulaţiile limfocitare T au funcţii importante în generarea şi derularea răspunsului imun-inflamator,<br />
limfocitele T4, CD4+, numite generic “helper” iniţiind sau stimulând producţia de citokine specifice, iar limfocitele<br />
T8, CD8+, numite generic “citotoxice”, intervenind în activare, supresie şi citotoxicitate (Lanzavecchia, Sallusto,<br />
2000, Romagnani, 2000, Romagnani, 2006, Zhu, Paul, 2008). Trebuie însă subliniat faptul că numărul studiilor<br />
dedicate acestui subiect este foarte mic, iar metodologia de investigare se bazează în principal pe analiza<br />
populaţiilor celulare în sângele periferic şi în sângele recoltat din venele varicoase (Schmid-Schonbein et al., 2001,<br />
Ojdana et al., 2009), existând, după cunoştinţa noastră, un singur raport care include date obţinute printr-o analiză<br />
morfologică imunohistochimică (Sayer, Smith, 2004). Rezultatele pot fi interpretate în contextul răspunsului imuninflamator<br />
existent la nivelul întregului organism, şi care include şi afectarea teritoriul venos. Astfel, un studiu<br />
foarte recent (Ojdana et al., 2009) demonstrează că în sângele periferic nu există o diferenţă semnificativă statistic<br />
între pacienţii cu boală varicoasă şi martor, în ceea ce priveşte numărul total de limfocite T CD4+ şi CD8+, precum<br />
şi subseturile particulare de limfocite T cu memorie. În timp, se constată o diferenţa semnificativă statistic între<br />
sângele periferic şi sângele obţinut de la nivelul venelor varicoase, pentru toate seturile şi subseturile de celule T<br />
menţionate anterior. Aceste rezultate au importante implicaţii în elucidarea statusului inflamator local şi deschid<br />
perspectiva implicării celulelor T cu memorie imunologică în patogeneza bolii venoase cronice. Aceste date se<br />
corelează cu două studii axate asupra morfologiei infiltratului inflamator (preponderent limfocitar) din valvulele<br />
venoase şi din peretele venos (Schmid-Schonbein et al., 2001, Sayer, Smith, 2004).<br />
Studiul nostru se individualizează în cadrul cercetărilor asupra infiltratului imun prezent în structura<br />
peretelui varicos prin două elemente: (i) evaluarea distinctă a limfocitelor T4 helper şi T8 citotoxic; (ii) compararea<br />
rezultatelor cantitative (valoare medie limfocite T4, respectiv T8), corespondente venelor varicoase simple (stadiul<br />
CEAP 2-3) şi venelor varicoase complicate (stadiul CEAP 4-6). Atragem atenţia asupra faptului că, deşi<br />
modalitatea de cuantificare a fost diferită, valorile obţinute sunt relativ comparabile cu singurele raportări numerice<br />
prezente din literatură (valoare medie 49 limfocite T/5,5 mm 2 în venele varicoase, cu varianţii între minim 30 şi<br />
maxim 67 (Sayer, Smith, 2004)). În acest context, diferenţele semnificative statistic între limfocitele T4 şi,<br />
respectiv, T8, în cadrul fiecrărui sublot în parte, precum şi între limfocitele T4, respectiv T8, în comparaţia sublot 1<br />
versus sublot 2 sunt rezultate originale, care contribuie, în mod cert, la dezvoltarea cunoaşterii în domeniu.<br />
În mod cert, implicarea funcţională a limfocitelor T4 justifică răspunsul imun mediat celular care întreţine<br />
procesul inflamator prezent în peretele venos şi, foarte probabil, ar putea exista o relaţie directă, dependentă de un<br />
anumit prag numeric, cu evoluţia leziunilor morfologice identificabile în componentele tisulare ale structurii<br />
venoase.
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
CAPITOLUL 8. STUDIU MORFOLOGIC ULTRATRUCTURAL AL SISTEMULUI VENOS<br />
SUPERFICIAL<br />
8.1. INTRODUCERE<br />
Cercetarea substratului morfologic al bolii varicoase a beneficiat, în mod indubitabil, de posibilitatea<br />
penetrării la nivel ultrastructural, prin investigarea electrono-microscopică. Din această perspectivă, începând cu<br />
anii 80, câteva grupuri de interes s-au focalizat asupra identificării leziunilor prezente la nivelul peretelui venos, în<br />
tentativa de a putea înţelege şi, implicit, de a putea explica mecanismul patogenic intrinsec care determină<br />
transformările celulare şi tisulare specifice bolii varicoase. Sunt puţine studii dedicate acestui subiect, iar<br />
construcţia lor este diferită – deoarece abordează componentele celor trei tunici care realizează structura peretelui<br />
venos (intima, media, adventicea) fie individual, fie în ansamblu. În acest context, am considerat oportun să<br />
sintetizăm, ca punct de plecare, datele referitoare la caracteristicile endoteliului, ale matricei extracelulare fibrilare<br />
(colagen, elastină) şi nefibrilare şi ale celulelor musculare netede (Jurukova, Milenkov, 1982, Bouissou et al., 1988,<br />
Goldman, Froneck, 1989, Maurel et al., 1990, Venturi et al., 1996, Travers et al., 1996, Coleridge-Smith, 1997, Kockx<br />
