Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile - Universitatea ...
Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile - Universitatea ...
Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile - Universitatea ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi<br />
Bacillus<br />
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
<strong>Universitatea</strong> <strong>din</strong> Bucureşti, Facultatea de Biologie Splaiul Independenţei 91-95, 76201<br />
Bucureşti<br />
Bacteriile aparţinând genurilor Bacillus şi Streptomyces sunt cunoscute ca fiind<br />
producători ai unor game largi de compuşi biologic activi, <strong>din</strong>tre care unii au aplicaţii în<br />
agricultură şi industria farmaceutică. Dacă în cazul bacililor cunoştinţele sunt mai avansate, iar<br />
aplicaţiile practice concentrate mai <strong>ale</strong>s asupra enzimelor, la streptomicete cele mai multe<br />
cunoştinţe au fost dobândite în urma studiilor asupra producerii de antibiotice. Scopul acestei<br />
lucrări este de a sintetiza datele referitoare la biosinteza de enzime şi de compuşi cu efect<br />
inhibitor, utili pentru diferite procese <strong>biotehnologice</strong>. De asemenea, sunt prezentate unele date<br />
referitoare la genele ce codifică biosinteza unor substanţe importante <strong>din</strong> punct de vedere<br />
biotehnologic.<br />
Actinomicetele reprezintă un grup de microorganisme procariote cu numeroase<br />
asemănări cu fungii microscopici, alături de care constituie un exemplu clasic de evoluţie<br />
convergentă. Relevante în acest sens sunt: morfologia şi organizarea micelială a coloniilor lor ca<br />
şi sistemul lor de reproducere. Se poate specula că aceste asemănări rezultă <strong>din</strong>tr-o adaptare<br />
comună în sensul desfăşurării tuturor funcţiilor metabolice în condiţiile absenţei apei în imediata<br />
lor vecinătate.<br />
Ciclul de viaţa al streptomicetelor, cel mai important gen <strong>din</strong> cadrul grupului<br />
actinomicetelor, crescute pe mediu solid implică formarea (diferenţierea) a două tipuri diferite de<br />
miceliu: miceliul de substrat care creşte în si pe mediul de cultură solid; miceliul aerian care<br />
creşte pe primul şi pe care se formează sporii (Figura 1).<br />
In timpul creşterii miceliului de substrat se remarcă o creştere simultană a greutăţii uscate<br />
care însă încetineşte semnificativ odată cu formarea miceliului aerian.<br />
Figura 1. Reprezentarea schematică a celor două tipuri de miceliu (după Zarnea, 1982).<br />
123
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Un aspect interesant este acela că, la multe <strong>din</strong>tre speciile de streptomicete, încetinirea<br />
ratei de creştere este însoţită de producerea de substanţe antibiotice sau cu alte funcţii (metaboliţi<br />
secundari), astfel că în timpul formării miceliului aerian se remarcă o foarte intensă activitate<br />
antibiotică. Acest fapt vine în sprijinul ipotezei asupra rolului antibioticelor produse de<br />
streptomicete şi anume acela de a proteja miceliul de substrat care se lizează împotriva altor<br />
bacterii existente în sol care l-ar putea folosi ca sursă de carbon şi azot, păstrându-l astfel pentru<br />
creşterea miceliului aerian (Chater şi Merrick, 1979).<br />
Diferenţierea celulară evidenţiată la streptomicete pare a fi un proces controlat de unele<br />
substanţe autoreglatoare cum sunt factorii A şi B al căror mecanism de acţiune, cel puţin în cazul<br />
unor specii de streptomicete care au fost studiate mai intens, este asemănător mecanismului de<br />
acţiune al hormonilor de la eucariote, implicând prezenţa unor receptori specifici (Beppu, 1986).<br />
Acest tip de reglaj împreună cu observaţiile legate de asemănările structur<strong>ale</strong> <strong>ale</strong> factorului B cu<br />
AMPc de la eucariote sugerează ideea că anumite substanţe evidenţiate la streptomicete ar putea<br />
fi semn<strong>ale</strong> univers<strong>ale</strong> sau mesageri pentru funcţii celulare nu numai la procariote ci şi la<br />
eucariote.<br />
Ca rezultat al activităţii lor metabolice, atât streptomicetele cât şi bacilii, formează mai<br />
multe categorii de compuşi care includ, pe lângă constituenţii structurali ai celulei, enzime intra-<br />
şi extracelulare, produşi finali de metabolism precum şi o serie de produşi cu importanţă practică<br />
deosebită incluzând metaboliţii primari şi pe cei secundari.<br />
Metaboliţii primari sunt compuşi cu greutate moleculară în general mică, reprezentând<br />
produşi intermediari sau finali ai metabolismului intermediar necesari microorganismului<br />
producător şi care includ : aminoacizi, acizi organici, nucleotide, vitamine, enzime etc (Zarnea,<br />
1984). Aceşti compuşi sunt sintetizaţi în cursul trofofazei (perioadei de multiplicare rapidă şi<br />
acumulare de biomasă celulară), în medii bogate în substanţe nutritive şi condiţii fizice<br />
corespunzătoare. După această etapă urmează idiofaza în cursul căreia creşterea şi multiplicarea<br />
încetează dar celulele rămân metabolic active sintetizând o categorie specială de substanţe cu<br />
structură chimică variată, denumite metaboliţi secundari. Numărul metaboliţilor secundari este<br />
foarte mare iar efectele lor sunt de asemenea foarte variate. Diversitatea neobişnuită a efectelor<br />
farmaco<strong>din</strong>amice şi a structurii lor chimice este ilustrată de numeroasele clase de compuşi<br />
organici la care pot aparţine şi care includ: glucide aminate, chinone, cumarine, epoxizi,<br />
alcaloizi, glicozide, derivaţi indolici, lactione, macrolide, naft<strong>ale</strong>ne, nucleozide, terpenoizi şi<br />
tetracicline (Berdy, 1974).<br />
Sinteza metaboliţilor secundari se face printr-o mai mare varietate de căi decât aceea a<br />
metaboliţilor primari, pe seama compuşilor cu greutate moleculară mică folosiţi în timpul<br />
creşterii exponenţi<strong>ale</strong> pentru sinteza constituenţilor celulari normali şi este rezultatul acumulării<br />
în mediu a unor substanţe cu rol de inductor. De asemenea, declanşarea sintezei metaboliţilor<br />
secundari se poate datora şi epuizării unor substanţe cu funcţie de represor (Vining, 1990). In<br />
contrast cu diversitatea căilor de biosinteză şi a produşilor finali, cei mai mulţi <strong>din</strong>tre metaboliţii<br />
secundari sunt asamblaţi pornind de la câţiva metaboliţi cheie. In plus, spre deosebire de<br />
metabolismul primar în care procesele de biosinteză se desfăşoară întotdeauna cu mare<br />
specificitate (se utilizează un singur substrat şi rezultă un singur produs), în metabolismul<br />
secundar proporţia fiecărui component depinde de factori genetici şi de mediu, probabil datorită<br />
specificităţii scăzute a enzimelor implicate în desfăşurarea sa.<br />
Majoritatea metaboliţilor secundari au acţiuni antibiotice dar există şi compuşi cu acţiuni<br />
diferite. In general ei au mărime redusă chiar dacă nu sunt monomeri ci oligomeri; ei sunt de<br />
obicei excretaţi în mediul extern fie sub formă solubilă în apă fie ca produşi insolubili care<br />
formează agregate amorfe sau cristaline asociate cu celulele producătoare (Vining, 1990).<br />
124
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
1. Functiile metabolitilor secundari produşi de bacili şi<br />
streptomicete<br />
1.1. Activitatea antibiotică a metaboliţilor secundari<br />
Printre bacterii, actinomicetele şi în special cele <strong>din</strong> genul Streptomyces sunt cunoscute<br />
ca fiind principalii producători de antibiotice, sintetizând 3/4 <strong>din</strong>tre toţi produşii cunoscuţi de<br />
acest tip. Antibioticele produse de streptomicete au structură chimică variată putând fi clasificate<br />
în diferite tipuri în timp ce compuşii cu funcţii similare elaboraţi de bacteriile <strong>din</strong> genul Bacillus<br />
sau <strong>din</strong> alte grupe (bacterii lactice, enterobacterii, Pseudomonas sp.) sunt în majoritate peptide<br />
sau peptide modificate.<br />
Membrii genului Bacillus (Figura 2) sunt capabili să producă antibiotice ca metaboliţi<br />
secundari în faza de creştere logaritmică târzie sau la începutul fazei staţionare. Au fost semnalaţi<br />
mai mult de 169 de astfel de metaboliţi. De exemplu, B subtilis poate produce 68 tipuri de<br />
antibiotice, în timp ce la B.brevis au fost identificate numai 23 asemenea tipuri de<br />
substanţe.(Katz şi Demain 1987).<br />
Figura 2. Aspect electronomicroscopic al celulelor de Bacillus subtilis (după Zarnea, 1984).<br />
Multe <strong>din</strong>tre antibioticele produse de bacili sunt active împotriva <strong>bacteriilor</strong> Gram<br />
pozitive, dar există şi excepţii. Aşa cum s-a menţionat deja, majoritatea antibioticelor produse de<br />
bacili sunt peptide, dar unele aparţin altor clase de compuşi chimici (de exemplu, leutirosin este o<br />
amiloglicozidă, iar protacin este o trienă fosforică).<br />
Există o controversă în ceea ce priveşte funcţia acestor antibiotice la bacteriile <strong>din</strong> genul<br />
Bacillus. Ele apar, de obicei, în timpul sporutării, de aceea se crede că antibioticele respective<br />
constituie un factor important ce apare la tranziţia de la starea vegetativă la spori (Katz şi<br />
Demain,1987).<br />
Multe <strong>din</strong>tre tulpinile de bacili producătoare de compuşi cu acţiune antimicrobiană au<br />
fost supuse unor analize speci<strong>ale</strong> de cartare moleculară, de identificare şi clonare a genelor<br />
codificate. Datele obţinute până în prezent sunt prezentate în Tabelul 1. Metaboliţii secundari<br />
datorează activitatea antibiotică capacităţii lor de a inhiba procesele metabolice primare. Cei mai<br />
mulţi acţionează ca antimetaboliţi deoarece asemănarea lor funcţională cu metaboliţii normali le<br />
permite legarea la situsuri ţintă şi să interfere cu activitatea normală. Produşii generaţi de o<br />
anumită c<strong>ale</strong> metabolică inhibă de obicei o altă c<strong>ale</strong> metabolică, activitatea lor depinzând în<br />
întregime de configuraţia antibioticului şi de distribuţia grupărilor funcţion<strong>ale</strong> la nivelul lor.<br />
125
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Tabelul 1. Substanţe antibiotice produse de bacteriile genului Bacillus<br />
Specie Antibiotic Acţiune inhibitoare Harta<br />
B.subtilis<br />
126<br />
genetică<br />
Gene<br />
clonate<br />
Subtilin Bacterii Gram + + +<br />
Surfactin + -<br />
Bacilysin Bacterii Gram + + -<br />
Diffici<strong>din</strong> Spectru larg de acţiune - -<br />
Oxydifici<strong>din</strong> Spectru larg de acţiune - -<br />
Bacillomycin F Antifungic - -<br />
Mycobacillin Antifungic - -<br />
Iturin Antifungic<br />
B. brevis Gramici<strong>din</strong> S Bacterii Gram + + +<br />
Tyroci<strong>din</strong> Bacterii Gram + + +<br />
B. licheniformis Bacitracin Bacterii Gram + + +<br />
Proticin - -<br />
B. pumilus Pumilin Bacterii Gram + - -<br />
Tetain Bacterii Gram + - -<br />
B. mesentericus Esperin Bacterii Gram + - -<br />
B. polymyxa Polymyxin Bacterii Gram - - -<br />
Colistin Bacterii Gram - - -<br />
B.tyaminoliticus Octopytin Bacterii Gram + - -<br />
Baciphelecin Bacterii Gram + - -<br />
B. circulans Circulin Bacterii Gram - - -<br />
Butirosin Bacterii Gram + - -<br />
B.laterosporus Laterospuramine Bacterii Gram + - -<br />
Laterosporin<br />
B. cereus Biorin<br />
Cerexin<br />
Bacterii Gram + - -<br />
Deoarece nu există o corelaţie strictă între ţintele antibioticului şi căile metabolice în care<br />
el este format, este riscant să se spună că toţi metaboliţii secundari manifestă o anumită activitate<br />
biologică, mai <strong>ale</strong>s dacă ţinem cont de faptul că de multe ori aceşti compuşi au semnificaţie<br />
numai pentru om şi mai puţin pentru organismul producător.<br />
Deşi cercetările asupra utilităţii medic<strong>ale</strong> a antibioticelor s-au referit în special la<br />
activitatea antibacteriană, în prezent sunt studiate acţiunile unor asemenea substanţe şi asupra<br />
unor alte tipuri de celule, eucariote. Un exemplu în acest sens îl constituie monensinul, identificat<br />
iniţial în culturi de Streptomyces cinnamonensis şi care în prezent este utilizat pe scară largă ca şi<br />
coccidiostatic sau ca stimulator al creşterii anim<strong>ale</strong>lor (Vining, 1990).<br />
O problemă care se pune în cazul producerii de substanţe antibiotice este aceea a<br />
modalităţilor în care bacteriile producătoare rezistă la acţiunea acestor substanţe care de obicei<br />
inhibă creşterea sau alte procese biochimice esenţi<strong>ale</strong>. Pentru a elimina efectul de inhibare a<br />
creşterii, bacteriile producătoare pot prezenta mai multe mecanisme de rezistenţă: modificarea<br />
situsului ţintă al antibioticului, modificarea permeabilităţii membranare sau inactivarea<br />
metabolitului toxic (Cundliffe, 1989). Deoarece antibioticele sunt rapid eliminate în exteriorul<br />
celulei pe măsură ce el este produs, inactivarea celulară nu afectează eficienţa produsului<br />
extracelular.<br />
Un studiu efectuat asupra rezistenţei la antibiotice a tulpinilor bacteriene sensibile ("ţintă") a<br />
evidenţiat faptul că antibioticele excretate în mediu şi care acţionează în vecinătatea<br />
organismului producător au semnificaţia unor factori implicaţi în competiţia pentru resurse.
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
Rezistenţa la antibioticele obţinute a fost observată la multe tulpini bacteriene de colecţie,<br />
izolate înainte de introducerea acestor antibiotice în practica medicală ceea ce sugerează ideea că<br />
populatiile bacteriene vin în contact cu asemenea compuşi în mediul lor natural de viaţă. De<br />
asemenea, unii metaboliţi toxici chiar dacă nu au o valoare antibiotică mare, ei pot potenţa<br />
activitatea altor antibiotice faţă de care s-a instalat rezistenţa la numeroase tulpini bacteriene.<br />
Acesta este cazul acidului clavulanic produs de tulpini de S.clavuligerus care are o slabă<br />
activitate antibiotică dar care determină o sporire a acţiunii unor antibiotice β-lactamice cum este<br />
cefamicinul prin inhibarea β-lactamazelor pro-duse de tulpina bacteriană ţintă.<br />
Antibioticele descoperite până în prezent şi utilizate mai mult sau mai puţin intens în<br />
practica medicală pot fi clasificate ţinând cont de diferite criterii: modul de acţiune, natura<br />
chimică, spectru de acţiune etc.<br />
O abordare recentă a structurii unor antibiotice consideră că acestea, alături de un număr<br />
mare de metaboliţi sintetizaţi atât de către bacterii cât şi de fungi sau plante, pot fi grupate într-o<br />
familie de compuşi denumiţi poliketide (Hopwood şi Sherman 1990). Toţi aceşti compuşi au în<br />
comun prezenţa unor grupări keto la nivelul unor atomi de carbon foarte variaţi ca poziţie în<br />
molecula respectivă. Printre compuşii incluşi în această familie menţionăm: tetraciclinele,<br />
antraciclinele, eritromicina, rifamicinele, granaticinul, avermectinul (toate sintetizate de către<br />
streptomicete), aurantininul (sintetizat de Bacillus sp.) mupirocin (elaborat de Pseudomonas sp.)<br />
precum şi <strong>ale</strong> substanţe elaborate de celule eucariote: micotoxine, flavonoizi, fito<strong>ale</strong>xine etc.<br />
1.1.1. Antibiotice care inhibă sinteza peretelui celular<br />
După descoperirea penicilinei de către Fleming în 1929, un număr mare de antibiotice<br />
înrudite cu aceasta au fost izolate, ele având în comun structura chimică (sunt β-lactami) şi<br />
modul de acţiune (inhibarea sintezei peretelui celular bacterian).<br />
Deşi penicilinele au fost descoperite ca fiind produse de către fungi, s-a dovedit că<br />
asemenea antibiotice pot fi sintetizate şi de către unele specii de streptomicete cum ar fi:<br />
S.clavuligerus, S.lipmanii, S.lactamgens, S.cattleya (Martin şi Liras, 1989; Matsushima şi Baltz,<br />
1989; Srinivasan şi colab.,1991).<br />
Pe lângă antibioticele β-lactamice au mai fost izolaţi şi caracterizaţi şi alţi compuşi care<br />
afectează funcţiile membranei plasmatice. Un exemplu îl constituie nistatinul, antifungic produs<br />
de unele specii <strong>ale</strong> genului Streptomyces. Un alt grup este reprezentat de polimixine, bacitracine<br />
şi gramici<strong>din</strong>e, antibiotice polipeptidice produse de bacterii aparţinând genului Bacillus<br />
(B.polymixa, B.licheniformis, B.brevis). Aceşti compuşi determină creşterea permeabilităţii<br />
membranei plasmatice ceea ce are drept consecinţă ieşirea masivă a unor aminoacizi sau a unor<br />
derivaţi purinici şi pirimi<strong>din</strong>ici <strong>din</strong> bacterie, conducând în final la moartea celulei. De asemenea,<br />
bacitracina acţionează asupra sintezei peretelui celular, determinând inhibarea biosintezei<br />
peptidoglicanului unor bacterii Gram negative.<br />
1.1.2. Antibiotice care inhibă sinteza proteinelor<br />
Dintre antibioticele care afectează sinteza proteinelor, un loc important este ocupat de<br />
aminoglicozide, tetracicline şi cloramfenicol, toate cele trei grupe fiind sintetizate de specii <strong>ale</strong><br />
genului Streptomyces..<br />
Aminoglicozidele reprezintă un grup foarte important de antibiotice care au drept<br />
component principal unele glucide aminate. Primul antibiotic <strong>din</strong> acest grup care a fost<br />
descoperit în 1944 este streptomicina produsă de S.griseus, după care au fost izolate numeroase<br />
alte aminoglicozide de la bacterii aparţinând în principal genurilor Streptomyces şi<br />
Micromonospora: gentamicina produsă de specii de Micromonospora, neomicina produsă de<br />
S.fradiae, ribostamicina produsă de S.ribosidificus, kanamicina sintetizată de tulpini de<br />
S.kanamyceticus, butirozina produsă de B.circulans etc.(Okuda şi Ito, 1982).<br />
127
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Aminoglicozidele sunt antibiotice cu spectru larg de acţiune utilizate de obicei pentru<br />
tratarea unor infecţii produse de tulpini de E.coli, Klebsiella sp., Proteus sp., Enterobacter sp.<br />
Mecanismul prin care aceste antibiotice omoară celulele sensibile nu este pe deplin elucidat.<br />
Există numeroase date experiment<strong>ale</strong> care evidenţiază că situsul primar de acţiune al acestor<br />
antibiotice ar fi ribosomii, ceea ce determină afectarea sintezei proteinelor. Efectele pleiotropice<br />
<strong>ale</strong> aminoglicozidelor asupra <strong>bacteriilor</strong> sunt considerate a fi consecinţa interacţiunii lor cu<br />
ribosomii. Alături de interferenţa cu sinteza proteică, aminoglicozidele induc distrugeri <strong>ale</strong><br />
membranei plasmatice, afectează respiraţia celulară, acumularea de ARN şi determină în final<br />
moartea celulelor. In ceea ce priveşte mecanismul rezistenţei <strong>bacteriilor</strong> producătoare la acţiunea<br />
acestor antibiotice s-a evidenţiat faptul că acestea prezintă strategii diferite cum ar fi producerea<br />
unor enzime ce inactivează antibioticul sau modificarea situsului de acţiune al acestuia<br />
(Cundliffe, 1989). Spre exemplu, bacteriile producătoare de aminoglicozide sintetizează în<br />
