Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile - Universitatea ...

Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces şi 

Bacillus 

Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu 

Universitatea din Bucureşti, Facultatea de Biologie Splaiul Independenţei 91-95, 76201 

Bucureşti 

Bacteriile aparţinând genurilor Bacillus şi Streptomyces sunt cunoscute ca fiind 

producători ai unor game largi de compuşi biologic activi, dintre care unii au aplicaţii în 

agricultură şi industria farmaceutică. Dacă în cazul bacililor cunoştinţele sunt mai avansate, iar 

aplicaţiile practice concentrate mai ales asupra enzimelor, la streptomicete cele mai multe 

cunoştinţe au fost dobândite în urma studiilor asupra producerii de antibiotice. Scopul acestei 

lucrări este de a sintetiza datele referitoare la biosinteza de enzime şi de compuşi cu efect 

inhibitor, utili pentru diferite procese biotehnologice. De asemenea, sunt prezentate unele date 

referitoare la genele ce codifică biosinteza unor substanţe importante din punct de vedere 

biotehnologic. 

Actinomicetele reprezintă un grup de microorganisme procariote cu numeroase 

asemănări cu fungii microscopici, alături de care constituie un exemplu clasic de evoluţie 

convergentă. Relevante în acest sens sunt: morfologia şi organizarea micelială a coloniilor lor ca 

şi sistemul lor de reproducere. Se poate specula că aceste asemănări rezultă dintr-o adaptare 

comună în sensul desfăşurării tuturor funcţiilor metabolice în condiţiile absenţei apei în imediata 

lor vecinătate. 

Ciclul de viaţa al streptomicetelor, cel mai important gen din cadrul grupului 

actinomicetelor, crescute pe mediu solid implică formarea (diferenţierea) a două tipuri diferite de 

miceliu: miceliul de substrat care creşte în si pe mediul de cultură solid; miceliul aerian care 

creşte pe primul şi pe care se formează sporii (Figura 1). 

In timpul creşterii miceliului de substrat se remarcă o creştere simultană a greutăţii uscate 

care însă încetineşte semnificativ odată cu formarea miceliului aerian. 

Figura 1. Reprezentarea schematică a celor două tipuri de miceliu (după Zarnea, 1982). 

123


Un aspect interesant este acela că, la multe dintre speciile de streptomicete, încetinirea 

ratei de creştere este însoţită de producerea de substanţe antibiotice sau cu alte funcţii (metaboliţi 

secundari), astfel că în timpul formării miceliului aerian se remarcă o foarte intensă activitate 

antibiotică. Acest fapt vine în sprijinul ipotezei asupra rolului antibioticelor produse de 

streptomicete şi anume acela de a proteja miceliul de substrat care se lizează împotriva altor 

bacterii existente în sol care l-ar putea folosi ca sursă de carbon şi azot, păstrându-l astfel pentru 

creşterea miceliului aerian (Chater şi Merrick, 1979). 

Diferenţierea celulară evidenţiată la streptomicete pare a fi un proces controlat de unele 

substanţe autoreglatoare cum sunt factorii A şi B al căror mecanism de acţiune, cel puţin în cazul 

unor specii de streptomicete care au fost studiate mai intens, este asemănător mecanismului de 

acţiune al hormonilor de la eucariote, implicând prezenţa unor receptori specifici (Beppu, 1986). 

Acest tip de reglaj împreună cu observaţiile legate de asemănările structurale ale factorului B cu 

AMPc de la eucariote sugerează ideea că anumite substanţe evidenţiate la streptomicete ar putea 

fi semnale universale sau mesageri pentru funcţii celulare nu numai la procariote ci şi la 

eucariote. 

Ca rezultat al activităţii lor metabolice, atât streptomicetele cât şi bacilii, formează mai 

multe categorii de compuşi care includ, pe lângă constituenţii structurali ai celulei, enzime intra- 

şi extracelulare, produşi finali de metabolism precum şi o serie de produşi cu importanţă practică 

deosebită incluzând metaboliţii primari şi pe cei secundari. 

Metaboliţii primari sunt compuşi cu greutate moleculară în general mică, reprezentând 

produşi intermediari sau finali ai metabolismului intermediar necesari microorganismului 

producător şi care includ : aminoacizi, acizi organici, nucleotide, vitamine, enzime etc (Zarnea, 

1984). Aceşti compuşi sunt sintetizaţi în cursul trofofazei (perioadei de multiplicare rapidă şi 

acumulare de biomasă celulară), în medii bogate în substanţe nutritive şi condiţii fizice 

corespunzătoare. După această etapă urmează idiofaza în cursul căreia creşterea şi multiplicarea 

încetează dar celulele rămân metabolic active sintetizând o categorie specială de substanţe cu 

structură chimică variată, denumite metaboliţi secundari. Numărul metaboliţilor secundari este 

foarte mare iar efectele lor sunt de asemenea foarte variate. Diversitatea neobişnuită a efectelor 

farmacodinamice şi a structurii lor chimice este ilustrată de numeroasele clase de compuşi 

organici la care pot aparţine şi care includ: glucide aminate, chinone, cumarine, epoxizi, 

alcaloizi, glicozide, derivaţi indolici, lactione, macrolide, naftalene, nucleozide, terpenoizi şi 

tetracicline (Berdy, 1974). 

Sinteza metaboliţilor secundari se face printr-o mai mare varietate de căi decât aceea a 

metaboliţilor primari, pe seama compuşilor cu greutate moleculară mică folosiţi în timpul 

creşterii exponenţiale pentru sinteza constituenţilor celulari normali şi este rezultatul acumulării 

în mediu a unor substanţe cu rol de inductor. De asemenea, declanşarea sintezei metaboliţilor 

secundari se poate datora şi epuizării unor substanţe cu funcţie de represor (Vining, 1990). In 

contrast cu diversitatea căilor de biosinteză şi a produşilor finali, cei mai mulţi dintre metaboliţii 

secundari sunt asamblaţi pornind de la câţiva metaboliţi cheie. In plus, spre deosebire de 

metabolismul primar în care procesele de biosinteză se desfăşoară întotdeauna cu mare 

specificitate (se utilizează un singur substrat şi rezultă un singur produs), în metabolismul 

secundar proporţia fiecărui component depinde de factori genetici şi de mediu, probabil datorită 

specificităţii scăzute a enzimelor implicate în desfăşurarea sa. 

Majoritatea metaboliţilor secundari au acţiuni antibiotice dar există şi compuşi cu acţiuni 

diferite. In general ei au mărime redusă chiar dacă nu sunt monomeri ci oligomeri; ei sunt de 

obicei excretaţi în mediul extern fie sub formă solubilă în apă fie ca produşi insolubili care 

formează agregate amorfe sau cristaline asociate cu celulele producătoare (Vining, 1990). 

124

Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces şi Bacillus 

1. Functiile metabolitilor secundari produşi de bacili şi 

streptomicete 

1.1. Activitatea antibiotică a metaboliţilor secundari 

Printre bacterii, actinomicetele şi în special cele din genul Streptomyces sunt cunoscute 

ca fiind principalii producători de antibiotice, sintetizând 3/4 dintre toţi produşii cunoscuţi de 

acest tip. Antibioticele produse de streptomicete au structură chimică variată putând fi clasificate 

în diferite tipuri în timp ce compuşii cu funcţii similare elaboraţi de bacteriile din genul Bacillus 

sau din alte grupe (bacterii lactice, enterobacterii, Pseudomonas sp.) sunt în majoritate peptide 

sau peptide modificate. 

Membrii genului Bacillus (Figura 2) sunt capabili să producă antibiotice ca metaboliţi 

secundari în faza de creştere logaritmică târzie sau la începutul fazei staţionare. Au fost semnalaţi 

mai mult de 169 de astfel de metaboliţi. De exemplu, B subtilis poate produce 68 tipuri de 

antibiotice, în timp ce la B.brevis au fost identificate numai 23 asemenea tipuri de 

substanţe.(Katz şi Demain 1987). 

Figura 2. Aspect electronomicroscopic al celulelor de Bacillus subtilis (după Zarnea, 1984). 

Multe dintre antibioticele produse de bacili sunt active împotriva bacteriilor Gram 

pozitive, dar există şi excepţii. Aşa cum s-a menţionat deja, majoritatea antibioticelor produse de 

bacili sunt peptide, dar unele aparţin altor clase de compuşi chimici (de exemplu, leutirosin este o 

amiloglicozidă, iar protacin este o trienă fosforică). 

Există o controversă în ceea ce priveşte funcţia acestor antibiotice la bacteriile din genul 

Bacillus. Ele apar, de obicei, în timpul sporutării, de aceea se crede că antibioticele respective 

constituie un factor important ce apare la tranziţia de la starea vegetativă la spori (Katz şi 

Demain,1987). 

Multe dintre tulpinile de bacili producătoare de compuşi cu acţiune antimicrobiană au 

fost supuse unor analize speciale de cartare moleculară, de identificare şi clonare a genelor 

codificate. Datele obţinute până în prezent sunt prezentate în Tabelul 1. Metaboliţii secundari 

datorează activitatea antibiotică capacităţii lor de a inhiba procesele metabolice primare. Cei mai 

mulţi acţionează ca antimetaboliţi deoarece asemănarea lor funcţională cu metaboliţii normali le 

permite legarea la situsuri ţintă şi să interfere cu activitatea normală. Produşii generaţi de o 

anumită cale metabolică inhibă de obicei o altă cale metabolică, activitatea lor depinzând în 

întregime de configuraţia antibioticului şi de distribuţia grupărilor funcţionale la nivelul lor. 

125


Tabelul 1. Substanţe antibiotice produse de bacteriile genului Bacillus 

Specie Antibiotic Acţiune inhibitoare Harta 

B.subtilis 

126 

genetică 

Gene 

clonate 

Subtilin Bacterii Gram + + + 

Surfactin + - 

Bacilysin Bacterii Gram + + - 

Difficidin Spectru larg de acţiune - - 

Oxydificidin Spectru larg de acţiune - - 

Bacillomycin F Antifungic - - 

Mycobacillin Antifungic - - 

Iturin Antifungic 

B. brevis Gramicidin S Bacterii Gram + + + 

Tyrocidin Bacterii Gram + + + 

B. licheniformis Bacitracin Bacterii Gram + + + 

Proticin - - 

B. pumilus Pumilin Bacterii Gram + - - 

Tetain Bacterii Gram + - - 

B. mesentericus Esperin Bacterii Gram + - - 

B. polymyxa Polymyxin Bacterii Gram - - - 

Colistin Bacterii Gram - - - 

B.tyaminoliticus Octopytin Bacterii Gram + - - 

Baciphelecin Bacterii Gram + - - 

B. circulans Circulin Bacterii Gram - - - 

Butirosin Bacterii Gram + - - 

B.laterosporus Laterospuramine Bacterii Gram + - - 

Laterosporin 

B. cereus Biorin 

Cerexin 

Bacterii Gram + - - 

Deoarece nu există o corelaţie strictă între ţintele antibioticului şi căile metabolice în care 

el este format, este riscant să se spună că toţi metaboliţii secundari manifestă o anumită activitate 

biologică, mai ales dacă ţinem cont de faptul că de multe ori aceşti compuşi au semnificaţie 

numai pentru om şi mai puţin pentru organismul producător. 

Deşi cercetările asupra utilităţii medicale a antibioticelor s-au referit în special la 

activitatea antibacteriană, în prezent sunt studiate acţiunile unor asemenea substanţe şi asupra 

unor alte tipuri de celule, eucariote. Un exemplu în acest sens îl constituie monensinul, identificat 

iniţial în culturi de Streptomyces cinnamonensis şi care în prezent este utilizat pe scară largă ca şi 

coccidiostatic sau ca stimulator al creşterii animalelor (Vining, 1990). 

O problemă care se pune în cazul producerii de substanţe antibiotice este aceea a 

modalităţilor în care bacteriile producătoare rezistă la acţiunea acestor substanţe care de obicei 

inhibă creşterea sau alte procese biochimice esenţiale. Pentru a elimina efectul de inhibare a 

creşterii, bacteriile producătoare pot prezenta mai multe mecanisme de rezistenţă: modificarea 

situsului ţintă al antibioticului, modificarea permeabilităţii membranare sau inactivarea 

metabolitului toxic (Cundliffe, 1989). Deoarece antibioticele sunt rapid eliminate în exteriorul 

celulei pe măsură ce el este produs, inactivarea celulară nu afectează eficienţa produsului 

extracelular. 

Un studiu efectuat asupra rezistenţei la antibiotice a tulpinilor bacteriene sensibile ("ţintă") a 

evidenţiat faptul că antibioticele excretate în mediu şi care acţionează în vecinătatea 

organismului producător au semnificaţia unor factori implicaţi în competiţia pentru resurse.


Rezistenţa la antibioticele obţinute a fost observată la multe tulpini bacteriene de colecţie, 

izolate înainte de introducerea acestor antibiotice în practica medicală ceea ce sugerează ideea că 

populatiile bacteriene vin în contact cu asemenea compuşi în mediul lor natural de viaţă. De 

asemenea, unii metaboliţi toxici chiar dacă nu au o valoare antibiotică mare, ei pot potenţa 

activitatea altor antibiotice faţă de care s-a instalat rezistenţa la numeroase tulpini bacteriene. 

Acesta este cazul acidului clavulanic produs de tulpini de S.clavuligerus care are o slabă 

activitate antibiotică dar care determină o sporire a acţiunii unor antibiotice β-lactamice cum este 

cefamicinul prin inhibarea β-lactamazelor pro-duse de tulpina bacteriană ţintă. 

Antibioticele descoperite până în prezent şi utilizate mai mult sau mai puţin intens în 

practica medicală pot fi clasificate ţinând cont de diferite criterii: modul de acţiune, natura 

chimică, spectru de acţiune etc. 

O abordare recentă a structurii unor antibiotice consideră că acestea, alături de un număr 

mare de metaboliţi sintetizaţi atât de către bacterii cât şi de fungi sau plante, pot fi grupate într-o 

familie de compuşi denumiţi poliketide (Hopwood şi Sherman 1990). Toţi aceşti compuşi au în 

comun prezenţa unor grupări keto la nivelul unor atomi de carbon foarte variaţi ca poziţie în 

molecula respectivă. Printre compuşii incluşi în această familie menţionăm: tetraciclinele, 

antraciclinele, eritromicina, rifamicinele, granaticinul, avermectinul (toate sintetizate de către 

streptomicete), aurantininul (sintetizat de Bacillus sp.) mupirocin (elaborat de Pseudomonas sp.) 

precum şi ale substanţe elaborate de celule eucariote: micotoxine, flavonoizi, fitoalexine etc. 

1.1.1. Antibiotice care inhibă sinteza peretelui celular 

După descoperirea penicilinei de către Fleming în 1929, un număr mare de antibiotice 

înrudite cu aceasta au fost izolate, ele având în comun structura chimică (sunt β-lactami) şi 

modul de acţiune (inhibarea sintezei peretelui celular bacterian). 

Deşi penicilinele au fost descoperite ca fiind produse de către fungi, s-a dovedit că 

asemenea antibiotice pot fi sintetizate şi de către unele specii de streptomicete cum ar fi: 

S.clavuligerus, S.lipmanii, S.lactamgens, S.cattleya (Martin şi Liras, 1989; Matsushima şi Baltz, 

1989; Srinivasan şi colab.,1991). 

Pe lângă antibioticele β-lactamice au mai fost izolaţi şi caracterizaţi şi alţi compuşi care 

afectează funcţiile membranei plasmatice. Un exemplu îl constituie nistatinul, antifungic produs 

de unele specii ale genului Streptomyces. Un alt grup este reprezentat de polimixine, bacitracine 

şi gramicidine, antibiotice polipeptidice produse de bacterii aparţinând genului Bacillus 

(B.polymixa, B.licheniformis, B.brevis). Aceşti compuşi determină creşterea permeabilităţii 

membranei plasmatice ceea ce are drept consecinţă ieşirea masivă a unor aminoacizi sau a unor 

derivaţi purinici şi pirimidinici din bacterie, conducând în final la moartea celulei. De asemenea, 

bacitracina acţionează asupra sintezei peretelui celular, determinând inhibarea biosintezei 

peptidoglicanului unor bacterii Gram negative. 

1.1.2. Antibiotice care inhibă sinteza proteinelor 

Dintre antibioticele care afectează sinteza proteinelor, un loc important este ocupat de 

aminoglicozide, tetracicline şi cloramfenicol, toate cele trei grupe fiind sintetizate de specii ale 

genului Streptomyces.. 

Aminoglicozidele reprezintă un grup foarte important de antibiotice care au drept 

component principal unele glucide aminate. Primul antibiotic din acest grup care a fost 

descoperit în 1944 este streptomicina produsă de S.griseus, după care au fost izolate numeroase 

alte aminoglicozide de la bacterii aparţinând în principal genurilor Streptomyces şi 

Micromonospora: gentamicina produsă de specii de Micromonospora, neomicina produsă de 

S.fradiae, ribostamicina produsă de S.ribosidificus, kanamicina sintetizată de tulpini de 

S.kanamyceticus, butirozina produsă de B.circulans etc.(Okuda şi Ito, 1982). 

127


Aminoglicozidele sunt antibiotice cu spectru larg de acţiune utilizate de obicei pentru 

tratarea unor infecţii produse de tulpini de E.coli, Klebsiella sp., Proteus sp., Enterobacter sp. 

Mecanismul prin care aceste antibiotice omoară celulele sensibile nu este pe deplin elucidat. 

Există numeroase date experimentale care evidenţiază că situsul primar de acţiune al acestor 

antibiotice ar fi ribosomii, ceea ce determină afectarea sintezei proteinelor. Efectele pleiotropice 

ale aminoglicozidelor asupra bacteriilor sunt considerate a fi consecinţa interacţiunii lor cu 

ribosomii. Alături de interferenţa cu sinteza proteică, aminoglicozidele induc distrugeri ale 

membranei plasmatice, afectează respiraţia celulară, acumularea de ARN şi determină în final 

moartea celulelor. In ceea ce priveşte mecanismul rezistenţei bacteriilor producătoare la acţiunea 

acestor antibiotice s-a evidenţiat faptul că acestea prezintă strategii diferite cum ar fi producerea 

unor enzime ce inactivează antibioticul sau modificarea situsului de acţiune al acestuia 

(Cundliffe, 1989). Spre exemplu, bacteriile producătoare de aminoglicozide sintetizează în 

acelaşi timp şi enzime ce modifică antibioticele respective: aminoglicozid-fosfotransferaza 

(APH) şi acetiltransferaza (AAC). De asemenea, bacteriile respective (S..kanamyceticus, 

S.tenebrarius) pot produce simultan şi enzime ce modifică unele situsuri de acţiune ale 

antibioticului (de exemplu, situsurile ribosomale) prin metilarea ARNr. 

Tetraciclinele reprezintă un grup destul de heterogen de antibiotice produse în special de 

bacterii din genul Streptomyces ele având în comun o structură chimică de bază dar variind în 

funcţie de grupările chimice care se leagă de această structură: oxitetraciclina (produsă de 

S.rimosus), tetraciclina (produsă de S. viridofaciens), clortetraciclina (sintetizată de 

S.aureofaciens). Tetraciclinele prezintă un spectru destul de larg de acţiune fiind bacteriostatice 

pentru diferite bacterii Gram pozitive şi Gram negative (cu excepţia tulpinilor de Salmonella, 

Proteus şi Pseudomonas) şi bactericide în concentraţii mari. Tinta principală de acţiune a acestor 

antibiotice este sinteza proteică, ele neavând efecte evidente asupra ADN, ARN sau asupra 

sintezei peretelui celular. Modalitatea exactă a legării tetraciclinelor la ribosomi nu este încă pe 

deplin cunoscută. Se pare că ele se leagă puternic de subunitatea 70S a ribosomilor ceea ce 

determină efectul inhibitor al antibioticelor. De asemenea, tetraciclina se leagă slab de 

subunitatea 30S ceea ce are drept consecinţă blocarea legării aminoacil-ARNt la această 

subunitate şi deci a alungirii lanţurilor polipeptidice. Autorezistenţa bacteriilor producătoare 

poate include modificarea situsurilor ţintă normale, inactivarea intracelulară a antibioticului sau 

eliminarea sa rapidă din celulă (Cundliffe, 1989). 

Cloramfenicolul este un antibiotic cu spectru destul de larg de acţiune, el fiind izolat în 

1947 din filtrat de cultură de S.venezuelae. Acţiunea cloramfenicolului constă în împiedicarea 

ARNm să se lege la ribosomi ceea ce se concretizează prin inhibarea sintezei proteice (a formării 

legăturilor peptidice) (Pongs, 1979). 