et al., 1998, Wali, Eid, 2001, Wali, Eid, 2002, Urbanek et al., 2004, Elsharawy et al., 2007). Din trecerea în revistă a<br />
datelor neomogene prezente în fluxul principal de publicaţii rezultă că nu există încă un tablou ultrastructural definit,<br />
unanim acceptat care să susţină patogenia bolii varicoase. Din acest motiv, informaţiile neconcordante legate de<br />
creşteri, scăderi sau inexistenţa modificărilor componentelor individuale trebuie tratate cu precauţie, fiind<br />
recomandată, întotdeauna, o raportare la structura ansamblului, printr-o evaluare calitativă şi cantitativă globală.<br />
Obiectivul prezentului studiu a fost reprezentat de analiza modificărilor ultrastructurale din venele varicoase,<br />
investigarea noastră fiind concentrată asupra componentelor structurale endoteliale, colagenice, elastice şi musculare,<br />
în scopul de a contribui la caracterizarea leziunilor prezente la nivelul intimei, mediei şi adventicei venoase.<br />
8.2. MATERIAL <strong>ŞI</strong> METODĂ<br />
Materialul a fost reprezentat de 8 fragmente de venă safenă internă, prelevate din teritoriul varicos – în 4<br />
cazuri de la vene simple (cazurile 1-4, stadiul CEAP 2-3), în celelalte 4 cazuri de la vene complicate (cazurile 5-8,<br />
stadiul CEAP 4-6), 1 caz prezentând tromboză vasculară.<br />
Studiul de microscopie electronică a fost realizat în Laboratorul de Patologie Ultrastructurală al Institutului<br />
Naţional de Cercetare-Dezvoltare în Domeniul Patologiei şi Ştiintelor Biomedicale "Victor Babeş” Bucureşti.<br />
Fragmentele vasculare necesare examenului în microscopie optică - secţiuni semifine şi, respectiv, în microscopie<br />
electronică au fost fixate în glutaraldehidă 4% imediat ce au fost recoltate. Includerea fragmentelor tisulare a fost<br />
făcută în Epon, conform procedurii standard practice în laborator. Secţiunile semifine (microscopie optică) şi<br />
secţiunile fine (microscopie electronică) au fost efectuate cu un ultramicrotom RMC.<br />
8.3. REZULTATE<br />
Examenul microscopic al secţiunilor semifine a evidenţiat următoarele modificări: • îngroşarea segmentară<br />
a intimei; • activarea celulelor endoteliale, reflectată prin prezenţa de celule înalte care proemină în lumen şi<br />
prezenţa de vacuole citoplasmatice; • îngroşarea segmentară a mediei; • prezenţa focală în grosimea mediei a unor<br />
arii vacuolare; • creşterea cantităţii de matrice extracelulară în intimă şi medie.<br />
Ca şi aspect general, creşterea în dimensiuni a peretelui venos a fost datorată atât modificărilor de la nivelul<br />
intimei (hipertrofie intimală prin creşterea matricii extracelulare), cât şi de la nivelul medie (hiperplazia şi<br />
hipertrofia celulelor musculare netede, în paralel cu creşterea matricei extracelulare). Examenul electronomicroscopic<br />
a pus în evidenţă, la nivelul celulelor şi al matricei extracelulare, aspecte relevante pentru a susţine<br />
leziuni la nivel ultrastructural (tabelul 58).<br />
La nivelul intimei au fost observate leziuni endoteliale consecutive activării celulare: dimensiunile celulelor<br />
endoteliale, pavimentoase, au fost crescute, celulele devenind înalte (cubice sau cubico-pavimentoase) şi proeminente în<br />
lumen; intracitoplasmatic, s-a semnalat un exces de organite şi numeroase vacuole lipidice. Membrana bazală a<br />
endoteliului a prezentat îngroşări şi aspecte lamelare iar subjacent, în ţesutul subendotelial, s-a identificat colagen fibrilar.<br />
În mod evident, structura normală a limitantei elastice interne a fost dezorganizată. La nivelul tunicii musculare, au fost<br />
prezente modificări ale formei celulelor musculare netede, fie cu apariţia de prelungiri citoplasmatice, care se extind şi<br />
înconjură alte celule musculare netede, în curs de dezintegrare, fie prin elongare excesivă, aspectul devenind fibrilar.<br />
Celulele musculare netede integre au prezentat, în citoplasmă, RE bogat, fapt care indică o intensă activitate de sinteză,<br />
precum şi numeroşi lizozomi, ceea ce sugerează implicarea în activitatea de degradare celulară şi matriceală. Alte leziuni<br />
identificate au constat în: fragmentarea citoplasmatică, îngroşarea laminei bazale sau lamelarea acesteia, urmată de<br />
fragmentare. În matricea extracelulară au fost observate şi fragmente celulare mici, izolate, rezultate din distrugerea<br />
completă a unor celule musculare netede. Microscopia electronică a relevat separarea netă a celulelor musculare netede<br />
prin cantităţi mari de matrice extracelulară şi fibre de colagen fibrilar, tip I şi III. Dezorganizarea laminei elastice externe<br />
a fost evidentă. Prezenţa altor tipuri celulare la nivel lezional (fibroblaste şi miofibroblaste) a constituit un element inedit.<br />
De asemenea, a surprins aspectul colagenului fibrilar, cu diametru mai mare decât cel normal şi distribuţie complet<br />