acelaşi timp şi enzime ce modifică antibioticele respective: aminoglicozid-fosfotransferaza<br />
(APH) şi acetiltransferaza (AAC). De asemenea, bacteriile respective (S..kanamyceticus,<br />
S.tenebrarius) pot produce simultan şi enzime ce modifică unele situsuri de acţiune <strong>ale</strong><br />
antibioticului (de exemplu, situsurile ribosom<strong>ale</strong>) prin metilarea ARNr.<br />
Tetraciclinele reprezintă un grup destul de heterogen de antibiotice produse în special de<br />
bacterii <strong>din</strong> genul Streptomyces ele având în comun o structură chimică de bază dar variind în<br />
funcţie de grupările chimice care se leagă de această structură: oxitetraciclina (produsă de<br />
S.rimosus), tetraciclina (produsă de S. viridofaciens), clortetraciclina (sintetizată de<br />
S.aureofaciens). Tetraciclinele prezintă un spectru destul de larg de acţiune fiind bacteriostatice<br />
pentru diferite bacterii Gram pozitive şi Gram negative (cu excepţia tulpinilor de Salmonella,<br />
Proteus şi Pseudomonas) şi bactericide în concentraţii mari. Tinta principală de acţiune a acestor<br />
antibiotice este sinteza proteică, ele neavând efecte evidente asupra ADN, ARN sau asupra<br />
sintezei peretelui celular. Modalitatea exactă a legării tetraciclinelor la ribosomi nu este încă pe<br />
deplin cunoscută. Se pare că ele se leagă puternic de subunitatea 70S a ribosomilor ceea ce<br />
determină efectul inhibitor al antibioticelor. De asemenea, tetraciclina se leagă slab de<br />
subunitatea 30S ceea ce are drept consecinţă blocarea legării aminoacil-ARNt la această<br />
subunitate şi deci a alungirii lanţurilor polipeptidice. Autorezistenţa <strong>bacteriilor</strong> producătoare<br />
poate include modificarea situsurilor ţintă norm<strong>ale</strong>, inactivarea intracelulară a antibioticului sau<br />
eliminarea sa rapidă <strong>din</strong> celulă (Cundliffe, 1989).<br />
Cloramfenicolul este un antibiotic cu spectru destul de larg de acţiune, el fiind izolat în<br />
1947 <strong>din</strong> filtrat de cultură de S.venezuelae. Acţiunea cloramfenicolului constă în împiedicarea<br />
ARNm să se lege la ribosomi ceea ce se concretizează prin inhibarea sintezei proteice (a formării<br />
legăturilor peptidice) (Pongs, 1979).<br />
1.1.3. Antibiotice care inhibă replicarea şi transcrierea informaţiei genetice<br />
Dintre antibioticele care împiedică replicarea ADN şi sinteza ARNm menţionăm<br />
novobiocina, coumermicina şi rifamicinele.<br />
Novobiocina este un antibiotic cu o structură complexă produs de S.sphaeroides cu<br />
efect, de obicei, bacteriostatic asupra <strong>bacteriilor</strong>, mai <strong>ale</strong>s în mediu acid. Similar ca acţiune este<br />
coumermicina A, un antibiotic izolat <strong>din</strong> culturi de S.rishinensis şi S.hazeliensis. La concentraţii<br />
mai mici de novobiocină şi cumermicină A este afectată doar replicarea ADN <strong>din</strong> celulele<br />
sensibile, nu şi procesul de transcriere. Cele două antibiotice pot afecta acţiunea ADN girazei,<br />
enzimă ce determină suprarăsuciri <strong>ale</strong> moleculei de ADN, ceea ce explică inhibarea replicării şi<br />
transcrierii informaţiei genetice (Ryan, 1979). Rezistenţa la novobiocină a bacteriei producătoare<br />
S.sphaeroides este determinată de gena gyrB al cărei produs, ADN giraza B este rezistentă la<br />
acţiunea acestui antibiotic (Cundliffe, 1989).<br />
Rifamicinele, având ca reprezentat tipic rifampicina reprezintă un grup de antibiotice<br />
macrociclice care acţionează, în special, asupra mico<strong>bacteriilor</strong> şi <strong>bacteriilor</strong> Gram pozitive.<br />
128
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
Mecanismul lor de acţiune se referă la inhibarea procesului de transcriere a informaţiei genetice<br />
prin blocarea acţiunii enzimei ARN-polimeraza.<br />
Un alt antibiotic cu acţiune inhibitoare asupra acizilor nucleici este granaticinul,<br />
antibiotic de tip quinonic, izolat <strong>din</strong> culturi de S.olivaceus şi S.violaceoruber. Acţiunea sa „in<br />
vitro” se manifestă, atât la procariote cât şi la eucariote, asupra sintezei de ADN, ARN, dar şi de<br />
proteine. De aceea, granaticinul are efect antitumoral, împotriva leucemiei P388 şi efect citotoxic<br />
pentru celulele KB (Ogilvie şi Kersten, 1979).<br />
1.2. Acţiuni asupra celulelor anim<strong>ale</strong><br />
Numeroase substanţe antibiotice nu au fost utilizate în practica medicală datorită acţiunii<br />
lor toxice asupra celulelor anim<strong>ale</strong>. Acest efect toxic rezultă <strong>din</strong> acţiunea directă asupra uneia<br />
<strong>din</strong>tre căile metabolismului primar, căi care sunt univers<strong>ale</strong>, de obicei, asupra producerii de<br />
energie sau exprimării genelor. Totuşi, toxicitatea asupra celulelor anim<strong>ale</strong> nu rezultă<br />
întotdeauna <strong>din</strong> inhibarea aceleiaşi reacţii care este ţintă la microorganisme. Spre exemplu,<br />
amfomicina care interferă cu transportul membranar al intermediarilor mureinei la bacterii, la<br />
celulele eucariote determină o blocare a glicozilării.<br />
Unele antibiotice care au evidenţiat o activitate de inhibare a creşterii mai multor tipuri de<br />
organisme au început să fie utilizate ca substanţe antitumor<strong>ale</strong> datorită toxicităţii lor asupra<br />
celulelor ce proliferează rapid. Printre aceste substanţe, un loc important îl ocupă antraciclinele şi<br />
bleomicina substanţe care sunt produse de specii <strong>ale</strong> genului Streptomyces (Tsukagoshi şi<br />
colab.,1986). Descoperite iniţial ca agenţi antibacterieni, s-a dovedit ulterior că cele două familii<br />
de substanţe se leagă specific, prin intercalare, la moleculele de ADN iar bleomicina, în plus,<br />
poate determina scindarea catenelor de ADN. Citotoxicitatea selectivă a bleomicinei rezultă <strong>din</strong><br />
scăderea activităţii unei enzime de inactivare <strong>din</strong> celulele tumor<strong>ale</strong>.<br />
Un alt tip de produşi antimicrobieni sau inhibitori enzimatici cu activitate antitumorală<br />
este reprezentat de proteine de dimensiuni mici, cum ar fi: macromicinul, actinoxantinul,<br />
forfenicin sau bestatin, ce conţin o grupare prostetică cromoforă ce se interc<strong>ale</strong>ază în<br />
macromoleculele de ADN, modificându-le structura(Aoyagi şi colab.,1978).<br />
Unii metaboliţi secundari manifestă acţiune farmacologică specificpă asupra anim<strong>ale</strong>lor;<br />
în acest caz ei nu prezintă o citotoxicitate generală, dar acţiunea lor farmacologică îi poate face<br />
uneori extrem de toxici. Un exemplu îl constituie acţiunea vasodilatatoare a unui compus (WS<br />
1228A, B) izolat de la S. aureofaciens care însă nu este însoţită şi de toxicitate sau activitate<br />
antibiotică. Un alt compus, MY-336a, izolat <strong>din</strong> culturi de S. gabonae exercită acţiune<br />
antagonică cu receptorii β-adrenergici, avînd deci o acţiune farmacologică selectivă, netoxică<br />
(Kase, 1986). In cazul amicourmamicinei A izolate de la B. pumilis s-a evidenţiat iniţial o<br />
acţiune antibiotică, după care s-a dovedit a avea şi o activitate antiinflamatorie asupra anim<strong>ale</strong>lor<br />
testate (Itoh şi colab., 1981).<br />
De asemenea, printre substanţele izolate iniţial în experimentele de screening pentru<br />
activitatea antibiotică au fost descoperite unele care au acţiune de modulare a răspunsului imun.<br />
Spre exemplu, substanţa IC201 izolată de la S.cirratus şi S fimbriatus ca agent antitumoral, s-a<br />
dovedit a avea acţiune activatoare şi asupra macrofagelor. Un alt compus, macrolidul FK 506<br />
izolat de la S.tsukubaensis în cursul unor experimente de selecţie a unor substanţe care să inhibe<br />
producerea de interleukină-2 s-a dovedit a avea acţiune imunosupresoare.<br />
1.2.1. Activitate insecticidă<br />
S-a evidenţiat că numeroşi metaboliţi secundari produşi de streptomicete în special au<br />
acţiune insecticidă. Unii <strong>din</strong>tre ei, cum ar fi unele antibiotice macrolidice polienice, blochează<br />
respiraţia celulară sau inhibă sinteza proteică la eucariote, fiind astfel agenţi nespecifici. Alţi<br />
metaboliţi secundari, de tipul nikamicinei au acţiune specifică inhibând chitin-sintetaza şi deci<br />
129
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
acţionează asupra peretelui celular chitinos al insectelor. Un alt antibiotic, mibelmicina produsă<br />
de S. hygroscopicus subsp. aureolacrimosus, nu are efect antibacterian dar acţionează selectiv<br />
asupra insectelor având în plus şi efect antihelmintic şi acaricid.<br />
Intr-un studiu recent, Fabre şi colab.(1988) au izolat în urma unui complex proces de<br />
selecţie realizat asupra a 6280 de culturi de actinomicete, o nouă substanţă cu acţiune insecticidă.<br />
O importantă acţiune insecticidă este datorată biosintezei de către unele tulpini bacteriene a<br />
chitinazei care acţionează direct asupra învelişurilor insectelor patogene.<br />
1.3. Activitate asupra celulelor veget<strong>ale</strong><br />
Unii metaboliţi secundari produşi de bacteriile <strong>din</strong> genul Streptomyces au acţiune<br />
fitotoxică şi uneori antifungică. Spre exemplu, herbici<strong>din</strong>ele produse de S.sagonensis sunt<br />
nucleozide cu acţiune fitotoxică pentru plantele dicotiledonate. Ele inhibă, de asemenea, şi<br />
dezvoltarea fungilor. Alte substanţe, cum ar fi herbimicinele produse de S.hygroscopicus au o<br />
foarte slabă activitate antibiotică, în schimb sunt toxice pentru celulele veget<strong>ale</strong>. In plus,<br />
herbimicina A inhibă dezvoltarea virusului mozaicului tutunului şi are acţiune antitumorală<br />
pentru celulele anim<strong>ale</strong> (Yamashita şi colab., 1989). O altă substanţă, homoalanozina, produsă de<br />
S. galileus este un antimetabolit al acidului aspartic şi acidului glutamic, ea exercitând acţiune<br />
insecticidă şi herbicidă (Fushimi şi altii,1989).<br />
De asemenea, numeroşi cercetători (Backman 1995, Baker 1985, Bachow 1995) au<br />
publicat date referitoare la capacitatea unor specii aparţinând genului Bacillus de a inhiba<br />
dezvoltarea unor ciuperci fitopatogene (Tabelul 1). In majoritatea cazurilor combaterea<br />
biologică a fungilor fitopatogeni implică folosirea factorilor biotici existenţi în mediul<br />
plantelor. Studiile efectuate până în prezent au evidenţiat capacitatea unor tulpini de Bacillus<br />
subtilis de a combate diferite ciuperci fitopatogene, cum ar fi : Macrophomina phaseolina –<br />
patogen la mazăre (Siddiqui 1995), Rhizoctomia solani - patogen la mazăre (Bochow 1994),<br />
fasole şi seminţe de grâu (Lazzareti 1994), Fusarium oxysporum şi Phytyum ultinacere –<br />
patogeni la tomate (Sadders 1996).<br />
Cele mai frecvente specii <strong>ale</strong> genului Bacillus care au prezentat capacitatea de a<br />
preveni şi combate evoluţia unor boli determinate de ciuperci fitopatogene sunt: Bacillus<br />
subtilis (Figura 3), Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus.<br />
Figura 3. Acţiunea inhibitoare a tulpinii B.subtilis B2 asupra fitopatogenului Sclerotinia sclerotiorum.<br />
Studiile privind oportunitatea utilizării acestor specii bacteriene în combaterea<br />
biologică s-au bazat pe proprietatea de a produce spori cu înaltă rezistenţă şi longevitate în<br />
condiţii natur<strong>ale</strong> de mediu, acesta determinând posibilitatea obţinerii şi comercializării lor<br />
într-o manieră similară cu fungicidele chimice.<br />
In lupta pentru nutrienţi microorganismele au la dispoziţie un întreg arsenal de<br />
compuşi chimici care inhibă organismele competitive. Mulţi <strong>din</strong> aceşti compuşi au origine<br />
130
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
peptidică şi pot fi sintetizaţi ribozomal sau neribozomal. Multe <strong>din</strong>tre tulpinile de Bacillus<br />
subtilis produc o serie de substanţe de natură lipooligopeptidică <strong>din</strong> gama iturinului, care au<br />
activitate antifungică, hemolitică precum şi proprietăţi antibiotice. Structura chimică a acestor<br />
substanţe a fost determinată prin diverse metode (spectrometrie de masă (MS), gel<br />
cromatografie, cromatografie în strat subţire (TLC), lichid cromatografie (HPLC)).<br />
Componenta proteică a acestor substanţe este reprezentată de oligopeptide alcătuite <strong>din</strong> şapte<br />
aminoacizi, iar componenta lipidică conţine acizi graşi cu catena carbonică lungă (C14-C16).<br />
Astfel, iturin AL conţine o heptapeptidă (2 D-Asp, 1 L-Asp, 1 L-Glu, 1 L-Pro, 1 L-<br />
Ser, 1 D-Tir) şi un amestec de β-amino acizi graşi cu catenă lungă C14-C16. Iturin D şi iturin E<br />
conţin o heptapeptidă (3 Asp, 1 Glu, 1 Pro, 1 Ser, 1 Tyr) şi un amestec de β-amino acizi graşi<br />
cu catenă C14-C16, diferind de iturin A prin prezenţa unei grupări carboxil la iturin D şi o<br />
grupare carboximetil la iturin E. Mycosubtilin, o substanţă <strong>din</strong> gama iturinului, conţine o<br />
heptapeptidă ciclică (Asn, Tyr, Asn, Gln, Pro, Ser, Asn) legată de un β-amino acid gras. Tot<br />
<strong>din</strong> gama iturinului fac parte surfactinul şi fengycinul care conţin un β-hidroxiacid gras şi<br />
bacillomycinul care conţine un β-amino acid gras.<br />
Studii mai intense au fost efectuate cu o substanţă produsă de mai multe specii de<br />
Streptomyces (S. hygroscopicus, S. viridochromogenes) şi care a primit denumirea de bialafos<br />
(fosfinotricin-alanil-alanina). Aceasta substanţă a fost iniţial selectată pentru activitatea sa<br />
antibiotică după care s-a observat că ea are, de fapt, o acţiune mult mai complexă. Componentul<br />
activ al bialafosului este fosfinotricinul care inhibă glutamin-sintetaza <strong>din</strong> celulele veget<strong>ale</strong>, ceea<br />
ce îi conferă bialafosului o puternică acţiune herbicidă (Lea şi colab., 1984).<br />
Mulţi <strong>din</strong>tre metaboliţii secundari produşi de diverse microorganisme au fost testaţi<br />
pentru eventuala lor acţiune asupra unor enzime. Atunci când sistemul test a inclus enzime cheie<br />
în procesele farmacologice de la anim<strong>ale</strong>, numeroşi metaboliţi secundari au fost detectaţi ca<br />
având activităţi fiziologice "in vivo". Mulţi <strong>din</strong>tre aceşti compuşi au fost descoperiţi a fi inhibitori<br />
proteazici, acţionând asupra pepsinei, papainei, tripsinei, chimiotripsinei, catepsinei, elastazelor,<br />
aminopeptidazei B şi leucin-aminopeptidazei (Umezawa, 1982). Printre inhibitorii proteazici<br />
izolaţi de la actinomicete unii acţionează asupra reninei sau asupra unei zinc-exopeptidaze care<br />
converteşte angiotensina I în angiotensină II.<br />
Cercetările efectuate asupra culturilor microbiene au permis izolarea unor inhibitori şi ai<br />
altor enzime. Acesta este cazul inhibitorilor pentru glucozidaze (Muller, 1986), pentru cAMP<br />
(reticulol), pentru kinaze etc.<br />
2. Determinismul genetic al biosintezei unor antibiotice si a altor<br />
metaboliti secundari<br />
In urma experimentelor de cartare a genelor implicate în metabolismul secundar la<br />
procariote s-a evidenţiat faptul că acestea sunt grupate formând "clusteri". Localizarea acestor<br />
gene este, în majoritatea cazurilor, cromosomală dar, există cazuri cînd acestea sunt localizate pe<br />
plasmide (Hopwood, 1978; Kinashi şi colab.,1987). Spre exemplu, genele implicate în sinteza<br />
oxitetraciclinei de către S.rimosus sunt grupate în doi "clusteri" cromosomali (Binnie şi colab.,<br />
1989). La fel şi genele care determină sinteza actinorho<strong>din</strong>ului şi undecilprodigiozinului de către<br />
tulpini de S. coelicolor (Rudd şi Hopwood, 1979), a eritromicinei de către Saccharopolyspora<br />
erythraea (Weber şi altii, 1985) sau avermectinei de către Streptromyces avermectilis (Ikeda şi<br />
colab., 1987). In plus, evidenţierea faptului că aceste grupuri de gene includ şi elemente<br />
reglatoare ca şi determinanţi genetici de rezistenţă la produsul antibiotic respectiv sugerează<br />
existenţa unui sistem foarte bine organizat, cu funcţionare complexă. Nu este însă stabilit cu<br />
exactitate dacă această organizare a genelor există şi în cazul altor metaboliţi secundari, fără<br />
131
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
activitate antibiotică, cum ar fi unii pigmenţi, alcaloizi, reglatori ai celulei veget<strong>ale</strong> etc. (Martin<br />
şi Liras, 1989).<br />
In ceea ce priveşte localizarea plasmidială a unor gene implicate în biosinteza unor<br />
antibiotice, datele referitoare la acest aspect sunt mai puţine. Un exemplu îl constituie genele<br />
pentru biosinteza metilenomicinei care se găsesc plasate pe plasmida SCP1 de la S. coelicolor<br />
(Wright şi Hopwood, 1978; Chater şi Bruton, 1985). De asemenea, de la bacteriile <strong>din</strong> genul<br />
Streptomyces au fost izolate o serie de plasmide lineare cu dimensiuni variate, între 5,4-17 Kb<br />
până la 350-520 Kb (Chardon-Loriaux, 1985; Kinashi şi colab., 1987). Evidenţierea plasmidelor<br />
lineare uriaşe la şase tulpini de Streptomyces producătoare de antibiotice şi examinarea corelaţiei<br />
<strong>din</strong>tre prezenţa lor şi sinteza de antibiotice a dus la concluzia că, cel puţin în cazul<br />
metilenomicinei, genele implicate în sinteza sa sunt plasate pe aceste plasmide care reprezintă<br />
aproximativ 5 % <strong>din</strong> cantitatea totală de ADN celular. Sunt însă necesare studii suplimentare<br />
pentru a stabili dacă şi în alte cazuri genele care determină sinteza unor antibiotice sunt localizate<br />
pe plasmide similare.<br />
2.1. Organizarea şi exprimarea genelor pentru unii metaboliţi secundari sintetiza şi de<br />
specii de Bacillus<br />
Cea mai mare parte a metaboliţilor secundari produşi de bacteriile <strong>din</strong> genul Bacillus sunt<br />
homo- sau heteropeptide. Spre exemplu, gramici<strong>din</strong>a S este un decapeptid ciclic format <strong>din</strong><br />
douăă unităţi de D-Phe-L-Pro-L-Val-L-Orn-L-Leu, fiind produsă de tulpini de B. brevis, ca de<br />
altfel şi tiroci<strong>din</strong>ele. Familia bacitracinelor cuprinde peptide alcătuite <strong>din</strong> 12 aminoacizi, produse<br />
de tulpini de B. licheniformis. Studiile cu extracte celulare au evidenţiat că aminoacizii<br />
constituenţi ai acestor compuşi sunt activaţi şi legaţi în subunităţile respective de către mai multe<br />
tipuri de peptid-sintetaze (Kleinkauf şi Van Dohren, 1987).<br />
Experimentele de clonare în E. coli a genelor pentru sinteza gramici<strong>din</strong>ei şi tiroci<strong>din</strong>ei au<br />
evidenţiat faptul că în cazul tiroci<strong>din</strong>ei sunt implicate trei enzime multifuncţion<strong>ale</strong>, în timp ce la<br />
producerea gramici<strong>din</strong>ei S participă cel puţin 2 sintetaze (GS1 şi GS2) codificate de două gene<br />
diferite grsA şi grsB.<br />
2.2. Organizarea şi exprimarea genelor pentru unele antibiotice sintetizate de bacteriile <strong>din</strong><br />
genul Streptomyces<br />