1.1.3. Antibiotice care inhibă replicarea şi transcrierea informaţiei genetice 

Dintre antibioticele care împiedică replicarea ADN şi sinteza ARNm menţionăm 

novobiocina, coumermicina şi rifamicinele. 

Novobiocina este un antibiotic cu o structură complexă produs de S.sphaeroides cu 

efect, de obicei, bacteriostatic asupra bacteriilor, mai ales în mediu acid. Similar ca acţiune este 

coumermicina A, un antibiotic izolat din culturi de S.rishinensis şi S.hazeliensis. La concentraţii 

mai mici de novobiocină şi cumermicină A este afectată doar replicarea ADN din celulele 

sensibile, nu şi procesul de transcriere. Cele două antibiotice pot afecta acţiunea ADN girazei, 

enzimă ce determină suprarăsuciri ale moleculei de ADN, ceea ce explică inhibarea replicării şi 

transcrierii informaţiei genetice (Ryan, 1979). Rezistenţa la novobiocină a bacteriei producătoare 

S.sphaeroides este determinată de gena gyrB al cărei produs, ADN giraza B este rezistentă la 

acţiunea acestui antibiotic (Cundliffe, 1989). 

Rifamicinele, având ca reprezentat tipic rifampicina reprezintă un grup de antibiotice 

macrociclice care acţionează, în special, asupra micobacteriilor şi bacteriilor Gram pozitive. 

128


Mecanismul lor de acţiune se referă la inhibarea procesului de transcriere a informaţiei genetice 

prin blocarea acţiunii enzimei ARN-polimeraza. 

Un alt antibiotic cu acţiune inhibitoare asupra acizilor nucleici este granaticinul, 

antibiotic de tip quinonic, izolat din culturi de S.olivaceus şi S.violaceoruber. Acţiunea sa „in 

vitro” se manifestă, atât la procariote cât şi la eucariote, asupra sintezei de ADN, ARN, dar şi de 

proteine. De aceea, granaticinul are efect antitumoral, împotriva leucemiei P388 şi efect citotoxic 

pentru celulele KB (Ogilvie şi Kersten, 1979). 

1.2. Acţiuni asupra celulelor animale 

Numeroase substanţe antibiotice nu au fost utilizate în practica medicală datorită acţiunii 

lor toxice asupra celulelor animale. Acest efect toxic rezultă din acţiunea directă asupra uneia 

dintre căile metabolismului primar, căi care sunt universale, de obicei, asupra producerii de 

energie sau exprimării genelor. Totuşi, toxicitatea asupra celulelor animale nu rezultă 

întotdeauna din inhibarea aceleiaşi reacţii care este ţintă la microorganisme. Spre exemplu, 

amfomicina care interferă cu transportul membranar al intermediarilor mureinei la bacterii, la 

celulele eucariote determină o blocare a glicozilării. 

Unele antibiotice care au evidenţiat o activitate de inhibare a creşterii mai multor tipuri de 

organisme au început să fie utilizate ca substanţe antitumorale datorită toxicităţii lor asupra 

celulelor ce proliferează rapid. Printre aceste substanţe, un loc important îl ocupă antraciclinele şi 

bleomicina substanţe care sunt produse de specii ale genului Streptomyces (Tsukagoshi şi 

colab.,1986). Descoperite iniţial ca agenţi antibacterieni, s-a dovedit ulterior că cele două familii 

de substanţe se leagă specific, prin intercalare, la moleculele de ADN iar bleomicina, în plus, 

poate determina scindarea catenelor de ADN. Citotoxicitatea selectivă a bleomicinei rezultă din 

scăderea activităţii unei enzime de inactivare din celulele tumorale. 

Un alt tip de produşi antimicrobieni sau inhibitori enzimatici cu activitate antitumorală 

este reprezentat de proteine de dimensiuni mici, cum ar fi: macromicinul, actinoxantinul, 

forfenicin sau bestatin, ce conţin o grupare prostetică cromoforă ce se intercalează în 

macromoleculele de ADN, modificându-le structura(Aoyagi şi colab.,1978). 

Unii metaboliţi secundari manifestă acţiune farmacologică specificpă asupra animalelor; 

în acest caz ei nu prezintă o citotoxicitate generală, dar acţiunea lor farmacologică îi poate face 

uneori extrem de toxici. Un exemplu îl constituie acţiunea vasodilatatoare a unui compus (WS 

1228A, B) izolat de la S. aureofaciens care însă nu este însoţită şi de toxicitate sau activitate 

antibiotică. Un alt compus, MY-336a, izolat din culturi de S. gabonae exercită acţiune 

antagonică cu receptorii β-adrenergici, avînd deci o acţiune farmacologică selectivă, netoxică 

(Kase, 1986). In cazul amicourmamicinei A izolate de la B. pumilis s-a evidenţiat iniţial o 

acţiune antibiotică, după care s-a dovedit a avea şi o activitate antiinflamatorie asupra animalelor 

testate (Itoh şi colab., 1981). 

De asemenea, printre substanţele izolate iniţial în experimentele de screening pentru 

activitatea antibiotică au fost descoperite unele care au acţiune de modulare a răspunsului imun. 

Spre exemplu, substanţa IC201 izolată de la S.cirratus şi S fimbriatus ca agent antitumoral, s-a 

dovedit a avea acţiune activatoare şi asupra macrofagelor. Un alt compus, macrolidul FK 506 

izolat de la S.tsukubaensis în cursul unor experimente de selecţie a unor substanţe care să inhibe 

producerea de interleukină-2 s-a dovedit a avea acţiune imunosupresoare. 

1.2.1. Activitate insecticidă 

S-a evidenţiat că numeroşi metaboliţi secundari produşi de streptomicete în special au 

acţiune insecticidă. Unii dintre ei, cum ar fi unele antibiotice macrolidice polienice, blochează 

respiraţia celulară sau inhibă sinteza proteică la eucariote, fiind astfel agenţi nespecifici. Alţi 

metaboliţi secundari, de tipul nikamicinei au acţiune specifică inhibând chitin-sintetaza şi deci 

129


acţionează asupra peretelui celular chitinos al insectelor. Un alt antibiotic, mibelmicina produsă 

de S. hygroscopicus subsp. aureolacrimosus, nu are efect antibacterian dar acţionează selectiv 

asupra insectelor având în plus şi efect antihelmintic şi acaricid. 

Intr-un studiu recent, Fabre şi colab.(1988) au izolat în urma unui complex proces de 

selecţie realizat asupra a 6280 de culturi de actinomicete, o nouă substanţă cu acţiune insecticidă. 

O importantă acţiune insecticidă este datorată biosintezei de către unele tulpini bacteriene a 

chitinazei care acţionează direct asupra învelişurilor insectelor patogene. 

1.3. Activitate asupra celulelor vegetale 

Unii metaboliţi secundari produşi de bacteriile din genul Streptomyces au acţiune 

fitotoxică şi uneori antifungică. Spre exemplu, herbicidinele produse de S.sagonensis sunt 

nucleozide cu acţiune fitotoxică pentru plantele dicotiledonate. Ele inhibă, de asemenea, şi 

dezvoltarea fungilor. Alte substanţe, cum ar fi herbimicinele produse de S.hygroscopicus au o 

foarte slabă activitate antibiotică, în schimb sunt toxice pentru celulele vegetale. In plus, 

herbimicina A inhibă dezvoltarea virusului mozaicului tutunului şi are acţiune antitumorală 

pentru celulele animale (Yamashita şi colab., 1989). O altă substanţă, homoalanozina, produsă de 

S. galileus este un antimetabolit al acidului aspartic şi acidului glutamic, ea exercitând acţiune 

insecticidă şi herbicidă (Fushimi şi altii,1989). 

De asemenea, numeroşi cercetători (Backman 1995, Baker 1985, Bachow 1995) au 

publicat date referitoare la capacitatea unor specii aparţinând genului Bacillus de a inhiba 

dezvoltarea unor ciuperci fitopatogene (Tabelul 1). In majoritatea cazurilor combaterea 

biologică a fungilor fitopatogeni implică folosirea factorilor biotici existenţi în mediul 

plantelor. Studiile efectuate până în prezent au evidenţiat capacitatea unor tulpini de Bacillus 

subtilis de a combate diferite ciuperci fitopatogene, cum ar fi : Macrophomina phaseolina – 

patogen la mazăre (Siddiqui 1995), Rhizoctomia solani - patogen la mazăre (Bochow 1994), 

fasole şi seminţe de grâu (Lazzareti 1994), Fusarium oxysporum şi Phytyum ultinacere – 

patogeni la tomate (Sadders 1996). 

Cele mai frecvente specii ale genului Bacillus care au prezentat capacitatea de a 

preveni şi combate evoluţia unor boli determinate de ciuperci fitopatogene sunt: Bacillus 

subtilis (Figura 3), Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus. 

Figura 3. Acţiunea inhibitoare a tulpinii B.subtilis B2 asupra fitopatogenului Sclerotinia sclerotiorum. 

Studiile privind oportunitatea utilizării acestor specii bacteriene în combaterea 

biologică s-au bazat pe proprietatea de a produce spori cu înaltă rezistenţă şi longevitate în 

condiţii naturale de mediu, acesta determinând posibilitatea obţinerii şi comercializării lor 

într-o manieră similară cu fungicidele chimice. 

In lupta pentru nutrienţi microorganismele au la dispoziţie un întreg arsenal de 

compuşi chimici care inhibă organismele competitive. Mulţi din aceşti compuşi au origine 

130


peptidică şi pot fi sintetizaţi ribozomal sau neribozomal. Multe dintre tulpinile de Bacillus 

subtilis produc o serie de substanţe de natură lipooligopeptidică din gama iturinului, care au 

activitate antifungică, hemolitică precum şi proprietăţi antibiotice. Structura chimică a acestor 

substanţe a fost determinată prin diverse metode (spectrometrie de masă (MS), gel 

cromatografie, cromatografie în strat subţire (TLC), lichid cromatografie (HPLC)). 

Componenta proteică a acestor substanţe este reprezentată de oligopeptide alcătuite din şapte 

aminoacizi, iar componenta lipidică conţine acizi graşi cu catena carbonică lungă (C14-C16). 

Astfel, iturin AL conţine o heptapeptidă (2 D-Asp, 1 L-Asp, 1 L-Glu, 1 L-Pro, 1 L- 

Ser, 1 D-Tir) şi un amestec de β-amino acizi graşi cu catenă lungă C14-C16. Iturin D şi iturin E 

conţin o heptapeptidă (3 Asp, 1 Glu, 1 Pro, 1 Ser, 1 Tyr) şi un amestec de β-amino acizi graşi 

cu catenă C14-C16, diferind de iturin A prin prezenţa unei grupări carboxil la iturin D şi o 

grupare carboximetil la iturin E. Mycosubtilin, o substanţă din gama iturinului, conţine o 

heptapeptidă ciclică (Asn, Tyr, Asn, Gln, Pro, Ser, Asn) legată de un β-amino acid gras. Tot 

din gama iturinului fac parte surfactinul şi fengycinul care conţin un β-hidroxiacid gras şi 

bacillomycinul care conţine un β-amino acid gras. 

Studii mai intense au fost efectuate cu o substanţă produsă de mai multe specii de 

Streptomyces (S. hygroscopicus, S. viridochromogenes) şi care a primit denumirea de bialafos 

(fosfinotricin-alanil-alanina). Aceasta substanţă a fost iniţial selectată pentru activitatea sa 

antibiotică după care s-a observat că ea are, de fapt, o acţiune mult mai complexă. Componentul 

activ al bialafosului este fosfinotricinul care inhibă glutamin-sintetaza din celulele vegetale, ceea 

ce îi conferă bialafosului o puternică acţiune herbicidă (Lea şi colab., 1984). 

Mulţi dintre metaboliţii secundari produşi de diverse microorganisme au fost testaţi 

pentru eventuala lor acţiune asupra unor enzime. Atunci când sistemul test a inclus enzime cheie 

în procesele farmacologice de la animale, numeroşi metaboliţi secundari au fost detectaţi ca 

având activităţi fiziologice "in vivo". Mulţi dintre aceşti compuşi au fost descoperiţi a fi inhibitori 

proteazici, acţionând asupra pepsinei, papainei, tripsinei, chimiotripsinei, catepsinei, elastazelor, 

aminopeptidazei B şi leucin-aminopeptidazei (Umezawa, 1982). Printre inhibitorii proteazici 

izolaţi de la actinomicete unii acţionează asupra reninei sau asupra unei zinc-exopeptidaze care 

converteşte angiotensina I în angiotensină II. 

Cercetările efectuate asupra culturilor microbiene au permis izolarea unor inhibitori şi ai 

altor enzime. Acesta este cazul inhibitorilor pentru glucozidaze (Muller, 1986), pentru cAMP 

(reticulol), pentru kinaze etc. 

2. Determinismul genetic al biosintezei unor antibiotice si a altor 

metaboliti secundari 

In urma experimentelor de cartare a genelor implicate în metabolismul secundar la 

procariote s-a evidenţiat faptul că acestea sunt grupate formând "clusteri". Localizarea acestor 

gene este, în majoritatea cazurilor, cromosomală dar, există cazuri cînd acestea sunt localizate pe 

plasmide (Hopwood, 1978; Kinashi şi colab.,1987). Spre exemplu, genele implicate în sinteza 

oxitetraciclinei de către S.rimosus sunt grupate în doi "clusteri" cromosomali (Binnie şi colab., 

1989). La fel şi genele care determină sinteza actinorhodinului şi undecilprodigiozinului de către 

tulpini de S. coelicolor (Rudd şi Hopwood, 1979), a eritromicinei de către Saccharopolyspora 

erythraea (Weber şi altii, 1985) sau avermectinei de către Streptromyces avermectilis (Ikeda şi 

colab., 1987). In plus, evidenţierea faptului că aceste grupuri de gene includ şi elemente 

reglatoare ca şi determinanţi genetici de rezistenţă la produsul antibiotic respectiv sugerează 

existenţa unui sistem foarte bine organizat, cu funcţionare complexă. Nu este însă stabilit cu 

exactitate dacă această organizare a genelor există şi în cazul altor metaboliţi secundari, fără 

131


activitate antibiotică, cum ar fi unii pigmenţi, alcaloizi, reglatori ai celulei vegetale etc. (Martin 

şi Liras, 1989). 

In ceea ce priveşte localizarea plasmidială a unor gene implicate în biosinteza unor 

antibiotice, datele referitoare la acest aspect sunt mai puţine. Un exemplu îl constituie genele 

pentru biosinteza metilenomicinei care se găsesc plasate pe plasmida SCP1 de la S. coelicolor 

(Wright şi Hopwood, 1978; Chater şi Bruton, 1985). De asemenea, de la bacteriile din genul 

Streptomyces au fost izolate o serie de plasmide lineare cu dimensiuni variate, între 5,4-17 Kb 

până la 350-520 Kb (Chardon-Loriaux, 1985; Kinashi şi colab., 1987). Evidenţierea plasmidelor 

lineare uriaşe la şase tulpini de Streptomyces producătoare de antibiotice şi examinarea corelaţiei 

dintre prezenţa lor şi sinteza de antibiotice a dus la concluzia că, cel puţin în cazul 

metilenomicinei, genele implicate în sinteza sa sunt plasate pe aceste plasmide care reprezintă 

aproximativ 5 % din cantitatea totală de ADN celular. Sunt însă necesare studii suplimentare 

pentru a stabili dacă şi în alte cazuri genele care determină sinteza unor antibiotice sunt localizate 

pe plasmide similare. 

2.1. Organizarea şi exprimarea genelor pentru unii metaboliţi secundari sintetiza şi de 

specii de Bacillus 

Cea mai mare parte a metaboliţilor secundari produşi de bacteriile din genul Bacillus sunt 

homo- sau heteropeptide. Spre exemplu, gramicidina S este un decapeptid ciclic format din 

douăă unităţi de D-Phe-L-Pro-L-Val-L-Orn-L-Leu, fiind produsă de tulpini de B. brevis, ca de 

altfel şi tirocidinele. Familia bacitracinelor cuprinde peptide alcătuite din 12 aminoacizi, produse 

de tulpini de B. licheniformis. Studiile cu extracte celulare au evidenţiat că aminoacizii 

constituenţi ai acestor compuşi sunt activaţi şi legaţi în subunităţile respective de către mai multe 

tipuri de peptid-sintetaze (Kleinkauf şi Van Dohren, 1987). 

Experimentele de clonare în E. coli a genelor pentru sinteza gramicidinei şi tirocidinei au 

evidenţiat faptul că în cazul tirocidinei sunt implicate trei enzime multifuncţionale, în timp ce la 

producerea gramicidinei S participă cel puţin 2 sintetaze (GS1 şi GS2) codificate de două gene 

diferite grsA şi grsB. 

2.2. Organizarea şi exprimarea genelor pentru unele antibiotice sintetizate de bacteriile din 

genul Streptomyces 

In cazul streptomicetelor au fost evidenţiaţi numeroşi metaboliţi secundari, dar numai 

puţini au o structură peptidică. Unul dintre aceştia, bialafosul prezintă importanţă practică 

deosebită, deoarece manifestă activitate herbicidă. Recent, Nakajima şi colaboratorii (1991) au 

izolat de la S.hygroscopicus un nou compus cu activitate herbicidă, care a primit denumirea de 

hidantocidin. Bialafosul, care a fost mai intens studiat, este sintetizat pornind de la piruvat sau 

fosfoenolpiruvat, printr-o cale metabolică care cuprinde cel puţin 13 etape (Thompson şi Anzai, 

1987). Experimentele de clonare cu genele implicate în sinteza acestui compus au evidenţiat 

faptul că în acest proces sunt implicate mai multe gene (cel puţin 7) grupate, alături de care se 

află şi gena pentru rezistenţa la bialafos (bar). Astfel, au fost obţinute două grupe de clone 

derivate de la mutante neproducătoare şi care au fost transformate cu plasmida pIJ61 

recombinantă (conţinea diferite gene de la S.hygroscopicus). Un grup de asemenea plasmide 

recombinante restabileşte productivitatea mutantelor care prezintă modificări ale etapelor 5, 6, 12 

şi 13 ale căii metabolice, în timp ce un alt grup restabilea producerea de bialafos de către 

mutantele blocate la nivelul etapelor 1, 3 şi 4. In plus, a fost realizat transferul unui segment de 

16 Kb, care restabilea productivitatea tuturor celor 7 tipuri de mutante. Acest segment de ADN 

conţinea şi gena bar care, de altfel, a permis şi identificarea clonelor transformate. Totuşi, acest 

fragment nu determină o producţie semnificativă de bialafos la mutantele neproducătoare, ceea 

132


ce sugerează existenţa unor gene suplimentare aflate în afara segmentului de 16 Kb, necesare 

exprimării complete a operonului pentru sinteza bialafosului. 

De asemenea, în urma experimentelor de clonare a genelor bar (de rezistenţă la bialafos) 

în diferite celule gazdă, inclusiv în celulele vegetale s-a evidenţiat faptul că pentru funcţionarea 

normală a genelor pentru biosinteza bialafosului sunt necesare încă trei gene diferite care 

determină adenilarea la diferite etape ale biosintezei. Aceste noi date conduc la presupunerea că 

genele implicate în biosinteza acestui compus se găsesc localizate la nivelul unui fragment de 

ADN de peste 34 Kb. 

Experimentele lui Anzai si ale colaboratorilor (1987) au evidenţiat faptul că prin clonarea 

unui fragment de ADN de 5,9 Kb, care conţine gena brpA are loc activarea transcrierii atât a 

genei bar cât şi a cel puţin altor 6 gene structurale bap. De asemenea, aceşti autori au arătat că 

atât la S.viridochromogenes, cât şi la S. hygroscopicus organizarea genetică a genelor implicate 

în sinteza bialafosului este identică. 

Un alt grup de metaboliţi secundari peptidici, actinomicinele (cromopeptide) este 

sintetizat în urma acţiunii unei enzime, fenoxazinon-sintetaza (PHS). Prin clonarea genei pentru 

PHS de la S. antibioticus în S. lividans (Jones şi Hopwood, 1984) s-au obţinut mai multe tipuri 

de clone: unele care conţineau gena structurală pentru PHS, iar altele care prezentau activitate 

PHS, dar care a rezultat în urma activării unei gene "tăcute" (silent gene) endogene de către 

fragmentul de ADN exogen transformant. Fenomenul este frecvent întâlnit în cazul 

streptomicetelor, el fiind semnalat şi în cazul tulpinilor producătoare de alţi metaboliţi secundari. 