dezordonată, anarhică, fără a respecta asamblarea regulată, în fascicule de fibre paralele. Atât în medie, cât şi în intimă,<br />
au fost identificate numeroase vase de tip arteriolar, prezenţa acestora fiind asociată unor zone de hemoragie intramurală.<br />
20
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
Fig. 186. Perete venos cu hipertrofie a intimei (I); în medie (M) se<br />
observă arii vacuolare (→) între straturile de celule musculare netede cu<br />
direcţii diferite (Albastru Toluidină x 10)<br />
Fig. 187. Perete venos. Între straturile de celule musculare netede cu<br />
direcţii diferite se observă fibre de colagen (→) (Albastru Toluidină, x<br />
40)<br />
CMN<br />
Fig. 221. Varice. Celule musculare netede<br />
(CMN) a căror lamină bazală este<br />
întreruptă (→) (ME x 9.100)<br />
*<br />
RER<br />
L<br />
Fig. 229. Varice trombozată. Celulă<br />
musculară netedă transformată într-un<br />
miofibroblast (Mf) prezintă RER bogat.<br />
Lamina bazală prezentă focal (→).<br />
Material asemănător materialului de<br />
lamina bazală acumulat în vecinătatea<br />
celulei (#) (ME x 11.000)<br />
I<br />
CMN<br />
CMN<br />
#<br />
RER<br />
M<br />
CMN<br />
Mf<br />
Fig. 222. Varice. Celule musculare<br />
netede (CMN) cu RER lărgit înconjurate<br />
de fibre de colagen cu orientare variabilă<br />
(*) (ME x 9.100)<br />
col<br />
CMN<br />
el<br />
Mf<br />
RER<br />
Fig. 230. Varice trombozată.<br />
Miofibroblast (Mf) cu RER, cu segmente<br />
de lamina bazală (→) dar şi cu fibre de<br />
colagen (săgeata mare) el- elastina col –<br />
colagen (ME x 9.100)<br />
*<br />
21<br />
RER<br />
M<br />
m<br />
m<br />
Fig. 191 Perete venos. Intima este lărgită segmentar (săgeţi<br />
duble). Celule musculare netede (m) sunt prezente în intimă.<br />
Subendotelial apar spaţii clare (*). Unele celule endoteliale sunt<br />
activate (e). L – lumen (Albastru Toluidină x 20)<br />
col<br />
*<br />
col<br />
Fb<br />
col<br />
Fig. 225. Varice. Fibroblast (Fb) în medie<br />
într-o atmosferă colagenică bogată (ME x<br />
9.100)<br />
Fig. 232. Safena. Varice trombozată.<br />
Miofibroblast (Mf) înconjurat de fibre de<br />
colagen cu diametru variabil (săgeţi) el –<br />
elastina (ME x 9.100)<br />
e<br />
L<br />
*
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
8.4. DISCUŢII<br />
Tabloul histopatologic al leziunilor caracteristice bolii varicoase este completat printr-o gamă largă de<br />
modificări ultrastructurale care pot fi corelate cu mecanismul patogenic responsabil de slăbirea peretelui venos.<br />
Este extrem de dificil de stabilit o secvenţă exactă a apariţiei leziunilor, cu atât mai mult a celor instalate la<br />
nivel ultrastructural, în condiţiile în care afectarea tunicii intime şi a tunicii medii par a se interfera, iar asocierea<br />
frecventă a modificărilor patologice în stratul muscular şi în intimă sugerează că ambele au o cauză comună<br />
(Milroy et al., 1989). Astfel, modificările se dezvoltă în baza a două procese: (i) stimularea producţiei colagenice<br />
care se extinde din intimă spre medie, şi (ii) modificarea celulelor musculare netede din medie care pierd<br />
aranjamentul tipic în strat continuu şi, separându-se, penetrează în intimă. Totuşi, discutarea semnificaţiei<br />
modificărilor structurale, fundamentate de transformările ultrastructurale ale celulelor şi fibrelor, în relaţie cu<br />
funcţionalitatea alterată a venelor varicoase, impune o abordare distinctă a tunicilor intimă şi, respectiv, medie.<br />
• Implicaţiile patologice ale leziunilor intimei<br />
În venele varicoase, tunica intimă reacţionează ca parte componentă a peretelui care îşi creşte grosimea<br />
totală, în paralel cu mărirea/lărgirea lumenului. Termenii utilizaţi pentru a defini aceste modificări generale,<br />
certificate prin studii de microscopie electronică, sunt elongarea şi învaginarea suprafeţei tunicii intime (Wali, Eid,<br />
2002) şi hipertrofia tunicii intime (Jurukova, Milenkov, 1982, Obitsu, 1990, Travers et al., 1996, Porto et al., 1998,<br />
Khan et al., 2000, Wali, Eid, 2002). Deşi hipertrofia intimală este susţinută de cele mai multe rezultate raportate,<br />
există totuşi şi date care indică menţinerea dimensiunilor normale, sau chiar reducerea acestora (Mashiah et al.,<br />
1991). Hipertrofia intimală reprezintă, morfologic, o proliferare intensă a fibrelor de colagen, iniţiată şi localizată în<br />
teritoriul intimei. Mecanismul precis al hipertrofiei intimei în venele varicoase este o chestiune controversată, cu<br />
multiple explicaţii oferite, în timp, de diferite grupuri de cercetători, ipotezele principale fiind asociate cu un<br />
răspuns hemodinamic normal (Cheanvechai et al., 1975) sau la stress (Vlodaver, Edwards, 1971), cu tensiunea şi<br />
ischemia (Brody et al., 1972), sau cu hipoxia (Lengyel, Acsady, 1990, Coleridge-Smith, 1997). Implicarea hipoxiei<br />