In cazul streptomicetelor au fost evidenţiaţi numeroşi metaboliţi secundari, dar numai<br />
puţini au o structură peptidică. Unul <strong>din</strong>tre aceştia, bialafosul prezintă importanţă practică<br />
deosebită, deoarece manifestă activitate herbicidă. Recent, Nakajima şi colaboratorii (1991) au<br />
izolat de la S.hygroscopicus un nou compus cu activitate herbicidă, care a primit denumirea de<br />
hidantoci<strong>din</strong>. Bialafosul, care a fost mai intens studiat, este sintetizat pornind de la piruvat sau<br />
fosfoenolpiruvat, printr-o c<strong>ale</strong> metabolică care cuprinde cel puţin 13 etape (Thompson şi Anzai,<br />
1987). Experimentele de clonare cu genele implicate în sinteza acestui compus au evidenţiat<br />
faptul că în acest proces sunt implicate mai multe gene (cel puţin 7) grupate, alături de care se<br />
află şi gena pentru rezistenţa la bialafos (bar). Astfel, au fost obţinute două grupe de clone<br />
derivate de la mutante neproducătoare şi care au fost transformate cu plasmida pIJ61<br />
recombinantă (conţinea diferite gene de la S.hygroscopicus). Un grup de asemenea plasmide<br />
recombinante restabileşte productivitatea mutantelor care prezintă modificări <strong>ale</strong> etapelor 5, 6, 12<br />
şi 13 <strong>ale</strong> căii metabolice, în timp ce un alt grup restabilea producerea de bialafos de către<br />
mutantele blocate la nivelul etapelor 1, 3 şi 4. In plus, a fost realizat transferul unui segment de<br />
16 Kb, care restabilea productivitatea tuturor celor 7 tipuri de mutante. Acest segment de ADN<br />
conţinea şi gena bar care, de altfel, a permis şi identificarea clonelor transformate. Totuşi, acest<br />
fragment nu determină o producţie semnificativă de bialafos la mutantele neproducătoare, ceea<br />
132
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
ce sugerează existenţa unor gene suplimentare aflate în afara segmentului de 16 Kb, necesare<br />
exprimării complete a operonului pentru sinteza bialafosului.<br />
De asemenea, în urma experimentelor de clonare a genelor bar (de rezistenţă la bialafos)<br />
în diferite celule gazdă, inclusiv în celulele veget<strong>ale</strong> s-a evidenţiat faptul că pentru funcţionarea<br />
normală a genelor pentru biosinteza bialafosului sunt necesare încă trei gene diferite care<br />
determină adenilarea la diferite etape <strong>ale</strong> biosintezei. Aceste noi date conduc la presupunerea că<br />
genele implicate în biosinteza acestui compus se găsesc localizate la nivelul unui fragment de<br />
ADN de peste 34 Kb.<br />
Experimentele lui Anzai si <strong>ale</strong> colaboratorilor (1987) au evidenţiat faptul că prin clonarea<br />
unui fragment de ADN de 5,9 Kb, care conţine gena brpA are loc activarea transcrierii atât a<br />
genei bar cât şi a cel puţin altor 6 gene structur<strong>ale</strong> bap. De asemenea, aceşti autori au arătat că<br />
atât la S.viridochromogenes, cât şi la S. hygroscopicus organizarea genetică a genelor implicate<br />
în sinteza bialafosului este identică.<br />
Un alt grup de metaboliţi secundari peptidici, actinomicinele (cromopeptide) este<br />
sintetizat în urma acţiunii unei enzime, fenoxazinon-sintetaza (PHS). Prin clonarea genei pentru<br />
PHS de la S. antibioticus în S. lividans (Jones şi Hopwood, 1984) s-au obţinut mai multe tipuri<br />
de clone: unele care conţineau gena structurală pentru PHS, iar altele care prezentau activitate<br />
PHS, dar care a rezultat în urma activării unei gene "tăcute" (silent gene) endogene de către<br />
fragmentul de ADN exogen transformant. Fenomenul este frecvent întâlnit în cazul<br />
streptomicetelor, el fiind semnalat şi în cazul tulpinilor producătoare de alţi metaboliţi secundari.<br />
Un exemplu îl constituie clonarea genelor pentru producerea cefamicinei de la S.cattleya la<br />
S.lividans, clonele producătoare rezultând în urma activării unor gene endogene silenţioase<br />
(Martin şi Liras, 1989).<br />
Mulţi <strong>din</strong>tre metaboliţii secundari produşi de streptomicete au o structură de tip<br />
macrolidic în care inelul macrociclic derivat de la poliketide este închis printr-o legătură<br />
lactonică. La acest inel macrociclic sunt, de obicei, ataşate glucide bazice sau neutre. Spre<br />
exemplu, eritromicina produsă de Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythraeus)<br />
conţine un inel lactonic (eritronolid) şi 2 glucide specifice, dezozamina şi cla<strong>din</strong>oza, sinteza sa<br />
realizându-se în aproximativ 30 etape enzimatice Prin clonarea în S.lividans a unor fragmente de<br />
ADN cromosomal izolate de la tulpini de S.erythraea producătoare de eritromicină s-a stabilit că<br />
trei <strong>din</strong>tre genele implicate în biosinteza antibioticului, eryA, eryB şi eryC sunt grupate şi<br />
localizate într-o unică regiune a cromosomului bacteriei producătoare. Utilizând un vector de<br />
clonare integrativ (care se poate integra în cromosomul gazdei) s-a stabilit că alături de genele<br />
care determină sinteza antibioticului se află şi gena pentru rezistenţa la eritromicină, ermE (genă<br />
care determină sinteza unei metilaze pentru ARNr) (Stanzak şi colab., 1986). De asemenea, Mc<br />
Alpine şi colab. (1987) au comunicat obţinerea unui antibiotic hibrid care a primit denumirea de<br />
2-noreritromicină, în urma clonării într-o mutantă de S.erythraea, care avea blocată ultima etapă<br />
a sintezei eritromicinei a unui fragment de ADN de 30-35 Kb izolat de la S.antibioticus<br />
producător de oleandomicină.<br />
Un alt antibiotic, tilozina produs de tulpini de S.fradiae prezintă o structură chimică<br />
asemănătoare eritromicinei, având un inel macrociclic, tilanolid şi trei glucide mai puţin<br />
răspândite: micaminoza, micaroza şi micinoza. Studiile referitoare la organizarea genelor<br />
implicate în sinteza acestui antibiotic au evidenţiat faptul că genele tyl (aproximativ 9 gene) sunt<br />
grupate, alături de ele aflându-se şi gena de rezistenţă (tlrB), precum şi o secvenţă de ADN<br />
amplificabil flancată de 2 secvenţe repetate direct (Baltz şi Seno, 1988). De asemenea, s-a stabilit<br />
că pentru exprimarea genei tylF, care codifică enzima ce controlează ultima etapă a căii<br />
metabolice de sinteză a antibioticului este necesară o proteină reglatoare (efector pozitiv) produsă<br />
de gena tylG. O situaţie asemănătoare prezintă şi genele care codifică sinteza carbomicinei şi<br />
rezistenţa la acest antibiotic (Martin şi Liras, 1989).<br />
133
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Un alt grup de antibiotice derivate de la poliketide este reprezentat de tetracicline şi<br />
antracicline, antibiotice intens studiate datorită importanţei lor practice deosebite. In urma<br />
examinării mai multor tipuri de mutante incapabile de a sintetiza oxitetraciclina s-a dovedit că<br />
genele care codifică producerea acestui antibiotic se află localizate în două grupe plasate opus pe<br />
cromosomul bacterian. Prin clonarea în S.griseus a unor fragmente de ADN izolate de la<br />
S.rimosus s-a reuşit identificarea a două gene responsabile de rezistenţa la tetraciclină (Ohnuki şi<br />
colab., 1985): gena tetA care codifică un polipeptid care interferă cu sinteza proteinelor la nivel<br />
ribosomal şi gena tetB care determină o acumulare intracelulară redusă a antibioticului în celulele<br />
producătoare. Nu este, însă, clar dacă aceste gene se află localizate la nivelul celor douăă grupuri<br />
de gene sau au o altă dispunere. Au mai fost clonate şi alte gene de rezistenţă la tetraciclină,<br />
otcRI şi otcRII, dar nu s-a stabilit încă dacă aceste gene sunt sau nu identice cu cele anterioare.<br />
Recent, Butler şi colab. (1989) şi Binnie şi colab. (1989), au realizat o serie de clonări a unor<br />
gene implicate în sinteza şi rezistenţa la acest antibiotic şi au sugerat faptul că cel puţin o parte,<br />
dacă nu chiar toate genele structur<strong>ale</strong> care codifică sinteza oxitetraciclinei sunt linkate cu genele<br />
de rezistenţă otcRI şi otcRII, formând, astfel, un singur "cluster".<br />
O grupare asemănătoare prezintă şi genele implicate în biosinteza/rezistenţa<br />
tetracenomicinei C, un antibiotic antraciclinic produs de S.glaucescens.<br />
Aminoglicozidele reprezintă un alt grup de antibiotice intens studiat datorită importanţei<br />
practice deosebite. Din acest grup streptomicinei i s-a acordat cea mai mare atenţie. Astfel, la<br />
S.griseus, cel mai cunoscut producător al acestui antibiotic, cel puţin 13 gene sunt implicate în<br />
biosinteza şi rezistenţa la streptomicină, ele fiind localizate într-un singur "cluster" cromosomal<br />
(Mansouri şi altii, 1989) (Figura 4).<br />
Figura 4. Reprezentarea schematică a genelor implicate în biosinteza streptomicinei la două specii de streptomicete:<br />
S.griseus şi S.glaucescens.<br />
Ohnuki şi colaboratorii (1985) au arătat că la S.griseus grupul de gene str este format <strong>din</strong><br />
cel puţin 4 gene: strR, strA, strB şi strC. Gena strA codifică enzima streptomicin-6'fosfotransferaza<br />
care asigură rezistenţa la acest antibiotic; strB complementează o mutaţie la o<br />
tulpină care prezenta deficienţă în legarea strepti<strong>din</strong>-6-fosfatului de dihidrostreptoză; strR este o<br />
genă reglatoare care codifică un efector pozitiv necesar exprimării complete a genelor strA şi<br />
strB. Rezultate similare au obţinut Distler şi colab.(1987), care au evidenţiat că la S.griseus<br />
genele necesare sintezei streptomicinei sunt linkate cu gena aphD care codifică pentru enzima<br />
streptomicin 6-fosfotransferaza, genă similară genei sph pentru enzima hidroxi-streptomicin-<br />
134
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
fosfotransferaza de la S.glaucescens. Analizele de restricţie şi studiile de hibridizare a<br />
fragmentelor de ADN de la S.griseus şi S.glaucescens au relevat existenţa, în ciuda unei<br />
omologii de aproximativ 75 % a genelor implicate în biosinteza streptomicinei, a unor diferenţe<br />
majore, ceea ce sugerează faptul că, în cursul evoluţiei a avut loc o separare a genelor de<br />
biosinteză în două seturi distincte repartizate doar la speciile de Streptomyces (Martin şi Liras,<br />
1989).<br />
2.3. Organizarea şi exprimarea genelor de biosinteză a unor pigmenţi de către<br />
streptomicete<br />
Streptomicetele pot sintetiza pe lângă diferite antibiotice şi alţi metaboliţi secundari, cum<br />
ar fi pigmenţii, unii <strong>din</strong>tre aceştia manifestând şi o uşoară activitate antibiotică. Dintre aceştia cel<br />
mai mult studiat este actinorho<strong>din</strong>ul, un pigment de tip izocromanequinonic, produs de<br />
S.coelicolor printr-o c<strong>ale</strong> poliketidică tipică (Floss, 1981). Pigmentul respectiv produs de<br />
bacteriile cultivate pe mediul R2YE este roşu şi nedifuzibil la pH neutru dar, după expunere la<br />
vapori de amoniac devine albastru şi difuzibil. In urma cercetărilor efectuate pe diferite tulpini<br />
mutante de S.coelicolor s-a realizat o grupare a acestora în mai multe clase (7) în funcţie de<br />
variaţiile de exprimare a genelor care alcătuiesc "clusterul" act. Rezultatele obţinute au permis<br />
elaborarea unei ipoteze referitoare la sinteza unor metaboliţi secundari de tip poliketidic, ţinând<br />
cont de marea varietate de asemenea metaboliţi (macrolide, poliene, polieteri, tetracicline,<br />
antracicline, ansamicine, isocromaquinone etc). Se pare că la toţi metaboliţii secundari de tip<br />
poliketidic, esterii acil-CoA şi β-cetoacizii condensează împreună printr-un mecanism de<br />
polimerizare de tip cap-coadă, ceea ce conduce la obţinerea unor lanţuri alifatice de diferite<br />
dimensiuni. Aceste lanţuri suferă, ulterior, modificări suplimentare, care le asigură specificitatea<br />
(Hopwood şi Sherman, 1990). Dacă reacţia de condensare realizată prin intervenţia unei enzime<br />
de tip β-ceto-acil-tioester-sintetaza ("enzima de condensare") este comună tuturor metaboliţilor<br />
secundari poliketidici, atunci ar însemna că între secvenţele care codifică poliketid-sintetazele la<br />
diferite organisme producătoare există o mare omologie care este conservată. Pornind de la o<br />
asemenea ipoteză, Malpardita şi colab.(1987) au utilizat genele act de la mutantele <strong>din</strong> clasele I<br />
şi III ca probe de ADN în experimentele de hibridizare şi au observat că între acestea şi ADN de<br />
la 14 <strong>din</strong>tre cei 18 producători de poliketide se produce hibridizare cu intensitate variată, deci<br />
există omologie. Probele nu au hibridizat cu ADN izolat de la tulpinile care produc tetraciclină,<br />
eritromicină, candici<strong>din</strong>ă şi curamicin. Aceste rezultate demonstrează o corelaţie, incompletă,<br />
între producerea de poliketide şi prezenţa de secvenţe de ADN care sunt parţial omoloage cu<br />
actinorho<strong>din</strong> poliketid-sintetaza. Această strategie de hibridizare poate fi extinsă prin utilizarea<br />
unor probe de ADN a unor secvenţe care codifică diferite sintetaze izolate de la tulpini bacteriene<br />
variate, ceea ce ar permite recunoaşterea unor producători criptici ai unor clase de metaboliţi<br />
secundari particulari. Prin alterarea specificităţii de substrat a unor sintetaze specifice utilizând<br />
mutageneza directă sau recombinarea"in vitro" a genelor care codifică pentru aceste enzime pot<br />
fi obţinute noi antibiotice cu proprietăţi speci<strong>ale</strong>.<br />
Alte două tipuri de pigmenţi, metilenomicin produs de tulpini de S.coelicolor şi<br />
S.violaceoruber sau undecilprodigiozin produs de S.coelicolor A3(2) au fost studiate cu o<br />
intensitate mai scăzută, rezultatele obţinute sugerând şi în aceste cazuri o grupare a genelor<br />
implicate în biosinteza produşilor respectivi (Malpardita şi colab., 1990).<br />
Gruparea în "clusteri” a genelor care codifică căi <strong>ale</strong> metabolismului secundar reprezintă<br />
un fenomen comun pentru numeroase tipuri de substanţe. In cazul "clusterilor" pentru sinteza<br />
tetra-cenomicinei şi actinorho<strong>din</strong>ului s-a evidenţiat o subgrupare specială a genelor componente<br />
care controlează momentul apariţiei fiecărei enzime în c<strong>ale</strong>a metabolică respectivă, astfel încât<br />
intermediarii apar în anumite etape <strong>ale</strong> reacţiilor biochimice. Formarea secvenţială a enzimelor<br />
este binecunoscută în căile de biosinteză a metaboliţilor secundari la fungi şi streptomicete<br />
135
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
(Martin şi Liras, 1989). Cuplarea strânsă a proceselor de transcriere/traducere la streptomicete şi<br />
la alte procariote, precum şi faptul că genele structur<strong>ale</strong> sunt grupate şi ordonate permite ca<br />
enzima obţinută în urma acestor fenomene să acţioneze asupra produsului enzimei anterioare<br />
(Motamedi şi Hutchinson, 1987).<br />
O acţiune mai eficientă a enzimelor poate rezulta în urma grupării enzimelor în complexe<br />
enzimatice, fenomen întâlnit în cazul biosintezei gramici<strong>din</strong>ei,tiroci<strong>din</strong>ei şi bacitracinei.<br />
Poliketidele şi metaboliţii secundari polienici sunt formaţi prin acţiunea unor complexe<br />
enzimatice care cuprind sintetaze specifice.<br />
2.4. Coordonarea exprimării genelor de biosinteză şi rezistenţă<br />
Deoarece genele implicate în biosinteza şi rezistenţa la antibiotice sunt grupate este foarte<br />
probabil să existe o coordonare a exprimării genelor pentru a nu produce disfuncţii. Dacă un<br />
metabolit secundar este activ faţă de tulpina producătoare, mecanismele de protecţie (inactivarea<br />
antibioticului sau sporirea eliminării lui) trebuie să fie induse înaintea acumulării metabolitului<br />
respectiv.<br />
Există numeroase exemple referitoare la inducerea exprimării genelor de rezistenţă la<br />
antibiotice la bacteriile <strong>din</strong> genul Streptomyces. Astfel, exprimarea genelor de rezistenţă la<br />
tetraciclină, tetA şi tetB de la S.rimosus şi S.griseus a fost indusă de adăugarea de tetraciclină în<br />
mediul de cultură (Ohnuki şi colab., 1985). Nivelul rezistenţei a crescut de 2 ori atunci când s-a<br />
mărit cantitatea de tetraciclină adăugată (de la 5 la 50µg/ml). Aceasta sugerează faptul că<br />
inducerea genelor de rezistenţă protejează tulpinile producătoare faţă de creşterea nivelului<br />
antibioticului în timpul cultivării.<br />
Gena de rezistenţă la streptomicină (strA sau aphD) de la S.griseus se află plasată alături<br />
de genele pentru biosinteza antibioticului şi se găseşte sub un control dublu, pozitiv şi negativ.<br />
Ea este indusă de streptomicină, dar nu şi de streptavi<strong>din</strong>. Exprimarea genei strA se află sub un<br />
control negativ exercitat de o proteină represor de 40 KDa codificată de o secvenţă (ORF)<br />
plasată în apropierea acestei gene. De asemenea, ea este stimulată de produsul genei strR care<br />
activează în acelaşi timp şi gena strB (genă structurală care codifică o ami<strong>din</strong>otransferază)<br />
(Ohnuki şi colab., 1985) (Figura 5).<br />
Figura 5. Model ipotetic al transcrierii genelor implicate în sinteza şi rezistenţa la streptomicină (după Piepersberg şi<br />
colab., 1988).<br />
In mod similar, gena de rezistenţă la kanamicină clonată de la bacteria producătoare<br />
S.kanamyceticus se exprimă după inducere în noile gazde (S.lividans, S.lavendulae sau<br />
S.parvulus) (Nakana şi colab., 1984).<br />
S-a dovedit că multe <strong>din</strong>tre tulpinile de Streptomyces producătoare de antibiotice prezintă<br />
două sau mai multe mecanisme de rezistenţă la antibioticele pe care le produc, probabil ca o<br />
modalitate de protecţie faţă de antibiotice înrudite. Spre exemplu, în cazul tulpinilor de<br />
136
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
S.kanamyceticus există două mecanisme de rezistenţă la kanamicină: una este modificarea<br />
ribozomilor, iar cealaltă presupune inactivarea antibioticului de către o enzimă specifică (6'-Nacetiltransferaza)<br />
(Nakano şi colab., 1988). La S.fradiae, la o tulpină industrială au fost<br />
identificate cel puţin trei gene diferite care asigură rezistenţa la tilozin, gene care sunt linkate la<br />
genele de biosinteză.<br />
In unele situaţii, enzima codificată de gena de rezistenţă poate îndeplini şi alte funcţii<br />
catalitice în cadrul căii metabolice de biosinteză a antibioticului respectiv. Acesta este cazul<br />
genelor de rezistenţă la puromicină sau bialafos, care se pare că sunt implicate şi în unele <strong>din</strong>tre<br />
etapele intermediare <strong>ale</strong> sintezei metabolitului respectiv, ceea ce înseamnă că exprimarea genelor<br />
de biosinteză şi rezistenţă se află sub acelaşi mecanism de reglare.<br />
2.5. Reglarea exprimării genelor implicate în metabolismul secundar<br />
Metabolismul secundar este o formă de diferenţiere biochimică a microorganismelor.<br />
Reglarea desfăşurării s<strong>ale</strong> este realizată prin diferite mecanisme. Astfel, factorul A este o<br />
proteină reglatoare cu efecte pleiotropice care stimulează atât biosinteza şi rezistenţa la<br />