Un exemplu îl constituie clonarea genelor pentru producerea cefamicinei de la S.cattleya la 

S.lividans, clonele producătoare rezultând în urma activării unor gene endogene silenţioase 

(Martin şi Liras, 1989). 

Mulţi dintre metaboliţii secundari produşi de streptomicete au o structură de tip 

macrolidic în care inelul macrociclic derivat de la poliketide este închis printr-o legătură 

lactonică. La acest inel macrociclic sunt, de obicei, ataşate glucide bazice sau neutre. Spre 

exemplu, eritromicina produsă de Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythraeus) 

conţine un inel lactonic (eritronolid) şi 2 glucide specifice, dezozamina şi cladinoza, sinteza sa 

realizându-se în aproximativ 30 etape enzimatice Prin clonarea în S.lividans a unor fragmente de 

ADN cromosomal izolate de la tulpini de S.erythraea producătoare de eritromicină s-a stabilit că 

trei dintre genele implicate în biosinteza antibioticului, eryA, eryB şi eryC sunt grupate şi 

localizate într-o unică regiune a cromosomului bacteriei producătoare. Utilizând un vector de 

clonare integrativ (care se poate integra în cromosomul gazdei) s-a stabilit că alături de genele 

care determină sinteza antibioticului se află şi gena pentru rezistenţa la eritromicină, ermE (genă 

care determină sinteza unei metilaze pentru ARNr) (Stanzak şi colab., 1986). De asemenea, Mc 

Alpine şi colab. (1987) au comunicat obţinerea unui antibiotic hibrid care a primit denumirea de 

2-noreritromicină, în urma clonării într-o mutantă de S.erythraea, care avea blocată ultima etapă 

a sintezei eritromicinei a unui fragment de ADN de 30-35 Kb izolat de la S.antibioticus 

producător de oleandomicină. 

Un alt antibiotic, tilozina produs de tulpini de S.fradiae prezintă o structură chimică 

asemănătoare eritromicinei, având un inel macrociclic, tilanolid şi trei glucide mai puţin 

răspândite: micaminoza, micaroza şi micinoza. Studiile referitoare la organizarea genelor 

implicate în sinteza acestui antibiotic au evidenţiat faptul că genele tyl (aproximativ 9 gene) sunt 

grupate, alături de ele aflându-se şi gena de rezistenţă (tlrB), precum şi o secvenţă de ADN 

amplificabil flancată de 2 secvenţe repetate direct (Baltz şi Seno, 1988). De asemenea, s-a stabilit 

că pentru exprimarea genei tylF, care codifică enzima ce controlează ultima etapă a căii 

metabolice de sinteză a antibioticului este necesară o proteină reglatoare (efector pozitiv) produsă 

de gena tylG. O situaţie asemănătoare prezintă şi genele care codifică sinteza carbomicinei şi 

rezistenţa la acest antibiotic (Martin şi Liras, 1989). 

133


Un alt grup de antibiotice derivate de la poliketide este reprezentat de tetracicline şi 

antracicline, antibiotice intens studiate datorită importanţei lor practice deosebite. In urma 

examinării mai multor tipuri de mutante incapabile de a sintetiza oxitetraciclina s-a dovedit că 

genele care codifică producerea acestui antibiotic se află localizate în două grupe plasate opus pe 

cromosomul bacterian. Prin clonarea în S.griseus a unor fragmente de ADN izolate de la 

S.rimosus s-a reuşit identificarea a două gene responsabile de rezistenţa la tetraciclină (Ohnuki şi 

colab., 1985): gena tetA care codifică un polipeptid care interferă cu sinteza proteinelor la nivel 

ribosomal şi gena tetB care determină o acumulare intracelulară redusă a antibioticului în celulele 

producătoare. Nu este, însă, clar dacă aceste gene se află localizate la nivelul celor douăă grupuri 

de gene sau au o altă dispunere. Au mai fost clonate şi alte gene de rezistenţă la tetraciclină, 

otcRI şi otcRII, dar nu s-a stabilit încă dacă aceste gene sunt sau nu identice cu cele anterioare. 

Recent, Butler şi colab. (1989) şi Binnie şi colab. (1989), au realizat o serie de clonări a unor 

gene implicate în sinteza şi rezistenţa la acest antibiotic şi au sugerat faptul că cel puţin o parte, 

dacă nu chiar toate genele structurale care codifică sinteza oxitetraciclinei sunt linkate cu genele 

de rezistenţă otcRI şi otcRII, formând, astfel, un singur "cluster". 

O grupare asemănătoare prezintă şi genele implicate în biosinteza/rezistenţa 

tetracenomicinei C, un antibiotic antraciclinic produs de S.glaucescens. 

Aminoglicozidele reprezintă un alt grup de antibiotice intens studiat datorită importanţei 

practice deosebite. Din acest grup streptomicinei i s-a acordat cea mai mare atenţie. Astfel, la 

S.griseus, cel mai cunoscut producător al acestui antibiotic, cel puţin 13 gene sunt implicate în 

biosinteza şi rezistenţa la streptomicină, ele fiind localizate într-un singur "cluster" cromosomal 

(Mansouri şi altii, 1989) (Figura 4). 

Figura 4. Reprezentarea schematică a genelor implicate în biosinteza streptomicinei la două specii de streptomicete: 

S.griseus şi S.glaucescens. 

Ohnuki şi colaboratorii (1985) au arătat că la S.griseus grupul de gene str este format din 

cel puţin 4 gene: strR, strA, strB şi strC. Gena strA codifică enzima streptomicin-6'fosfotransferaza 

care asigură rezistenţa la acest antibiotic; strB complementează o mutaţie la o 

tulpină care prezenta deficienţă în legarea streptidin-6-fosfatului de dihidrostreptoză; strR este o 

genă reglatoare care codifică un efector pozitiv necesar exprimării complete a genelor strA şi 

strB. Rezultate similare au obţinut Distler şi colab.(1987), care au evidenţiat că la S.griseus 

genele necesare sintezei streptomicinei sunt linkate cu gena aphD care codifică pentru enzima 

streptomicin 6-fosfotransferaza, genă similară genei sph pentru enzima hidroxi-streptomicin- 

134


fosfotransferaza de la S.glaucescens. Analizele de restricţie şi studiile de hibridizare a 

fragmentelor de ADN de la S.griseus şi S.glaucescens au relevat existenţa, în ciuda unei 

omologii de aproximativ 75 % a genelor implicate în biosinteza streptomicinei, a unor diferenţe 

majore, ceea ce sugerează faptul că, în cursul evoluţiei a avut loc o separare a genelor de 

biosinteză în două seturi distincte repartizate doar la speciile de Streptomyces (Martin şi Liras, 

1989). 

2.3. Organizarea şi exprimarea genelor de biosinteză a unor pigmenţi de către 

streptomicete 

Streptomicetele pot sintetiza pe lângă diferite antibiotice şi alţi metaboliţi secundari, cum 

ar fi pigmenţii, unii dintre aceştia manifestând şi o uşoară activitate antibiotică. Dintre aceştia cel 

mai mult studiat este actinorhodinul, un pigment de tip izocromanequinonic, produs de 

S.coelicolor printr-o cale poliketidică tipică (Floss, 1981). Pigmentul respectiv produs de 

bacteriile cultivate pe mediul R2YE este roşu şi nedifuzibil la pH neutru dar, după expunere la 

vapori de amoniac devine albastru şi difuzibil. In urma cercetărilor efectuate pe diferite tulpini 

mutante de S.coelicolor s-a realizat o grupare a acestora în mai multe clase (7) în funcţie de 

variaţiile de exprimare a genelor care alcătuiesc "clusterul" act. Rezultatele obţinute au permis 

elaborarea unei ipoteze referitoare la sinteza unor metaboliţi secundari de tip poliketidic, ţinând 

cont de marea varietate de asemenea metaboliţi (macrolide, poliene, polieteri, tetracicline, 

antracicline, ansamicine, isocromaquinone etc). Se pare că la toţi metaboliţii secundari de tip 

poliketidic, esterii acil-CoA şi β-cetoacizii condensează împreună printr-un mecanism de 

polimerizare de tip cap-coadă, ceea ce conduce la obţinerea unor lanţuri alifatice de diferite 

dimensiuni. Aceste lanţuri suferă, ulterior, modificări suplimentare, care le asigură specificitatea 

(Hopwood şi Sherman, 1990). Dacă reacţia de condensare realizată prin intervenţia unei enzime 

de tip β-ceto-acil-tioester-sintetaza ("enzima de condensare") este comună tuturor metaboliţilor 

secundari poliketidici, atunci ar însemna că între secvenţele care codifică poliketid-sintetazele la 

diferite organisme producătoare există o mare omologie care este conservată. Pornind de la o 

asemenea ipoteză, Malpardita şi colab.(1987) au utilizat genele act de la mutantele din clasele I 

şi III ca probe de ADN în experimentele de hibridizare şi au observat că între acestea şi ADN de 

la 14 dintre cei 18 producători de poliketide se produce hibridizare cu intensitate variată, deci 

există omologie. Probele nu au hibridizat cu ADN izolat de la tulpinile care produc tetraciclină, 

eritromicină, candicidină şi curamicin. Aceste rezultate demonstrează o corelaţie, incompletă, 

între producerea de poliketide şi prezenţa de secvenţe de ADN care sunt parţial omoloage cu 

actinorhodin poliketid-sintetaza. Această strategie de hibridizare poate fi extinsă prin utilizarea 

unor probe de ADN a unor secvenţe care codifică diferite sintetaze izolate de la tulpini bacteriene 

variate, ceea ce ar permite recunoaşterea unor producători criptici ai unor clase de metaboliţi 

secundari particulari. Prin alterarea specificităţii de substrat a unor sintetaze specifice utilizând 

mutageneza directă sau recombinarea"in vitro" a genelor care codifică pentru aceste enzime pot 

fi obţinute noi antibiotice cu proprietăţi speciale. 

Alte două tipuri de pigmenţi, metilenomicin produs de tulpini de S.coelicolor şi 

S.violaceoruber sau undecilprodigiozin produs de S.coelicolor A3(2) au fost studiate cu o 

intensitate mai scăzută, rezultatele obţinute sugerând şi în aceste cazuri o grupare a genelor 

implicate în biosinteza produşilor respectivi (Malpardita şi colab., 1990). 

Gruparea în "clusteri” a genelor care codifică căi ale metabolismului secundar reprezintă 

un fenomen comun pentru numeroase tipuri de substanţe. In cazul "clusterilor" pentru sinteza 

tetra-cenomicinei şi actinorhodinului s-a evidenţiat o subgrupare specială a genelor componente 

care controlează momentul apariţiei fiecărei enzime în calea metabolică respectivă, astfel încât 

intermediarii apar în anumite etape ale reacţiilor biochimice. Formarea secvenţială a enzimelor 

este binecunoscută în căile de biosinteză a metaboliţilor secundari la fungi şi streptomicete 

135


(Martin şi Liras, 1989). Cuplarea strânsă a proceselor de transcriere/traducere la streptomicete şi 

la alte procariote, precum şi faptul că genele structurale sunt grupate şi ordonate permite ca 

enzima obţinută în urma acestor fenomene să acţioneze asupra produsului enzimei anterioare 

(Motamedi şi Hutchinson, 1987). 

O acţiune mai eficientă a enzimelor poate rezulta în urma grupării enzimelor în complexe 

enzimatice, fenomen întâlnit în cazul biosintezei gramicidinei,tirocidinei şi bacitracinei. 

Poliketidele şi metaboliţii secundari polienici sunt formaţi prin acţiunea unor complexe 

enzimatice care cuprind sintetaze specifice. 

2.4. Coordonarea exprimării genelor de biosinteză şi rezistenţă 

Deoarece genele implicate în biosinteza şi rezistenţa la antibiotice sunt grupate este foarte 

probabil să existe o coordonare a exprimării genelor pentru a nu produce disfuncţii. Dacă un 

metabolit secundar este activ faţă de tulpina producătoare, mecanismele de protecţie (inactivarea 

antibioticului sau sporirea eliminării lui) trebuie să fie induse înaintea acumulării metabolitului 

respectiv. 

Există numeroase exemple referitoare la inducerea exprimării genelor de rezistenţă la 

antibiotice la bacteriile din genul Streptomyces. Astfel, exprimarea genelor de rezistenţă la 

tetraciclină, tetA şi tetB de la S.rimosus şi S.griseus a fost indusă de adăugarea de tetraciclină în 

mediul de cultură (Ohnuki şi colab., 1985). Nivelul rezistenţei a crescut de 2 ori atunci când s-a 

mărit cantitatea de tetraciclină adăugată (de la 5 la 50µg/ml). Aceasta sugerează faptul că 

inducerea genelor de rezistenţă protejează tulpinile producătoare faţă de creşterea nivelului 

antibioticului în timpul cultivării. 

Gena de rezistenţă la streptomicină (strA sau aphD) de la S.griseus se află plasată alături 

de genele pentru biosinteza antibioticului şi se găseşte sub un control dublu, pozitiv şi negativ. 

Ea este indusă de streptomicină, dar nu şi de streptavidin. Exprimarea genei strA se află sub un 

control negativ exercitat de o proteină represor de 40 KDa codificată de o secvenţă (ORF) 

plasată în apropierea acestei gene. De asemenea, ea este stimulată de produsul genei strR care 

activează în acelaşi timp şi gena strB (genă structurală care codifică o amidinotransferază) 

(Ohnuki şi colab., 1985) (Figura 5). 

Figura 5. Model ipotetic al transcrierii genelor implicate în sinteza şi rezistenţa la streptomicină (după Piepersberg şi 

colab., 1988). 

In mod similar, gena de rezistenţă la kanamicină clonată de la bacteria producătoare 

S.kanamyceticus se exprimă după inducere în noile gazde (S.lividans, S.lavendulae sau 

S.parvulus) (Nakana şi colab., 1984). 

S-a dovedit că multe dintre tulpinile de Streptomyces producătoare de antibiotice prezintă 

două sau mai multe mecanisme de rezistenţă la antibioticele pe care le produc, probabil ca o 

modalitate de protecţie faţă de antibiotice înrudite. Spre exemplu, în cazul tulpinilor de 

136


S.kanamyceticus există două mecanisme de rezistenţă la kanamicină: una este modificarea 

ribozomilor, iar cealaltă presupune inactivarea antibioticului de către o enzimă specifică (6'-Nacetiltransferaza) 

(Nakano şi colab., 1988). La S.fradiae, la o tulpină industrială au fost 

identificate cel puţin trei gene diferite care asigură rezistenţa la tilozin, gene care sunt linkate la 

genele de biosinteză. 

In unele situaţii, enzima codificată de gena de rezistenţă poate îndeplini şi alte funcţii 

catalitice în cadrul căii metabolice de biosinteză a antibioticului respectiv. Acesta este cazul 

genelor de rezistenţă la puromicină sau bialafos, care se pare că sunt implicate şi în unele dintre 

etapele intermediare ale sintezei metabolitului respectiv, ceea ce înseamnă că exprimarea genelor 

de biosinteză şi rezistenţă se află sub acelaşi mecanism de reglare. 

2.5. Reglarea exprimării genelor implicate în metabolismul secundar 

Metabolismul secundar este o formă de diferenţiere biochimică a microorganismelor. 

Reglarea desfăşurării sale este realizată prin diferite mecanisme. Astfel, factorul A este o 

proteină reglatoare cu efecte pleiotropice care stimulează atât biosinteza şi rezistenţa la 

streptomicină, cât şi sporularea la S.griseus şi S.bikinensis. Au fost identificate, astfel, mai multe 

gene ai căror produşi de transcriere controlează diferite procese. Un exemplu este reprezentat de 

gena afsA ("A factor synthesis"), care a fost izolată de la S.bikinensis, şi apoi clonată în diferite 

gazde. O altă genă, afsB a fost izolată de la S.coelicolor şi s-a dovedit că ea codifică o proteină 

reglatoare care stimulează atât producerea de factor A, cât şi a unor pigmenţi cum ar fi 

actinorhodinul şi undecilprodigiozinul. 

O situaţie interesantă o prezintă gena saf ("secondary metabolism-acting factor") izolată 

de la S.griseus, genă care este implicată într-un mecanism de control comun pentru diferenţierea 

celulară, pentru producerea a cel puţin patru enzime extracelulare şi pentru formarea de pigment 

(Martin şi Liras, 1989). Secvenţa aminoacizilor pe care îi conţine produsul genei saf indică faptul 

că acesta interacţionează cu ADN, secvenţa respectivă conţinînd un domeniu tipic de legare la 

ADN. Aceasta înseamnă fie că polipeptidele de legare la ADN interacţionează specific cu 

secvenţe reglatorii ale genelor implicate în metabolismul secundar, fie că ele controlează 

exprimarea genelor care determină formarea factorului A sau a altor efectori pleiotropici, 

influenţând, astfel, exprimarea grupurilor de gene care codifică enzimele metabolismului 

secundar. 

Genele implicate în biosinteza metabolismului secundar nu sunt exprimate, de obicei, în 

culturile cu o rată mare de creştere. Astfel, numeroase sintetaze aparţinând metabolismului 

secundar sunt fie inhibate fie represate de nivelul surselor de carbon, fosfor, sau azot în timpul 

fazei de creştere a producătorilor (Martin, 1989). 

Un alt mecanism de coordonare a exprimării genelor, evidenţiat iniţial la B.subtilis, 

E.coli, dar şi la alte bacterii, este producerea unor factori sigma sau a altor proteine care modifică 

specificitatea ARN polimerazei, conducând la o exprimare selectivă a unor seturi speciale de 

gene. Si în cazul streptomicetelor a fost evidenţiată o heterogenitate a ARN polimerazelor 

(Westpheling şi col.ab, 1985). Spre exemplu, două holoenzime de ARN polimerază (E 35 şi E 

49) de la S.coelicolor recunosc doi promotori bine definiţi de la B.subtilis. Promotorii de la 

streptomicete sunt destul de variaţi: unii care prezintă conservate regiunile -10 şi -35 par a fi 

similari celor de la E.coli, în timp ce alţii sunt complet diferiţi (Jansen şi colab, 1985). Distanţa 

dintre cele două regiuni conservate, -10 şi -35, este un factor important al determinării tăriei 

promotorului. Astfel, o distanţă de aproximativ 17 perechi de baze este corelată cu o activitate 

optimă a promotorului, în timp ce o distanţă mai mică de 15pb sau mai mare de 20pb este 

asociată cu o scădere a activităţii sale. 

Date recente (Buttner şi colab., 1988) indică faptul că gena pentru agarază (dagA) de la 

S.coelicolor care conţine patru promotori diferiţi este transcrisă de cel puţin trei forme diferite 

137


(holoenzime) de ARN polimerază. Similar, genele galE şi galK de la S.lividans sunt transcrise de 

două ARN polimeraze de la nivelul a doi promotori, galP1 şi galP2. 

Deşi existenţa mai multor factori sigma este bine cunoscută, semnificaţia fiziologică a 

diferitelor holoenzime de ARN polimerază rămâne încă neclară. La streptomicete multe dintre 

secvenţele aflate înaintea regiunii start a transcrierii unor gene conţin doi sau mai mulţi 

promotori dar nu este clar dacă toţi promotorii funcţionează "in vivo" (Tomich, 1988). 

Recunoaşterea diferenţiată a promotorilor aranjaţi în tandem de către diferite ARN polimeraze 

poate explica exprimarea selectivă a anumitor seturi de gene în timpul creşterii şi diferenţierii 

morfologice şi a altor gene în timpul desfăşurării metabolismului secundar. Aranjarea genelor 

implicate în biosinteza antibioticelor în grupuri ("clusteri") este deci de mare interes în legătură 

cu exprimarea diferenţiată a genelor. 