a fost ulterior aprofundată, punctul iniţial în declanşarea mecanismului considerându-se a fi celulele endoteliale<br />
(Arnould et al., 1992, Arnould et al., 1998, Janssens et al., 1999). În acest context, o atenţie deosebită merită a fi<br />
acordată endoteliului vascular. Informaţiile asupra ultrastructurii celulelor endoteliale în venele varicoase sunt însă<br />
nu numai extrem de reduse, ci şi contradictorii. Unii autori contestă leziunile endoteliale în venele varicoase<br />
(Cheanvechai et al., 1975, Khan et al., 2000), alţii demonstrează în mod cert afectarea severă a celulelor<br />
endoteliale, care se detaşează de pe suprafaţa intimei şi se descuamă în lumen, fapt care determină pierderea<br />
bariereri endoteliale şi expunerea consecutivă a ţesutului subendotelial (Wali, Eid, 2002, Somers, Knaapen, 2006,<br />
Elsharawy et al., 2007), cu pierderea diferitelor componente ale peretelui în lumen şi migrarea intramurală a<br />
componentelor sângelui.<br />
Analiza electrono-microscopică a pus în evidenţă, în studiul nostru, menţinerea integrităţii endoteliului<br />
vascular, celulele endoteliale menţinând contactul cu membrana bazală îngroşată, cu un caracter lamelar. Trăsătura<br />
definitorie a celulelor endoteliale a fost reprezentată de numărul mare de organite prezente la nivel citoplasmatic<br />
care, alături de schimbarea profilului pavimentos într-un profil mai înalt (cubic sau cubico-pavimentos), cu<br />
evidentă proeminare intraluminală, constituie criterii morfologice certe de activare celulară. Toate aceste aspecte au<br />
făcut posibilă diferenţierea endoteliului activat de endoteliul lezat, caracterizat prin creşterea dimensiunilor<br />
celulare, apariţia de vacuole mari care înlocuiesc marea parte a citoplasmei, redusă la un inel situat periferic,<br />
organite celulare (în principal mitocondrii) parţial distruse şi un număr crescut de granule dense<br />
electronomicroscopic. Totuşi, identificarea de celule endoteliale cu vacuole lipidice intracitoplasmatice a ridicat<br />
problema unei suferinţe endoteliale hipoxice precoce – explicabilă prin existenţa de leziuni focale endoteliale,<br />
nesurprinse prin secţiunile pentru microscopie electronică, datorită cărora lipidele intraluminale migrează prin<br />
perete şi se depun intracelular – fapt care ar putea explica procesul tromboflebitei superficiale clinice, care uneori<br />
complică cazurile de vene varicoase. În opinia noastră, celulele endoteliale ar putea dezvolta proprietăţi fagocitare,<br />
fagocitând lipide – dar acesta ipoteză trebuie confirmată. Nu au fost observate însă aspecte de degenerare şi<br />
descuamare, asociate cu prezenţa celulelor sanguine în interiorul peretelui venos. Astfel, putem aprecia că<br />
severitatea leziunilor ultrastructurale iniţiate de stress-ul hemodinamic devine ulterior dependentă de gradul de<br />
hipoxie consecutivă stazei venoase. Mai mult, identificarea unor leziuni izolate semnalează declanşarea procesului<br />
patogenic pe toată lungimea venei, fapt care impune o revizuire a concepţiilor terapeutice. Asociată evaluării<br />
endoteliale, analiza ţesutului conjunctiv subendotelial a relevat creşterea cantităţii de matrice extracelulară fibrilară<br />
şi nefibrilară, cu rezultat în hipertrofia intimală.<br />
• Implicaţiile patologice ale leziunilor mediei<br />
Transformările morfologice ale tunicii medii sunt complexe, interrelaţia colagen – elastină – celule musculare<br />
netede fiind intens studiată, inclusiv prin microscopie electronică, cu rezultate neconcordante. Diferenţele de opinie,<br />
fundamentate pe diferite metode de cuantificare, vizează atât componenta colagenică, cât şi cea musculară – date<br />
despre diminuarea (Svejcar et al., 1963, Andreotti et al., 1978, Andreotti et al., 1979, Psaila, Melhuish, 1989, Venturi<br />
et al., 1996, Travers et al., 1996, Dovell, 1992, Krasinski et al., 1997), creşterea (Rose, Ahmed, 1986, Wali, Eid,<br />
2001) sau absenţa modificărilor (Travers et al., 1992, Lee et al., 1992a, Lee et al., 1992b, Elsharawy et al., 2007)<br />
22
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
acestora, comparativ cu statusul normal venos, fiind prezentate anterior, în Capitolul 6. Deşi toate rezultatele susţin<br />
existenţa unui defect primar în structura peretelui, nu este clar stabilit dacă evenimentul iniţial este reprezentat de o<br />
lezare celulelor musculare printr-un defect intrinsec, cu producţie consecutivă de colagen, sau de o anomalie în<br />
producerea fibrelor de colagen (Travers et al., 1996, Wali, Eid, 2001, Wali, Eid, 2002).<br />
Componenta musculară netedă<br />
Rezultatele noastre sunt în concordanţă cu studiile de referinţă asupra modificărilor ultrastructurale ale<br />