streptomicină, cât şi sporularea la S.griseus şi S.bikinensis. Au fost identificate, astfel, mai multe<br />
gene ai căror produşi de transcriere controlează diferite procese. Un exemplu este reprezentat de<br />
gena afsA ("A factor synthesis"), care a fost izolată de la S.bikinensis, şi apoi clonată în diferite<br />
gazde. O altă genă, afsB a fost izolată de la S.coelicolor şi s-a dovedit că ea codifică o proteină<br />
reglatoare care stimulează atât producerea de factor A, cât şi a unor pigmenţi cum ar fi<br />
actinorho<strong>din</strong>ul şi undecilprodigiozinul.<br />
O situaţie interesantă o prezintă gena saf ("secondary metabolism-acting factor") izolată<br />
de la S.griseus, genă care este implicată într-un mecanism de control comun pentru diferenţierea<br />
celulară, pentru producerea a cel puţin patru enzime extracelulare şi pentru formarea de pigment<br />
(Martin şi Liras, 1989). Secvenţa aminoacizilor pe care îi conţine produsul genei saf indică faptul<br />
că acesta interacţionează cu ADN, secvenţa respectivă conţinînd un domeniu tipic de legare la<br />
ADN. Aceasta înseamnă fie că polipeptidele de legare la ADN interacţionează specific cu<br />
secvenţe reglatorii <strong>ale</strong> genelor implicate în metabolismul secundar, fie că ele controlează<br />
exprimarea genelor care determină formarea factorului A sau a altor efectori pleiotropici,<br />
influenţând, astfel, exprimarea grupurilor de gene care codifică enzimele metabolismului<br />
secundar.<br />
Genele implicate în biosinteza metabolismului secundar nu sunt exprimate, de obicei, în<br />
culturile cu o rată mare de creştere. Astfel, numeroase sintetaze aparţinând metabolismului<br />
secundar sunt fie inhibate fie represate de nivelul surselor de carbon, fosfor, sau azot în timpul<br />
fazei de creştere a producătorilor (Martin, 1989).<br />
Un alt mecanism de coordonare a exprimării genelor, evidenţiat iniţial la B.subtilis,<br />
E.coli, dar şi la alte bacterii, este producerea unor factori sigma sau a altor proteine care modifică<br />
specificitatea ARN polimerazei, conducând la o exprimare selectivă a unor seturi speci<strong>ale</strong> de<br />
gene. Si în cazul streptomicetelor a fost evidenţiată o heterogenitate a ARN polimerazelor<br />
(Westpheling şi col.ab, 1985). Spre exemplu, două holoenzime de ARN polimerază (E 35 şi E<br />
49) de la S.coelicolor recunosc doi promotori bine definiţi de la B.subtilis. Promotorii de la<br />
streptomicete sunt destul de variaţi: unii care prezintă conservate regiunile -10 şi -35 par a fi<br />
similari celor de la E.coli, în timp ce alţii sunt complet diferiţi (Jansen şi colab, 1985). Distanţa<br />
<strong>din</strong>tre cele două regiuni conservate, -10 şi -35, este un factor important al determinării tăriei<br />
promotorului. Astfel, o distanţă de aproximativ 17 perechi de baze este corelată cu o activitate<br />
optimă a promotorului, în timp ce o distanţă mai mică de 15pb sau mai mare de 20pb este<br />
asociată cu o scădere a activităţii s<strong>ale</strong>.<br />
Date recente (Buttner şi colab., 1988) indică faptul că gena pentru agarază (dagA) de la<br />
S.coelicolor care conţine patru promotori diferiţi este transcrisă de cel puţin trei forme diferite<br />
137
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
(holoenzime) de ARN polimerază. Similar, genele galE şi galK de la S.lividans sunt transcrise de<br />
două ARN polimeraze de la nivelul a doi promotori, galP1 şi galP2.<br />
Deşi existenţa mai multor factori sigma este bine cunoscută, semnificaţia fiziologică a<br />
diferitelor holoenzime de ARN polimerază rămâne încă neclară. La streptomicete multe <strong>din</strong>tre<br />
secvenţele aflate înaintea regiunii start a transcrierii unor gene conţin doi sau mai mulţi<br />
promotori dar nu este clar dacă toţi promotorii funcţionează "in vivo" (Tomich, 1988).<br />
Recunoaşterea diferenţiată a promotorilor aranjaţi în tandem de către diferite ARN polimeraze<br />
poate explica exprimarea selectivă a anumitor seturi de gene în timpul creşterii şi diferenţierii<br />
morfologice şi a altor gene în timpul desfăşurării metabolismului secundar. Aranjarea genelor<br />
implicate în biosinteza antibioticelor în grupuri ("clusteri") este deci de mare interes în legătură<br />
cu exprimarea diferenţiată a genelor.<br />
2.6. Seminificaţia biologică a metaboliţilor secundari<br />
Semnificaţia biologică a metaboliţilor secundari produşi de diferite microorganisme nu<br />
este încă foarte clară. Sinteza lor ar reprezenta rezultatul unor "erori de metabolism" fără<br />
importanţă pentru fiziologia microorganismului producător. In legătură cu rolul metaboliţilor<br />
secundari au fost avansate numeroase propuneri pornind de la studiul în laborator al activităţii<br />
acestor compuşi. Vining (1990) consideră că funcţiile metaboliţilor secundari pot fi grupate în<br />
două categorii: unele care privesc direct producătorul (funcţii intrinseci) şi altele care asigură<br />
anumite beneficii producătorului prin acţiunea în exterior, în mediu (funcţii extrinseci). In cadrul<br />
funcţiilor intrinseci, unii metaboliţi secundari pot fi precursori ai unor componente structur<strong>ale</strong><br />
cum ar fi de exemplu streptomicina care, se sugerează că ar fi un constituent al învelişului<br />
mureinic (Szabo şi colab., 1989). De asemenea, alţi metaboliţi secundari joacă un rol important<br />
în sporulare şi în germinarea sporilor la actinomicete şi la bacili ca şi în diferenţierea celulară<br />
(Chater, 1989; Maplestone şi colab.,1992).<br />
Atunci când activitatea metaboliţilor secundari este direcţionată asupra altor organisme<br />
<strong>din</strong> mediul înconjurător, aceste substanţe pot fi considerate ca "agenţi ecologici" asigurând producătorilor<br />
supravieţuirea în cadrul competiţiei cu alte organisme ce populează aceeaşi nişă<br />
ecologică. De asemenea, datele obţinute până în prezent în urma analizei secvenţei de nucleotide<br />
sprijină conceptul că metabolismul secundar a rezultat în urma modificărilor căilor existente <strong>ale</strong><br />
metabolismului primar. Deşi secvenţa de aminoacizi identificată deductiv <strong>din</strong> secvenţa de<br />
nucleotide a genelor corespunzătoare este suficientă pentru a indica o origine comună, pentru ca<br />
datele să fie mai concludente ar fi necesară o comparare a genelor de la specii diferite decât de la<br />
aceeaşi specie. Informaţiile obţinute în acest fel sugerează că transferul natural de gene între<br />
diferite organisme a reprezentat un important factor în evoluţia metaboliţilor secundari. Multe<br />
<strong>din</strong>tre căile metabolismului secundar pot avea o origine foarte veche, modificările care apar la<br />
nivelul lor putând rezulta în urma achiziţiilor mai recente de material genetic exogen la nivelul<br />
unor microorganisme producătoare.<br />
Pe baza cunoştinţelor acumulate în domeniu, Vining (1992) stabileşte o serie de<br />
caracteristici clare <strong>ale</strong> metabolismului secundar:<br />
1. metaboliţii secundari nu sunt esenţiali pentru creştere şi tind să fie specifici de tulpină;<br />
2. aceşti compuşi au o mare varietate de structuri chimice şi activităţi biologice;<br />
3. metaboliţii secundari derivă <strong>din</strong> intermediari ai metabolismului primar prin căi de<br />
biosinteză unice. Aceste căi sunt deseori lungi şi complexe; reacţiile biochimice sunt catalizate<br />
de enzime cu specificitate de substrat diferită de cea a enzimelor echiv<strong>ale</strong>nte <strong>ale</strong> metabolismului<br />
primar;<br />
4. formarea metaboliţilor secundari este determinată de seturi de gene asociate supuse<br />
unui mecanism de reglare care se referă atât la nivelul exprimării genelor cât şi la momentul<br />
declanşării acesteia;<br />
138
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
5. mecanismele de control este bine integrat cu fiziologia organismului producător.<br />
Relativ recent, Davies (1990) a propus ideea că metaboliţii secundari sunt substanţe cu<br />
origine foarte veche şi că mulţi <strong>din</strong>tre ei exercită activităţi biologice cunoscute (cum sunt<br />
antibioticele) datorită interacţiunii cu anumite situsuri vechi, conservate <strong>ale</strong> diferitelor<br />
macromolecule. Aceasta înseamnă că metaboliţii secundari au jucat un rol important în evoluţia<br />
reacţiilor biochimice, înainte ca enzimele să fie disponibile. Spre exemplu, reacţiile de biosinteză<br />
erau catalizate sau modulate de molecule cu greutate moleculară mică care erau prezente în<br />
atmosfera Pământului sau erau produse în "supa primordială". Odată ce sistemul de traducere a<br />
evoluat iar proteinele au început să fie produse şi să exercite diferite funcţii, rolul produşilor cu<br />
greutate moleculară mică a fost înlocuit de mecanisme mai complexe în care sunt implicate<br />
polipeptidele, dar aceştia şi-au menţinut capacitatea de a interacţiona cu anumite situsuri<br />
receptoare <strong>din</strong> macromolecule (acizi nucleici sau proteine).<br />
Conceptul rolului cheie primordial al moleculelor cu greutate moleculară mică ca efectori<br />
(stimulatori) ai biosintezelor sugerează o nouă abordare a modalităţilor de screening pentru<br />
diferite activităţi farmacologice. In locul urmăririi exclusive a efectelor inhibitorii este necesar să<br />
se studieze activitatea stimulatoare fie a unor celule întregi fie a unor extracte celulare<br />
(Murakama şi colab.,1989). Numeroase organisme (poate chiar toate) produc compuşi cu<br />
greutate moleculară mică cu activitate antibiotică, cum ar fi de exemplu defensinele (Gabai şi<br />
colab., 1989). In acest sens, microorganisme de tipul streptomicetelor sunt neobişnuite în sens<br />
evolutiv deoarece ele şi-au dezvoltat şi menţinut căile necesare pentru a produce o gamă foarte<br />
largă de compuşi cu greutate moleculară mică atunci când sunt cultivate în mod corespunzător.<br />
Acţiunea acestor compuşi este foarte variată, ei inhibând de obicei desfăşurarea unor procese<br />
biochimice diferite. Studii mai amănunţite asupra activităţii acestor substanţe antibiotice a<br />
evidenţiat însă că multe <strong>din</strong>tre ele au efect stimulator asupra transferului de gene<br />
(aminoglicozidele, penicilinele, tetraciclinele), asupra transpoziţiei (tetraciclina), transcrierii<br />
(eritromicina, tiostreptonul), creşterii celulare (kanamicina, streptomicina, eritromicina) sau<br />
mutagenezei (streptomicina). Pornind de la aceste observaţii, Davies (1990) propune că efectorii<br />
cu greutate moleculară mică şi situsurile lor de acţiune datează <strong>din</strong>aintea stabilirii rolului<br />
proteinelor, deşi acţiunea lor este mai puţin eficientă şi are o specificitate scăzută. Odată ce<br />
organismele devin <strong>din</strong> punct de vedere genetic şi biochimic mai evoluate, rolul efectorilor cu<br />
greutate moleculară mică este preluat de proteine care asigură o eficienţă şi specificitate de<br />
acţiune ridicată.<br />
3. Enzime produse de bacteriile <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Bacillus si<br />
Streptomyces<br />
Deşi streptomicetele produc mai mult de 60% <strong>din</strong>tre antibioticele cunoscute, există<br />
relativ puţine date referitoare la echipamentul enzimatic al acestor bacterii. Tinând cont de faptul<br />
că streptomicetele sunt microorganisme <strong>din</strong> sol unde există o mare varietate de posibile<br />
substraturi nutritive, este logic de presupus că aceste bacterii prezintă o mare varietate de căi<br />
metabolice putând sintetiza unii intermediari prin căi diferite. Căile metabolice alternative fac<br />
posibilă utilizarea eficientă a celor mai multe substrate disponibile (Behal, 1986).<br />
In ultimii ani bacteriile <strong>din</strong> genul Streptomyces constituie un serios subiect de studiu <strong>din</strong><br />
punctul de vedere al enzimelor pe care le produc, multe <strong>din</strong>tre ele fiind de importanţă<br />
biotehnologică (proteaze, amilaze, glucoz-izomeraze, celulaze, hemicelulaze, endonucleaze,<br />
chitinaze etc. Mai mult, s-a dovedit că cel puţin unele <strong>din</strong>tre aceste enzime sunt produse simultan<br />
cu unele antibiotice (tabelul 2) (Pokorny şi Vit<strong>ale</strong>, 1980).<br />
Unele <strong>din</strong>tre enzimele sintetizate de către streptomicete sunt sau pot fi folosite în practica<br />
medicală fie în stabilirea unor diagnostice fie în terapie. Acesta este cazul colesterol-oxidazei<br />
produsă de unele specii de Streptomyces şi Nocardia care este utilizată pentru dozările de<br />
139
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
colesterol <strong>din</strong> ser, sau al urat-oxidazei produsă de S.cyanogenus care poate fi utilizată pe scară<br />
largă pentru detectarea enzimatică a acidului uric (Srinivasan şi colab., 1991).<br />
Producerea enzimelor hidrolitice de către streptomicete depinde în mare măsură de<br />
substratul pe care acestea sunt cultivate astfel că datele prezentate în Tabelul 2 pot fi completate<br />
şi cu alte tipuri de enzime. Uneori însă, datorită scopului în care enzimele ar putea fi utilizate (de<br />
exemplu în industria alimentară) se preferă utilizarea unor tulpini bacteriene producătoare care<br />
însă să nu sintetizeze substanţe toxice sau potenţial toxice (cum sunt de altfel antibioticele)<br />
Tabelul 2. Enzime entracelulare produse de unele bacterii producătoare de antibiotice<br />
Specia bacteriană Antibioticul Enzimele detectate<br />
S.griseus streptomicina proteaze, elastaze, amilaze, peptidaze<br />
S.rimosus oxitetraciclin proteaze, elastaze,<br />
S.aureofaciens tetraciclina proteaze, amilaze<br />
S.fradiae neomicina proteaze, elastaze, keratinaze<br />
S.antibioticus oleandomicina proteaze, amilaze<br />
S.venezuelae cloramfenicol Proteaze<br />
B.licheniformis Bacitracina Proteaze<br />
B.subtilis Bacitracina Proteaze<br />
De asemenea, studii recente au demonstrat posibilitatea utilizării <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> genul<br />
Streptomyces pentru clonarea unor gene cu origine diferită şi pentru producerea proteinelor<br />
corespunzătoare (Erpicum şi colab., 1990). In plus, metaboliţii secundari ai acestor bacterii oferă<br />
avantajul exprimării (sintezei) prelungite a unui produs şi după faza iniţială de creştere a culturii<br />
(Gardner şi Cadman, 1990).<br />
In cazul enzimelor produse de bacteriile <strong>din</strong> genul Bacillus, aplicaţiile practice sunt bine<br />
cunoscute, ele fiind prezentate pe scurt în Tabelul 3.<br />
Tabelul 3. Tipuri de enzime hidrolitice produse de bacili şi princip<strong>ale</strong>le aplicaţii <strong>ale</strong> acestora<br />
Enzima Tipul enzimei Specia producătoare Utilizări<br />
Proteaze alcaline Extracelulare B. subtilis<br />
detergenţi<br />
B. pumillus<br />
industria alimentară<br />
B. amylosacchariticus<br />
B. licheniformis<br />
industria pielăriei<br />
Proteaze neutre Extracelulare B.subtilis<br />
Industria berii<br />
B. amyloliquefaciens<br />
B. thermoproteolyticus<br />
B. amylosacchariticus<br />
B. stearothermophilus<br />
B. cereus<br />
Industria alimentară<br />
α-amilaze Extracelulare B. subtilis<br />
Industria alimentară<br />
B.licheniformis<br />
B.coagulans<br />
B. stearothermophilus<br />
B. cereus var.mycoides<br />
degradarea amidonului<br />
Β-amilază Extracelulare B. polymyxa<br />
industria alimentară<br />
B.circulans<br />
B. megatherium<br />
B. cereus var.mycoides<br />
degradarea amidonului<br />
Celulaze Extracelulare B.subtilis<br />
Industria alimentară<br />
B.polymyxa<br />
Industria textilă<br />
B. licheniformis Industria celulozei şi hârtiei<br />
B. cereus<br />
Zootehnie<br />
Tratarea deşeurilor agricole<br />
140
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
Datorită acestor considerente o trecere în revistă a princip<strong>ale</strong>lor tipuri de enzime (cu<br />
posibilă valoare biotehnologică) este nu numai interesantă ci şi necesară.<br />
3.1. Proteaze<br />
Proteazele microbiene constituie un grup complex de enzime hidrolitice, care diferă<br />
prin specificitatea de substrat, mecanism de reacţie, dependenţa activităţii enzimatice şi<br />
stabilităţii în funcţie de pH şi temperatură. Acţiunea lor poate fi blocată, activată, sau inhibată<br />
într-o anumită proporţie de agenţi fizici, chimici sau biologici. Producţia şi caracteristicile<br />
enzimelor microbiene pot fi influenţate prin selecţia tulpinii producătoare şi <strong>ale</strong>gerea<br />
condiţiilor de cultivare <strong>ale</strong> acesteia.<br />
Enzimele <strong>din</strong> categoria proteazelor hidrolizează majoritatea proteinelor comune cum<br />
ar fi: caseina, hemoglobina, gelatina, albumina de ou, glutenul, proteina <strong>din</strong> soia şi alte<br />
proteine veget<strong>ale</strong> şi anim<strong>ale</strong>. Condiţiile de hidroliză precum şi randamentul operaţiei în sine<br />
depind însă de natura, caracteristicile şi gradul de puritate al preparatului proteolitic utilizat.<br />
Numeroasele utilizări <strong>ale</strong> enzimelor proteolitice, în cele mai diferite domenii de activitate<br />
(industria alimentară, farmaceutică, agricultură, industria detergenţilor, medicină) au<br />
determinat demararea cercetărilor în vederea obţinerii acestora pe c<strong>ale</strong> biotehnologică ţinând<br />
seama în acelaşi timp de avantajele pe care le oferă utilizarea microorganismelor ca sursă<br />
biologică, precum şi de proprietăţile enzimelor microbiene.<br />
Proteazele reprezintă un grup de enzime hidrolitice, de obicei extracelulare, care<br />
scindează molecula proteică în fragmente polipeptidice formate <strong>din</strong> câţiva aminoacizi uniţi prin<br />
legături peptidice. Aceste polipeptide pot fi în continuare degradate de către peptidaze până la<br />
aminoacizii componenţi. Peptidazele, în funcţie de modul lor de acţiune sunt de două tipuri:<br />
endopeptidaze şi exopeptidaze. La rândul lor exopeptidazele pot fi: aminopeptidaze care îşi încep<br />
acţiunea de la nivelul extremităţii NH2 libere a polipeptidului, activitatea lor depinzând de<br />
prezenţa unor ioni metalici; carboxipeptidaze care îşi încep atacul de la capǎtul COOH liber al<br />
peptidului (Scriban, 1988).<br />
Clasificarea enzimelor proteolitice se face, conform recomandǎrilor International Unit of<br />
Biochemistry în şase familii, diferenţele <strong>din</strong>tre ele datorându-se secvenţelor de aminoacizi care<br />
alcătuiesc situsul activ (Tabelul 4) (Neurath, 1989).<br />
Tabelul 4. Familii de enzime proteolitice (după Neurath, 1989)<br />
Familia Proteaze reprezentative Resturi caractiristice de<br />
aminoacizi <strong>ale</strong> situsului activ<br />
Serin proteaze I Chimiotripsina, tripsina, elastaza,<br />
kalikreina,pancreatina<br />
Asp 102 Ser 195 His 57<br />
Serin proteaze II Subtilizina Asp 32 Ser 221 His 64<br />
Cistein proteaze Papaina, actini<strong>din</strong>, catepsina B şi H de<br />
la şobolan<br />
Cys 25 His 159 Asp 158<br />
Aspartic proteaze Penicilopepsin, renina, proteaze acide Asp 33 Asp 213<br />