2.6. Seminificaţia biologică a metaboliţilor secundari 

Semnificaţia biologică a metaboliţilor secundari produşi de diferite microorganisme nu 

este încă foarte clară. Sinteza lor ar reprezenta rezultatul unor "erori de metabolism" fără 

importanţă pentru fiziologia microorganismului producător. In legătură cu rolul metaboliţilor 

secundari au fost avansate numeroase propuneri pornind de la studiul în laborator al activităţii 

acestor compuşi. Vining (1990) consideră că funcţiile metaboliţilor secundari pot fi grupate în 

două categorii: unele care privesc direct producătorul (funcţii intrinseci) şi altele care asigură 

anumite beneficii producătorului prin acţiunea în exterior, în mediu (funcţii extrinseci). In cadrul 

funcţiilor intrinseci, unii metaboliţi secundari pot fi precursori ai unor componente structurale 

cum ar fi de exemplu streptomicina care, se sugerează că ar fi un constituent al învelişului 

mureinic (Szabo şi colab., 1989). De asemenea, alţi metaboliţi secundari joacă un rol important 

în sporulare şi în germinarea sporilor la actinomicete şi la bacili ca şi în diferenţierea celulară 

(Chater, 1989; Maplestone şi colab.,1992). 

Atunci când activitatea metaboliţilor secundari este direcţionată asupra altor organisme 

din mediul înconjurător, aceste substanţe pot fi considerate ca "agenţi ecologici" asigurând producătorilor 

supravieţuirea în cadrul competiţiei cu alte organisme ce populează aceeaşi nişă 

ecologică. De asemenea, datele obţinute până în prezent în urma analizei secvenţei de nucleotide 

sprijină conceptul că metabolismul secundar a rezultat în urma modificărilor căilor existente ale 

metabolismului primar. Deşi secvenţa de aminoacizi identificată deductiv din secvenţa de 

nucleotide a genelor corespunzătoare este suficientă pentru a indica o origine comună, pentru ca 

datele să fie mai concludente ar fi necesară o comparare a genelor de la specii diferite decât de la 

aceeaşi specie. Informaţiile obţinute în acest fel sugerează că transferul natural de gene între 

diferite organisme a reprezentat un important factor în evoluţia metaboliţilor secundari. Multe 

dintre căile metabolismului secundar pot avea o origine foarte veche, modificările care apar la 

nivelul lor putând rezulta în urma achiziţiilor mai recente de material genetic exogen la nivelul 

unor microorganisme producătoare. 

Pe baza cunoştinţelor acumulate în domeniu, Vining (1992) stabileşte o serie de 

caracteristici clare ale metabolismului secundar: 

1. metaboliţii secundari nu sunt esenţiali pentru creştere şi tind să fie specifici de tulpină; 

2. aceşti compuşi au o mare varietate de structuri chimice şi activităţi biologice; 

3. metaboliţii secundari derivă din intermediari ai metabolismului primar prin căi de 

biosinteză unice. Aceste căi sunt deseori lungi şi complexe; reacţiile biochimice sunt catalizate 

de enzime cu specificitate de substrat diferită de cea a enzimelor echivalente ale metabolismului 

primar; 

4. formarea metaboliţilor secundari este determinată de seturi de gene asociate supuse 

unui mecanism de reglare care se referă atât la nivelul exprimării genelor cât şi la momentul 

declanşării acesteia; 

138


5. mecanismele de control este bine integrat cu fiziologia organismului producător. 

Relativ recent, Davies (1990) a propus ideea că metaboliţii secundari sunt substanţe cu 

origine foarte veche şi că mulţi dintre ei exercită activităţi biologice cunoscute (cum sunt 

antibioticele) datorită interacţiunii cu anumite situsuri vechi, conservate ale diferitelor 

macromolecule. Aceasta înseamnă că metaboliţii secundari au jucat un rol important în evoluţia 

reacţiilor biochimice, înainte ca enzimele să fie disponibile. Spre exemplu, reacţiile de biosinteză 

erau catalizate sau modulate de molecule cu greutate moleculară mică care erau prezente în 

atmosfera Pământului sau erau produse în "supa primordială". Odată ce sistemul de traducere a 

evoluat iar proteinele au început să fie produse şi să exercite diferite funcţii, rolul produşilor cu 

greutate moleculară mică a fost înlocuit de mecanisme mai complexe în care sunt implicate 

polipeptidele, dar aceştia şi-au menţinut capacitatea de a interacţiona cu anumite situsuri 

receptoare din macromolecule (acizi nucleici sau proteine). 

Conceptul rolului cheie primordial al moleculelor cu greutate moleculară mică ca efectori 

(stimulatori) ai biosintezelor sugerează o nouă abordare a modalităţilor de screening pentru 

diferite activităţi farmacologice. In locul urmăririi exclusive a efectelor inhibitorii este necesar să 

se studieze activitatea stimulatoare fie a unor celule întregi fie a unor extracte celulare 

(Murakama şi colab.,1989). Numeroase organisme (poate chiar toate) produc compuşi cu 

greutate moleculară mică cu activitate antibiotică, cum ar fi de exemplu defensinele (Gabai şi 

colab., 1989). In acest sens, microorganisme de tipul streptomicetelor sunt neobişnuite în sens 

evolutiv deoarece ele şi-au dezvoltat şi menţinut căile necesare pentru a produce o gamă foarte 

largă de compuşi cu greutate moleculară mică atunci când sunt cultivate în mod corespunzător. 

Acţiunea acestor compuşi este foarte variată, ei inhibând de obicei desfăşurarea unor procese 

biochimice diferite. Studii mai amănunţite asupra activităţii acestor substanţe antibiotice a 

evidenţiat însă că multe dintre ele au efect stimulator asupra transferului de gene 

(aminoglicozidele, penicilinele, tetraciclinele), asupra transpoziţiei (tetraciclina), transcrierii 

(eritromicina, tiostreptonul), creşterii celulare (kanamicina, streptomicina, eritromicina) sau 

mutagenezei (streptomicina). Pornind de la aceste observaţii, Davies (1990) propune că efectorii 

cu greutate moleculară mică şi situsurile lor de acţiune datează dinaintea stabilirii rolului 

proteinelor, deşi acţiunea lor este mai puţin eficientă şi are o specificitate scăzută. Odată ce 

organismele devin din punct de vedere genetic şi biochimic mai evoluate, rolul efectorilor cu 

greutate moleculară mică este preluat de proteine care asigură o eficienţă şi specificitate de 

acţiune ridicată. 

3. Enzime produse de bacteriile din genurile Bacillus si 

Streptomyces 

Deşi streptomicetele produc mai mult de 60% dintre antibioticele cunoscute, există 

relativ puţine date referitoare la echipamentul enzimatic al acestor bacterii. Tinând cont de faptul 

că streptomicetele sunt microorganisme din sol unde există o mare varietate de posibile 

substraturi nutritive, este logic de presupus că aceste bacterii prezintă o mare varietate de căi 

metabolice putând sintetiza unii intermediari prin căi diferite. Căile metabolice alternative fac 

posibilă utilizarea eficientă a celor mai multe substrate disponibile (Behal, 1986). 

In ultimii ani bacteriile din genul Streptomyces constituie un serios subiect de studiu din 

punctul de vedere al enzimelor pe care le produc, multe dintre ele fiind de importanţă 

biotehnologică (proteaze, amilaze, glucoz-izomeraze, celulaze, hemicelulaze, endonucleaze, 

chitinaze etc. Mai mult, s-a dovedit că cel puţin unele dintre aceste enzime sunt produse simultan 

cu unele antibiotice (tabelul 2) (Pokorny şi Vitale, 1980). 

Unele dintre enzimele sintetizate de către streptomicete sunt sau pot fi folosite în practica 

medicală fie în stabilirea unor diagnostice fie în terapie. Acesta este cazul colesterol-oxidazei 

produsă de unele specii de Streptomyces şi Nocardia care este utilizată pentru dozările de 

139


colesterol din ser, sau al urat-oxidazei produsă de S.cyanogenus care poate fi utilizată pe scară 

largă pentru detectarea enzimatică a acidului uric (Srinivasan şi colab., 1991). 

Producerea enzimelor hidrolitice de către streptomicete depinde în mare măsură de 

substratul pe care acestea sunt cultivate astfel că datele prezentate în Tabelul 2 pot fi completate 

şi cu alte tipuri de enzime. Uneori însă, datorită scopului în care enzimele ar putea fi utilizate (de 

exemplu în industria alimentară) se preferă utilizarea unor tulpini bacteriene producătoare care 

însă să nu sintetizeze substanţe toxice sau potenţial toxice (cum sunt de altfel antibioticele) 

Tabelul 2. Enzime entracelulare produse de unele bacterii producătoare de antibiotice 

Specia bacteriană Antibioticul Enzimele detectate 

S.griseus streptomicina proteaze, elastaze, amilaze, peptidaze 

S.rimosus oxitetraciclin proteaze, elastaze, 

S.aureofaciens tetraciclina proteaze, amilaze 

S.fradiae neomicina proteaze, elastaze, keratinaze 

S.antibioticus oleandomicina proteaze, amilaze 

S.venezuelae cloramfenicol Proteaze 

B.licheniformis Bacitracina Proteaze 

B.subtilis Bacitracina Proteaze 

De asemenea, studii recente au demonstrat posibilitatea utilizării bacteriilor din genul 

Streptomyces pentru clonarea unor gene cu origine diferită şi pentru producerea proteinelor 

corespunzătoare (Erpicum şi colab., 1990). In plus, metaboliţii secundari ai acestor bacterii oferă 

avantajul exprimării (sintezei) prelungite a unui produs şi după faza iniţială de creştere a culturii 

(Gardner şi Cadman, 1990). 

In cazul enzimelor produse de bacteriile din genul Bacillus, aplicaţiile practice sunt bine 

cunoscute, ele fiind prezentate pe scurt în Tabelul 3. 

Tabelul 3. Tipuri de enzime hidrolitice produse de bacili şi principalele aplicaţii ale acestora 

Enzima Tipul enzimei Specia producătoare Utilizări 

Proteaze alcaline Extracelulare B. subtilis 

detergenţi 

B. pumillus 

industria alimentară 

B. amylosacchariticus 

B. licheniformis 

industria pielăriei 

Proteaze neutre Extracelulare B.subtilis 

Industria berii 

B. amyloliquefaciens 

B. thermoproteolyticus 

B. amylosacchariticus 

B. stearothermophilus 

B. cereus 

Industria alimentară 

α-amilaze Extracelulare B. subtilis 


B.licheniformis 

B.coagulans 

B. stearothermophilus 

B. cereus var.mycoides 

degradarea amidonului 

Β-amilază Extracelulare B. polymyxa 

industria alimentară 

B.circulans 

B. megatherium 

B. cereus var.mycoides 

degradarea amidonului 

Celulaze Extracelulare B.subtilis 


B.polymyxa 

Industria textilă 

B. licheniformis Industria celulozei şi hârtiei 

B. cereus 

Zootehnie 

Tratarea deşeurilor agricole 

140


Datorită acestor considerente o trecere în revistă a principalelor tipuri de enzime (cu 

posibilă valoare biotehnologică) este nu numai interesantă ci şi necesară. 

3.1. Proteaze 

Proteazele microbiene constituie un grup complex de enzime hidrolitice, care diferă 

prin specificitatea de substrat, mecanism de reacţie, dependenţa activităţii enzimatice şi 

stabilităţii în funcţie de pH şi temperatură. Acţiunea lor poate fi blocată, activată, sau inhibată 

într-o anumită proporţie de agenţi fizici, chimici sau biologici. Producţia şi caracteristicile 

enzimelor microbiene pot fi influenţate prin selecţia tulpinii producătoare şi alegerea 

condiţiilor de cultivare ale acesteia. 

Enzimele din categoria proteazelor hidrolizează majoritatea proteinelor comune cum 

ar fi: caseina, hemoglobina, gelatina, albumina de ou, glutenul, proteina din soia şi alte 

proteine vegetale şi animale. Condiţiile de hidroliză precum şi randamentul operaţiei în sine 

depind însă de natura, caracteristicile şi gradul de puritate al preparatului proteolitic utilizat. 

Numeroasele utilizări ale enzimelor proteolitice, în cele mai diferite domenii de activitate 

(industria alimentară, farmaceutică, agricultură, industria detergenţilor, medicină) au 

determinat demararea cercetărilor în vederea obţinerii acestora pe cale biotehnologică ţinând 

seama în acelaşi timp de avantajele pe care le oferă utilizarea microorganismelor ca sursă 

biologică, precum şi de proprietăţile enzimelor microbiene. 

Proteazele reprezintă un grup de enzime hidrolitice, de obicei extracelulare, care 

scindează molecula proteică în fragmente polipeptidice formate din câţiva aminoacizi uniţi prin 

legături peptidice. Aceste polipeptide pot fi în continuare degradate de către peptidaze până la 

aminoacizii componenţi. Peptidazele, în funcţie de modul lor de acţiune sunt de două tipuri: 

endopeptidaze şi exopeptidaze. La rândul lor exopeptidazele pot fi: aminopeptidaze care îşi încep 

acţiunea de la nivelul extremităţii NH2 libere a polipeptidului, activitatea lor depinzând de 

prezenţa unor ioni metalici; carboxipeptidaze care îşi încep atacul de la capǎtul COOH liber al 

peptidului (Scriban, 1988). 

Clasificarea enzimelor proteolitice se face, conform recomandǎrilor International Unit of 

Biochemistry în şase familii, diferenţele dintre ele datorându-se secvenţelor de aminoacizi care 

alcătuiesc situsul activ (Tabelul 4) (Neurath, 1989). 

Tabelul 4. Familii de enzime proteolitice (după Neurath, 1989) 

Familia Proteaze reprezentative Resturi caractiristice de 

aminoacizi ale situsului activ 

Serin proteaze I Chimiotripsina, tripsina, elastaza, 

kalikreina,pancreatina 

Asp 102 Ser 195 His 57 

Serin proteaze II Subtilizina Asp 32 Ser 221 His 64 

Cistein proteaze Papaina, actinidin, catepsina B şi H de 

la şobolan 

Cys 25 His 159 Asp 158 

Aspartic proteaze Penicilopepsin, renina, proteaze acide Asp 33 Asp 213 

de la Rhizopus sp. 

Metaloproteaze I Carboxipeptidaza A bovină Zn, Glu 270 Try 248 

Metaloproteaze II Termolizina Zn Glu 143 His 231 

Membrii fiecărei familii se crede că au rezultat dintr-o formă ancestrală comună, în urma 

unui proces evolutiv divergent. Din datele prezentate în tabelul 2 se remarcă faptul că serin 

proteazele includ două familii distincte: serin-proteazele de la mamifere şi cele de origine 

bacteriană. Deşi prezintă un mecanism enzimatic comun, cele două familii de serinproteaze 

diferă ca secvenţă de aminoacizi şi ca structură tridimensională. 

141


In mod similar, metalopreoteazele includ şi ele tot două familii în funcţie de originea lor 

şi de structura chimică: de la mamifere şi de la bacterii. Există şi alte enzime proteolitice 

identificate la diferite grupe de organisme care nu pot fi încadrate încă în nici una dintre grupele 

de mai sus deoarece mecanismul lor de acţiune şi situsul activ nu este cunoscut cu exactitate. 

Acesta este cazul colagenazelor şi aminopeptidazelor. 

Proteazele bacteriene produse de tulpini de Bacillus subtilis sunt amestecuri de 

proteaze alcaline (subsubclasa 3.4.21, proteaze serinice) şi proteaze neutre (subsubclasa 

3.4.24, metaloproteaze). 

Proteazele serinice au în centrul lor activ serina şi histidina. Acest grup a fost divizat 

de Morihara în alte 4 subgrupe: 

• proteaze similare tripsinei; 

• proteaze alcaline; 

• proteaze Myxobacter α-litice; 

• proteaze stafilococice. 

Proteazele similare tripsinei cuprind, în afară de tripsină şi chimotripsină, enzime 

produse de specii de Streptomyces, care hidrolizează legăturile Arg 22 – Gly 23 şi Lys 29 – Ala 30 

din lanţul β-insulinic, această specificitate de substrat fiind trăsătura distinctivă. 

Aceste enzime acţionează la pH 8,0, au temperatura optimă de cataliză 50°C, sunt 

inhibate de diizopropilfluorfosfat (DIFP), p–cloromercurilbenzoic (PCMB), tosyl-L-lizinclorometilcetonă 

(TLCK), tripsin-inhibitorul din soia. Activitatea lor nu este influenţată de 

etilendiaminotetraacetat (EDTA) şi acid iod-acetic (IAA), în plus prezintă şi activitate 

esterazică şi amidazică. 

A doua grupă de proteaze serinice sunt proteazele alcaline; acestea pot fi produse de 

bacterii, drojdii şi fungi fiind prezente şi în ţesuturile animale. În această grupă se încadrează 

şi proteazele alcaline produse de unele tulpini de B.subtilis şi cele fungice din Aspergillus 

oryzae. 

Aceste proteaze au acţiune specifică faţă de resturile de aminoacizi aromatici sau 

hidrofobi care participă cu gruparea carboxil la legătura care se scindează; valoarea optimă a 

pH este cuprins între pH 9 şi pH 11, dar enzimele rămân active în domeniul de pH 5–9; aceste 

proteaze sunt inhibate de DIFP, de PMSF fiind însă rezistente şa acţiunea EDTA sau 

ortofenantrolinei. Din acest grup fac parte proteazele cunoscute sub denumirea de subtilizine 

sau subtilopeptidaze. S-a constatat că aceste proteaze nu sunt exclusiv produse de B.subtilis ci 

în general de bacterii ale genului Bacillus astfel încât s-a propus numele generic de 

bacilopeptidaze. Respectivele enzime pot fi clasificate în două grupe: 

• Bacilopeptidaze A care cuprind subtilizina Carlsberg (proteaza alcalină produsă de 

tulpini de B.licheniformis) şi proteaza alcalină produsă de B.pumilis; 

• Bacilopeptidaze B care includ subtilizina NOVO (protează alcalină sintetizată de 

B.subtilis NRRL B3411) şi subtilizina BNP (Bacterial Protease Nagarse), protează 

alcalină din B. subtilis var. amylosacchariticus. 

Metodele de examinare a amestecurilor de enzime produse de diferiţi bacili au arătat 

că bacteriile producătoare de bacilopeptidaze A nu sintetizează proteaze neutre sau amilază, în 

timp ce bacteriile producătoare de bacilopeptidaze B sintetizează în acelaşi timp şi proteaze 

neutre şi amilază în acelaşi timp. 

Metaloproteazele sunt proteaze activate de ionii metalici legaţi de centrul activ al 

enzimei (Ca 2+ , Zn 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ ). Ele pot fi metaloproteaze neutre şi metaloproteaze alcaline. 

Proteazele neutre conţin de obicei Zn şi prezintă specificitate faţă de aminoacizii hidrofobi 

implicaţi cu gruparea amino în legătura peptidică. Ele au un pH optim de acţiune cuprins între 

pH 7 şi pH 8, sunt inhibate complet de EDTA (care complexează atomul de Zn din structură) 

142


fiind sensibile la concentraţii de EDTA sub 10 -3 M, orto-fenantrolină, nefiind afectate de DIFP 

şi PCMB. 

Metaloproteazele alcaline conţin, de asemenea, un ion metalic implicat în mecanismul 

de reacţie catalitică. Ele îşi manifestă activitatea optimă în domeniul de pH 7–9, fiind mai 

puţin inhibate de EDTA decât proteazele neutre, necesitând concentraţii mai ridicate de 10 -2 

M pentru inactivare. 

Proteazele neutre produse de Bacillus subtilis var. amylosacchariticus sunt diferite de 

proteazele neutre produse de Bacillus subtilis NRRL B3441 şi din acest motiv este necesară 

specificarea exactă a provenienţei proteazei neutre respective. Producerea lor este supusă 

represiei exercitate de prezenţa în mediul de incubare a unor aminoacizi în cantitate mai mare 

(Bawden şi colab.,1987). Aceste enzime sunt folosite în prezent la fabricarea detergenţilor la 

tratarea pieilor în industria pielăriei, frăgezirea cărnii, eliminarea depozitelor proteice din 

băuturile fermentate (Sasson, 1988). La aceste bacterii s-au realizat şi numeroase studii 

referitoare la determinismul genetic şi controlul producerii şi excreţiei acestor enzime în scopul 

obţinerii prin clonare a unor tulpini superproducătoare (Mc Connell şi colab., 1986). 

S-a dovedit faptul că producerea de proteaze este supusă unor mecanisme reglatoare 

complexe, între care un rol cheie este jucat de sistemul DegS-DegU precum şi de factorii de 

reglare DegR and DegQ (Nagami and Tanaka, 1986; Tanaka et al., 1987; Ogura et al., 1994). 