celulelor musculare netede ale venelor varicoase, comparativ cu venele normale (Kockx et al., 1998, Wali, Eid,<br />
2001, Elsharawy et al., 2007). Potenţialul fagocitar a fost pus în evidenţă prin identificarea a numeroşi lizozomi în<br />
citoplasmă, iar degradarea celulelor musculare – prin prezenţa de celule musculare netede cu citoplasmă<br />
fragmentată, în curs de dezorganizare. Alte modificări ultrastructurale observate, anume îngroşarea laminei bazale,<br />
lamelarea sau întreruperea acesteia, pot explica pierderea aranjamentului muscular tipic din medie, prin separarea şi<br />
migrarea celulară, confirmată prin existenţa de celule musculare netede în intimă. Considerăm extrem de<br />
importante datele obţinute din investigarea venelor trombozate, în care modificările ultrastructurale au avut un grad<br />
evident de severitate, celule musculare netede cu fenotip secretor fiind predominante, în asociere cu prezenţa de<br />
fibre de colagen cu diametru neuniform, mai mare decât cel normal, şi cu schimbări bruşte în direcţie de dispunere.<br />
Componenta colagenică<br />
Studiul nostru a identificat prezenţa unei cantităţi mari de fibre de colagen fibrilar, de tip I sau III, la<br />
nivelul mediei. Rezultatele personale obţinute, corelate cu datele raportate în literatură, conduc în opinia noastră la<br />
interpretarea modificărilor componentei colagenice ca etapă secundară în succesiunea evenimentelor patogenice<br />
care fundamentează substratul morfologic al bolii varicoase, etapă consecutivă leziunilor corespondente celulelor<br />
musculare netede. Elementele de noutate, care trebuie subliniate, sunt reprezentate însă de apariţia altor tipuri<br />
celulare la nivel lezional – în mod concret, prezenţa fibroblastelor şi a miofibroblastelor – care nu au fost semnalate<br />
în studii similare. Cu rol determinant în producţia de colagen, dar şi în degradarea acestuia, fibroblastele asociate<br />
celulelor musculare netede contribuie la perturbarea echilibrului structural al mediei, explicându-se astfel nu numai<br />
excesul de colagen (care nu poate fi atribuit exclusiv celulelor musculare netede cu fenotip secretor), ci şi existenţa<br />
zonelor izolate în care matricea extracelulară este dezorganizată (prin eliberarea enzimelor capabile de liză).<br />
Miofibroblastul, care asociază capacitate contractilă, poate interveni în echilibrul funcţional – prezenţa sa putând fi<br />
interpretată ca reacţie compensatorie, adaptativă, la pierderea celulelor musculare netede.<br />
Suplimentar datelor din literatură, studiul nostru realizează o caracterizare aprofundată colagenului fibrilar:<br />
diametrul variabil, mai mare decât în statusul de normalitate, precum şi distribuţia anarhică ce înlocuieşte<br />
dispunerea în pachete de fibre paralele, indică o asamblare patologică – specifică proceselor tumorale sau<br />
procesului de îmbătrânire.<br />
Componenta elastică<br />
Rezultatele noastre concordă cu raportările din fluxul principal de publicaţii, leziunea principală observată<br />
fiind dezorganizarea laminei elastice interne.<br />
• Diferenţe ultrastructurale în raport de teritoriile afectate şi severitatea bolii varicoase<br />
În studiul nostru nu au existat diferenţe ultrastructurale majore între componentele intimale şi ale mediei<br />
(celule musculare netede, colagen, elastină), corespondente teritoriilor lezate în varicele simple (stadiul CEAP 2-3)<br />
şi, respectiv, în varicele complicate (stadiul CEAP 4-6), ci un continuum lezional evolutiv, în care se poate constata<br />
existenta unei corelatii clinico-morfologice. Analiza leziunilor decelate în studiul nostru indică un profil<br />
ultrastructural instalat din momentul declanşării mecanismului patogenic, rezultatele personale adaugându-se celor<br />
care susţin existenţa modificărilor morfologice chiar în teritoriile clinic nevaricoase. Dovezile morfologice se<br />
repercută direct în abordarea terapeutică, pentru chirurgia venelor varicoase fiind recomandată nu numai<br />
îndepărtarea pachetelor varicoase, ci şi strippingul venei safene (Wali, Eid, 2001).<br />
CAPITOLUL 9. CONCLUZII<br />
Datele personale obţinute au condus la formularea următoarelor concluzii care individualizează rezultatele,<br />
conferind elemente de originalitate ale tezei:<br />
• În aprecierea ecografică a modificărilor venoase, diametrele joncţiunii safeno-femurale şi a venelor perforante,<br />
numărului de vene perforante cu flux bidirecţional şi timpul mediu de reflux sunt indicatori fiabili pentru apreciarea<br />
statusului evolutiv, valorile acestor parametri structurali şi funcţionali fiind corelate semnificativ statistic cu<br />
stadiul bolii varicoase.<br />
• Modificările structurii morfologice microscopice a peretelui venos sunt rezultatul perturbării echilibrului dintre<br />
componentele endotelială, matriceală amorfă, matriceală fibrilară şi musculară netedă. Deşi rolul principal este<br />