de la Rhizopus sp.<br />
Metaloproteaze I Carboxipeptidaza A bovină Zn, Glu 270 Try 248<br />
Metaloproteaze II Termolizina Zn Glu 143 His 231<br />
Membrii fiecărei familii se crede că au rezultat <strong>din</strong>tr-o formă ancestrală comună, în urma<br />
unui proces evolutiv divergent. Din datele prezentate în tabelul 2 se remarcă faptul că serin<br />
proteazele includ două familii distincte: serin-proteazele de la mamifere şi cele de origine<br />
bacteriană. Deşi prezintă un mecanism enzimatic comun, cele două familii de serinproteaze<br />
diferă ca secvenţă de aminoacizi şi ca structură tridimensională.<br />
141
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
In mod similar, metalopreoteazele includ şi ele tot două familii în funcţie de originea lor<br />
şi de structura chimică: de la mamifere şi de la bacterii. Există şi alte enzime proteolitice<br />
identificate la diferite grupe de organisme care nu pot fi încadrate încă în nici una <strong>din</strong>tre grupele<br />
de mai sus deoarece mecanismul lor de acţiune şi situsul activ nu este cunoscut cu exactitate.<br />
Acesta este cazul colagenazelor şi aminopeptidazelor.<br />
Proteazele bacteriene produse de tulpini de Bacillus subtilis sunt amestecuri de<br />
proteaze alcaline (subsubclasa 3.4.21, proteaze serinice) şi proteaze neutre (subsubclasa<br />
3.4.24, metaloproteaze).<br />
Proteazele serinice au în centrul lor activ serina şi histi<strong>din</strong>a. Acest grup a fost divizat<br />
de Morihara în alte 4 subgrupe:<br />
• proteaze similare tripsinei;<br />
• proteaze alcaline;<br />
• proteaze Myxobacter α-litice;<br />
• proteaze stafilococice.<br />
Proteazele similare tripsinei cuprind, în afară de tripsină şi chimotripsină, enzime<br />
produse de specii de Streptomyces, care hidrolizează legăturile Arg 22 – Gly 23 şi Lys 29 – Ala 30<br />
<strong>din</strong> lanţul β-insulinic, această specificitate de substrat fiind trăsătura distinctivă.<br />
Aceste enzime acţionează la pH 8,0, au temperatura optimă de cataliză 50°C, sunt<br />
inhibate de diizopropilfluorfosfat (DIFP), p–cloromercurilbenzoic (PCMB), tosyl-L-lizinclorometilcetonă<br />
(TLCK), tripsin-inhibitorul <strong>din</strong> soia. Activitatea lor nu este influenţată de<br />
etilendiaminotetraacetat (EDTA) şi acid iod-acetic (IAA), în plus prezintă şi activitate<br />
esterazică şi amidazică.<br />
A doua grupă de proteaze serinice sunt proteazele alcaline; acestea pot fi produse de<br />
bacterii, drojdii şi fungi fiind prezente şi în ţesuturile anim<strong>ale</strong>. În această grupă se încadrează<br />
şi proteazele alcaline produse de unele tulpini de B.subtilis şi cele fungice <strong>din</strong> Aspergillus<br />
oryzae.<br />
Aceste proteaze au acţiune specifică faţă de resturile de aminoacizi aromatici sau<br />
hidrofobi care participă cu gruparea carboxil la legătura care se scindează; valoarea optimă a<br />
pH este cuprins între pH 9 şi pH 11, dar enzimele rămân active în domeniul de pH 5–9; aceste<br />
proteaze sunt inhibate de DIFP, de PMSF fiind însă rezistente şa acţiunea EDTA sau<br />
ortofenantrolinei. Din acest grup fac parte proteazele cunoscute sub denumirea de subtilizine<br />
sau subtilopeptidaze. S-a constatat că aceste proteaze nu sunt exclusiv produse de B.subtilis ci<br />
în general de bacterii <strong>ale</strong> genului Bacillus astfel încât s-a propus numele generic de<br />
bacilopeptidaze. Respectivele enzime pot fi clasificate în două grupe:<br />
• Bacilopeptidaze A care cuprind subtilizina Carlsberg (proteaza alcalină produsă de<br />
tulpini de B.licheniformis) şi proteaza alcalină produsă de B.pumilis;<br />
• Bacilopeptidaze B care includ subtilizina NOVO (protează alcalină sintetizată de<br />
B.subtilis NRRL B3411) şi subtilizina BNP (Bacterial Protease Nagarse), protează<br />
alcalină <strong>din</strong> B. subtilis var. amylosacchariticus.<br />
Metodele de examinare a amestecurilor de enzime produse de diferiţi bacili au arătat<br />
că bacteriile producătoare de bacilopeptidaze A nu sintetizează proteaze neutre sau amilază, în<br />
timp ce bacteriile producătoare de bacilopeptidaze B sintetizează în acelaşi timp şi proteaze<br />
neutre şi amilază în acelaşi timp.<br />
Metaloproteazele sunt proteaze activate de ionii metalici legaţi de centrul activ al<br />
enzimei (Ca 2+ , Zn 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ ). Ele pot fi metaloproteaze neutre şi metaloproteaze alcaline.<br />
Proteazele neutre conţin de obicei Zn şi prezintă specificitate faţă de aminoacizii hidrofobi<br />
implicaţi cu gruparea amino în legătura peptidică. Ele au un pH optim de acţiune cuprins între<br />
pH 7 şi pH 8, sunt inhibate complet de EDTA (care complexează atomul de Zn <strong>din</strong> structură)<br />
142
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
fiind sensibile la concentraţii de EDTA sub 10 -3 M, orto-fenantrolină, nefiind afectate de DIFP<br />
şi PCMB.<br />
Metaloproteazele alcaline conţin, de asemenea, un ion metalic implicat în mecanismul<br />
de reacţie catalitică. Ele îşi manifestă activitatea optimă în domeniul de pH 7–9, fiind mai<br />
puţin inhibate de EDTA decât proteazele neutre, necesitând concentraţii mai ridicate de 10 -2<br />
M pentru inactivare.<br />
Proteazele neutre produse de Bacillus subtilis var. amylosacchariticus sunt diferite de<br />
proteazele neutre produse de Bacillus subtilis NRRL B3441 şi <strong>din</strong> acest motiv este necesară<br />
specificarea exactă a provenienţei proteazei neutre respective. Producerea lor este supusă<br />
represiei exercitate de prezenţa în mediul de incubare a unor aminoacizi în cantitate mai mare<br />
(Bawden şi colab.,1987). Aceste enzime sunt folosite în prezent la fabricarea detergenţilor la<br />
tratarea pieilor în industria pielăriei, frăgezirea cărnii, eliminarea depozitelor proteice <strong>din</strong><br />
băuturile fermentate (Sasson, 1988). La aceste bacterii s-au realizat şi numeroase studii<br />
referitoare la determinismul genetic şi controlul producerii şi excreţiei acestor enzime în scopul<br />
obţinerii prin clonare a unor tulpini superproducătoare (Mc Connell şi colab., 1986).<br />
S-a dovedit faptul că producerea de proteaze este supusă unor mecanisme reglatoare<br />
complexe, între care un rol cheie este jucat de sistemul DegS-DegU precum şi de factorii de<br />
reglare DegR and DegQ (Nagami and Tanaka, 1986; Tanaka et al., 1987; Ogura et al., 1994).<br />
Aceşti factori reglatori se pare că sunt implicaţi în superproducţia de proteaze cel puţin în<br />
cazul unor tulpini de B.subtilis. De asemenea, relativ recent, Ogura et al (1994) au caracterizat<br />
alte două gene: proB (ce codifică sinteza γ-glutamil kinazei) şi proA (codifică sinteza<br />
glutamil-γ-semialdehid dehidrogenaza) <strong>ale</strong> căror produşi par a fi implicaţi în sporirea<br />
capacităţii de biosinteză a exoproteazelor la o tulpină de B.subtilis. Astfel, cele două gene au<br />
fost clonate într-un vector e clonare (pLC1) şi apoi introduse, împreună cu un alt vector<br />
(pNC61) ce conţine gena reglatoare prtR (degR) într-o tulpină de B.subtilis. Transformanţii<br />
obţinuţi au prezentat o activitate proteolitică mai mare decât a tulpinii parent<strong>ale</strong>.<br />
Date fiind aplicaţiile practice <strong>ale</strong> acestor enzime extracelulare, preocupările<br />
cercetătorilor vizează sporirea nivelului de biosinteză ca şi mărirea stabilităţii enzimelor în<br />
diferite condiţii experiment<strong>ale</strong>. Aceste deziderate se pot realiza pe mai multe căi, printre care<br />
cele ce utilizează metodele clasice de ameliorare a microoganismelor (prin tratament cu agenţi<br />
mutageni) şi cele moderne, de inginerie genetică (fuziunea de protoplaşti şi tehnologia ADN<br />
recombinant).<br />
Conform datelor de literatură, mutagenii cei mai eficienţi sunt nitrosometiluree,<br />
nitrosoguani<strong>din</strong>a, dietilsulfatul, precum şi agenţi fizici de tipul radiaţiilor X sau a radiaţiilor γ.<br />
Astfel, prin mutageneză s-a reuşit ridicarea nivelului de biosinteză a tulpinilor de B.subtilis de<br />
aproximativ 8-10 ori.<br />
În cel de-al doilea caz, majoritatea tulpinilor superproducătoare de proteaze care<br />
prezintă anumite caracteristici s-au obţinut prin inginerie genetică. Astfel, sunt foarte<br />
cunoscute rezultatele obţinute de cercetătorii japonezi care, pornind de la tulpini sălbatice de<br />
B.thermoproteolyticus şi B.stearothermophilus au reuşit obţinerea de tulpini producătoare de<br />
termolizină, o protează foarte diferită de celelalte proteaze neutre în ceea ce priveşte<br />
termostabilitatea şi mecanismul de acţiune. În prezent, cunoscându-se structura termolizinei<br />
precum şi genele răspunzătoare de caracteristicile s<strong>ale</strong> deosebite, se încearcă obţinerea de<br />
tulpini de B.subtilis, B.stearothermophilus modificate genetic, capabile să producă proteaze<br />
termostabile sau stabile la valori diferite <strong>ale</strong> pH sau la acţiunea unor agenţi inhibitori.<br />
In cazul <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> genul Streptomyces examinarea lichidelor de cultură a unor tulpini<br />
producătoare de antibiotice a dus la evidenţierea prezenţei unui amestec de enzime <strong>din</strong>tre care,<br />
un loc important <strong>din</strong> punct de vedere cantitativ îl ocupă proteazele (neutre şi alcaline) şi<br />
peptidazele (aminopeptidaze) (Pokorny şi Vit<strong>ale</strong>, 1980).<br />
143
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Vit<strong>ale</strong> şi colab.(1980) au reuşit izolarea <strong>din</strong> filtrat de cultură de S.rimosus a unei serin<br />
proteaze care a prezentat un pH optim de acţiune cuprins între 7 şi 9 şi al cărei substrat de acţiune<br />
este reprezentat de proteine sau de peptide mari, hidrolizând în general esterii terminali simpli.<br />
Recent, Renko şi colab.(1989) au prezentat particularităţile unei proteaze de tip tripsinic<br />
("trypsin-like proteinase") izolată tot <strong>din</strong> filtrat de cultură de S.rimosus evidenţiind faptul că<br />
aceasta este o protează alcalină, sensibilă la acţiunea inhibitorului proteazic PMSF (specific<br />
pentru serin-proteaze) ca şi la cea a α-antitripsinei. Aceste enzime au activitate arginilaminopeptidazică<br />
atât asupra proteinelor cât şi asupra peptidelor mai mici. Enzime similare au<br />
fost izolate şi caracterizate şi de la alte specii de Streptomyces: S.fradiae, S.paromomycinus,<br />
S.moderatus, S.hygroscopicus etc. O situaţie oarecum specială o prezintă S.griseus care produce<br />
un amestec de proteaze neutre şi alcaline, produsul obţinut fiind denumit pronază, el fiind studiat<br />
mai intens în scopul elucidării mecanismului de acţiune şi a omologiei s<strong>ale</strong> cu tripsinele<br />
vertebratelor (Read şi colab.,1984).<br />
Aceste studii au importanţă atât teoretică prin contribuţiile aduse la înţelegerea unor<br />
aspecte evolutive, a taxonomiei serin-proteazelor dar şi practică, aceste enzime putând înlocui<br />
tripsina în anumite reacţii biochimice.<br />
S-a dovedit de asemenea că unele specii de streptomicete, cum ar fi de pildă S.rimosus,<br />
pot produce şi o altă categorie de proteaze: metaloproteaze (Vit<strong>ale</strong> şi colab.,1987). Aceste<br />
enzime sunt fie bazice fie neutre, fiind activate de ionii de calciu, mangan sau zinc, stabilizate de<br />
ionii de calciu şi inhibate de EDTA. Metaloproteazele alcaline acţionează doar asupra<br />
proteinelor, nu şi asupra peptidelor în timp ce metaloproteazele neutre degradează în egală<br />
măsură proteinele şi peptidele. In cazul acestora <strong>din</strong> urmă acţiunea enzimatică se manifestă la<br />
extremitatea COOH, ceea ce permite încadrarea lor printre dipeptidil-carboxipeptidaze. De<br />
asemenea, s-a reuşit izolarea de la mai multe specii de Streptomyces (S.rimosus, S.fradiae,<br />
S.peptidofaciens, S.griseus) a unor peptidaze care, pe baza proprietăţilor specifice (specificitatea<br />
de substrat, inhibarea de către EDTA, activare de către ionii de calciu, magneziu, prezenţa<br />
leucinei la capătul NH2 terminal) au fost identificate ca fiind leucin-amino-peptidaze (Vit<strong>ale</strong> şi<br />
colab.,1986).<br />
Tinând cont că în ultima vreme streptomicetele au început să fie utilizate drept gazde<br />
pentru clonarea de material genetic heterolog, este interesant de ştiut dacă tulpinile utilizate de<br />
obicei drept acceptori elaborează sau nu proteaze. Producerea unor asemenea enzime la aceste<br />
tulpini constituie un serios impediment în obţinerea produsului dorit. Pornind de la această idee,<br />
Aretz şi colab.(1989) au studiat prezenţa enzimelor proteolitice la tulpina S.lividans TK24,<br />
tulpină recombinată obţinută pentru prelucrarea şi secretarea unei proteine de fuziune (între<br />
inhibitorul α-amilazei de la S.tendae şi proinsulina de la maimuţa Macacca fascicularis). După<br />
purificarea prin cromatografie pe schimbători de ion au fost separate mai multe tipuri de enzime<br />
proteolitice: alanin-aminopeptidaze, leucin-aminopeptidaze, proteaze de tip tripsinic şi proteaze<br />
de tip chimiotripsinic. Dintre acestea, proteazele de tip chimiotripsinic ("chemo-trypsin-like")<br />
sunt cele care degradează proteina de fuziune dar această acţiune poate fi inhibată prin adăugarea<br />
în mediul de culturăa unor săruri de zinc sau nichel.<br />
Dacă în cazul bacililor au fost izolate şi clonate genele ce codifică sinteza a două<br />
subtilizine şi a unei proteaze neutre (Mc Connell şi colab.,1986), în cazul <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> genul<br />
Streptomyces studiile referitoare la determinismul genetic al producerii de proteaze sunt mult mai<br />
puţine. Astfel, Duez şi colab.(1987) au reuşit izolarea, clonarea şi secvenţierea genei pentru o<br />
peptidază extracelulară de la Streptomyces sp.R61 la S.lividans, iar Henderson şi colab.(1987) au<br />
caracterizat genele pentru proteazele A şi B de la S.griseus.<br />
In cazul unor tulpini de streptomicete au fost evidenţiate unele enzime proteolitice care<br />
degradează preferenţial colagenul ("collagenase-like")(Mukhopadhyay şi Chandra, 1987). Deşi<br />
nu au fost izolate şi purificate (s-au utilizat filtrate de cultură) enzimele de tip colagenaze de la<br />
Streptomyces au evidenţiat o activitate specifică pe colagen <strong>din</strong> tendon bovin şi piele de viţel, la<br />
144
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
28 0 C şi pH 7,2-7,5, fiind inhibate de EDTA şi azidă de sodiu. Deşi neobişnuită, producerea unor<br />
asemenea enzime de către streptomicete nu este surprinzătoare dacă ne gândim la multitu<strong>din</strong>ea<br />
de substrate nutritive pe care aceste bacterii le pot găsi în sol.<br />
3.2. α-Amilazele<br />
α-Amilazele (1,4-α-D-glucan-glucanhidrolaza, EC 3.2.1.1.) sunt larg răspândite în rândul<br />
microorganismelor, atât la fungi cât şi la bacterii, mai <strong>ale</strong>s la specii <strong>ale</strong> genurilor Bacillus şi<br />
Streptomyces, acţiunea lor constând în hidroliza legăturilor α-1,4-glicozidice de la nivelul<br />
amidonului, eliberând maltoza. Cel mai mult studiate şi utilizate în practică sunt α-amilazele<br />
produse de speciile de Bacillus (B.amilolyquefaciens, B.licheniformis, B.stearothermophilus,<br />
B.subtilis etc). Aceste bacterii produc două tipuri de α-amilaze: de lichefiere a amidonului<br />
(degradarea amidonului până la maltodextrine) şi de zaharificare (convertesc maltoza la<br />
glucoză). α-Amilazele produse de tulpinile de B.licheniformis prezintă un interes special datorită<br />
rezistenţei lor la temperaturi ridicate (85-115<br />
145<br />
0 C). In general, enzimele respective sunt utilizate în<br />
practică în lichefierea amidonului în industria distilatelor ca şi în industria textilă (Zarnea şi<br />
colab.,1980).<br />
O serie de studii genetice realizate prin experimente de mutageneză sau prin clonări de<br />
gene au evidenţiat faptul că gena pentru α-amilază de la B.subtilis se află sub un control genetic<br />
complex care este însă puţin cunoscut la nivel molecular (Mc Connell şi colab.,1986). Se pare<br />
însă că există mai multe gene reglatoare cu efecte pleiotropice (sacU, sacQ, prtR) care intervin în<br />
exprimarea genei pentru α-amilază, levansucrază, serin protează, proteaze neutre şi β-glucanază<br />
(Priest, 1987).<br />
In cazul streptomicetelor au fost izolate şi caracterizate α-amilaze de la mai multe specii,<br />
acest tip de enzime părând a fi sintetizat practic de majoritatea <strong>bacteriilor</strong> aparţinând acestui<br />
grup. O atenţie specială a fost acordată α-amilazei produsă de S.hygroscopicus (Hoshiko şi<br />
colab.,1987), S.limosus (Virolle şi Bibb, 1988) şi S.venezuelae (Virolle şi colab.,1988) la aceste<br />
specii fiind studiat şi genele ce codifică sinteza şi reglarea sintezei acestor enzime. De asemenea,<br />
s-au efectuat experimente de clonare a genelor respective în diferite gazde (E.coli, S.lividans) în<br />
scopul obţinerii unor tulpini superproducătoare de interes industrial. Pe lângă aspectul practic al<br />
cercetărilor de acest tip, ele mai pot oferi o serie de informaţii referitoare la modul de exprimare<br />
şi reglare a funcţiilor genelor de la streptomicete (în particular a genelor pentru α-amilază). Mai<br />
mult, rezultatele obţinute au permis o comparare a enzimelor de tip α-amilază produse de<br />
streptomicete cu cele produse de alte organisme, în special cu cele produse de eucarioate (Mac<br />
Gregor, 1988).<br />
S-a dovedit că S.hygrosopicus produce o α-amilază care degradează amidonul până la<br />
maltoză, acţiunea sa fiind de tip endoglucanolitic (taie legăturile α-1,4 glicozidice <strong>din</strong> interiorul<br />
lanţului polizaharidic). Compararea secvenţei de aminoacizi pe care această enzimă o conţine cu<br />
cele <strong>ale</strong> altor enzime de acest tip, fie de la procariote (de la bacili) fie de la eucariote (de la<br />
Aspergillus oryzae, A.nidulans, Hordeum vulgare, Drosophila melanosgaster etc) a evidenţiat<br />
faptul că există trei regiuni care sunt conservate la toate aceste enzime, indiferent de origine<br />
(Ihara şi colab.,1985). Cu toate acestea, α-amilaza de la S.hygroscopicus este unică deoarece<br />
conţine triptofan la nivelul celei de-a treia regiuni conservate (Mac Gregor, 1988).<br />
Experimentele de clonare a genei amy de la S.hygroscopicus în alte gazde cum ar fi<br />
E.coli şi S.lividans au evidenţiat faptul că, deşi transferul genei s-a realizat eficient, exprimarea<br />
sa variază în funcţie de gazdă şi de numărul de copii <strong>ale</strong> genei respective (efectul de dozare a<br />
genei). Hoshika şi colab. (1987) utilizând cartarea cu o nuclează specifică ("mung bean<br />
nuclease") au determinat faptul că gena amy de la S.hygroscopicus prezintă trei situsuri de<br />
iniţiere a transcrierii (trei promotori): amyP1, amyP2 şi amyP3, care au asemănări mai mult sau<br />
mai puţin extinse cu promotorii altor gene de la Streptomyces (endoH, ermP1, aphP1).