Aceşti factori reglatori se pare că sunt implicaţi în superproducţia de proteaze cel puţin în 

cazul unor tulpini de B.subtilis. De asemenea, relativ recent, Ogura et al (1994) au caracterizat 

alte două gene: proB (ce codifică sinteza γ-glutamil kinazei) şi proA (codifică sinteza 

glutamil-γ-semialdehid dehidrogenaza) ale căror produşi par a fi implicaţi în sporirea 

capacităţii de biosinteză a exoproteazelor la o tulpină de B.subtilis. Astfel, cele două gene au 

fost clonate într-un vector e clonare (pLC1) şi apoi introduse, împreună cu un alt vector 

(pNC61) ce conţine gena reglatoare prtR (degR) într-o tulpină de B.subtilis. Transformanţii 

obţinuţi au prezentat o activitate proteolitică mai mare decât a tulpinii parentale. 

Date fiind aplicaţiile practice ale acestor enzime extracelulare, preocupările 

cercetătorilor vizează sporirea nivelului de biosinteză ca şi mărirea stabilităţii enzimelor în 

diferite condiţii experimentale. Aceste deziderate se pot realiza pe mai multe căi, printre care 

cele ce utilizează metodele clasice de ameliorare a microoganismelor (prin tratament cu agenţi 

mutageni) şi cele moderne, de inginerie genetică (fuziunea de protoplaşti şi tehnologia ADN 

recombinant). 

Conform datelor de literatură, mutagenii cei mai eficienţi sunt nitrosometiluree, 

nitrosoguanidina, dietilsulfatul, precum şi agenţi fizici de tipul radiaţiilor X sau a radiaţiilor γ. 

Astfel, prin mutageneză s-a reuşit ridicarea nivelului de biosinteză a tulpinilor de B.subtilis de 

aproximativ 8-10 ori. 

În cel de-al doilea caz, majoritatea tulpinilor superproducătoare de proteaze care 

prezintă anumite caracteristici s-au obţinut prin inginerie genetică. Astfel, sunt foarte 

cunoscute rezultatele obţinute de cercetătorii japonezi care, pornind de la tulpini sălbatice de 

B.thermoproteolyticus şi B.stearothermophilus au reuşit obţinerea de tulpini producătoare de 

termolizină, o protează foarte diferită de celelalte proteaze neutre în ceea ce priveşte 

termostabilitatea şi mecanismul de acţiune. În prezent, cunoscându-se structura termolizinei 

precum şi genele răspunzătoare de caracteristicile sale deosebite, se încearcă obţinerea de 

tulpini de B.subtilis, B.stearothermophilus modificate genetic, capabile să producă proteaze 

termostabile sau stabile la valori diferite ale pH sau la acţiunea unor agenţi inhibitori. 

In cazul bacteriilor din genul Streptomyces examinarea lichidelor de cultură a unor tulpini 

producătoare de antibiotice a dus la evidenţierea prezenţei unui amestec de enzime dintre care, 

un loc important din punct de vedere cantitativ îl ocupă proteazele (neutre şi alcaline) şi 

peptidazele (aminopeptidaze) (Pokorny şi Vitale, 1980). 

143


Vitale şi colab.(1980) au reuşit izolarea din filtrat de cultură de S.rimosus a unei serin 

proteaze care a prezentat un pH optim de acţiune cuprins între 7 şi 9 şi al cărei substrat de acţiune 

este reprezentat de proteine sau de peptide mari, hidrolizând în general esterii terminali simpli. 

Recent, Renko şi colab.(1989) au prezentat particularităţile unei proteaze de tip tripsinic 

("trypsin-like proteinase") izolată tot din filtrat de cultură de S.rimosus evidenţiind faptul că 

aceasta este o protează alcalină, sensibilă la acţiunea inhibitorului proteazic PMSF (specific 

pentru serin-proteaze) ca şi la cea a α-antitripsinei. Aceste enzime au activitate arginilaminopeptidazică 

atât asupra proteinelor cât şi asupra peptidelor mai mici. Enzime similare au 

fost izolate şi caracterizate şi de la alte specii de Streptomyces: S.fradiae, S.paromomycinus, 

S.moderatus, S.hygroscopicus etc. O situaţie oarecum specială o prezintă S.griseus care produce 

un amestec de proteaze neutre şi alcaline, produsul obţinut fiind denumit pronază, el fiind studiat 

mai intens în scopul elucidării mecanismului de acţiune şi a omologiei sale cu tripsinele 

vertebratelor (Read şi colab.,1984). 

Aceste studii au importanţă atât teoretică prin contribuţiile aduse la înţelegerea unor 

aspecte evolutive, a taxonomiei serin-proteazelor dar şi practică, aceste enzime putând înlocui 

tripsina în anumite reacţii biochimice. 

S-a dovedit de asemenea că unele specii de streptomicete, cum ar fi de pildă S.rimosus, 

pot produce şi o altă categorie de proteaze: metaloproteaze (Vitale şi colab.,1987). Aceste 

enzime sunt fie bazice fie neutre, fiind activate de ionii de calciu, mangan sau zinc, stabilizate de 

ionii de calciu şi inhibate de EDTA. Metaloproteazele alcaline acţionează doar asupra 

proteinelor, nu şi asupra peptidelor în timp ce metaloproteazele neutre degradează în egală 

măsură proteinele şi peptidele. In cazul acestora din urmă acţiunea enzimatică se manifestă la 

extremitatea COOH, ceea ce permite încadrarea lor printre dipeptidil-carboxipeptidaze. De 

asemenea, s-a reuşit izolarea de la mai multe specii de Streptomyces (S.rimosus, S.fradiae, 

S.peptidofaciens, S.griseus) a unor peptidaze care, pe baza proprietăţilor specifice (specificitatea 

de substrat, inhibarea de către EDTA, activare de către ionii de calciu, magneziu, prezenţa 

leucinei la capătul NH2 terminal) au fost identificate ca fiind leucin-amino-peptidaze (Vitale şi 

colab.,1986). 

Tinând cont că în ultima vreme streptomicetele au început să fie utilizate drept gazde 

pentru clonarea de material genetic heterolog, este interesant de ştiut dacă tulpinile utilizate de 

obicei drept acceptori elaborează sau nu proteaze. Producerea unor asemenea enzime la aceste 

tulpini constituie un serios impediment în obţinerea produsului dorit. Pornind de la această idee, 

Aretz şi colab.(1989) au studiat prezenţa enzimelor proteolitice la tulpina S.lividans TK24, 

tulpină recombinată obţinută pentru prelucrarea şi secretarea unei proteine de fuziune (între 

inhibitorul α-amilazei de la S.tendae şi proinsulina de la maimuţa Macacca fascicularis). După 

purificarea prin cromatografie pe schimbători de ion au fost separate mai multe tipuri de enzime 

proteolitice: alanin-aminopeptidaze, leucin-aminopeptidaze, proteaze de tip tripsinic şi proteaze 

de tip chimiotripsinic. Dintre acestea, proteazele de tip chimiotripsinic ("chemo-trypsin-like") 

sunt cele care degradează proteina de fuziune dar această acţiune poate fi inhibată prin adăugarea 

în mediul de culturăa unor săruri de zinc sau nichel. 

Dacă în cazul bacililor au fost izolate şi clonate genele ce codifică sinteza a două 

subtilizine şi a unei proteaze neutre (Mc Connell şi colab.,1986), în cazul bacteriilor din genul 

Streptomyces studiile referitoare la determinismul genetic al producerii de proteaze sunt mult mai 

puţine. Astfel, Duez şi colab.(1987) au reuşit izolarea, clonarea şi secvenţierea genei pentru o 

peptidază extracelulară de la Streptomyces sp.R61 la S.lividans, iar Henderson şi colab.(1987) au 

caracterizat genele pentru proteazele A şi B de la S.griseus. 

In cazul unor tulpini de streptomicete au fost evidenţiate unele enzime proteolitice care 

degradează preferenţial colagenul ("collagenase-like")(Mukhopadhyay şi Chandra, 1987). Deşi 

nu au fost izolate şi purificate (s-au utilizat filtrate de cultură) enzimele de tip colagenaze de la 

Streptomyces au evidenţiat o activitate specifică pe colagen din tendon bovin şi piele de viţel, la 

144


28 0 C şi pH 7,2-7,5, fiind inhibate de EDTA şi azidă de sodiu. Deşi neobişnuită, producerea unor 

asemenea enzime de către streptomicete nu este surprinzătoare dacă ne gândim la multitudinea 

de substrate nutritive pe care aceste bacterii le pot găsi în sol. 

3.2. α-Amilazele 

α-Amilazele (1,4-α-D-glucan-glucanhidrolaza, EC 3.2.1.1.) sunt larg răspândite în rândul 

microorganismelor, atât la fungi cât şi la bacterii, mai ales la specii ale genurilor Bacillus şi 

Streptomyces, acţiunea lor constând în hidroliza legăturilor α-1,4-glicozidice de la nivelul 

amidonului, eliberând maltoza. Cel mai mult studiate şi utilizate în practică sunt α-amilazele 

produse de speciile de Bacillus (B.amilolyquefaciens, B.licheniformis, B.stearothermophilus, 

B.subtilis etc). Aceste bacterii produc două tipuri de α-amilaze: de lichefiere a amidonului 

(degradarea amidonului până la maltodextrine) şi de zaharificare (convertesc maltoza la 

glucoză). α-Amilazele produse de tulpinile de B.licheniformis prezintă un interes special datorită 

rezistenţei lor la temperaturi ridicate (85-115 

145 

0 C). In general, enzimele respective sunt utilizate în 

practică în lichefierea amidonului în industria distilatelor ca şi în industria textilă (Zarnea şi 

colab.,1980). 

O serie de studii genetice realizate prin experimente de mutageneză sau prin clonări de 

gene au evidenţiat faptul că gena pentru α-amilază de la B.subtilis se află sub un control genetic 

complex care este însă puţin cunoscut la nivel molecular (Mc Connell şi colab.,1986). Se pare 

însă că există mai multe gene reglatoare cu efecte pleiotropice (sacU, sacQ, prtR) care intervin în 

exprimarea genei pentru α-amilază, levansucrază, serin protează, proteaze neutre şi β-glucanază 

(Priest, 1987). 

In cazul streptomicetelor au fost izolate şi caracterizate α-amilaze de la mai multe specii, 

acest tip de enzime părând a fi sintetizat practic de majoritatea bacteriilor aparţinând acestui 

grup. O atenţie specială a fost acordată α-amilazei produsă de S.hygroscopicus (Hoshiko şi 

colab.,1987), S.limosus (Virolle şi Bibb, 1988) şi S.venezuelae (Virolle şi colab.,1988) la aceste 

specii fiind studiat şi genele ce codifică sinteza şi reglarea sintezei acestor enzime. De asemenea, 

s-au efectuat experimente de clonare a genelor respective în diferite gazde (E.coli, S.lividans) în 

scopul obţinerii unor tulpini superproducătoare de interes industrial. Pe lângă aspectul practic al 

cercetărilor de acest tip, ele mai pot oferi o serie de informaţii referitoare la modul de exprimare 

şi reglare a funcţiilor genelor de la streptomicete (în particular a genelor pentru α-amilază). Mai 

mult, rezultatele obţinute au permis o comparare a enzimelor de tip α-amilază produse de 

streptomicete cu cele produse de alte organisme, în special cu cele produse de eucarioate (Mac 

Gregor, 1988). 

S-a dovedit că S.hygrosopicus produce o α-amilază care degradează amidonul până la 

maltoză, acţiunea sa fiind de tip endoglucanolitic (taie legăturile α-1,4 glicozidice din interiorul 

lanţului polizaharidic). Compararea secvenţei de aminoacizi pe care această enzimă o conţine cu 

cele ale altor enzime de acest tip, fie de la procariote (de la bacili) fie de la eucariote (de la 

Aspergillus oryzae, A.nidulans, Hordeum vulgare, Drosophila melanosgaster etc) a evidenţiat 

faptul că există trei regiuni care sunt conservate la toate aceste enzime, indiferent de origine 

(Ihara şi colab.,1985). Cu toate acestea, α-amilaza de la S.hygroscopicus este unică deoarece 

conţine triptofan la nivelul celei de-a treia regiuni conservate (Mac Gregor, 1988). 

Experimentele de clonare a genei amy de la S.hygroscopicus în alte gazde cum ar fi 

E.coli şi S.lividans au evidenţiat faptul că, deşi transferul genei s-a realizat eficient, exprimarea 

sa variază în funcţie de gazdă şi de numărul de copii ale genei respective (efectul de dozare a 

genei). Hoshika şi colab. (1987) utilizând cartarea cu o nuclează specifică ("mung bean 

nuclease") au determinat faptul că gena amy de la S.hygroscopicus prezintă trei situsuri de 

iniţiere a transcrierii (trei promotori): amyP1, amyP2 şi amyP3, care au asemănări mai mult sau 

mai puţin extinse cu promotorii altor gene de la Streptomyces (endoH, ermP1, aphP1).


Studii similare au fost făcute şi cu gena pentru α-amilază (aml) de la S.limosus şi 

S.venezuelae. In cazul tulpinilor de S.venezuelae analizate s-a observat că exprimarea genei aml 

este represată puternic de glucoză în timp ce asupra exprimării genei similare de la S.limosus 

glucoza nu are efect. Exprimarea acestei gene este însă influenţată (represată) puternic de 

manitol (Virolle şi colab.,1988). Interesant este că prin clonarea genei aml de la S.limosus în 

S.lividans exprimarea genei este puternic represată de glucoză în noua gazdă (Virolle şi Bibb 

1988). Acesta înseamnă că rezistenţa la acţiunea glucozei evidenţiată la tulpinile de S.limosus 

analizate este mai degrabă o particularitate a bacteriei decât a genei pentru α-amilază. De 

asemenea, în urma comparării secvenţei de aminoacizi a acestei proteine cu proteine similare de 

la eucariote s-a observat o omologie ridicată cu α-amilaza produsă de Drosophila melanogaster 

(>40%), Mus musculus (36,8%), Aspergillus nidulans (36,1%) şi mai mică cu enzimele similare 

de la B.subtilis (22,6%) şi B.amylolyquefaciens (16,1%)(Long şi colab.,1987). 

3.3. Glucoz-izomeraza 

In ultimii ani, de mare interes în Japonia, SUA şi Franţa este obţinerea siropurilor cu 

conţinut ridicat de fructoză din hidrolizate de amidon în urma acţiunii glucoz-izomerazei (xilozoizomeraza, 

EC 5.3.1.5.). Printre producătorii recunoscuţi de asemenea enzime se numără şi 

unele specii de streptomicete: S.violaceoniger şi S.olivochromogenes. Suekane şi Iizuka (1982), 

în cadrul unor cercetări legate de producerea de glucoz-izomerază de către streptomicete au 

evidenţiat faptul că abilitatea de a converti glucoza la fructoză este larg răspândită între bacteriile 

acestui gen. Localizarea acestei enzime este atât intracelulară (cea mai mare parte) dar şi 

extracelulară. 

Experimentele lui Szentirmai şi colab.(1986) au evidenţiat faptul că, cel puţin în cazul 

S.matensis, glucoz-izomeraza intracelulară diferă de cea extracelulară din punctul de vedere al 

greutăţii moleculare. De asemenea, s-a observat că utilizarea ca sursă de azot a unei combinaţii 

de glicocol şi sulfat de amoniu şi adăugarea xilozei şi a ionilor de cobalt (de magneziu sau 

mangan în cazul altor specii bacteriene) duce la stimularea producerii de enzimă la 

S.olivochromogenes, S.flavogriseus sau S.violaceoniger (Chen şi colab.,1979; Sicard şi colab., 

1990). 

Park şi Toma (1974) au observat că la unele tulpini de streptomicete există o interrelaţie 

între producerea de glucoz-izomerază şi cea de xilanază, în funcţie de sursa de carbon utilizată 

pentru cultivarea bacteriilor respective. Utilizarea unui mediu de cultură ce conţine fie xilan fie 

glucoză ca sursă de carbon determină producerea de glucoz-izomerază în timp ce xilanaza este 

produsă doar de bacteriile crescute pe mediu cu xilan, nu şi pe cel ce conţine glucoză. 

Datorită importanţei practice deosebite a acestei enzime, în ultimii ani au fost realizate 

studii referitoare la determinismul genetic al sintezei glucoz-izomerazei ca şi la controlul acestei 

sinteze, scopul fiind acela al obţinerii prin tehnici de inginerie genetică a unor tulpini capabile de 

a sintetiza noi tipuri de glucoz-izomeraze cu proprietăţi modificate, cu acţiunea mai eficientă. 

Utilizarea D-xilozei ca sursă de carbon de către bacterii se realizează pe o cale metabolică 

ce presupune transportul prin membrana plasmatică, izomerizarea la D-xiluloză şi apoi 

fosforilarea acesteia cu ajutorul xiluloz-kinazei cu formarea de D-xiluloz-5-fosfat. Intermediarul 

fosforilat este apoi metabolizat fie pe calea pentozo-fosfaţilor fie pe calea Embden-Meyerhoff. 

Pornind de la aceste date s-a determinat faptul că operonul xyl de la streptomicete (de la 

S.violaceoniger în particular) este alcătuit din cel puţin trei gene: xylA care codifică pentru 

sinteza xiloz-izomerazei, xylB care codifică xiluloz-kinaza şi xylX care determină sinteza unei 

proteine reglatoare. In cazul acestor bacterii s-a evidenţiat o situaţie interesantă: genele xylA şi 

xylB plasate apropiat una de cealaltă pe cromosomul bacterian prezintă o orientare diferită, 

exprimarea lor datorându-se unor promotori divergenţi plasaţi în regiunea dintre cele două gene 

146


(Tiraby şi colab.,1989). Produsul genei xylX pare a fi o proteină reglatoare care controlează atât 

exprimarea celor două gene cu orientare opusă cât şi propria sa sinteză. 

Experimentele de clonare care se realizează în diferite laboratoare încearcă, pe de o parte 

stabilirea cu precizie a genelor ce alcătuiesc operonul xyl la streptomicete şi modul de reglare a 

exprimării lor atât în tulpina de origine cât şi în diferite tulpini gazdă în care genele respective au 

fost clonate, şi, pe de altă parte să se construiască "in vitro" tulpini recombinate genetic capabile 

de a sintetiza glucoz-izomerază cu proprietăţi ameliorate (de exemplu termostabilă) (Sicard şi 

colab, 1990). Rezultatele obiţute până în prezent sunt promiţătoare, cercetările fiind continuate 

pe direcţiile menţionate mai sus. 

3.4. Celulazele 

Biomasa vegetală reprezintă sursa majoră de carbon în ecosistemele terestre astfel că este 

firească presupunerea că multe dintre microorganismele care populează aceste ecosisteme să fie 

capabile să degradeze aceste substrate, deci să sintetizeze enzime de timpul celulazelor şi 

hemicelulazelor. Actinomicetele şi în mod special bacteriile din genul Streptomyces constituie un 

grup important care intră în alcătuirea populaţiilor microbiene respective (Mc Carthy şi 

Williams, 1992). 

Celuloza este un polimer neramificat de glucoză compus din unităţi de anhidro Dglucoză 

unite prin legături 1,4-β-D-glucozidice. Aceste legături pot fi hidrolizate de către 

enzimele celulozolitice. De obicei celuloza este foarte rezistentă la hidroliză datorită gradului 

ridicat de cristalinitate, rezultatul unei conformaţi lineare (paralele) care permite realizarea unor 

puternice legături de hidrogen între grupările OH ale lanţurilor paralele vecine. In fibrele de 

celuloză regiunile cu structură înalt cristalină coexistă cu regiunile cu structură amorfă iar cele cu 

un raport favorabil zonelor cristaline prezintă o rezistenţă crescută la acţiunea enzimatică. 

Celuloza, aşa cum se găseşte în natură este un homopolimer cu greutate moleculară mare, 

insolubil şi adesea în asociere intimă cu lignina, hemiceluloza la nivelul peretelui celular vegetal 

fapt ce o face puţin accesibilă degradării enzimatice (Robson şi Chambliss, 1989). 

Toate organismele care degradează celuloza cristalină secretă sisteme enzimatice mai 

mult sau mai puţin complexe care sunt alcătuite din enzime cu diferite modalităţi de acţiune, 

specificitate de substrat şi care acţionează de obicei sinergic pentru a hidroliza celuloza. Cel mai 

bine studiat sistem celulazic este cel de la fungi (de la Trichoderma reesei), enzimele care îl 

alcătuiesc fiind grupate în trei categorii: 

- exo-β-1,4-glucanaze sau celobiohidrolaze (EC 3.2.1.91.) 

- endo-β-1,4-glucanaze sau endocelulaze (endoglucanaze)(EC 3.2.1.4.) 