atribuit celulelor musculare netede din tunica medie, leziunile sunt extrapolate în intimă. Hipertrofia intimală,<br />
datorată creşterii marcate a matricii extracelulare fibrilare colagenice şi elastice, precum şi prezenţei celulelor<br />
23
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
musculare migrate din medie – şi nu hipertrofia celulelor musculare netede – este responsabilă de creşterea în<br />
ansamblu a dimensiunilor peretelui.<br />
• Evaluarea cantitativă a componentei colagenice nu poate fi corelată direct cu evoluţia stadială a bolii varicoase.<br />
Creşterea cantităţii de laminină şi prezenţa sa la nivelul tunicii medii poate fi interpretată ca indicator obiectiv pentru<br />
procesul de consolidare a matricei extracelulare care, odată produsă în exces, modifică histologia peretelui venos.<br />
• Modificările profilului morfologic al microvascularizaţiei peretelui venos în evoluţia bolii varicoase constituie un<br />
efect, şi nu o cauză patogenică.<br />
• În procesul de remodelare matriceală la nivelul peretelui venos afectat este implicată intervenţia MMP9, dar nu<br />
şi a MMP2.<br />
• Activitatea pro-apoptotică scade odată cu progresia bolii, procesul de moarte celulară programată în boala<br />
varicoasă având un potenţial rol în transformarea de tip fibros a componentei colagenice.<br />
• Prezenţa mastocitelor şi a limfocitelor T se corelează semnificativ statistic cu stadiile evolutive ale bolii<br />
varicoase.<br />
• Profilul ultrastructural al leziunilor specifice bolii varicoase, în cadrul căruia transformarea fenotipului contractil<br />
al celulei musculare netede în fenotip secretor, este completat prin prezenţa miofibroblastelor şi a caracterizării<br />
colagenului nou format, a cărui asamblare nu respectă tiparul normal.<br />
• Absenţa unor diferenţe semnificative între leziunile tisulare/celulare şi trăsăturile moleculare identificate în<br />
diferite teritorii venoase afectate indică faptul că există o afectare a ansamblului structural venos – de la crosă la<br />
perforante – în momentul în care boala varicoasă este evidentă clinic.<br />
Bibliografie selectivă<br />
Akagi D, Arita H, Komiyama T. Objective assessment of nerve injury after greater saphenous vein stripping. Eur J Vasc Endovasc Surg 2007;<br />
33: 625–630.<br />
Ali SM, Callam MJ. Results and significance of colour duplex assessment of the deep venous system in recurrent varicose veins. Eur J Vasc<br />
Endovasc Surg 2007; 34: 97–101.<br />
Amsler F, Blättler W. Compression therapy for occupational leg symptoms and chronic venous disorders – a meta-analysis of randomised<br />
controlled trials. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 35: 366–372.<br />
Andreotti L, Cammelli D. Connective tissue in varicose veins. Angiology 1979; 30(12): 798-805.<br />
Arshard A, London NJM, McCarthy M. Varicose Veins. In: Donnelly R . ABC of Arterial and Venous Disease, 2 nd ed. US: Wiley-Blackwell,<br />
2009, 61-66.<br />
Asciutto G, Mumme A, Marpe B. Venography in the detection of pelvic venous congestion. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 36: 491–496.<br />
Aunapuu M, Arend A. Histopathological changes and expression of adhesion molecules and laminin in varicose veins. Vasa 2005; 34(3): 170-175.<br />
Badea RI, Dudea SM, Mircea PA, Zdrenghea D. Tratat de Ultrasonografie, vol. II. Bucureşti: Ed. Medicală, 2006.<br />
Balzer K. Chronic Venous Insufficiency. In: Liapidis C (ed.). European Manual of Medicine: Vascular Surgery. Berlin Heidelberg: Springer-<br />
Verlag, 2007, 539-550.<br />
Bergan J, Pascarella L. Venous anatomy, physiology and pathophysiology. In: Bergan J (ed.). The Vein Book. Amsterdam: Elsevier Academic<br />
Press, 2007, 39-46.<br />
Bergan J. Molecular Mechanisms in Chronic Venous Insufficiency. Ann Vasc Surg 2007; 21: 260-266.<br />
Bergan JJ, Schmid-Schonbein G, Colleridge-Smith P et al. Chronic venous disease. N Engl J Med 2006; 355: 488-498.<br />
Brunicardi CF. Schwartz’s Principles of Surgery, 9 th ed. The Mc<strong>Gr</strong>aw-Hill Companies Inc, 2010.<br />
Bucur G. Flebologie Practică (medicală şi dermatologică). Varicele Simple, vol I. Bucureşti: Infomedica, 2003.<br />
Caggiati A, Allegra C. Historical introduction. In: Bergan J(ed.). The Vein Book. Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2007, 1-14.<br />
Campbell WB, Decaluwe H, Boecxstaens V. The symptoms of varicose veins: difficult to determine and difficult to study. Eur J Vasc<br />
Endovasc Surg 2007; 34: 741-744.<br />
Candea V. Chirurgie Vasculară. Bolile Venelor şi Limfaticelor. Bucureşti: Ed.Tehnica, 2001.<br />
Cavezzi A, Labropoulos N, Partsch H et al. Duplex ultrasound investigation of the veins in chronic venous disease of the lower limbs-UIP<br />
consensus document. Eur J Vasc Endovasc Surg 2006; 31(3): 288-299.<br />