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Studii similare au fost făcute şi cu gena pentru α-amilază (aml) de la S.limosus şi<br />
S.venezuelae. In cazul tulpinilor de S.venezuelae analizate s-a observat că exprimarea genei aml<br />
este represată puternic de glucoză în timp ce asupra exprimării genei similare de la S.limosus<br />
glucoza nu are efect. Exprimarea acestei gene este însă influenţată (represată) puternic de<br />
manitol (Virolle şi colab.,1988). Interesant este că prin clonarea genei aml de la S.limosus în<br />
S.lividans exprimarea genei este puternic represată de glucoză în noua gazdă (Virolle şi Bibb<br />
1988). Acesta înseamnă că rezistenţa la acţiunea glucozei evidenţiată la tulpinile de S.limosus<br />
analizate este mai degrabă o particularitate a bacteriei decât a genei pentru α-amilază. De<br />
asemenea, în urma comparării secvenţei de aminoacizi a acestei proteine cu proteine similare de<br />
la eucariote s-a observat o omologie ridicată cu α-amilaza produsă de Drosophila melanogaster<br />
(>40%), Mus musculus (36,8%), Aspergillus nidulans (36,1%) şi mai mică cu enzimele similare<br />
de la B.subtilis (22,6%) şi B.amylolyquefaciens (16,1%)(Long şi colab.,1987).<br />
3.3. Glucoz-izomeraza<br />
In ultimii ani, de mare interes în Japonia, SUA şi Franţa este obţinerea siropurilor cu<br />
conţinut ridicat de fructoză <strong>din</strong> hidrolizate de amidon în urma acţiunii glucoz-izomerazei (xilozoizomeraza,<br />
EC 5.3.1.5.). Printre producătorii recunoscuţi de asemenea enzime se numără şi<br />
unele specii de streptomicete: S.violaceoniger şi S.olivochromogenes. Suekane şi Iizuka (1982),<br />
în cadrul unor cercetări legate de producerea de glucoz-izomerază de către streptomicete au<br />
evidenţiat faptul că abilitatea de a converti glucoza la fructoză este larg răspândită între bacteriile<br />
acestui gen. Localizarea acestei enzime este atât intracelulară (cea mai mare parte) dar şi<br />
extracelulară.<br />
Experimentele lui Szentirmai şi colab.(1986) au evidenţiat faptul că, cel puţin în cazul<br />
S.matensis, glucoz-izomeraza intracelulară diferă de cea extracelulară <strong>din</strong> punctul de vedere al<br />
greutăţii moleculare. De asemenea, s-a observat că utilizarea ca sursă de azot a unei combinaţii<br />
de glicocol şi sulfat de amoniu şi adăugarea xilozei şi a ionilor de cobalt (de magneziu sau<br />
mangan în cazul altor specii bacteriene) duce la stimularea producerii de enzimă la<br />
S.olivochromogenes, S.flavogriseus sau S.violaceoniger (Chen şi colab.,1979; Sicard şi colab.,<br />
1990).<br />
Park şi Toma (1974) au observat că la unele tulpini de streptomicete există o interrelaţie<br />
între producerea de glucoz-izomerază şi cea de xilanază, în funcţie de sursa de carbon utilizată<br />
pentru cultivarea <strong>bacteriilor</strong> respective. Utilizarea unui mediu de cultură ce conţine fie xilan fie<br />
glucoză ca sursă de carbon determină producerea de glucoz-izomerază în timp ce xilanaza este<br />
produsă doar de bacteriile crescute pe mediu cu xilan, nu şi pe cel ce conţine glucoză.<br />
Datorită importanţei practice deosebite a acestei enzime, în ultimii ani au fost realizate<br />
studii referitoare la determinismul genetic al sintezei glucoz-izomerazei ca şi la controlul acestei<br />
sinteze, scopul fiind acela al obţinerii prin tehnici de inginerie genetică a unor tulpini capabile de<br />
a sintetiza noi tipuri de glucoz-izomeraze cu proprietăţi modificate, cu acţiunea mai eficientă.<br />
Utilizarea D-xilozei ca sursă de carbon de către bacterii se realizează pe o c<strong>ale</strong> metabolică<br />
ce presupune transportul prin membrana plasmatică, izomerizarea la D-xiluloză şi apoi<br />
fosforilarea acesteia cu ajutorul xiluloz-kinazei cu formarea de D-xiluloz-5-fosfat. Intermediarul<br />
fosforilat este apoi metabolizat fie pe c<strong>ale</strong>a pentozo-fosfaţilor fie pe c<strong>ale</strong>a Embden-Meyerhoff.<br />
Pornind de la aceste date s-a determinat faptul că operonul xyl de la streptomicete (de la<br />
S.violaceoniger în particular) este alcătuit <strong>din</strong> cel puţin trei gene: xylA care codifică pentru<br />
sinteza xiloz-izomerazei, xylB care codifică xiluloz-kinaza şi xylX care determină sinteza unei<br />
proteine reglatoare. In cazul acestor bacterii s-a evidenţiat o situaţie interesantă: genele xylA şi<br />
xylB plasate apropiat una de cealaltă pe cromosomul bacterian prezintă o orientare diferită,<br />
exprimarea lor datorându-se unor promotori divergenţi plasaţi în regiunea <strong>din</strong>tre cele două gene<br />
146
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
(Tiraby şi colab.,1989). Produsul genei xylX pare a fi o proteină reglatoare care controlează atât<br />
exprimarea celor două gene cu orientare opusă cât şi propria sa sinteză.<br />
Experimentele de clonare care se realizează în diferite laboratoare încearcă, pe de o parte<br />
stabilirea cu precizie a genelor ce alcătuiesc operonul xyl la streptomicete şi modul de reglare a<br />
exprimării lor atât în tulpina de origine cât şi în diferite tulpini gazdă în care genele respective au<br />
fost clonate, şi, pe de altă parte să se construiască "in vitro" tulpini recombinate genetic capabile<br />
de a sintetiza glucoz-izomerază cu proprietăţi ameliorate (de exemplu termostabilă) (Sicard şi<br />
colab, 1990). Rezultatele obiţute până în prezent sunt promiţătoare, cercetările fiind continuate<br />
pe direcţiile menţionate mai sus.<br />
3.4. Celulazele<br />
Biomasa vegetală reprezintă sursa majoră de carbon în ecosistemele terestre astfel că este<br />
firească presupunerea că multe <strong>din</strong>tre microorganismele care populează aceste ecosisteme să fie<br />
capabile să degradeze aceste substrate, deci să sintetizeze enzime de timpul celulazelor şi<br />
hemicelulazelor. Actinomicetele şi în mod special bacteriile <strong>din</strong> genul Streptomyces constituie un<br />
grup important care intră în alcătuirea populaţiilor microbiene respective (Mc Carthy şi<br />
Williams, 1992).<br />
Celuloza este un polimer neramificat de glucoză compus <strong>din</strong> unităţi de anhidro Dglucoză<br />
unite prin legături 1,4-β-D-glucozidice. Aceste legături pot fi hidrolizate de către<br />
enzimele celulozolitice. De obicei celuloza este foarte rezistentă la hidroliză datorită gradului<br />
ridicat de cristalinitate, rezultatul unei conformaţi lineare (par<strong>ale</strong>le) care permite realizarea unor<br />
puternice legături de hidrogen între grupările OH <strong>ale</strong> lanţurilor par<strong>ale</strong>le vecine. In fibrele de<br />
celuloză regiunile cu structură înalt cristalină coexistă cu regiunile cu structură amorfă iar cele cu<br />
un raport favorabil zonelor cristaline prezintă o rezistenţă crescută la acţiunea enzimatică.<br />
Celuloza, aşa cum se găseşte în natură este un homopolimer cu greutate moleculară mare,<br />
insolubil şi adesea în asociere intimă cu lignina, hemiceluloza la nivelul peretelui celular vegetal<br />
fapt ce o face puţin accesibilă degradării enzimatice (Robson şi Chambliss, 1989).<br />
Toate organismele care degradează celuloza cristalină secretă sisteme enzimatice mai<br />
mult sau mai puţin complexe care sunt alcătuite <strong>din</strong> enzime cu diferite modalităţi de acţiune,<br />
specificitate de substrat şi care acţionează de obicei sinergic pentru a hidroliza celuloza. Cel mai<br />
bine studiat sistem celulazic este cel de la fungi (de la Trichoderma reesei), enzimele care îl<br />
alcătuiesc fiind grupate în trei categorii:<br />
- exo-β-1,4-glucanaze sau celobiohidrolaze (EC 3.2.1.91.)<br />
- endo-β-1,4-glucanaze sau endocelulaze (endoglucanaze)(EC 3.2.1.4.)<br />
- β-glucozidaza sau celobiaza (EC 3.2.1.21.)<br />
Aceste trei grupe de enzime acţionează sinergic ducând la hidroliza celulozei cristaline.<br />
Endoglucanazele determină ruperea legăturilor interne <strong>ale</strong> lanţului de celuloză, atacul făcându-se<br />
la întâmplare şi ducând la formarea de oligozaharide. Efectul direct al acestui tip de enzime este<br />
fragmentarea lanţului de celuloză cuplat cu o creştere slabă a cantităţii de zaharuri reducătoare<br />
eliberate. De obicei, în complexele celulozolitice sunt cuprinse mai multe endoglucanaze care<br />
pot prezenta afinităţi diferite pentru celo-oligozaharide cu lungimi variate. Spre deosebire de<br />
aceste, exoglucanazele (celobiohidrolazele) acţionează la nivelul extremităţilor nereducătoare <strong>ale</strong><br />
lanţului de celuloză, eliberând glucoză sau celobioză (zaharuri reducătoare) în cantitate crescută,<br />
lungimea lanţului celulozic nefiind modificată semnificativ.<br />
Acţionând individual, atât endoglucanazele cât şi celobiohidrolazele pot degrada regiuni<br />
restrânse <strong>ale</strong> lanţului celulozic (cele cu structură amorfă). Pentru a determina hidroliza regiunilor<br />
cu structură cristalină este necesar ca în amestecul enzimatic să fie prezente ambele tipuri de<br />
enzime.<br />
147
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
In ceea ce priveşte β-glucozidazele, acestea determină hidroliza celobiozei în două<br />
unităţi de glucoză. Deşi aceste enzime nu sunt propriu-zis celulaze, ele participă la îmbunătăţirea<br />
randamentului degradării celulozei prin eliminarea inhibării prin feedback a celulazelor realizată<br />
de obicei de celobioză (Robson şi Chambliss, 1989).<br />
Utilizarea a numeroase substrate şi diverse tehnici de evidenţiere a activităţii<br />
celulazice a dus la o comparare dificilă a sistemelor celulozolitice de la diferite organisme.<br />
Mai mult, deoarece celulazele aflate în extracte brute prezintă o suprapunere parţială a<br />
specificităţii de substrat, un studiu corect trebuie realizat în condiţiile purificării acestor enzime.<br />
In ultima vreme au fost obţinute o serie de substrate celulozice care ar putea fi folosite ca<br />
substrate mai mult sau mai puţin specifice pentru fiecare <strong>din</strong>tre componentele sistemului<br />
celulazic (Wood şi Bhat, 1988). Cel mai utilizat procedeu de determinare a activităţii enzimatice<br />
este măsurarea cantităţii de zaharuri reducătoare eliberate în urma acţiunii enzimelor asupra<br />
substratului. Astfel, substratele celulozice cu structură amorfă sau cele modificate chimic cum<br />
sunt celuloza-azur, carboximetilceluloza(CMC), celuloza tratată cu acizi ("acid-swollen<br />
cellulose") sau trinitrofenil-carboximetilceluloza (TNP-CMC) sunt degradate în mod<br />
semnificativ şi specific de către endoglucanaze dar, în unele situaţii şi celobiohidrolazele le pot<br />
hidroliza de şi cu o eficienţă mai mică. In cazul utilizării drept substrat a celulozei cu structură<br />
cristalină de tipul Avicelului (celuloză microcristalină), bumbacului sau hârtiei de filtru, pentru<br />
degradarea lor eficientă este necesar un sistem celulazic complet, care să conţină atât<br />
endoglucanază cât şi celobiohidrolază. De obidei, pentru a determina prezenţa într-un preparat<br />
enzimatic brut a ambelor tipuri de enzime se determină eliberarea de zaharuri reducătoare în<br />
funcţie de substrat. Astfel, endoglucanazele cauzează o creştere rapidă a fluidităţii (reducerea<br />
vâscozităţii) carboximetilcelulozei dar o eliberare scăzută de zaharuri reducătoare. In contrast,<br />
celobiohidrolazele nu modifică fluiditatea substratului dar conduce la eliberarea unei cantităţi<br />
mai mari de zaharuri reducătoare. Cu toate acestea este dificil de precizat dacă o celulază este sau<br />
nu celobiohidrolază deoarece nu există un substrat specific pentru aceasta. Deshpande şi colab.,<br />
(1988) au arătat însă că hidroliza unor compuşi cum ar fi metil-umbeliferil-celobiozid (MUC)<br />
sau p-nitrofenil-β-D-celobiozid (pNPC) ar fi un indiciu al activităţii exo-β-1,4-glucanazice.<br />
Există în prezent numeroase date referitoare la bacterii celulozolitice dar mulţi autori<br />
consideră că bacteriile produc doar endoglucanaze şi nu un sistem celulazic complet. Deşi cea<br />
mai acceptată teorie referitoare la modul de degradare a celulozei este cea bazată pe rezultatele<br />
cercetărilor efectuate asupra fungilor şi care presupune că hidroliza eficientă a substratelor<br />
celulozice se realizează în urma acţiunii sinergice a endo- şi exoglucanazelor, ea nu este aplicată<br />
<strong>bacteriilor</strong>. La acestea, modelul de degradare sugerat presupune că endoglucanazele care au ca<br />
substrat specific celo-oligozaharidele cu lungimi variate pot determina hidroliza celulozei<br />
cristaline dacă ele se află în concentraţie mare sau dacă se leagă de fibrele de celuloză sau sunt<br />
grupate în imediata vecinătate a acestora ("celulosomi") (Robson şi Chambliss, 1989). Reuşita<br />
unor laboratoare <strong>din</strong> lume de a izola şi caracteriza celobiohidrolaze de la bacterii vine să<br />
contrazică în cazul speciilor respective teoria enunţată mai sus (Creuzet şi colab.,1983; Mac<br />
Kenzie şi colab.,1984; Gardner şi colab., 1987; Beguin, 1990; Ruttersmith şi Daniel, 1991).<br />
Printre bacteriile considerate a avea sisteme celulazice complexe, tipice se numără<br />
<strong>genurile</strong> Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus, Bacteroides,<br />
Erwinia şi Acetobacter. De asemenea, tulpini celulozilitice au fost identi-ficate şi în cadrul altor<br />
genuri de bacterii: Streptomyces, Rhizobium, Cellvibrio, Pseudomonas, Microbispora etc. In<br />
studiul de faţă ne vom referi doar la sistemele celulazice de la două genuri de bacterii Gram<br />
pozitive, Bacillus şi Streptomyces.<br />
La bacteriile <strong>din</strong> genul Bacillus s-a evidenţiat faptul că ele produc doar endoglucanaza şi<br />
nu sînt capabile de o degradare eficientă a celulozei cristaline. Studiile referitoare la celulazele de<br />
la Bacillus au fost sprijinite şi de faptul că aceste bacterii pot fi uşor manipulate genetic<br />
(genomurile de la mai multe specii fiind destul de bine caracterizate) şi de caracterul extracelular<br />
148
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
al acestor enzime. Printre speciile care produc celulaze se numără B.subtilis, B.polymyxa,<br />
B.licheniformis, B.cereus etc.<br />
Studiile referitoare la celulazele de la Bacillus se referă atât la caracterizarea biochimică a<br />
enzimelor cât şi la identificarea şi secvenţierea genelor implicate în producerea acestor enzime ca<br />
şi în clonarea şi exprimarea lor în diferite gazde. In prezent se cunoaşte secvenţa de nucleotide a<br />
mai multor endoglucanaze de la Bacillus (tabelul 5) şi deci secvenţa de aminoacizi a proteinelor<br />
corespunzătoare, realizându-se astfel comparaţii între enzimele secretate de diferite specii de<br />
bacili.<br />
Tabelul 5. Genele pentru celulazele de la Bacillus<br />
Tulpina Gena Mărimea proteinei<br />
produse (aminoacizi)<br />
B.circulans 378<br />
B.subtilis DLG 499<br />
B.subtilis N-24 463<br />
B.subtilis PAP 115 499<br />
B.lautus celB 536<br />
Bacillus N-4 celA<br />
celB<br />
celC<br />
149<br />
384<br />
465<br />
>800<br />
B.polymyxa 365<br />
Bacillus 1139 celF 770<br />
Bacillus sp.KSM 635 912<br />
S-a stabilit astfel că enzimele produse de diferite tulpini de Bacillus prezintă un grad înalt<br />
de omologie, porţiunile cu omologie ridicată fiind localizate, în general, în regiunea<br />
aminoterminală, ceea ce sugerează că situsul catalitic activ al enzimelor se află plasat în această<br />
zonă. Această supoziţie este sprijinită de observaţiile că porţiunea de la capătul carboxiterminal<br />
al endoglucanazei respective nu este necesară pentru activitatea celulozolitică, regiunea<br />
respectivă putând fi deletată experimental fără pierderea actibvităţii (Nakamura şi colab. 1991).<br />
Recent, Henrissat şi colab.(1989) analizând grupările ("clusterii") hidrofobe <strong>ale</strong> diferitelor<br />
enzime au clasificat celulazele, inclusiv pe cele de la Bacillus, în şase familii. Din acest punct de<br />
vedere, endoglucanazele de la B.subtilis şi B.ciculans sunt incluse în familia A, subfamiliile A2 şi<br />
A4 (Beguin, 1990; Gilkes şi colab.,1991).<br />
De asemenea, rezultatele de până acum referitoare la genele pentru enduglucanazele de la<br />
Bacillus sugerează ideea că ele ar deriva <strong>din</strong>tr-o genă ancestrală comună.<br />
In ceea ce priveşte particularităţile biochimice <strong>ale</strong> endoglucanazelor de la bacteriile <strong>din</strong><br />
genul Bacillus acestea au o greutate moleculară ce variază, de obicei, între 35 şi 46 kDa, dar<br />
poate atinge, la unele tulpini alcalofile, până la 92 kDa (Fukumori şi colab., 1986), sunt în<br />
general termostabile, activitatea optimă realizându-se la 50-60 o C.<br />
Reglarea producerii de endoglucanaze de către bacteriile <strong>din</strong> genul Bacillus variază nu<br />
numai de la specie la specie ci chiar şi de la tulpină la tulpină. Spre exemplu, tulpini de B.cereus,<br />
Bacillus sp.N-4, B.subtilis AU1, B.licheniformis sintetizează enzima în mod constitutiv în timp ce<br />
la alte tulpini, B.polymyxa, B.subtilis DLG, Bacillus sp.1139, aceasta pare a fi inductibilă. De<br />
asemenea, nivelul glucozei şi al celobiozei influenţează diferit producerea englucanazei de către<br />
tulpinile bacteriene studiate. Dacă în cazul tulpinii B.subtilis AU1 atât glucoza cât şi celobioza<br />
inhibă sinteza enzimatică la concentraţii mai mari de 2%, în cazul tulpinii alcalofile Bacillus<br />
sp.1139 glucoza inhibă, iar celobioza stimulează producerea de enzimă. La alte tulpini de
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Bacillus, B.subtilis DGL, B.cereus, B.licheniformis, ambele zaharuri reducătoare stimulează<br />
sinteza endoglucanazei.<br />
In urma experimentelor de clonare a genelor pentru endoglucanază în diferite gazde (fie<br />
tulpini auxotrofe de E.coli fie alte tulpini de B.subtilis) au fost obţinute informaţii interesante<br />
referitoare la exprimarea genelor respective în gazde heterologe ca şi la reglarea exprimării<br />
acestora. De obicei, celulazele <strong>ale</strong> căror gene au fost clonate în E.coli sunt sintetizate iniţial sub<br />
forma unor compuşi de dimensiuni mari, activi <strong>din</strong> punct de vedere enzimatic, cu localizare<br />
intracelulară. Aceşti compuşi suferă o "prelucrare" în urma căreia dimensiunea enzimei se<br />
micşorează, sub această formă ea fiind exportată în spaţiul periplasmic (Cantwell şi Mc Connel,<br />
1983; Robson şi Chambliss, 1989). In cazul utilizării drept gazda pentru clonare a unor tulpini<br />
mutante de Bacillus s-a observat un fenomen similar de "procesare intracelulară" a precursorului<br />
enzimatic în urma căruia dimensiunia enzimei se apropie de cea a enzimei produsă de tulpina de<br />
origine (Robson şi Chambliss, 1989). De asemenea, Nakamura şi colab.(1991) au observat că<br />
utilizarea drept gazdă a unei tulpini mutante de B.subtillis care nu produce proteaze a condus la<br />
obţinerea unei cantităţi superioare de enzimă de la tulpina recombinată. Această creştere poate fi<br />
de cel puţin 9 ori dacă în noua gazdă este clonată suplimentar şi gena sacQ.<br />
Deşi cele mai multe informaţii referitoare la degradarea substratelor celulozice de către<br />
actinomicete sunt legate de bacteriile <strong>din</strong> genul Thermomonospora (T.fusca, T.curvata)(Wilson,<br />
1992), în ultimii ani au fost realizate şi studii referitoare la sistemul celulazic al <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong><br />
genul Streptomyces.<br />
Tulpinile de streptomicete capabile de a degrada celuloza aparţin la mai multe specii cum<br />
ar fi: S.antibioticus (Enger şi Mc Coy, 1965), S.thermodiastaticus (Crawford şi Mc Coy, 1972),<br />
S.flavogriseus (Ishaque şi Kluepfel, 1980), S.olivochromogenes (Mac Kenzie şi colab.,1987),<br />
S.reticuli (Wachinger şi colab., 1989), S.lividans (Theberge şi colab., 1992), S.flavovirens SfG3<br />
(Cornea şi colab., 1993), dar lista poate continua dacă ţinem cont de tulpinile de Streptomyces<br />
care nu au fost încadrate până acum într-o specie anume.<br />
Primele lucrări referitoare la sistemul celulazic de la streptomicete au evidenţiat faptul că<br />
acesta este complex, enzimele componente fiind capabile de a degrada substrate foarte variate:<br />
CMC, hârtie de filtru, bumbac, celuloză microcristalină, celobioză dar şi paie, tărâţe sau alte<br />
deşeuri celulozice. Studiind complexul celulazic de la S.flavogriseus, Ishaque şi Kluepfel (1980)<br />
au stabilit că aceste bacterii produc enzime extracelulare capabile de a degrada, cu o rată diferită,<br />
carboximetilceluloza, hârtia de filtru şi fibrele de bumbac. De asemenea, tulpina respectivă<br />
produce şi β-glucozidază dar această enzimă rămâne în cea mai mare parte localizată<br />
intracelular. Cercetările ulterioare realizate asupra unor tulpini aparţinând aceleiaşi specii<br />