- β-glucozidaza sau celobiaza (EC 3.2.1.21.) 

Aceste trei grupe de enzime acţionează sinergic ducând la hidroliza celulozei cristaline. 

Endoglucanazele determină ruperea legăturilor interne ale lanţului de celuloză, atacul făcându-se 

la întâmplare şi ducând la formarea de oligozaharide. Efectul direct al acestui tip de enzime este 

fragmentarea lanţului de celuloză cuplat cu o creştere slabă a cantităţii de zaharuri reducătoare 

eliberate. De obicei, în complexele celulozolitice sunt cuprinse mai multe endoglucanaze care 

pot prezenta afinităţi diferite pentru celo-oligozaharide cu lungimi variate. Spre deosebire de 

aceste, exoglucanazele (celobiohidrolazele) acţionează la nivelul extremităţilor nereducătoare ale 

lanţului de celuloză, eliberând glucoză sau celobioză (zaharuri reducătoare) în cantitate crescută, 

lungimea lanţului celulozic nefiind modificată semnificativ. 

Acţionând individual, atât endoglucanazele cât şi celobiohidrolazele pot degrada regiuni 

restrânse ale lanţului celulozic (cele cu structură amorfă). Pentru a determina hidroliza regiunilor 

cu structură cristalină este necesar ca în amestecul enzimatic să fie prezente ambele tipuri de 

enzime. 

147


In ceea ce priveşte β-glucozidazele, acestea determină hidroliza celobiozei în două 

unităţi de glucoză. Deşi aceste enzime nu sunt propriu-zis celulaze, ele participă la îmbunătăţirea 

randamentului degradării celulozei prin eliminarea inhibării prin feedback a celulazelor realizată 

de obicei de celobioză (Robson şi Chambliss, 1989). 

Utilizarea a numeroase substrate şi diverse tehnici de evidenţiere a activităţii 

celulazice a dus la o comparare dificilă a sistemelor celulozolitice de la diferite organisme. 

Mai mult, deoarece celulazele aflate în extracte brute prezintă o suprapunere parţială a 

specificităţii de substrat, un studiu corect trebuie realizat în condiţiile purificării acestor enzime. 

In ultima vreme au fost obţinute o serie de substrate celulozice care ar putea fi folosite ca 

substrate mai mult sau mai puţin specifice pentru fiecare dintre componentele sistemului 

celulazic (Wood şi Bhat, 1988). Cel mai utilizat procedeu de determinare a activităţii enzimatice 

este măsurarea cantităţii de zaharuri reducătoare eliberate în urma acţiunii enzimelor asupra 

substratului. Astfel, substratele celulozice cu structură amorfă sau cele modificate chimic cum 

sunt celuloza-azur, carboximetilceluloza(CMC), celuloza tratată cu acizi ("acid-swollen 

cellulose") sau trinitrofenil-carboximetilceluloza (TNP-CMC) sunt degradate în mod 

semnificativ şi specific de către endoglucanaze dar, în unele situaţii şi celobiohidrolazele le pot 

hidroliza de şi cu o eficienţă mai mică. In cazul utilizării drept substrat a celulozei cu structură 

cristalină de tipul Avicelului (celuloză microcristalină), bumbacului sau hârtiei de filtru, pentru 

degradarea lor eficientă este necesar un sistem celulazic complet, care să conţină atât 

endoglucanază cât şi celobiohidrolază. De obidei, pentru a determina prezenţa într-un preparat 

enzimatic brut a ambelor tipuri de enzime se determină eliberarea de zaharuri reducătoare în 

funcţie de substrat. Astfel, endoglucanazele cauzează o creştere rapidă a fluidităţii (reducerea 

vâscozităţii) carboximetilcelulozei dar o eliberare scăzută de zaharuri reducătoare. In contrast, 

celobiohidrolazele nu modifică fluiditatea substratului dar conduce la eliberarea unei cantităţi 

mai mari de zaharuri reducătoare. Cu toate acestea este dificil de precizat dacă o celulază este sau 

nu celobiohidrolază deoarece nu există un substrat specific pentru aceasta. Deshpande şi colab., 

(1988) au arătat însă că hidroliza unor compuşi cum ar fi metil-umbeliferil-celobiozid (MUC) 

sau p-nitrofenil-β-D-celobiozid (pNPC) ar fi un indiciu al activităţii exo-β-1,4-glucanazice. 

Există în prezent numeroase date referitoare la bacterii celulozolitice dar mulţi autori 

consideră că bacteriile produc doar endoglucanaze şi nu un sistem celulazic complet. Deşi cea 

mai acceptată teorie referitoare la modul de degradare a celulozei este cea bazată pe rezultatele 

cercetărilor efectuate asupra fungilor şi care presupune că hidroliza eficientă a substratelor 

celulozice se realizează în urma acţiunii sinergice a endo- şi exoglucanazelor, ea nu este aplicată 

bacteriilor. La acestea, modelul de degradare sugerat presupune că endoglucanazele care au ca 

substrat specific celo-oligozaharidele cu lungimi variate pot determina hidroliza celulozei 

cristaline dacă ele se află în concentraţie mare sau dacă se leagă de fibrele de celuloză sau sunt 

grupate în imediata vecinătate a acestora ("celulosomi") (Robson şi Chambliss, 1989). Reuşita 

unor laboratoare din lume de a izola şi caracteriza celobiohidrolaze de la bacterii vine să 

contrazică în cazul speciilor respective teoria enunţată mai sus (Creuzet şi colab.,1983; Mac 

Kenzie şi colab.,1984; Gardner şi colab., 1987; Beguin, 1990; Ruttersmith şi Daniel, 1991). 

Printre bacteriile considerate a avea sisteme celulazice complexe, tipice se numără 

genurile Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus, Bacteroides, 

Erwinia şi Acetobacter. De asemenea, tulpini celulozilitice au fost identi-ficate şi în cadrul altor 

genuri de bacterii: Streptomyces, Rhizobium, Cellvibrio, Pseudomonas, Microbispora etc. In 

studiul de faţă ne vom referi doar la sistemele celulazice de la două genuri de bacterii Gram 

pozitive, Bacillus şi Streptomyces. 

La bacteriile din genul Bacillus s-a evidenţiat faptul că ele produc doar endoglucanaza şi 

nu sînt capabile de o degradare eficientă a celulozei cristaline. Studiile referitoare la celulazele de 

la Bacillus au fost sprijinite şi de faptul că aceste bacterii pot fi uşor manipulate genetic 

(genomurile de la mai multe specii fiind destul de bine caracterizate) şi de caracterul extracelular 

148


al acestor enzime. Printre speciile care produc celulaze se numără B.subtilis, B.polymyxa, 

B.licheniformis, B.cereus etc. 

Studiile referitoare la celulazele de la Bacillus se referă atât la caracterizarea biochimică a 

enzimelor cât şi la identificarea şi secvenţierea genelor implicate în producerea acestor enzime ca 

şi în clonarea şi exprimarea lor în diferite gazde. In prezent se cunoaşte secvenţa de nucleotide a 

mai multor endoglucanaze de la Bacillus (tabelul 5) şi deci secvenţa de aminoacizi a proteinelor 

corespunzătoare, realizându-se astfel comparaţii între enzimele secretate de diferite specii de 

bacili. 

Tabelul 5. Genele pentru celulazele de la Bacillus 

Tulpina Gena Mărimea proteinei 

produse (aminoacizi) 

B.circulans 378 

B.subtilis DLG 499 

B.subtilis N-24 463 

B.subtilis PAP 115 499 

B.lautus celB 536 

Bacillus N-4 celA 

celB 

celC 

149 

384 

465 

>800 

B.polymyxa 365 

Bacillus 1139 celF 770 

Bacillus sp.KSM 635 912 

S-a stabilit astfel că enzimele produse de diferite tulpini de Bacillus prezintă un grad înalt 

de omologie, porţiunile cu omologie ridicată fiind localizate, în general, în regiunea 

aminoterminală, ceea ce sugerează că situsul catalitic activ al enzimelor se află plasat în această 

zonă. Această supoziţie este sprijinită de observaţiile că porţiunea de la capătul carboxiterminal 

al endoglucanazei respective nu este necesară pentru activitatea celulozolitică, regiunea 

respectivă putând fi deletată experimental fără pierderea actibvităţii (Nakamura şi colab. 1991). 

Recent, Henrissat şi colab.(1989) analizând grupările ("clusterii") hidrofobe ale diferitelor 

enzime au clasificat celulazele, inclusiv pe cele de la Bacillus, în şase familii. Din acest punct de 

vedere, endoglucanazele de la B.subtilis şi B.ciculans sunt incluse în familia A, subfamiliile A2 şi 

A4 (Beguin, 1990; Gilkes şi colab.,1991). 

De asemenea, rezultatele de până acum referitoare la genele pentru enduglucanazele de la 

Bacillus sugerează ideea că ele ar deriva dintr-o genă ancestrală comună. 

In ceea ce priveşte particularităţile biochimice ale endoglucanazelor de la bacteriile din 

genul Bacillus acestea au o greutate moleculară ce variază, de obicei, între 35 şi 46 kDa, dar 

poate atinge, la unele tulpini alcalofile, până la 92 kDa (Fukumori şi colab., 1986), sunt în 

general termostabile, activitatea optimă realizându-se la 50-60 o C. 

Reglarea producerii de endoglucanaze de către bacteriile din genul Bacillus variază nu 

numai de la specie la specie ci chiar şi de la tulpină la tulpină. Spre exemplu, tulpini de B.cereus, 

Bacillus sp.N-4, B.subtilis AU1, B.licheniformis sintetizează enzima în mod constitutiv în timp ce 

la alte tulpini, B.polymyxa, B.subtilis DLG, Bacillus sp.1139, aceasta pare a fi inductibilă. De 

asemenea, nivelul glucozei şi al celobiozei influenţează diferit producerea englucanazei de către 

tulpinile bacteriene studiate. Dacă în cazul tulpinii B.subtilis AU1 atât glucoza cât şi celobioza 

inhibă sinteza enzimatică la concentraţii mai mari de 2%, în cazul tulpinii alcalofile Bacillus 

sp.1139 glucoza inhibă, iar celobioza stimulează producerea de enzimă. La alte tulpini de


Bacillus, B.subtilis DGL, B.cereus, B.licheniformis, ambele zaharuri reducătoare stimulează 

sinteza endoglucanazei. 

In urma experimentelor de clonare a genelor pentru endoglucanază în diferite gazde (fie 

tulpini auxotrofe de E.coli fie alte tulpini de B.subtilis) au fost obţinute informaţii interesante 

referitoare la exprimarea genelor respective în gazde heterologe ca şi la reglarea exprimării 

acestora. De obicei, celulazele ale căror gene au fost clonate în E.coli sunt sintetizate iniţial sub 

forma unor compuşi de dimensiuni mari, activi din punct de vedere enzimatic, cu localizare 

intracelulară. Aceşti compuşi suferă o "prelucrare" în urma căreia dimensiunea enzimei se 

micşorează, sub această formă ea fiind exportată în spaţiul periplasmic (Cantwell şi Mc Connel, 

1983; Robson şi Chambliss, 1989). In cazul utilizării drept gazda pentru clonare a unor tulpini 

mutante de Bacillus s-a observat un fenomen similar de "procesare intracelulară" a precursorului 

enzimatic în urma căruia dimensiunia enzimei se apropie de cea a enzimei produsă de tulpina de 

origine (Robson şi Chambliss, 1989). De asemenea, Nakamura şi colab.(1991) au observat că 

utilizarea drept gazdă a unei tulpini mutante de B.subtillis care nu produce proteaze a condus la 

obţinerea unei cantităţi superioare de enzimă de la tulpina recombinată. Această creştere poate fi 

de cel puţin 9 ori dacă în noua gazdă este clonată suplimentar şi gena sacQ. 

Deşi cele mai multe informaţii referitoare la degradarea substratelor celulozice de către 

actinomicete sunt legate de bacteriile din genul Thermomonospora (T.fusca, T.curvata)(Wilson, 

1992), în ultimii ani au fost realizate şi studii referitoare la sistemul celulazic al bacteriilor din 

genul Streptomyces. 

Tulpinile de streptomicete capabile de a degrada celuloza aparţin la mai multe specii cum 

ar fi: S.antibioticus (Enger şi Mc Coy, 1965), S.thermodiastaticus (Crawford şi Mc Coy, 1972), 

S.flavogriseus (Ishaque şi Kluepfel, 1980), S.olivochromogenes (Mac Kenzie şi colab.,1987), 

S.reticuli (Wachinger şi colab., 1989), S.lividans (Theberge şi colab., 1992), S.flavovirens SfG3 

(Cornea şi colab., 1993), dar lista poate continua dacă ţinem cont de tulpinile de Streptomyces 

care nu au fost încadrate până acum într-o specie anume. 

Primele lucrări referitoare la sistemul celulazic de la streptomicete au evidenţiat faptul că 

acesta este complex, enzimele componente fiind capabile de a degrada substrate foarte variate: 

CMC, hârtie de filtru, bumbac, celuloză microcristalină, celobioză dar şi paie, tărâţe sau alte 

deşeuri celulozice. Studiind complexul celulazic de la S.flavogriseus, Ishaque şi Kluepfel (1980) 

au stabilit că aceste bacterii produc enzime extracelulare capabile de a degrada, cu o rată diferită, 

carboximetilceluloza, hârtia de filtru şi fibrele de bumbac. De asemenea, tulpina respectivă 

produce şi β-glucozidază dar această enzimă rămâne în cea mai mare parte localizată 

intracelular. Cercetările ulterioare realizate asupra unor tulpini aparţinând aceleiaşi specii 

(S.flavogriseus) au condus la precizarea că aceste bacterii produc atât endoglucanaze cât şi 

exoglucanaze (celobio-hibrolaze)(Mac Kenzie şi colab.,1984). Rezultate asemănătoare au fost 

comunicate şi de alţi autori în cazul unor specii diferite de Streptomyces: S.reticuli (Wachinger şi 

colab., 1989) sau Streptomyces sp.SD16 (Cornea şi colab.,1992) (Figura 6). 

In ceea ce priveşte stabilirea condiţiilor optime de acţiune a acestor enzime, există o 

oarecare variaţie în funcţie de tulpina bacteriană studiată şi de autor. Astfel, în cazul tulpinilor de 

S.flavogriseus analizate, testarea acţiunii enzimelor pe CMC se realizează la 50 

150 

0 C, în tampon 

fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie şi colab.,1984) sau în tampon citrat-fosfat 50mM pH 7 (Ishaque 

şi Kluepfel, 1980), în timp ce activitatea enzimatică pe hîrtie de filtru sau pe celuloză 

microcristalină (Avicel) se realizează la 40 0 C fie în tampon fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie şi 

colab.,1984) fie în tampon citrat 50mM pH 5,6 (Ishaque şi Kluepfel, 1980). La o altă specie, 

S.reticuli, testarea activităţii celulazelor s-a realizat la 45 0 C în tampon Tris HCl pH 7,5 

(Wachinger şi colab., 1989). Alţi autori (Godden şi colab., 1989) testează activitatea 

endoglucanazică a filtratului de cultură de la o tulpină de Streptomyces în tampon fosfat de 

potasiu 100mM, pH 8 la 50 0 C. Recent, Theberge şi colab.(1992) au caracterizat o endoglucanază 

de la S.lividans 66 care prezenta o activitate optimă la p 5,5 la 50 0 C. O situaţie particulară a fost


evidenţiată la o tulpină alcalofilă de Streptomyces tulpină capabilă de a sintetiza trei 

endoglucanaze diferite, cu pH optim de acţiune ce variază între 6 şi 8,5 (Nakai şi colab.,1988). 

Figura 6. Selecţia unor noi tulpini de Streptomyces sp. producătoare de celulaze. 

In cadrul unor exprimente realizate cu o tulpină de Streptomyces sp.SD16 izolată 

în Institutul de Biologie Bucureşti, Cornea şi colab. (1992) au înregistrat o activitate 

endoglucanazică maximă la pH 6,4 la 50 0 C în tampon fosfat de potasiu 50mM. In cazul utilizării 

drept substrat a hârtiei de filtru au fost obţinute valori maxime de degradare (eliberare de 

zaharuri reducătoare) la 40 0 C în tampon fosfat de potasiu 50mM la pH 5,8 şi pH 8 (Figura 7). 

Figura 7. Activitatea enzimatică a unor tulpini de streptomicete izolate din sol (după Cornea şi colab., 1992). 

Streptomicetele, ca multe alte bacterii, sitetizează celobiază (β-glucozidază) dar în mod 

normal nu o excretă în mediul de cultură ci ea rămâne localizată intracelular. Studii mai 

amănunţite asupra acestui tip de enzime au fost realizate la tulpini de S.granaticolor (Jiresova şi 

colab.,1987) la care s-a încercat izolarea şi caracterizarea enzimei, ca şi la S.thermodiastaticus 

(Ozaki şi Yamada, 1991). La această ultimă specie a fost obţinută o tulpină care produce o βglucozidază 

a cărei sinteză nu este afectată de glucoză, enzima fiind purificată şi caracterizată. 

Alături de această enzimă rezistentă la acţiunea glucozei, de la aceeaşi tulpină bacteriană au mai 

151


fost izolate încă două enzime de acelaşi tip (β-glucozidaze) dar a căror sinteză este supusă 

inhibării de către glucoză. 

Un aspect interesant al cercetărilor referitoare la celulazele produse de bacteriile din 

genul Streptomyces este izolarea şi purificarea componentelor acestui sistem. Spre deosebire de 

bacteriile din genul Thermomonospora la care au fost bine caracterizate cinci endoglucanaze 

diferite (E1-E5) dintre care E3 prezintă sinergism atât cu alte endoglucanaze cât şi cu o 

celobiohidrolază izolată de la Trichoderma reesei (Wilson, 1992), la streptomicete asemenea 

rezultate sunt mai puţine. 

Nakai şi colab.(1987) au purificat şi caracterizat de la o tulpină alcalofilă de Streptomyces 

(Streptomyces sp.KSM9) trei celulaze diferite care degradează preferenţial CMC şi care au fost 

notate CMC-aza I, CMC-aza II şi CMC-aza III. Greutăţile moleculare ale acestor enzime variază 

între 32 kDa (CMC-aza I), 32,5 kDa (CMC-aza II) şi 92 kDa (CMC-aza III). Purificarea şi 

separarea celor trei enzime s-a realizat prin cromatografie pe schimbători de ioni, prin trecerea pe 

o coloană de DEAE-Toyopearl 650M a unui preparat celulazic brut, rezultat prin precipitarea cu 

sulfat de amoniu (70%) a proteinelor din filtratul de cultură şi eluarea lor cu un gradient linear de 

NaCl (0,05-0,4M). Alţi autori (Wachinger şi colab.,1989) au fracţionat celulazele de la S.reticuli 

prin gel filtrare pe Superose 12 şi au obţinut cel puţin două CMC-aze precum şi mai multe 

proteine cu activitate pe celuloza microcristalină. CMC-azele, notate CMC-aza 1 de 40 kDa şi 

CMC-aza 2 de 48 kDa prezintă un pH optim de acţiune ce variază între 5,5 şi 7,5 la o 

temperatură de 45-50 

152 

0 C. De asemenea ele nu sunt inhibate de tamponul fosfat şi nu sunt 

stimulate de adăugarea de ioni de calciu în amestecul de reacţie. Spre deosebire de acestea, 

preparatul enzimatic ce prezintă activitate specifică pe Avicel, supus electroforezei în gel de 

poliacrilamidă în condiţii de denaturare a evidenţiat prezenţa a mai multor benzi cu greutăţi 

moleculare ce au variat între 42 şi 120 kDa (42, 56, 70, 120). Preparatul enzimatic obţinut prin 

gel filtrare a avut o temperatură optimă de acţiune la 45-50 0 C la un pH optim 7. Activitatea 

celulazică pe substrat de Avicel este redusă semnificativ în tampon fosfat, dar este stimulată de 

adăugarea de CaCl2 40mM şi de asemenea ea este pierdută rapid, în decursul a câtorva zile prin 

păstrare la 4 0 C, în timp ce CMC-azele sunt mult mai stabile. Proprietăţile avicelazei de la 

S.reticuli sunt foarte asemănătoare celor descrise pentru exoglucanaza de la Ruminococcus albus 

care a fost izolată sub forma unui complex de 230 kDa, alcătuitdin monomeri de 118 kDa 

(Gardner şi colab., 1987). 