Chiesa R, Marone E M, Limoni C et al. Chronic venous disorders: Correlation between visible signs, symptoms, and presence of functional<br />
disease. J Vasc Surg 2007a; 46: 322-330.<br />
Chiesa R, Marone EM, Limoni C et al. Chronic Venous Insufficiency in Italy: the 24-Cities Cohort Study. Eur J Vasc Endovasc Surg 2005a;<br />
30: 422-429.<br />
Chiesa R, Marone EM, Limoni C et al. Demographic factors and their relationship with the presence of CVI signs in Italy: the 24-Cities Cohort<br />
Study. Eur J Vasc Endovasc Surg 2005b; 30: 674-680.<br />
Chiesa R, Marone EM, Limoni C et al. Impact of chronic venous insufficiency on daily activities and quality of life, and correlation of<br />
demographic factors with the outcome of duplex-ultrasound measurements. Angiology 2007b; 58: 440-449.<br />
Chung AW, Wong J, Luo H et al. Arterialisation of a vein graft promotes cell cycle progression through Akt and p38 mitogen-activated protein<br />
kinase pathways: impact of the preparation procedure. Can J Cardiol 2007; 23: 1147-1154.<br />
Coleridge Smith DP. Physiology of the vein and lymphatics. In: Labropoulos N (ed.). Venous and Lymphatic Diseases. Taylor and Francis<br />
<strong>Gr</strong>oup, 2006, 23-36.<br />
Defty C, Eardley N, Taylor M. A comparison of the complication rates following unilateral and bilateral varicose vein surgery. Eur J Vasc<br />
Endovasc Surg 2008; 35: 745-749.<br />
Ducasse E, Giannakakis K, Chevalier J et al. Dysregulated apoptosis in primary varicose veins. Eur J Vasc Endovasc Surg 2005; 29: 316–323.<br />
Dudea SM, Badea RI. Ultrasonografie Vasculară. Bucureşti: Ed. Medicală, 2004.<br />
Edwards AG, Donaldson D, Bennets C et al. The outcome of recurrent varicose veins surgery. Phlebology 2005; 20: 57-59.<br />
Eklof B. Classifying venous disease. In: Bergan J (ed.). The Vein Book. Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2007, 111-118.<br />
24
Cercetări histologice, histochimice şi electronomicroscopice în venele varicoase<br />
Elsharawy MA, Naim MM, Abdelmaguid EM, Abdulmohsen AA. Role of saphenous vein wall in the pathogenesis of primary varicose veins.<br />
Interact CardioVasc Thorac Surg 2007; 6:219-224.<br />
Friedman S. A History of Vascular Surgery, 2 nd ed. Blackwell Futura, 2005.<br />
García-Gimeno M, Rodríguez-Camarero S, Tagarro-Villalba S et al. Duplex mapping of 2036 primary varicose veins. J Vasc Surg 2009; 49(3): 681-689.<br />
Ginghină C, Popescu BA, Jurcuţ R. Esenţialul în Ecocardiografie. Bucureşti: Ed. Medicală Antaeus, 2005.<br />
Glazebrook MA, Wright Jr. JR, Langman M et al. Histological analysis of achilles tendons in an overuse rat model. J Orthopaedic Res 2008;<br />
26: 840–846.<br />
<strong>Gr</strong>eenberg JI, Angle N, Bergan J. The anatomy, epidemiology, and pathophysiology of venous disease. In: Heuser R (ed.). Textbook of<br />
Peripheral Vascular Interventions, . 2 nd ed. London: Informa UK Ltd, 2008, 829-834.<br />
Hashizume K. Analysis of utero-placental-specific molecules and their functions during implantation and placentation in the bovine. J Reprod<br />
Dev 2007; 53(1): 1-11.<br />
Hollingsworth SJ, Powell G, Barker SG et al. Primary varicose veins: Altered transcription of VEGF and its receptors (KDR,vflt-1, soluble flt-<br />
1) with sapheno-femoral junction incompetence. Eur J Vasc Endovasc Surg 2004; 27: 259.<br />
Howlader MH, Coleridge Smith PD. Relationship of plasma Vascular Endothelial <strong>Gr</strong>owth Factor to CEAP clinical stage and symptoms in<br />
patients with chronic venous disease. Eur J Vasc Endovasc Surg 2004; 27: 89–93.<br />
Jeanneret C, Jäger KA, Zaugg CE, Hoffmann U. Venous reflux and venous dispensability in varicose and healthy veins. Eur J Vasc Endovasc<br />
Surg 2007; 34: 236–242.<br />
Kachlik S, Baca V, Fara P et al. Blood vessels of the normal and pathologically changed wall of the human vena saphena magna. Central Eur J<br />
Med 2008; 3: 475-481.<br />
Kalia V, Sarkar S, Gourley TS et al. Differentiation of memory B and T cells. Curr Opin Immunol 2006; 18: 255-264.<br />
Khosravi Shahi P, Fernández Pineda I. Tumoral angiogenesis: review of the literature. Cancer Invest 2008; 26(1): 104-108.<br />
Kim D, Ryu W, Park S. Outpatient trans-illuminated powered phlebectomy under the local anesthesia might be a feasible procedure for<br />
varicose veins. J Korean Soc Vasc Surg 2005; 21(1): 45-48.<br />
Kosugi I, Urayama H, Kasashima F et al. Matrix metalloproteinase-9 and urokinase-type plasminogen activator in varicose veins. Ann Vasc<br />
Surg 2003; 17: 234–238.<br />
Kulkarni SR, Barwell JR, Gohel MS. Residual venous reflux after superficial venous surgery does not predict ulcer recurrence. Eur J Vasc<br />
Endovasc Surg 2007; 34: 107-111.<br />
Labropoulos N, Kokkosis AA, Spentzouris G et al. The distribution and significance of varicosities in the saphenous trunks. J Vasc Surg 2010;<br />