(S.flavogriseus) au condus la precizarea că aceste bacterii produc atât endoglucanaze cât şi<br />
exoglucanaze (celobio-hibrolaze)(Mac Kenzie şi colab.,1984). Rezultate asemănătoare au fost<br />
comunicate şi de alţi autori în cazul unor specii diferite de Streptomyces: S.reticuli (Wachinger şi<br />
colab., 1989) sau Streptomyces sp.SD16 (Cornea şi colab.,1992) (Figura 6).<br />
In ceea ce priveşte stabilirea condiţiilor optime de acţiune a acestor enzime, există o<br />
oarecare variaţie în funcţie de tulpina bacteriană studiată şi de autor. Astfel, în cazul tulpinilor de<br />
S.flavogriseus analizate, testarea acţiunii enzimelor pe CMC se realizează la 50<br />
150<br />
0 C, în tampon<br />
fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie şi colab.,1984) sau în tampon citrat-fosfat 50mM pH 7 (Ishaque<br />
şi Kluepfel, 1980), în timp ce activitatea enzimatică pe hîrtie de filtru sau pe celuloză<br />
microcristalină (Avicel) se realizează la 40 0 C fie în tampon fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie şi<br />
colab.,1984) fie în tampon citrat 50mM pH 5,6 (Ishaque şi Kluepfel, 1980). La o altă specie,<br />
S.reticuli, testarea activităţii celulazelor s-a realizat la 45 0 C în tampon Tris HCl pH 7,5<br />
(Wachinger şi colab., 1989). Alţi autori (Godden şi colab., 1989) testează activitatea<br />
endoglucanazică a filtratului de cultură de la o tulpină de Streptomyces în tampon fosfat de<br />
potasiu 100mM, pH 8 la 50 0 C. Recent, Theberge şi colab.(1992) au caracterizat o endoglucanază<br />
de la S.lividans 66 care prezenta o activitate optimă la p 5,5 la 50 0 C. O situaţie particulară a fost
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
evidenţiată la o tulpină alcalofilă de Streptomyces tulpină capabilă de a sintetiza trei<br />
endoglucanaze diferite, cu pH optim de acţiune ce variază între 6 şi 8,5 (Nakai şi colab.,1988).<br />
Figura 6. Selecţia unor noi tulpini de Streptomyces sp. producătoare de celulaze.<br />
In cadrul unor exprimente realizate cu o tulpină de Streptomyces sp.SD16 izolată<br />
în Institutul de Biologie Bucureşti, Cornea şi colab. (1992) au înregistrat o activitate<br />
endoglucanazică maximă la pH 6,4 la 50 0 C în tampon fosfat de potasiu 50mM. In cazul utilizării<br />
drept substrat a hârtiei de filtru au fost obţinute valori maxime de degradare (eliberare de<br />
zaharuri reducătoare) la 40 0 C în tampon fosfat de potasiu 50mM la pH 5,8 şi pH 8 (Figura 7).<br />
Figura 7. Activitatea enzimatică a unor tulpini de streptomicete izolate <strong>din</strong> sol (după Cornea şi colab., 1992).<br />
Streptomicetele, ca multe alte bacterii, sitetizează celobiază (β-glucozidază) dar în mod<br />
normal nu o excretă în mediul de cultură ci ea rămâne localizată intracelular. Studii mai<br />
amănunţite asupra acestui tip de enzime au fost realizate la tulpini de S.granaticolor (Jiresova şi<br />
colab.,1987) la care s-a încercat izolarea şi caracterizarea enzimei, ca şi la S.thermodiastaticus<br />
(Ozaki şi Yamada, 1991). La această ultimă specie a fost obţinută o tulpină care produce o βglucozidază<br />
a cărei sinteză nu este afectată de glucoză, enzima fiind purificată şi caracterizată.<br />
Alături de această enzimă rezistentă la acţiunea glucozei, de la aceeaşi tulpină bacteriană au mai<br />
151
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
fost izolate încă două enzime de acelaşi tip (β-glucozidaze) dar a căror sinteză este supusă<br />
inhibării de către glucoză.<br />
Un aspect interesant al cercetărilor referitoare la celulazele produse de bacteriile <strong>din</strong><br />
genul Streptomyces este izolarea şi purificarea componentelor acestui sistem. Spre deosebire de<br />
bacteriile <strong>din</strong> genul Thermomonospora la care au fost bine caracterizate cinci endoglucanaze<br />
diferite (E1-E5) <strong>din</strong>tre care E3 prezintă sinergism atât cu alte endoglucanaze cât şi cu o<br />
celobiohidrolază izolată de la Trichoderma reesei (Wilson, 1992), la streptomicete asemenea<br />
rezultate sunt mai puţine.<br />
Nakai şi colab.(1987) au purificat şi caracterizat de la o tulpină alcalofilă de Streptomyces<br />
(Streptomyces sp.KSM9) trei celulaze diferite care degradează preferenţial CMC şi care au fost<br />
notate CMC-aza I, CMC-aza II şi CMC-aza III. Greutăţile moleculare <strong>ale</strong> acestor enzime variază<br />
între 32 kDa (CMC-aza I), 32,5 kDa (CMC-aza II) şi 92 kDa (CMC-aza III). Purificarea şi<br />
separarea celor trei enzime s-a realizat prin cromatografie pe schimbători de ioni, prin trecerea pe<br />
o coloană de DEAE-Toyopearl 650M a unui preparat celulazic brut, rezultat prin precipitarea cu<br />
sulfat de amoniu (70%) a proteinelor <strong>din</strong> filtratul de cultură şi eluarea lor cu un gradient linear de<br />
NaCl (0,05-0,4M). Alţi autori (Wachinger şi colab.,1989) au fracţionat celulazele de la S.reticuli<br />
prin gel filtrare pe Superose 12 şi au obţinut cel puţin două CMC-aze precum şi mai multe<br />
proteine cu activitate pe celuloza microcristalină. CMC-azele, notate CMC-aza 1 de 40 kDa şi<br />
CMC-aza 2 de 48 kDa prezintă un pH optim de acţiune ce variază între 5,5 şi 7,5 la o<br />
temperatură de 45-50<br />
152<br />
0 C. De asemenea ele nu sunt inhibate de tamponul fosfat şi nu sunt<br />
stimulate de adăugarea de ioni de calciu în amestecul de reacţie. Spre deosebire de acestea,<br />
preparatul enzimatic ce prezintă activitate specifică pe Avicel, supus electroforezei în gel de<br />
poliacrilamidă în condiţii de denaturare a evidenţiat prezenţa a mai multor benzi cu greutăţi<br />
moleculare ce au variat între 42 şi 120 kDa (42, 56, 70, 120). Preparatul enzimatic obţinut prin<br />
gel filtrare a avut o temperatură optimă de acţiune la 45-50 0 C la un pH optim 7. Activitatea<br />
celulazică pe substrat de Avicel este redusă semnificativ în tampon fosfat, dar este stimulată de<br />
adăugarea de CaCl2 40mM şi de asemenea ea este pierdută rapid, în decursul a câtorva zile prin<br />
păstrare la 4 0 C, în timp ce CMC-azele sunt mult mai stabile. Proprietăţile avicelazei de la<br />
S.reticuli sunt foarte asemănătoare celor descrise pentru exoglucanaza de la Ruminococcus albus<br />
care a fost izolată sub forma unui complex de 230 kDa, alcătuit<strong>din</strong> monomeri de 118 kDa<br />
(Gardner şi colab., 1987).<br />
Recent, Theberge şi colab.(1992) au purificat şi caracterizat o endoglucanază de la<br />
S.lividans 66 după cultivarea <strong>bacteriilor</strong> pe mediu cu xiloză ca sursă de carbon. Aceasta este o<br />
glicoproteină cu greutatea moleculară de 46 kDa, cu pI la 3,3 şi cu o activitate maximă asupra<br />
CMC la 50 0 C la pH 5,5. Interesant este că prin cultivarea <strong>bacteriilor</strong> în mediu cu Avicel sau<br />
celobioză ca sursă principală de carbon s-a obţinut un preparat enzimatic alcătuit <strong>din</strong> mai multe<br />
proteine de dimensiuni variate, dar active pe oligozaharide şi care au interacţionat pozitiv cu<br />
anticorpii anti-endoglucanază. Fenomenul respectiv a fost observat la celulazele de la<br />
Trichoderma reesei şi de la Clostridium thermocellum, el datorându-se în cazul fungilor fie unui<br />
grad diferit de glicozilare a proteinelor fie unor modificări proteolitice. In cazul <strong>bacteriilor</strong><br />
fenomenul s-ar putea explica prin formarea unor complexe enzimatice specifice, celulosomi,<br />
doar în prezenţa substratelor microscristaline. Autorii presupun însă că apariţia fragmentelor<br />
endoglucanazice la S.lividans 66 s-ar datora mai degrabă unei serii de fenomene proteolitice<br />
decât unei glicozilări diferenţiate sau formării celulosomilor. In orice caz, activitatea specifică a<br />
endoglucanazei de S.lividans comunicată de autori a fost de 539 IU/mg proteină, ceea ce<br />
reprezintă una <strong>din</strong>tre cele mai mari valori raportate în literatură (Theberge şi colab.,1992).<br />
Rezultate interesante au fost obţinute şi de Mac Kenzie şi colab.(1984) care au reuşit,<br />
printre puţinii cercetători de altfel, izolarea şi caracterizarea unei exoglucanaze de la o tulpină de<br />
S.flavogriseus. Aceasta s-a realizat prin cromatografie pe DEAE Bio-Gel A a unui preparat brut<br />
obşinut prin concentrarea de 100 ori a filtratului de cultură (prin ultrafiltrare). Eluarea enzimelor
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
s-a făcut cu un gradient linear de NaCl (0-0,2M) obţinâdu-se mai multe "peak-uri" cu activitate<br />
celulazică. Cinci <strong>din</strong>tre acestea au prezentat activitate CMC-azică iar unul a evidenţiat o<br />
activitate enzimatică complexă (avicelazică, CMC-azică, xilanazică şi proteazică). Fracţiile care<br />
au prezentat cea mai mare activitate avicelazică au fost supuse gel filtrării pe Bio-Gel P60<br />
reuşindu-se separarea avicelazei de CMC-ază. Fracţiile active au fost apoi trecute pe o coloană<br />
de Concanavalină A-Sefaroză 4B, fiind recuperată o proteină de 46 kDa care nu a prezentat<br />
afinitate pentru coloana respectivă (pentru lectina imobilizată). Această proteină prezintă pI la<br />
4,15, determină în special hidroliza celulozei tratate cu acizi ("acid-swollen cellulose"), produşii<br />
de hidroliză fiind celobioza şi celotrioza (în cea mai mare parte).<br />
Datele obţinute la streptomicete, în special de la tulpinile de S.flavogriseus evidenţiază<br />
faptul că mecanismul de acţiune al celulazelor de la aceste bacterii este mai degrabă asemănător<br />
celui descris la fungi la care degradarea substratelor celulozice se datorează acţiunii sinergice a<br />
endoglucanazelor, exoglucanazelor şi β-glucozidazei. De asemenea, glicozilarea unora <strong>din</strong>tre<br />
componentele sistemului celulazic de la streptomicete (a endoglucanazelor, de exemplu),<br />
fenomen care este destul de puţin răspândit la bacterii dar frecvent la fungi poate sugera un<br />
comportament asemănător al celulazelor de la streptomicete cu cel al unor fungi. In ceea ce<br />
priveşte semnificaţia glicozilării, deşi unii autori atribuie glucidului un rol în funcţionarea<br />
enzimei, ea rămâne încă neclară (Knowles şi colab.,1987).<br />
Cu toate acestea explicarea mecanismului de acţiune a celulazelor de la streptomicete<br />
este complicat de faptul că la unele tulpini bacteriene, la S.reticuli de pildă, au fost identificate<br />
celulaze legate de miceliu ("mycelium buond cellulase") care amintesc de formarea<br />
celulosomilor de la Clostridium thermocellum (Lamed şi Bayer, 1988; Wachinger şi<br />
colab.,1989). O organizare a celulazelor în celulosomi similară celei evidenţiate la clostridii a<br />
fost descrisă şi la Thermomonospora curvata deşi studiile au fost în special de microscopie<br />
electronică (Figura 8).<br />
Figura 8. Aspect electronomicroscopic al suprafeţei celulelor de T.curvata cultivate pe fibre de celuloză (după Bond<br />
şi Stutzberger, 1989).<br />
Modificarea aspectului suprafeţei celulelor de streptomicete cultivate în mediu de cultură<br />
ce conţine celuloză drept unică sursă de carbon a fost observată la tulpinile Streptomyces<br />
sp.SD16 şi Streptomyces sp.P216 (Figura 9) (Cornea, 1996). Aceste rezultate sugerează că<br />
fenomenul complexării sistemului celulazic este comun mai multor tipuri de bacterii iar<br />
mecanismul de degradare a celulozei este mai complicat decât s-a presupus iniţial (Ljungdahl<br />
1989).<br />
153
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Figura 9. Aspect electronomicroscopic al celulelor Streptomyces sp.SD16 cultivate în mediu minimal ce conţine<br />
celuloză.<br />
In ceea ce priveşte determinismul genetic al producerii enzimelor celulozolitice, datele<br />
referitoare la streptomicete sunt destul de puţine şi incomplete. In general, clonarea şi<br />
secvenţierea unei gene structur<strong>ale</strong> pentru o enzimă este utilă nu numai pentru determinarea<br />
secvenţei de aminoacizi pe care proteina îi conţine ci şi pentru a obţine proteina în cantitate mai<br />
mare ca şi pentru studii de mutageneză care să determine rolul anumitor secvenţe de aminoacizi<br />
în funcţionarea enzimei. Clonarea prezintă interes mai <strong>ale</strong>s pentru celulaze deoarece prezenţa<br />
mai multor gene care codifică aceste enzime la majoritatea microorganismelor celulozolitice<br />
face dificilă atât obţinerea de mutante cât şi studiul rolului fiecărui component în parte.<br />
Până în prezent s-a reuşit izolarea, secvenţierea şi clonarea în diferite tulpini mutante de<br />
S.lividans (care nu produc celulaze) sau în E.coli a trei gene implicate în sinteza celulazelor la<br />
streptomicete: gena casA ce codifică CMC-aza I de la o tulpină alcalofilă de Streptomyces sp.<br />
(Nakai şi colab.,1988), gena celA ce codifică o endoglucanază de la S.lividans 66 (Theberge şi<br />
colab.,1992) şi gena celA1 ce codifică o endoglucanază de la S.halstedii (Fernandezabalos şi<br />
colab.,1992). De asemenea, Shareck şi colab.(1987) au realizat clonarea într-o tulpină mutantă de<br />
S.lividans (care nu producea celulaze) a unei secvenţe de ADN care a determinat nu numai<br />
restabilirea capacităţii de a degrada celuloza ci şi o sporire de peste 800 ori a activităţii<br />
enzimatice comparativ cu tulpina sălbatică. Interpretarea rezultatelor în acest caz rămâne dificilă<br />
deoarece genele clonate nu au fost analizate astfel că nu se poate preciza dacă secvenţele de<br />
ADN clonate conţin gene ce codifică celulaze (endoglucanaze) sau proteine reglatoare.<br />
Secvenţierea genelor casA şi celA a relevat prezenţa unei secvenţe de 14 pb repetate<br />
inversat, plasată înaintea regiunii ce codifică proteinele respective, secvenţă identificată şi la<br />
nivelul genelor celE2, celE4 şi celE5 de la Thermomonospora fusca (Wilson, 1992; Theberge şi<br />
colab., 1992). De asemenea, <strong>din</strong> examinarea secvenţelor de aminoacizi deduse <strong>din</strong> examinarea<br />
secvenţelor de nucleotide <strong>ale</strong> genelor casA şi celA şi compararea lor cu secvenţele de aminoacizi<br />
<strong>ale</strong> altor celulaze au fost evidenţiate elementele structur<strong>ale</strong> <strong>ale</strong> celulazelor respective, aşa cum au<br />
fost ele propuse de Gilkes şi colab.(1991): domeniile catalitice, domeniile de legare la celuloză,<br />
linkerii ce unesc asemenea domenii şi secvenţele repetate de aminoacizi. Spre exemplu,<br />
endoglucanaza produsă de S.lividans 66 (codificată de gena celA) este alcătuită <strong>din</strong> două domenii<br />
(domeniul catalitic şi domeniul de legare la celuloză) conectate de un linker scurt, extremitatea<br />
amino-terminală evidenţiind un grad înalt de omologie cu domeniul de legare la celuloză<br />
("cellulose-bin<strong>din</strong>g domain") al endoglucanazei CenA de la Cellulomonas fimi, iar regiunea <strong>din</strong><br />
154
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
mijlocul proteinei prezintă omologie extinsă cu celulaza E5 de la T.fusca şi alte endoglucanaze<br />
de Bacillus (Theberge şi colab., 1992).<br />
Conform propunerilor lui Henrissat şi colab.(1989) şi Gilkes şi colab.(1991) de grupare a<br />
celulazelor în familii pe baza secvenţelor de aminoacizi de la nivelul domeniilor catalitice<br />
conservate la mai multe microorganisme şi a analizei regiunilor ("clusteri") hidrofobe,<br />
endoglucanazele <strong>ale</strong> căror gene au fost clonate şi secvenţializate (casA şi celA) pot fi încadrate în<br />
familia A (celA), alături de endoglucanaze de la Clostridium thermocellum, B.subtilis, Bacillus<br />
sp., Erwinia chrosanthemi, Ruminococcus albus, Clostridium cellulolyticum etc, şi în familia B<br />
(casA) alături de endoglucanaze de la Cellulomonas fimi, Microbispora bispora şi o<br />
celobiohidrolază de la Trichoderma reesei.<br />
Reglarea activităţii celulazelor reprezintă un alt aspect al cercetărilor cu aceste enzime, în<br />
scopul stabilirii condiţiilor optime de producere şi acţiune a acestora. La fel ca şi în cazul<br />
mecanismului de degradare a substratelor celulozice, mecanismul de reglare a sintezei şi<br />
activităţii celulazelor este destul de neclar. O ipoteză generală susţine că microorganismele<br />
celulozolitice produc celulazele la un nivel bazal care este însă suficient pentru a asigura<br />
hidroliza celulozei insolubile, rezultând produşi de degradare care pot funcţiona ca inductori<br />
determinând sinteza unor cantităţi crescute de celulaze (Robson şi Chambliss, 1989). Ca şi alte<br />
enzime hidrolitice extracelulare şi celulazele se sintetizează ca răspuns la prezenţa inductorului,<br />
ele fiind represate de obicei de produşii finali de degradare. In cazul actinomicetelor există mai<br />
multe date referitoare la reglarea celulazelor la bacteriile <strong>din</strong> genul Thermomonospora. Astfel,<br />
sinteza celulazelor de către T.fusca este reglată atât prin inducere cât şi prin represie (Liu şi<br />
Wilson, 1987). Wilson (1992) a arătat că tulpina T.fusca YX cultivată pe celuloză a evidenţiat o<br />
activitate celulazică de 100 ori mai mare decât cea obţinută prin cultivarea în mediu cu glucoză<br />
ca sursă unică de carbon. Alţi autori (Fennington şi colab.,1984) au obţinut o tulpină mutantă de<br />
T.curvata capabilă de a rezista la acţiunea inhibitoare a glucozei. Liu şi Wilson (1988) au reuşit<br />
izolarea unei tulpini mutante de T.fusca YX care sintetiza în mod constitutiv celulaze, dar sinteza<br />
lor era supusă în continuare represiei produse de glucoză. Spre deosebire de bacteriile <strong>din</strong> genul<br />
Thermomonospora, la streptomicete există foarte puţine date referitoare la reglarea sintezei<br />
celulazelor iar cele care există sunt oarecum contradictorii. Astfel, Mac Kenzie şi colab.(1984)<br />
au arătat că activitatea celulazelor de la S.flavogriseus este inhibată de concentraţii mai mari de<br />
glucoză şi celobioză, în timp ce Ball şi Mc Carthy (1988) susţin că în cazul unor tulpini de<br />
Streptomyces izolate de ei glucoza şi xiloza nu exercită efect inhibitor asupra enzimelor implicate<br />
în degradarea deşeurilor celulozice de tipul paielor. In orice caz, cultivarea <strong>bacteriilor</strong> pe mediu<br />
ce conţine celuloză pulbere sau CMC are drept consecinţă inducerea sintezei doar a enzimelor<br />
celulazice în timp ce prin cultivarea <strong>bacteriilor</strong> pe medii mai complexe (cu paie, xilan sau tărâţe<br />
de grâu) are loc inducerea unei game mai largi de enzime hidrolitice: atât celulaze cât mai <strong>ale</strong>s<br />
hemicelulaze (Mac Kenzie şi col., 1987, Godden şi colab., 1989). Spre exemplu, Godden şi<br />
colab. (1989) utilizând pentru testări o tulpină de Streptomyces sp. a evidenţiat faptul că<br />
endoglucanazele şi β-glucozidazele sunt induse specific prin cultivarea pe mediu cu CMC ca<br />
sursă de carbon. Celobioza a evidenţiat o slabă acţiune de inducere a sintezei endoglucanazelor,<br />
dar induce β-glucozidaza în timp ce celotrioza şi celotetraoza induc slab endoglucanazele.<br />
Obţinerea unei activităţi celulazice specifice ridicate în filtratele de cultură rezultate prin<br />
cultivarea <strong>bacteriilor</strong> pe substratele celulozice natur<strong>ale</strong> (de exemplu paie) se datorează probabil<br />
unei cooperări <strong>din</strong>tre diferiţii inductori rezultaţi <strong>din</strong> acţiunea componentelor complexului<br />
lignocelulozic. Mai mult, inducerea sintezei celulazelor este inhibată de adăugarea a 50 µg/ml<br />
cloramfenicol ceea ce ar sugera că , cel puţin în cazul tulpinii analizate, inducerea enzimelor este<br />
mai degrabă o sinteză "de novo" (Godden şi colab. 1989).<br />
155
3.5. Hemicelulazele<br />
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Alături de celuloză şi lignină, hemicelulozele reprezintă componente de bază <strong>ale</strong> peretelui<br />
celular vegetal, degradarea lor în natură realizându-se destul de greoi, prin cooperarea unor<br />
sisteme enzimatice de origini foarte diferite. Intre microorganismele producătoare de<br />
hemicelulaze un loc important este ocupat de streptomicete datorită sintezei unei game foarte<br />
variate de asemenea enzime.<br />
Hemicelulozele sunt polizaharide care conţin diferite tipuri de resturi de zaharuri (xiloză,<br />
manoză, galactoză, arabinoză sau glucoză) ce alcătuiesc polimeri lineari sau ramificaţi.<br />
Clasificarea acestor substanţe se face în funcţie de conţinutul în zaharuri. Dintre acestea, β-1,4-<br />
D-xilanii reprezintă grupul major de hemiceluloze fiind alcătuiţi <strong>din</strong> resturi de D-xilopiranozil<br />
unite prin legături de tip β-1,4. In mulţi xilani resturile de D-xilopiranozil sunt întocmite de<br />
arabinozil, glucuronozil sau diferite grupări acetil, în funcţie de planta de origine. Un alt grup de<br />
hemiceluloze, mananii sînt constituiţi <strong>din</strong> resturi de D-manopiranozil unite tot prin legături de tip<br />
β-1,4. Si în cazul acestor polimeri unităţile specifice de D-manopiranozil pot fi înlocuite de Dgalactozil<br />