Recent, Theberge şi colab.(1992) au purificat şi caracterizat o endoglucanază de la 

S.lividans 66 după cultivarea bacteriilor pe mediu cu xiloză ca sursă de carbon. Aceasta este o 

glicoproteină cu greutatea moleculară de 46 kDa, cu pI la 3,3 şi cu o activitate maximă asupra 

CMC la 50 0 C la pH 5,5. Interesant este că prin cultivarea bacteriilor în mediu cu Avicel sau 

celobioză ca sursă principală de carbon s-a obţinut un preparat enzimatic alcătuit din mai multe 

proteine de dimensiuni variate, dar active pe oligozaharide şi care au interacţionat pozitiv cu 

anticorpii anti-endoglucanază. Fenomenul respectiv a fost observat la celulazele de la 

Trichoderma reesei şi de la Clostridium thermocellum, el datorându-se în cazul fungilor fie unui 

grad diferit de glicozilare a proteinelor fie unor modificări proteolitice. In cazul bacteriilor 

fenomenul s-ar putea explica prin formarea unor complexe enzimatice specifice, celulosomi, 

doar în prezenţa substratelor microscristaline. Autorii presupun însă că apariţia fragmentelor 

endoglucanazice la S.lividans 66 s-ar datora mai degrabă unei serii de fenomene proteolitice 

decât unei glicozilări diferenţiate sau formării celulosomilor. In orice caz, activitatea specifică a 

endoglucanazei de S.lividans comunicată de autori a fost de 539 IU/mg proteină, ceea ce 

reprezintă una dintre cele mai mari valori raportate în literatură (Theberge şi colab.,1992). 

Rezultate interesante au fost obţinute şi de Mac Kenzie şi colab.(1984) care au reuşit, 

printre puţinii cercetători de altfel, izolarea şi caracterizarea unei exoglucanaze de la o tulpină de 

S.flavogriseus. Aceasta s-a realizat prin cromatografie pe DEAE Bio-Gel A a unui preparat brut 

obşinut prin concentrarea de 100 ori a filtratului de cultură (prin ultrafiltrare). Eluarea enzimelor


s-a făcut cu un gradient linear de NaCl (0-0,2M) obţinâdu-se mai multe "peak-uri" cu activitate 

celulazică. Cinci dintre acestea au prezentat activitate CMC-azică iar unul a evidenţiat o 

activitate enzimatică complexă (avicelazică, CMC-azică, xilanazică şi proteazică). Fracţiile care 

au prezentat cea mai mare activitate avicelazică au fost supuse gel filtrării pe Bio-Gel P60 

reuşindu-se separarea avicelazei de CMC-ază. Fracţiile active au fost apoi trecute pe o coloană 

de Concanavalină A-Sefaroză 4B, fiind recuperată o proteină de 46 kDa care nu a prezentat 

afinitate pentru coloana respectivă (pentru lectina imobilizată). Această proteină prezintă pI la 

4,15, determină în special hidroliza celulozei tratate cu acizi ("acid-swollen cellulose"), produşii 

de hidroliză fiind celobioza şi celotrioza (în cea mai mare parte). 

Datele obţinute la streptomicete, în special de la tulpinile de S.flavogriseus evidenţiază 

faptul că mecanismul de acţiune al celulazelor de la aceste bacterii este mai degrabă asemănător 

celui descris la fungi la care degradarea substratelor celulozice se datorează acţiunii sinergice a 

endoglucanazelor, exoglucanazelor şi β-glucozidazei. De asemenea, glicozilarea unora dintre 

componentele sistemului celulazic de la streptomicete (a endoglucanazelor, de exemplu), 

fenomen care este destul de puţin răspândit la bacterii dar frecvent la fungi poate sugera un 

comportament asemănător al celulazelor de la streptomicete cu cel al unor fungi. In ceea ce 

priveşte semnificaţia glicozilării, deşi unii autori atribuie glucidului un rol în funcţionarea 

enzimei, ea rămâne încă neclară (Knowles şi colab.,1987). 

Cu toate acestea explicarea mecanismului de acţiune a celulazelor de la streptomicete 

este complicat de faptul că la unele tulpini bacteriene, la S.reticuli de pildă, au fost identificate 

celulaze legate de miceliu ("mycelium buond cellulase") care amintesc de formarea 

celulosomilor de la Clostridium thermocellum (Lamed şi Bayer, 1988; Wachinger şi 

colab.,1989). O organizare a celulazelor în celulosomi similară celei evidenţiate la clostridii a 

fost descrisă şi la Thermomonospora curvata deşi studiile au fost în special de microscopie 

electronică (Figura 8). 

Figura 8. Aspect electronomicroscopic al suprafeţei celulelor de T.curvata cultivate pe fibre de celuloză (după Bond 

şi Stutzberger, 1989). 

Modificarea aspectului suprafeţei celulelor de streptomicete cultivate în mediu de cultură 

ce conţine celuloză drept unică sursă de carbon a fost observată la tulpinile Streptomyces 

sp.SD16 şi Streptomyces sp.P216 (Figura 9) (Cornea, 1996). Aceste rezultate sugerează că 

fenomenul complexării sistemului celulazic este comun mai multor tipuri de bacterii iar 

mecanismul de degradare a celulozei este mai complicat decât s-a presupus iniţial (Ljungdahl 

1989). 

153


Figura 9. Aspect electronomicroscopic al celulelor Streptomyces sp.SD16 cultivate în mediu minimal ce conţine 

celuloză. 

In ceea ce priveşte determinismul genetic al producerii enzimelor celulozolitice, datele 

referitoare la streptomicete sunt destul de puţine şi incomplete. In general, clonarea şi 

secvenţierea unei gene structurale pentru o enzimă este utilă nu numai pentru determinarea 

secvenţei de aminoacizi pe care proteina îi conţine ci şi pentru a obţine proteina în cantitate mai 

mare ca şi pentru studii de mutageneză care să determine rolul anumitor secvenţe de aminoacizi 

în funcţionarea enzimei. Clonarea prezintă interes mai ales pentru celulaze deoarece prezenţa 

mai multor gene care codifică aceste enzime la majoritatea microorganismelor celulozolitice 

face dificilă atât obţinerea de mutante cât şi studiul rolului fiecărui component în parte. 

Până în prezent s-a reuşit izolarea, secvenţierea şi clonarea în diferite tulpini mutante de 

S.lividans (care nu produc celulaze) sau în E.coli a trei gene implicate în sinteza celulazelor la 

streptomicete: gena casA ce codifică CMC-aza I de la o tulpină alcalofilă de Streptomyces sp. 

(Nakai şi colab.,1988), gena celA ce codifică o endoglucanază de la S.lividans 66 (Theberge şi 

colab.,1992) şi gena celA1 ce codifică o endoglucanază de la S.halstedii (Fernandezabalos şi 

colab.,1992). De asemenea, Shareck şi colab.(1987) au realizat clonarea într-o tulpină mutantă de 

S.lividans (care nu producea celulaze) a unei secvenţe de ADN care a determinat nu numai 

restabilirea capacităţii de a degrada celuloza ci şi o sporire de peste 800 ori a activităţii 

enzimatice comparativ cu tulpina sălbatică. Interpretarea rezultatelor în acest caz rămâne dificilă 

deoarece genele clonate nu au fost analizate astfel că nu se poate preciza dacă secvenţele de 

ADN clonate conţin gene ce codifică celulaze (endoglucanaze) sau proteine reglatoare. 

Secvenţierea genelor casA şi celA a relevat prezenţa unei secvenţe de 14 pb repetate 

inversat, plasată înaintea regiunii ce codifică proteinele respective, secvenţă identificată şi la 

nivelul genelor celE2, celE4 şi celE5 de la Thermomonospora fusca (Wilson, 1992; Theberge şi 

colab., 1992). De asemenea, din examinarea secvenţelor de aminoacizi deduse din examinarea 

secvenţelor de nucleotide ale genelor casA şi celA şi compararea lor cu secvenţele de aminoacizi 

ale altor celulaze au fost evidenţiate elementele structurale ale celulazelor respective, aşa cum au 

fost ele propuse de Gilkes şi colab.(1991): domeniile catalitice, domeniile de legare la celuloză, 

linkerii ce unesc asemenea domenii şi secvenţele repetate de aminoacizi. Spre exemplu, 

endoglucanaza produsă de S.lividans 66 (codificată de gena celA) este alcătuită din două domenii 

(domeniul catalitic şi domeniul de legare la celuloză) conectate de un linker scurt, extremitatea 

amino-terminală evidenţiind un grad înalt de omologie cu domeniul de legare la celuloză 

("cellulose-binding domain") al endoglucanazei CenA de la Cellulomonas fimi, iar regiunea din 

154


mijlocul proteinei prezintă omologie extinsă cu celulaza E5 de la T.fusca şi alte endoglucanaze 

de Bacillus (Theberge şi colab., 1992). 

Conform propunerilor lui Henrissat şi colab.(1989) şi Gilkes şi colab.(1991) de grupare a 

celulazelor în familii pe baza secvenţelor de aminoacizi de la nivelul domeniilor catalitice 

conservate la mai multe microorganisme şi a analizei regiunilor ("clusteri") hidrofobe, 

endoglucanazele ale căror gene au fost clonate şi secvenţializate (casA şi celA) pot fi încadrate în 

familia A (celA), alături de endoglucanaze de la Clostridium thermocellum, B.subtilis, Bacillus 

sp., Erwinia chrosanthemi, Ruminococcus albus, Clostridium cellulolyticum etc, şi în familia B 

(casA) alături de endoglucanaze de la Cellulomonas fimi, Microbispora bispora şi o 

celobiohidrolază de la Trichoderma reesei. 

Reglarea activităţii celulazelor reprezintă un alt aspect al cercetărilor cu aceste enzime, în 

scopul stabilirii condiţiilor optime de producere şi acţiune a acestora. La fel ca şi în cazul 

mecanismului de degradare a substratelor celulozice, mecanismul de reglare a sintezei şi 

activităţii celulazelor este destul de neclar. O ipoteză generală susţine că microorganismele 

celulozolitice produc celulazele la un nivel bazal care este însă suficient pentru a asigura 

hidroliza celulozei insolubile, rezultând produşi de degradare care pot funcţiona ca inductori 

determinând sinteza unor cantităţi crescute de celulaze (Robson şi Chambliss, 1989). Ca şi alte 

enzime hidrolitice extracelulare şi celulazele se sintetizează ca răspuns la prezenţa inductorului, 

ele fiind represate de obicei de produşii finali de degradare. In cazul actinomicetelor există mai 

multe date referitoare la reglarea celulazelor la bacteriile din genul Thermomonospora. Astfel, 

sinteza celulazelor de către T.fusca este reglată atât prin inducere cât şi prin represie (Liu şi 

Wilson, 1987). Wilson (1992) a arătat că tulpina T.fusca YX cultivată pe celuloză a evidenţiat o 

activitate celulazică de 100 ori mai mare decât cea obţinută prin cultivarea în mediu cu glucoză 

ca sursă unică de carbon. Alţi autori (Fennington şi colab.,1984) au obţinut o tulpină mutantă de 

T.curvata capabilă de a rezista la acţiunea inhibitoare a glucozei. Liu şi Wilson (1988) au reuşit 

izolarea unei tulpini mutante de T.fusca YX care sintetiza în mod constitutiv celulaze, dar sinteza 

lor era supusă în continuare represiei produse de glucoză. Spre deosebire de bacteriile din genul 

Thermomonospora, la streptomicete există foarte puţine date referitoare la reglarea sintezei 

celulazelor iar cele care există sunt oarecum contradictorii. Astfel, Mac Kenzie şi colab.(1984) 

au arătat că activitatea celulazelor de la S.flavogriseus este inhibată de concentraţii mai mari de 

glucoză şi celobioză, în timp ce Ball şi Mc Carthy (1988) susţin că în cazul unor tulpini de 

Streptomyces izolate de ei glucoza şi xiloza nu exercită efect inhibitor asupra enzimelor implicate 

în degradarea deşeurilor celulozice de tipul paielor. In orice caz, cultivarea bacteriilor pe mediu 

ce conţine celuloză pulbere sau CMC are drept consecinţă inducerea sintezei doar a enzimelor 

celulazice în timp ce prin cultivarea bacteriilor pe medii mai complexe (cu paie, xilan sau tărâţe 

de grâu) are loc inducerea unei game mai largi de enzime hidrolitice: atât celulaze cât mai ales 

hemicelulaze (Mac Kenzie şi col., 1987, Godden şi colab., 1989). Spre exemplu, Godden şi 

colab. (1989) utilizând pentru testări o tulpină de Streptomyces sp. a evidenţiat faptul că 

endoglucanazele şi β-glucozidazele sunt induse specific prin cultivarea pe mediu cu CMC ca 

sursă de carbon. Celobioza a evidenţiat o slabă acţiune de inducere a sintezei endoglucanazelor, 

dar induce β-glucozidaza în timp ce celotrioza şi celotetraoza induc slab endoglucanazele. 

Obţinerea unei activităţi celulazice specifice ridicate în filtratele de cultură rezultate prin 

cultivarea bacteriilor pe substratele celulozice naturale (de exemplu paie) se datorează probabil 

unei cooperări dintre diferiţii inductori rezultaţi din acţiunea componentelor complexului 

lignocelulozic. Mai mult, inducerea sintezei celulazelor este inhibată de adăugarea a 50 µg/ml 

cloramfenicol ceea ce ar sugera că , cel puţin în cazul tulpinii analizate, inducerea enzimelor este 

mai degrabă o sinteză "de novo" (Godden şi colab. 1989). 

155

3.5. Hemicelulazele 


Alături de celuloză şi lignină, hemicelulozele reprezintă componente de bază ale peretelui 

celular vegetal, degradarea lor în natură realizându-se destul de greoi, prin cooperarea unor 

sisteme enzimatice de origini foarte diferite. Intre microorganismele producătoare de 

hemicelulaze un loc important este ocupat de streptomicete datorită sintezei unei game foarte 

variate de asemenea enzime. 

Hemicelulozele sunt polizaharide care conţin diferite tipuri de resturi de zaharuri (xiloză, 

manoză, galactoză, arabinoză sau glucoză) ce alcătuiesc polimeri lineari sau ramificaţi. 

Clasificarea acestor substanţe se face în funcţie de conţinutul în zaharuri. Dintre acestea, β-1,4- 

D-xilanii reprezintă grupul major de hemiceluloze fiind alcătuiţi din resturi de D-xilopiranozil 

unite prin legături de tip β-1,4. In mulţi xilani resturile de D-xilopiranozil sunt întocmite de 

arabinozil, glucuronozil sau diferite grupări acetil, în funcţie de planta de origine. Un alt grup de 

hemiceluloze, mananii sînt constituiţi din resturi de D-manopiranozil unite tot prin legături de tip 

β-1,4. Si în cazul acestor polimeri unităţile specifice de D-manopiranozil pot fi înlocuite de Dgalactozil 

sau grupări acetat (Zimmermann, 1989). Hemicelulozele reprezintă un important 

component al peretelui celular vegetal, ele putând fi linkate la compuşi fenolici sau pot prezenta 

legături cu lignina. 

Sistemul enzimatic pentru degradarea hemicelulozelor constă în enzime care clivează 

legăturile din interiorul macromoleculei (endoenzime) şi în exoenzime care taie resturile de 

zaharuri de la extremităţile nereducătoare ale polimerului. Prezenţa unor substituenţi variaţi 

influenţează puternic hidroliza enzimatică. De aceea, pentru hidroliza completă a 

hemicelulozelor sunt necesare enzime care să taie în diferite puncte de ramificaţie. In sistemul 

xilanolitic, aceste enzime acţionează în cooperare cu xilanazele pentru hidroliza completă a 

xilanilor (Biely, 1985). 

Tinând cont de habitatul natural al streptomicetelor şi de prezenţa în acesta a unei mari 

cantităţi de materiale celulozice şi lignocelulozice, bacteriile respective pot fi considerate ca o 

sursă potenţială de enzime hemicelulozolitice (Zimmermann şi colab., 1992). 

Sistemul enzimatic de degradare a xilanului de la diferite tulpini de Streptomyces a fost 

studiat în detaliu. La aceste bacterii au fost identificate mai multe tipuri de hemicelulaze: 

xilanaze, β-xilozidaze, α-L-arabinofuranozidaze, α-4-O-metil-glucuronidaze, acetil-xilan 

esteraze, ferulic şi cumaric esteraze, enzime ce degradează mananii (mananaze). Dintre acestea, 

1,4-β-D-xilanazele (EC 3.2.1.8.) au fost mai mult studiate, ele fiind detectate la numeroase 

tulpini de Streptomyces (Ball şi Mc Carthy, 1988). De asemenea, s-a evidenţiat faptul că aceeaşi 

tulpină poate produce mai multe xilanaze distincte. Spre exemplu, S.ostreogriseus şi S.exfoliatus 

produc câte 5 asemenea enzime în timp ce S.lividans produce o singură asemenea xilanază 

(Sreenath şi Joseph, 1982; Morosoli şi colab.,1986). Recent, Lumba şi Penninchx (1992) au 

caracterizat mai multe forme de β-xilanază izolate de la o tulpină de Streptomyces cultivată pe 

lignoceluloză. Interesant însă că în cazul acestei tulpini, formele de β-xilanază evidenţiate nu 

acţionează sinergic pentru hidrolizarea substratului ceea ce ar constitui o redundanţă a cărei 

semnificaţie nu este clară. 

Pentru purificarea şi caracterizarea xilanazelor de la diferite streptomicete (Tabelul 6) sau 

utilizat filtrate de cultură din care enzimele au fost precipitate cu sulfat de amoniu şi apoi 

supuse unor tratamente speciale: ultrafiltrare, cromatrografie pe schimbători de ioni, gel filtrare şi 

focusare izoelectrică ("isoelectric focusing")(Sreenath şi Joseph, 1982; Morosoli şi colab., 1986; 

Mac Kenzie şi colab., 1987; Yasui şi colab., 1988). 

Cele mai multe dintre aceste enzime au pH între 5 şi 6,5 iar punctul lor izoelectric variază 

între 5,2 şi 10,3 (Zimmermann, 1989). Xilanazele determină hidroliza xilanilor prin ruperea 

legăturilor interne β-1,4, determinând eliberarea de xilotrioză, xilobioză sau xiloză (Yasui şi 

colab., 1988). Un alt tip de hemicelulaze produse de streptomicete, exo-β-1,4-xilozidazele (1,4- 

156


β-D xylan xylohydrolase, EC 3.2.1.37) hidrolizează xilanii prin atac la extremităţile nereducă 

toare ale lanţului de polimer. 

Tabelul 6. Proprietăţile unor xilanaze izolate din diferite tulpini de streptomicete. 

Tulpina pH optim t 0 optimă pI greutate 

moleculară (kDa) 

S.xylophagus 6,5 55-60 - - 

S.flavogriseus 

CD45-2 

6,5 50 - - 

S.exfoliatus 5,5 50 - - 

Streptomyces sp. 5,5 55 6,9 43 

KT23 

S.lividans 5,5-6,5 55-65 5,2 - 

Streptomyces sp.E86 5,5-6,2 55-60 7,3 40 

Eliberarea de resturi α-L-arabinoză din arabinoxilani, arabinani şi arabinogalactani se 

datorează acţiunii specifice a α-L-arabinofuranozidazelor, enzime evidenţiate la unele specii de 

Streptomyces (S.rubiginosus, S.purpurascens, S.massasporus) (Zimmermann, 1989). Alte 

enzime, α-4-O-metilglucironidaze, evidenţiate la S.flavogriseus şi S.olivochromogenes (Mac 

Kenzie şi colab., 1987) determină clivarea legăturilor α-1,2 dintre acidul glucuronic şi resturile 

de xiloză, acţionând sinergic cu xilanazele în procesul de hidroliză a xilanilor. Pe lângă aceste 

tipuri de hemicelulaze, unele tulpini de Streptomyces mai pot sintetiza şi alte enzime care 

hidrolizează alte specii de xilani. Acetil-xilan esterazele produse de S.olivochromogenes şi 

S.rubiginosus participă alături de xilanaze la hidroliza acetil-xilanilor în timp ce alte tulpini de 

Streptomyces (S.viridosporus) pot produce ferulic esteraze care eliberează acid ferulic din 

arabinixilanii aflaţi în cantităţi mai mari în peretele celular al gramineelor (Mac Kenzie şi colab., 

1987; Deobald şi Crawford, 1987). 