51(1): 96-103.<br />
Labropoulos N, Leon Jr LR. Duplex evaluation of venous insufficiency. Semin Vasc Surg 2005; 18: 5-9.<br />
Langer HF, Chavakis T. Leukocyte-Endothelial Interactions in Inflammation. J Cell Mol Med 2009; 16.<br />
LeBleu VS, Macdonald B, Kalluri R. Structure and function of basement membranes. Exp Biol Med (Maywood) 2007; 232(9): 1121-1129.<br />
Lullmann-Rauch R. Histologie. Bruxelles: De Boeck, 2008.<br />
Menyhei G, Gyevnár Z, Arató E. Conventional stripping versus cryostripping: a prospective randomised trial to compare improvement in<br />
quality of life and complications. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 35: 218–223.<br />
Metcalfe M, Baker D. Varicose veins. Surgery 2007; 26(1) : 4–7.<br />
Mozes G, Gloviczki P. Venous embriology and anatomy. In: Bergan J (ed.). The Vein Book. Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2007, 15-26.<br />
Naoum JJ, Hunter GC, Woodside KJ, Chen C. Current advances in the pathogenesis of varicose veins. J Surg Res 2007; 141: 311–316.<br />
Naoum JJ, Hunter GC. Pathogenesis of varicose veins and implications for clinical management. Vascular 2007; 15(5): 242-249.<br />
Nijsten T, van den Bos R, Goldman MP. Minimally invasive techniques in the treatment of saphenous varicose veins. J Am Acad Dermatol<br />
2009; 60: 110–119.<br />
Obermayer A, Garzon K. Identifying the source of superficial reflux in venous leg ulcers using duplex ultrasound. J Vasc Surg 2010; 52(5): 1255-1261.<br />
Ojdana D, Safiejko K, Milewski R et al. Evaluation of the memory CD4+ and CD8+ T cells homeostasis during chronic venous disease of<br />
lower limbs. Folia Histochemica et Cytobiologica 2009; 47: 471-477.<br />
Ouvry P, Allaert FA, Desnos P. Efficacy of polidocanol foam versus liquid in sclerotherapy of the great saphenous vein: A multicentre<br />
randomised controlled trial with a 2-year follow-up. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 36: 366–370.<br />
Pascual G, Mendieta C, García-Honduvilla N et al. GF- beta 1 upregulation in the aging varicose vein. J Vasc Res 2007; 44: 192–201.<br />
Perumal S, Antipova O, Orgel JP. Collagen fibril architecture, domain organization, and triple-helical conformation govern its proteolysis.<br />
PNAS 2008; 105 (8): 2824–2829.<br />
Pittaluga P, Chastanet S, Rea B et al. Midterm results of the surgical treatment of varices by phlebectomy with conservation of a refluxing<br />
saphenous vein. J Vasc Surg 2009; 50(1): 107-118.<br />
Pop A, Costache A, Ghilencea A. Ghid Practic de Ultrasonografie clinică. Bucureşti: Ed. Infomedica, 2003.<br />
Romagnani S. Regulation of the T cell response. Clin Exp Allergy 2006; 36: 1357-1366.<br />
Romagnani S. T-cell subsets (Th1 versus Th2). Ann Allergy Asthma Immunol 2000; 85: 9-18.<br />
Rutherford RB. Vascular Surgery, 6 th ed. Philadelphia: WB Saunders, 2005.<br />
Sansilvestri-Morel P, Fioretti F, Rupin A et al. Comparison of extracellular matrix in skin and saphenous veins from patients with varicose<br />
veins: does the skin reflect venous matrix changes? Clin Sci (Lond) 2007; 112(4): 229-239.<br />
Somers P, Knaapen M. The histopathology of varicose vein disease. Angiology 2006; 57: 546-555.<br />
Sprague AH, Khalil RA. Inflammatory cytokines in vascular dysfunction and vascular disease. Biochem Pharmacol 2009; 78(6): 539–552.<br />
van Neer PA, Veraart JC, Neumann HA. Venae perforantes: A clinical review. Dermatol Surg 2003; 29: 931–942.<br />
van Rij AM, De Alwis CS, Jiang P. Obesity and impaired venous function. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 35: 739–744.<br />
Volkmann E, Falk A, Holm J et al. Effect of varicose vein surgery on venous reflux scoring and plethysmographic assessment of venous<br />
function. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 36: 731-737.<br />
Wali MA, Dewan M, Eid RA. Histopathological changes in the wall of varicose veins. Int Angiol 2003; 22: 188–193.<br />
Wali MA, Eid RA. Intimal changes in varicose veins: an ultrastructural study. J Smooth Muscle Res 2002; 38 (3): 63–74.<br />
Widmer LK. Peripheral venous disorders: Prevalence and Simportance: Observations in 4529 Apparently Healthy Persons: Basle III study.<br />
Bern Switzerland: Hans Huber, 1978.<br />
Zamboni P, Lanzara S, Mascoli F et al. Inflammation in venous disease. Int Angiol 2008; 27(5): 361-369.<br />
Zhu J, Paul WE. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood 2008; 1: 1557-1569.<br />
Zlobec I, Steele R, Terracciano L, Jass JR, Lugli A. Selecting immunohistochemical cut-off scores for novel biomarkers of progression and<br />
survival in colorectal cancer. J Clin Pathol 2007a; 60: 1112-1116.<br />
Zygmunt Jr J. What is new in duplex scanning of the venous system? Perspect Vasc Surg Endovasc Ther 2009; 21(2): 94-104.<br />
25