O categorie mai puţin studiată de hemicelulaze produse de streptomicete (ţinând cont de 

literatura de specialitate) este reprezentată de mananaze (1,4-β-D-manan mananohidrolaza, EC 

3.2.1.78.) evidenţiate la unele tulpini de S.olivochromogenes sau la alte specii. 

Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară şi implicit a celor de inginerie genetică în 

studiul hemicelulazelor de la streptomicete a permis izolarea şi caracterizarea genelor implicate 

în producerea unor asemenea enzime. Astfel, Mondou şi colab.,(1986) au raportat clonarea unei 

gene pentru endoxilanază de la S.lividans într-o tulpină mutantă neproducătoare. Clonele ce 

conţineau un fragment de ADN de 2kb au evidenţiat o creştere de peste 60 ori a producerii de 

xilanază comparativ cu tulpina sălbatică . De asemenea, Iwasaki şi colab.(1986) au realizat 

transferul genei pentru xilanază izolată de la o tulpină de Streptomyces în alte două tulpini de 

streptomicete - S. lividans şi S. kasugaensis - la care s-a observat o creştere a nivelului de sinteză 

a enzimei respective prin achiziţionarea unui fragment de ADN de 1,04kb. Alături de clonările 

de gene, fuziunile de protoplaşti constituie o metodă relativ simplă dar eficientă de a obţine 

tulpini recombinate genetic, capabile de o mai bună degradare a substratelor complexe. Astfel, 

Pettey şi Crwford (1984) au obţinut o îmbunătăţire a capacităţii de degradare a hemicelulozelor 

şi ligninei de către o tulpină recombinată obţinută prin fuziunea interspecifică de protoplaşti de la 

S.viridospurus T7A şi S.setonii 75 Vi2. Rezultate asemănătoare au for prezentate de Cornea şi 

colab.(1992) care, în urma fuziunii protoplaştilor de S.flavovirens SfG3 cu protoplaşti izolaţi de 

la Streptomyces sp.SD16 au obţinut mai multe tulpini recombinate genetic care prezentau o 

capacitate crescută de degradare a substratelor celulozice şi hemicelulozice comparativ cu 

tulpinile parentale (Figura 10). 

157


Uneori, enzimele produse de diferite tulpini de streptomicete (preparate brute sau enzime 

purificate) au fost studiate în privinţa acţiunii lor asupra peretelui celulei vegetale sau al unor 

fungi. Astfel, Cornea şi colab.(1992) au evidenţiat faptul că prin utilizarea unui filtrat de cultură 

de Streptomyces sp.SD16 s-au putut obţine în condiţii experimentale specifice protoplaşti 

vegetali de Nicotiana tabacum. Acest rezultat sugerează faptul că filtratul de cultură conţine o 

mare varietate de enzime asemănătoare celulazelor, hemicelulazelor dar şi alte enzime care 

cooperează în degradarea peretelui celular vegetal. 

Figura 10. Comparaţie între activitatea enzimatică (celulozolitică) a unor tulpini de streptomicete de tip sălbatic 

(P216, SD16 şi SFG3) şi a unor recombinanţi obţinuţi prin fuziune triparentală de protoplaşti. 

In ceea ce priveşte acţiunea pe peretele celular fungic, s-a dovedit că printre enzimele 

sintetizate de unele tulpini de Streptomyces se numără şi chitinazele, enzimele ce degradează 

componenta chitinică (dominantă) a peretelui celular fungic ducând la formarea protoplaştilor 

(Tagawa şi Okazaki, 1991). Okazaki şi Tagawa (1991) au izolat şi caracterizat o chitinază 

produsă de S.cinereoruber după cultivarea pe un mediu ce conţinea ca sursă de carbon pereţi 

celulari de Aspergillus niger. Enzima respectivă are o greutate moleculară de 19 kDa şi un pI 8,6 

iar pH optim se situează în domeniul acid (4,0-5,0) la 50 0 C. 

Beyer şi Diekeman (1984) au caracterizat enzime de tip laminarinază de la Streptomyces 

sp.ATCC11238 ca şi un complex de enzime ce degradează eficient chitina şi laminarina, fiind 

active asupra a peste 50 specii de ascomicete. Fracţionarea chitinazei prin gel filtrare şi 

cromatografie pe schimbători de ioni a condus la evidenţierea unei exo-chitinaze şi a unei β-Nacetil-glucozoaminidaze 

ce eliberează N-acetil glucozamina din crusta chitinoasă de crab (Beyer 

şi Diekman, 1985). In mod asemănător, Billich şi colab.(1988) au obţinut protoplaşti de 

Fusarium scirpi prin utilizarea unui preparat enzimatic de S.tsushimaensis. 

Datele prezentate în această lucrare reflectă particularităţile deosebite ale bacteriilor din 

genurile Streptomyces şi Bacillus şi importanţa pe care acestea o au atât din punct de vedere 

teoretic cât şi practic, fie pentru obţinerea unor compuşi cu aplicaţii in medicină, industria 

alimentară, a detergenţilor etc. fie în natură, ca verigi importante ale mecanismelor de degradare 

şi reciclare a unor resturi organice existente de obicei în sol. Cunoaşterea echipamentului lor 

enzimatic, al potenţialului lor de biosinteză ca şi al determinismului genetic al acestuia corelată 

cu tehnicile moderne de biologie moleculară şi cu cele de fuziuni celulare asigură, pe de o parte, 

o mai bună studiere a caracteristicilor acestor bacterii, inclusiv a taxonomiei grupului iar, pe de 

altă parte, poate conduce la obţinerea unor tulpini recombinate genetic capabile de a sintetiza sau 

degrada cu o eficienţă crescută anumiţi compuşi cu importanţă practică deosebită. 

158

Bibliografie selectivă 


1. Aretz, W., Koller, K. P., Riess, G., 1989, Proteolytic enzymes from recombinant 

Streptomyces lividans TK24, FEMS Microbiol. Letts., 65, p.31-36. 

2. Ball, A. S., Mc Carthy, A. J., 1988, Saccharification of straw by actinomycetes enzymes, J. 

Gen. Microbiol., 134, p.2139-2147. 

3. Baltz, R. H., Seno, E. T., 1988, Genetics of Streptomyces fradiae and tylosin biosynthesis, 

Ann. Rev. Microbiol., 42, p. 547-574. 

4. Bayer, E. A., Setter, E., Lamed, R., 1985, Organization and distribution of the cellulosome in 

Clostridium thermocellum, J. Bact., 163, p.552-559. 

5. Beguin, P., 1990, Molecular biology of cellulose degradation, Ann. Rev. Microbiol., 44, 

p. 219-248. 

6. Beyer, M., Diekman, H., 1985, The chitinase system of Streptomyces sp. ATCC 11238, 

Appl. Microbiol. Biotechnol., 23, p. 140-146 

7. Billich, A., Keller, U., Kleinkauf, H., Zocher, K., 1988, Production of protoplasts from 

Fusarium scirpi by lytic enzymes from Streptomyces tsusimaensis, Appl. Microbiol. 

Biotechnol., 28, p.442-444 

8. Binnie, C., Warren, M., Butler, M. J., 1989, Cloning and heterologous expression in 

S.lividans of S.rimosus genes involved in oxytetracycline biosynthesis, J. Bact., 171, p. 887- 

895 

9. Bond, K., Stutzenberger, F., 1989, A note on the localization of cellulosome formation in 

Thermomonospora curvata, J. Appl. Bacteriol., 67, p. 605-609. 

10. Bonner, M. A., Stutzenberger, F., 1988, Cell surface changes in Thermomonospora curvata 

during cellulase induction and repression, Letts. Appl. Microbiol., 6, p.59-63. 

11. Buttner, M. J., Smith, A. M., Bibb, M. J., 1988, At least three different RNA polymerase 

holoenzymes direct transcription of the agarase gene (dagA) of S.coelicolor A3(2), Cell, 52, 

p. 599-607. 

12. Chardon-Loriaux, I., Charpentier, M., Percheron, F., 1986, Isolation and characterization of a 

linear plasmid from Streptomyces rimosus, FEMS Microbiol.Letts., 35, p.151-155. 

13. Chater,K., Bruton,C.J., 1985, Resistance, regulatory and production genes for the antibiotic 

methylenomycin are clustered, EMBO.J., 4, p.1893-1900. 

14. Cornea, 1996, Obţinerea unor bacterii cu importanţă biotehnologică prin fuziunea şi 

transformarea genetică a protoplaştilor, Teză de doctorat, Universitatea Bucureşti. 

15. Cornea, C. P., Cogălniceanu, G., Brezeanu, A., Vatafu, I., Savu, L., Popescu, I., Pop, A., 

1992, Obţinerea protoplaştilor de tutun prin utilizarea unui preparat enzimatic brut de 

Streptomyces sp. SD16, St. Cercet. Biol., 44, p. 85-88. 

16. Cornea, C. P., Vatafu, I., Pop, A., Brezeanu, A., Savu, L., Dobrotă, S., 1993, Interspecific 

protoplast fusion in Streptomyces, Rev. Roum. Biol., 38, p. 49-53. 

17. Cornea, C. P., Vatafu, I., Savu, L., 1994, Plasmid transfer by protoplast fusion, Microbiol. 

Ind. Biotehnol., 8, p. 145-148. 

18. Coughlan, B. P., 1988, Staining techniques for the detection of the individual components of 

cellulolytic enzyme system, Methods in Enzymology, 160, p. 135-145. 

19. Cundliff, E., 1989, How antibiotic-producing organims avoid suicide, Ann. Rev. Microbiol., 

43, p. 207-233. 

20. Damude, H. G., Gilkes, N. R., Kilburn, D. G., Miller, R. C., Warren, R. A., 1993, 

Endoglucanase Cas A from alkalophilic Streptomyces strain KSM-9 is a tipical member of 

family B of â-1,4-endoglucanase, Gene, 123, p. 105-107. 

21. Davies, J., 1990, What are antibiotics? Archaic functions for modern activities, Molec. 

Microbiol. , 4 (8), p. 1227-1232. 

159


22. Deobald, L. A., Crawford, D. L., 1987, Activities of cellulase and other extracellular 

enzymes during lignin solubilization by Streptomyces viridosporus, Appl. Microbiol. 

Biotechnol., 28, p. 158-163. 

23. Dimcev, A., 1988, Protoplast from antibiotic-producing actinomycetes. Application in the 

biotechnology, Biotechnol. Bioeng., 4, p. 12-19. 

24. Doyle, R. J., 1994, Introduction to lectins and their interactions with microorganisms, in 

Lectin-Microorganism Interaction, Eds. R.J.Doyle si M.Slifkin, Marcel Dekker Inc., p. 1-65. 

25. Duitman, E., Hamoen, L., Rembold, M., Vater, L., 1999, The mycosubtilin synthetase of 

Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an 

amino transferase, and a fatty acid synthase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 96 (23), 13294- 

13299. 

26. Felix, C. R., Ljungdahl, L. G., 1993, The cellulosome: the exocellular organelle of 

Clostridium, Ann. Rev. Microbiol., 47, p. 791-819. 

27. Fernandez-Abalos, J. M., Sanchez, P., Coll, P. M., Villanueva, J. R., Perez, P., Santamaria, 

R. I., 1992, Cloning and nucleotide sequence of celA1, an endo-β-1,4-glucanase-encoding 

gene from Streptomyces halstedii JM8, J. Bacteriol., 174, p. 6338-6376. 

28. Ghangas, G. S., Wilson, D. B., 1988, Cloning of the Thermomonospora fusca endoglucanase 

E2 gene in Streptomyceslividans: affinity purification and functional domains of the cloned 

gene product, Appl. Envir. Microbiol., 54, p. 2521-2526. 

29. Gilbert, H. J., Hazlewood, G. P., 1993, Bacterial cellulases and xylanases, J. Gen. Microbiol., 

139, p. 187-194. 

30. Godden, B., Legon, T., Helvenstein, P., Penninckx, M., 1989, Regulation and production of 

hemicellulolytic and cellulolytic enzymes by a Streptomyces sp. growing on lignocellulose, J. 

Gen. Microbiol., 135, p. 285-292. 

31. Gokhale, D. V., Deobagkar, D. N., 1989, Differential expression of xylanase and 

endoglucanase in the hybrid derived from intergeneric protoplast fusion between 

Cellulomonas sp. and Bacillus subtilis, Appl. Envir. Microbiol., 55, p. 2675-2680. 

32. Gormley, E. P., Cantwell, B. A., Barker, P. J., Mc Connell, D. J., 1988, Secretion and 

processing of the Bacillus subtilis endo-â-1,3-14-glucanase in Escherichia coli, Molec. 

Microbiol, 2, p. 813-819. 

33. Horikoshi, K., Nakao, M., Kurono, Y., Sashihara, N., 1984, Cellulases of an alkalophilic 

Bacillus strain isolated from soil, Can. J. Microbiol., 30, p. 774-779. 

34. Imanaka, T., 1986, Application of recombinant DNA technology to the production of useful 

biomaterials, Adv. Biochem. Eng., 33, p. 1-27. 

35. Ishaque, M., Kluepfel, D., 1980, Cellulase complex of a mesophilic Streptomyces strain, 

Can. J. Microbiol., 26, p. 183 – 189. 

36. Kakoniova, D., Labudova, I, Liskova, D., 1987, Callus culture as substrate for the production 

of specific cell wall degradind enzymes for derived protoplast isolation, Biotechnol. Letts., 9, 

p. 721-724. 

37. Kinashi, H., 1988, Giant linear plasmids in Streptomyces and antibiotic production, in 

Biology of Actinomycetes '88, Japan Scientific Societies Press, p. 117-122. 

38. Kinashi, H., 1989, Giant linear plasmids in various methylenomycin-producing strains of 

Streptomyces species, in Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Ed. 

C. L. Hershberger, S. W. Queener, G. Hegeman, ASM, p. 141-146. 

39. Kirby, R., Hopwood, D. A., 1977, Genetic determination of methylenomycin biosynthesis 

by the SCP1 plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2), J. Gen. Microbiol., 98, p. 239-252. 

40. Kluepfel, D., Shareck, F., Mondou, F., Morosoli, R., 1986, Characterization of cellulase and 

xylanase activities of Streptomyces lividans, Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, p. 230-234. 

41. Lamed, R., Naimark, J., Morgenstern, E., Bayer, E. A., 1987, Specialized cell surface 

structures in cellulolytic bacteria, J. Bacteriol., 169, p. 3792-3800. 

160


42. Mansouri, K., Pissowotzki, K., Distler, J., Ebert, A., Piepersberg, W., 1989, Genetics of 

streptomycin production, în Genetics and molecular biology of industrial microorganisms, 

Ed. Hershberger, C. L., Queener, S. W., Hegeman, G., ASM, p. 61-67. 

43. Martin, J. F., 1989, Molecular mechanisms for the control by phosphate of the biosynthesis 

of antibiotics and other secondary metabolites, în Regulation of secondary metabolism in 

Actinomycetes, Ed. S. Shapiro, Boca Raton, CRC, p. 230-251. 

44. Martin, J. F., Liras, P., 1989, Organization and expression of genes involved in the 

biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites, Ann. Rev. Microbiol., 43, p. 173- 

206. 

45. Mc Carthy, A. J., Williams, S. T., 1992, Actinomycetes as agents of biodegradation in the 

environment - a review, Gene, 115, p. 189-192. 

46. Nakano, M. N., Butsuya, I., Ogawara, H., 1989, Expression of the kanamycin resistance gene 

in a kanamycin-producing strain of S. kanamyceticus, J. Antib., 42, p. 423-430. 

47. Nakano, M. N., Mashiko, H., Ogawara, H., 1984, Cloning of the kanamycin resistance gene 

from a kanamycin producing Streptomyces species, J. Bact., 157, p. 79-83. 

48. Okanishi, M., Katagiri, K., Furumai, T., Takeda, K., Kawagichi, K., Saitoh, M., Nabeshima, 

S., 1983, Basic techniques for DNA cloning and conditions required for streptomycetes as 

host, J. Antib., 36, p. 99-108. 

49. Okuda, T., Ito, Y., 1982, Biosynthesis and mutasynthesis of aminoglycoside antibiotics, în 

Aminoglycoside antibiotics, Ed. Umezawa, H., Hooper, I. R., Springer Verlag., p. 111-203. 

50. Omich, P. K., 1988, Streptomyces cloning: useful recombinant DNA systems and a 

summation of cloned genes, Antim. Ag. Chemoth., 32, p. 1465-1471. 

51. Peberdy, J. F., Illing, G. T., 1985, Genetic manipulation of antibiotic producer strains, in The 

Scientific Basis of Antimicrobial Chemotherapy, Ed. D. Greenwood, F. O' Grady, p.283-322. 

52. Pettey, T. M., Crawford, D. L., 1984, Enhancement of lignin degradation in Streptomyces 

spp. by protoplast fusion, Appl. Envir. Microbiol., 47, p. 439-440. 

53. Pokorny, M., Vitale, L., 1980, Enzymes as by-products during biosynthesis of antibiotics, în 

Industrial and Clinical Enzymology, Ed. Vitale, L., Simeon, V., Pergamon Press Oxford, p. 

13-25. 

54. Pongs, O., 1979, Cloramphenicol, în Antibiotics, Ed.Hahn, F. E., Springer Verlag, 5, 

p. 26-42. 

55. Ramachandra, M., Crawford, D. L., Pometta, A. L., 1987, Extracellular enzyme activities 

during lignocellulose degradation by Streptomyces spp.: a comparative study of wild-type 

and genetically manipulated strains, Appl. Envir. Microbiol., 53, p. 2754-2760. 

56. Robson, J. M., Chambliss, G. H., 1989, Cellulases of bacterial origin, Enzyme Microbiol. 

Technol., 11, p. 626-644. 

57. Schlochtermeier, A., Miemeier, F., Schrempf, H., 1992, Biochemical and electron 

microscopic studies of the Streptomyces reticuli cellulase (avicelase) in its myceliumassociated 

and extracellular forms, Appl. Environ. Microbiol., 58, p. 3240-3248. 

58. Schlochtermeier, A., Walter, S., Schroder, J., Moorman, M., Schrempf, H., 1992, The gene 

encoding the cellulase (avicelase) Cel1 from Streptomyces reticuli and analysis of protein 

domains, Molec. Microbiol., 6, p. 3611-362. 

59. Srinivasan, M. C., Laxman, R. S., Deshpande, M. V., 1991, Physiology and nutritional 

aspects of actinomycetes: an overview, World J. Microbiol. Biotechnol., 7, p. 171-184. 

60. Tiraby, G., Bejar, S., Reynes, J. P., Sicard, P. J., Farber, G. K., Ringe, D., Petsko, G. A., 

1989, Genetic, enzymatic and crystallographic studies of the glucose isomerase of two 

Streptomyces species, în Genetics and molecular biology of industrial microorganisms, Ed. 

Hershberger, C. L., Queener, S. W., Hegeman, G., ASM, p. 119-126. 

61. Vining, L. C., 1990, Functions of secondary metabolites, Ann. Rev. Microbiol., 44, p. 395- 

427 

161


62. Vining, L. C., 1992, Secondary metabolism, inventive evolution and biochemical diversity: a 

review, Gene, 115, p. 135-140. 

63. Wachinger, G., Bronnenmeier, K., Staudenbauer, W. L., Schrempf, H., 1989, Identification 

of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli, Appl. Environ. Microbiol., 55, 

p. 2653-2657. 

64. Wilson, D. B., 1992, Biochemistry and genetics of actinomycete cellulase, Crit.Rev. 

Biotechnol., 12, p. 45-63. 

65. Winkelmann G., Allgaier H., Lupp R., Jung G., Iturin AL- a new long chain iturin a 

possessing an unusual high content of C16-β-amino acids, J Antibiot (Tokyo) 1987 Apr., 

40(4): 437-42. 

66. Wood, T. M., Bhat, K. M., 1988, Methods for measuring cellulase activities, Methods 

Enzymol., 160, p. 87-112. 

67. Zarnea, G., 1984, Tratat de microbiologie generală, 1, Ed. Academiei. 

68. Zimmermann, W., 1989, Hemicellulolytic enzyme systems from actinomycetes, în Enzyme 

systems for lignocellulose degradation, Ed. Coughlan, M. P., Elsevier Applied Science, p. 

167-181. 

69. Zimmermann, W., Davis, B., Winter, B., Shou,W., 1992, Actinomycetes and their enzymes 

for applications in the pulp and paper industry, în Biotechnology in Pulp and Paper Industry, 

Ed. Kuwahara, M., Shimada, M., Uni Publishers, Co. LdT, p. 145-150. 

162

Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile - Universitatea ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?