sau grupări acetat (Zimmermann, 1989). Hemicelulozele reprezintă un important<br />
component al peretelui celular vegetal, ele putând fi linkate la compuşi fenolici sau pot prezenta<br />
legături cu lignina.<br />
Sistemul enzimatic pentru degradarea hemicelulozelor constă în enzime care clivează<br />
legăturile <strong>din</strong> interiorul macromoleculei (endoenzime) şi în exoenzime care taie resturile de<br />
zaharuri de la extremităţile nereducătoare <strong>ale</strong> polimerului. Prezenţa unor substituenţi variaţi<br />
influenţează puternic hidroliza enzimatică. De aceea, pentru hidroliza completă a<br />
hemicelulozelor sunt necesare enzime care să taie în diferite puncte de ramificaţie. In sistemul<br />
xilanolitic, aceste enzime acţionează în cooperare cu xilanazele pentru hidroliza completă a<br />
xilanilor (Biely, 1985).<br />
Tinând cont de habitatul natural al streptomicetelor şi de prezenţa în acesta a unei mari<br />
cantităţi de materi<strong>ale</strong> celulozice şi lignocelulozice, bacteriile respective pot fi considerate ca o<br />
sursă potenţială de enzime hemicelulozolitice (Zimmermann şi colab., 1992).<br />
Sistemul enzimatic de degradare a xilanului de la diferite tulpini de Streptomyces a fost<br />
studiat în detaliu. La aceste bacterii au fost identificate mai multe tipuri de hemicelulaze:<br />
xilanaze, β-xilozidaze, α-L-arabinofuranozidaze, α-4-O-metil-glucuronidaze, acetil-xilan<br />
esteraze, ferulic şi cumaric esteraze, enzime ce degradează mananii (mananaze). Dintre acestea,<br />
1,4-β-D-xilanazele (EC 3.2.1.8.) au fost mai mult studiate, ele fiind detectate la numeroase<br />
tulpini de Streptomyces (Ball şi Mc Carthy, 1988). De asemenea, s-a evidenţiat faptul că aceeaşi<br />
tulpină poate produce mai multe xilanaze distincte. Spre exemplu, S.ostreogriseus şi S.exfoliatus<br />
produc câte 5 asemenea enzime în timp ce S.lividans produce o singură asemenea xilanază<br />
(Sreenath şi Joseph, 1982; Morosoli şi colab.,1986). Recent, Lumba şi Penninchx (1992) au<br />
caracterizat mai multe forme de β-xilanază izolate de la o tulpină de Streptomyces cultivată pe<br />
lignoceluloză. Interesant însă că în cazul acestei tulpini, formele de β-xilanază evidenţiate nu<br />
acţionează sinergic pentru hidrolizarea substratului ceea ce ar constitui o redundanţă a cărei<br />
semnificaţie nu este clară.<br />
Pentru purificarea şi caracterizarea xilanazelor de la diferite streptomicete (Tabelul 6) sau<br />
utilizat filtrate de cultură <strong>din</strong> care enzimele au fost precipitate cu sulfat de amoniu şi apoi<br />
supuse unor tratamente speci<strong>ale</strong>: ultrafiltrare, cromatrografie pe schimbători de ioni, gel filtrare şi<br />
focusare izoelectrică ("isoelectric focusing")(Sreenath şi Joseph, 1982; Morosoli şi colab., 1986;<br />
Mac Kenzie şi colab., 1987; Yasui şi colab., 1988).<br />
Cele mai multe <strong>din</strong>tre aceste enzime au pH între 5 şi 6,5 iar punctul lor izoelectric variază<br />
între 5,2 şi 10,3 (Zimmermann, 1989). Xilanazele determină hidroliza xilanilor prin ruperea<br />
legăturilor interne β-1,4, determinând eliberarea de xilotrioză, xilobioză sau xiloză (Yasui şi<br />
colab., 1988). Un alt tip de hemicelulaze produse de streptomicete, exo-β-1,4-xilozidazele (1,4-<br />
156
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
β-D xylan xylohydrolase, EC 3.2.1.37) hidrolizează xilanii prin atac la extremităţile nereducă<br />
toare <strong>ale</strong> lanţului de polimer.<br />
Tabelul 6. Proprietăţile unor xilanaze izolate <strong>din</strong> diferite tulpini de streptomicete.<br />
Tulpina pH optim t 0 optimă pI greutate<br />
moleculară (kDa)<br />
S.xylophagus 6,5 55-60 - -<br />
S.flavogriseus<br />
CD45-2<br />
6,5 50 - -<br />
S.exfoliatus 5,5 50 - -<br />
Streptomyces sp. 5,5 55 6,9 43<br />
KT23<br />
S.lividans 5,5-6,5 55-65 5,2 -<br />
Streptomyces sp.E86 5,5-6,2 55-60 7,3 40<br />
Eliberarea de resturi α-L-arabinoză <strong>din</strong> arabinoxilani, arabinani şi arabinogalactani se<br />
datorează acţiunii specifice a α-L-arabinofuranozidazelor, enzime evidenţiate la unele specii de<br />
Streptomyces (S.rubiginosus, S.purpurascens, S.massasporus) (Zimmermann, 1989). Alte<br />
enzime, α-4-O-metilglucironidaze, evidenţiate la S.flavogriseus şi S.olivochromogenes (Mac<br />
Kenzie şi colab., 1987) determină clivarea legăturilor α-1,2 <strong>din</strong>tre acidul glucuronic şi resturile<br />
de xiloză, acţionând sinergic cu xilanazele în procesul de hidroliză a xilanilor. Pe lângă aceste<br />
tipuri de hemicelulaze, unele tulpini de Streptomyces mai pot sintetiza şi alte enzime care<br />
hidrolizează alte specii de xilani. Acetil-xilan esterazele produse de S.olivochromogenes şi<br />
S.rubiginosus participă alături de xilanaze la hidroliza acetil-xilanilor în timp ce alte tulpini de<br />
Streptomyces (S.viridosporus) pot produce ferulic esteraze care eliberează acid ferulic <strong>din</strong><br />
arabinixilanii aflaţi în cantităţi mai mari în peretele celular al gramineelor (Mac Kenzie şi colab.,<br />
1987; Deobald şi Crawford, 1987).<br />
O categorie mai puţin studiată de hemicelulaze produse de streptomicete (ţinând cont de<br />
literatura de specialitate) este reprezentată de mananaze (1,4-β-D-manan mananohidrolaza, EC<br />
3.2.1.78.) evidenţiate la unele tulpini de S.olivochromogenes sau la alte specii.<br />
Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară şi implicit a celor de inginerie genetică în<br />
studiul hemicelulazelor de la streptomicete a permis izolarea şi caracterizarea genelor implicate<br />
în producerea unor asemenea enzime. Astfel, Mondou şi colab.,(1986) au raportat clonarea unei<br />
gene pentru endoxilanază de la S.lividans într-o tulpină mutantă neproducătoare. Clonele ce<br />
conţineau un fragment de ADN de 2kb au evidenţiat o creştere de peste 60 ori a producerii de<br />
xilanază comparativ cu tulpina sălbatică . De asemenea, Iwasaki şi colab.(1986) au realizat<br />
transferul genei pentru xilanază izolată de la o tulpină de Streptomyces în alte două tulpini de<br />
streptomicete - S. lividans şi S. kasugaensis - la care s-a observat o creştere a nivelului de sinteză<br />
a enzimei respective prin achiziţionarea unui fragment de ADN de 1,04kb. Alături de clonările<br />
de gene, fuziunile de protoplaşti constituie o metodă relativ simplă dar eficientă de a obţine<br />
tulpini recombinate genetic, capabile de o mai bună degradare a substratelor complexe. Astfel,<br />
Pettey şi Crwford (1984) au obţinut o îmbunătăţire a capacităţii de degradare a hemicelulozelor<br />
şi ligninei de către o tulpină recombinată obţinută prin fuziunea interspecifică de protoplaşti de la<br />
S.viridospurus T7A şi S.setonii 75 Vi2. Rezultate asemănătoare au for prezentate de Cornea şi<br />
colab.(1992) care, în urma fuziunii protoplaştilor de S.flavovirens SfG3 cu protoplaşti izolaţi de<br />
la Streptomyces sp.SD16 au obţinut mai multe tulpini recombinate genetic care prezentau o<br />
capacitate crescută de degradare a substratelor celulozice şi hemicelulozice comparativ cu<br />
tulpinile parent<strong>ale</strong> (Figura 10).<br />
157
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
Uneori, enzimele produse de diferite tulpini de streptomicete (preparate brute sau enzime<br />
purificate) au fost studiate în privinţa acţiunii lor asupra peretelui celulei veget<strong>ale</strong> sau al unor<br />
fungi. Astfel, Cornea şi colab.(1992) au evidenţiat faptul că prin utilizarea unui filtrat de cultură<br />
de Streptomyces sp.SD16 s-au putut obţine în condiţii experiment<strong>ale</strong> specifice protoplaşti<br />
vegetali de Nicotiana tabacum. Acest rezultat sugerează faptul că filtratul de cultură conţine o<br />
mare varietate de enzime asemănătoare celulazelor, hemicelulazelor dar şi alte enzime care<br />
cooperează în degradarea peretelui celular vegetal.<br />
Figura 10. Comparaţie între activitatea enzimatică (celulozolitică) a unor tulpini de streptomicete de tip sălbatic<br />
(P216, SD16 şi SFG3) şi a unor recombinanţi obţinuţi prin fuziune triparentală de protoplaşti.<br />
In ceea ce priveşte acţiunea pe peretele celular fungic, s-a dovedit că printre enzimele<br />
sintetizate de unele tulpini de Streptomyces se numără şi chitinazele, enzimele ce degradează<br />
componenta chitinică (dominantă) a peretelui celular fungic ducând la formarea protoplaştilor<br />
(Tagawa şi Okazaki, 1991). Okazaki şi Tagawa (1991) au izolat şi caracterizat o chitinază<br />
produsă de S.cinereoruber după cultivarea pe un mediu ce conţinea ca sursă de carbon pereţi<br />
celulari de Aspergillus niger. Enzima respectivă are o greutate moleculară de 19 kDa şi un pI 8,6<br />
iar pH optim se situează în domeniul acid (4,0-5,0) la 50 0 C.<br />
Beyer şi Diekeman (1984) au caracterizat enzime de tip laminarinază de la Streptomyces<br />
sp.ATCC11238 ca şi un complex de enzime ce degradează eficient chitina şi laminarina, fiind<br />
active asupra a peste 50 specii de ascomicete. Fracţionarea chitinazei prin gel filtrare şi<br />
cromatografie pe schimbători de ioni a condus la evidenţierea unei exo-chitinaze şi a unei β-Nacetil-glucozoaminidaze<br />
ce eliberează N-acetil glucozamina <strong>din</strong> crusta chitinoasă de crab (Beyer<br />
şi Diekman, 1985). In mod asemănător, Billich şi colab.(1988) au obţinut protoplaşti de<br />
Fusarium scirpi prin utilizarea unui preparat enzimatic de S.tsushimaensis.<br />
Datele prezentate în această lucrare reflectă particularităţile deosebite <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong><br />
<strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus şi importanţa pe care acestea o au atât <strong>din</strong> punct de vedere<br />
teoretic cât şi practic, fie pentru obţinerea unor compuşi cu aplicaţii in medicină, industria<br />
alimentară, a detergenţilor etc. fie în natură, ca verigi importante <strong>ale</strong> mecanismelor de degradare<br />
şi reciclare a unor resturi organice existente de obicei în sol. Cunoaşterea echipamentului lor<br />
enzimatic, al potenţialului lor de biosinteză ca şi al determinismului genetic al acestuia corelată<br />
cu tehnicile moderne de biologie moleculară şi cu cele de fuziuni celulare asigură, pe de o parte,<br />
o mai bună studiere a caracteristicilor acestor bacterii, inclusiv a taxonomiei grupului iar, pe de<br />
altă parte, poate conduce la obţinerea unor tulpini recombinate genetic capabile de a sintetiza sau<br />
degrada cu o eficienţă crescută anumiţi compuşi cu importanţă practică deosebită.<br />
158
Bibliografie selectivă<br />
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
1. Aretz, W., Koller, K. P., Riess, G., 1989, Proteolytic enzymes from recombinant<br />
Streptomyces lividans TK24, FEMS Microbiol. Letts., 65, p.31-36.<br />
2. Ball, A. S., Mc Carthy, A. J., 1988, Saccharification of straw by actinomycetes enzymes, J.<br />
Gen. Microbiol., 134, p.2139-2147.<br />
3. Baltz, R. H., Seno, E. T., 1988, Genetics of Streptomyces fradiae and tylosin biosynthesis,<br />
Ann. Rev. Microbiol., 42, p. 547-574.<br />
4. Bayer, E. A., Setter, E., Lamed, R., 1985, Organization and distribution of the cellulosome in<br />
Clostridium thermocellum, J. Bact., 163, p.552-559.<br />
5. Beguin, P., 1990, Molecular biology of cellulose degradation, Ann. Rev. Microbiol., 44,<br />
p. 219-248.<br />
6. Beyer, M., Diekman, H., 1985, The chitinase system of Streptomyces sp. ATCC 11238,<br />
Appl. Microbiol. Biotechnol., 23, p. 140-146<br />
7. Billich, A., Keller, U., Kleinkauf, H., Zocher, K., 1988, Production of protoplasts from<br />
Fusarium scirpi by lytic enzymes from Streptomyces tsusimaensis, Appl. Microbiol.<br />
Biotechnol., 28, p.442-444<br />
8. Binnie, C., Warren, M., Butler, M. J., 1989, Cloning and heterologous expression in<br />
S.lividans of S.rimosus genes involved in oxytetracycline biosynthesis, J. Bact., 171, p. 887-<br />
895<br />
9. Bond, K., Stutzenberger, F., 1989, A note on the localization of cellulosome formation in<br />
Thermomonospora curvata, J. Appl. Bacteriol., 67, p. 605-609.<br />
10. Bonner, M. A., Stutzenberger, F., 1988, Cell surface changes in Thermomonospora curvata<br />
during cellulase induction and repression, Letts. Appl. Microbiol., 6, p.59-63.<br />
11. Buttner, M. J., Smith, A. M., Bibb, M. J., 1988, At least three different RNA polymerase<br />
holoenzymes direct transcription of the agarase gene (dagA) of S.coelicolor A3(2), Cell, 52,<br />
p. 599-607.<br />
12. Chardon-Loriaux, I., Charpentier, M., Percheron, F., 1986, Isolation and characterization of a<br />
linear plasmid from Streptomyces rimosus, FEMS Microbiol.Letts., 35, p.151-155.<br />
13. Chater,K., Bruton,C.J., 1985, Resistance, regulatory and production genes for the antibiotic<br />
methylenomycin are clustered, EMBO.J., 4, p.1893-1900.<br />
14. Cornea, 1996, Obţinerea unor bacterii cu importanţă biotehnologică prin fuziunea şi<br />
transformarea genetică a protoplaştilor, Teză de doctorat, <strong>Universitatea</strong> Bucureşti.<br />
15. Cornea, C. P., Cogălniceanu, G., Brezeanu, A., Vatafu, I., Savu, L., Popescu, I., Pop, A.,<br />
1992, Obţinerea protoplaştilor de tutun prin utilizarea unui preparat enzimatic brut de<br />
Streptomyces sp. SD16, St. Cercet. Biol., 44, p. 85-88.<br />
16. Cornea, C. P., Vatafu, I., Pop, A., Brezeanu, A., Savu, L., Dobrotă, S., 1993, Interspecific<br />
protoplast fusion in Streptomyces, Rev. Roum. Biol., 38, p. 49-53.<br />
17. Cornea, C. P., Vatafu, I., Savu, L., 1994, Plasmid transfer by protoplast fusion, Microbiol.<br />
Ind. Biotehnol., 8, p. 145-148.<br />
18. Coughlan, B. P., 1988, Staining techniques for the detection of the individual components of<br />
cellulolytic enzyme system, Methods in Enzymology, 160, p. 135-145.<br />
19. Cundliff, E., 1989, How antibiotic-producing organims avoid suicide, Ann. Rev. Microbiol.,<br />
43, p. 207-233.<br />
20. Damude, H. G., Gilkes, N. R., Kilburn, D. G., Miller, R. C., Warren, R. A., 1993,<br />
Endoglucanase Cas A from alkalophilic Streptomyces strain KSM-9 is a tipical member of<br />
family B of â-1,4-endoglucanase, Gene, 123, p. 105-107.<br />
21. Davies, J., 1990, What are antibiotics? Archaic functions for modern activities, Molec.<br />
Microbiol. , 4 (8), p. 1227-1232.<br />
159
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
22. Deobald, L. A., Crawford, D. L., 1987, Activities of cellulase and other extracellular<br />
enzymes during lignin solubilization by Streptomyces viridosporus, Appl. Microbiol.<br />
Biotechnol., 28, p. 158-163.<br />
23. Dimcev, A., 1988, Protoplast from antibiotic-producing actinomycetes. Application in the<br />
biotechnology, Biotechnol. Bioeng., 4, p. 12-19.<br />
24. Doyle, R. J., 1994, Introduction to lectins and their interactions with microorganisms, in<br />
Lectin-Microorganism Interaction, Eds. R.J.Doyle si M.Slifkin, Marcel Dekker Inc., p. 1-65.<br />
25. Duitman, E., Hamoen, L., Rembold, M., Vater, L., 1999, The mycosubtilin synthetase of<br />
Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an<br />
amino transferase, and a fatty acid synthase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 96 (23), 13294-<br />
13299.<br />
26. Felix, C. R., Ljungdahl, L. G., 1993, The cellulosome: the exocellular organelle of<br />
Clostridium, Ann. Rev. Microbiol., 47, p. 791-819.<br />
27. Fernandez-Abalos, J. M., Sanchez, P., Coll, P. M., Villanueva, J. R., Perez, P., Santamaria,<br />
R. I., 1992, Cloning and nucleotide sequence of celA1, an endo-β-1,4-glucanase-enco<strong>din</strong>g<br />
gene from Streptomyces halstedii JM8, J. Bacteriol., 174, p. 6338-6376.<br />
28. Ghangas, G. S., Wilson, D. B., 1988, Cloning of the Thermomonospora fusca endoglucanase<br />
E2 gene in Streptomyceslividans: affinity purification and functional domains of the cloned<br />
gene product, Appl. Envir. Microbiol., 54, p. 2521-2526.<br />
29. Gilbert, H. J., Hazlewood, G. P., 1993, Bacterial cellulases and xylanases, J. Gen. Microbiol.,<br />
139, p. 187-194.<br />
30. Godden, B., Legon, T., Helvenstein, P., Penninckx, M., 1989, Regulation and production of<br />
hemicellulolytic and cellulolytic enzymes by a Streptomyces sp. growing on lignocellulose, J.<br />
Gen. Microbiol., 135, p. 285-292.<br />
31. Gokh<strong>ale</strong>, D. V., Deobagkar, D. N., 1989, Differential expression of xylanase and<br />
endoglucanase in the hybrid derived from intergeneric protoplast fusion between<br />
Cellulomonas sp. and Bacillus subtilis, Appl. Envir. Microbiol., 55, p. 2675-2680.<br />
32. Gormley, E. P., Cantwell, B. A., Barker, P. J., Mc Connell, D. J., 1988, Secretion and<br />
processing of the Bacillus subtilis endo-â-1,3-14-glucanase in Escherichia coli, Molec.<br />
Microbiol, 2, p. 813-819.<br />
33. Horikoshi, K., Nakao, M., Kurono, Y., Sashihara, N., 1984, Cellulases of an alkalophilic<br />
Bacillus strain isolated from soil, Can. J. Microbiol., 30, p. 774-779.<br />
34. Imanaka, T., 1986, Application of recombinant DNA technology to the production of useful<br />
biomaterials, Adv. Biochem. Eng., 33, p. 1-27.<br />
35. Ishaque, M., Kluepfel, D., 1980, Cellulase complex of a mesophilic Streptomyces strain,<br />
Can. J. Microbiol., 26, p. 183 – 189.<br />
36. Kakoniova, D., Labudova, I, Liskova, D., 1987, Callus culture as substrate for the production<br />
of specific cell wall degra<strong>din</strong>d enzymes for derived protoplast isolation, Biotechnol. Letts., 9,<br />
p. 721-724.<br />
37. Kinashi, H., 1988, Giant linear plasmids in Streptomyces and antibiotic production, in<br />
Biology of Actinomycetes '88, Japan Scientific Societies Press, p. 117-122.<br />
38. Kinashi, H., 1989, Giant linear plasmids in various methylenomycin-producing strains of<br />
Streptomyces species, in Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Ed.<br />
C. L. Hershberger, S. W. Queener, G. Hegeman, ASM, p. 141-146.<br />
39. Kirby, R., Hopwood, D. A., 1977, Genetic determination of methylenomycin biosynthesis<br />
by the SCP1 plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2), J. Gen. Microbiol., 98, p. 239-252.<br />
40. Kluepfel, D., Shareck, F., Mondou, F., Morosoli, R., 1986, Characterization of cellulase and<br />
xylanase activities of Streptomyces lividans, Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, p. 230-234.<br />
41. Lamed, R., Naimark, J., Morgenstern, E., Bayer, E. A., 1987, Specialized cell surface<br />
structures in cellulolytic bacteria, J. Bacteriol., 169, p. 3792-3800.<br />
160
<strong>Aplicaţii</strong> <strong>biotehnologice</strong> <strong>ale</strong> <strong>bacteriilor</strong> <strong>din</strong> <strong>genurile</strong> Streptomyces şi Bacillus<br />
42. Mansouri, K., Pissowotzki, K., Distler, J., Ebert, A., Piepersberg, W., 1989, Genetics of<br />
streptomycin production, în Genetics and molecular biology of industrial microorganisms,<br />
Ed. Hershberger, C. L., Queener, S. W., Hegeman, G., ASM, p. 61-67.<br />
43. Martin, J. F., 1989, Molecular mechanisms for the control by phosphate of the biosynthesis<br />
of antibiotics and other secondary metabolites, în Regulation of secondary metabolism in<br />
Actinomycetes, Ed. S. Shapiro, Boca Raton, CRC, p. 230-251.<br />
44. Martin, J. F., Liras, P., 1989, Organization and expression of genes involved in the<br />
biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites, Ann. Rev. Microbiol., 43, p. 173-<br />
206.<br />
45. Mc Carthy, A. J., Williams, S. T., 1992, Actinomycetes as agents of biodegradation in the<br />
environment - a review, Gene, 115, p. 189-192.<br />
46. Nakano, M. N., Butsuya, I., Ogawara, H., 1989, Expression of the kanamycin resistance gene<br />
in a kanamycin-producing strain of S. kanamyceticus, J. Antib., 42, p. 423-430.<br />
47. Nakano, M. N., Mashiko, H., Ogawara, H., 1984, Cloning of the kanamycin resistance gene<br />
from a kanamycin producing Streptomyces species, J. Bact., 157, p. 79-83.<br />
48. Okanishi, M., Katagiri, K., Furumai, T., Takeda, K., Kawagichi, K., Saitoh, M., Nabeshima,<br />
S., 1983, Basic techniques for DNA cloning and conditions required for streptomycetes as<br />
host, J. Antib., 36, p. 99-108.<br />
49. Okuda, T., Ito, Y., 1982, Biosynthesis and mutasynthesis of aminoglycoside antibiotics, în<br />
Aminoglycoside antibiotics, Ed. Umezawa, H., Hooper, I. R., Springer Verlag., p. 111-203.<br />
50. Omich, P. K., 1988, Streptomyces cloning: useful recombinant DNA systems and a<br />
summation of cloned genes, Antim. Ag. Chemoth., 32, p. 1465-1471.<br />
51. Peberdy, J. F., Illing, G. T., 1985, Genetic manipulation of antibiotic producer strains, in The<br />
Scientific Basis of Antimicrobial Chemotherapy, Ed. D. Greenwood, F. O' Grady, p.283-322.<br />
52. Pettey, T. M., Crawford, D. L., 1984, Enhancement of lignin degradation in Streptomyces<br />
spp. by protoplast fusion, Appl. Envir. Microbiol., 47, p. 439-440.<br />
53. Pokorny, M., Vit<strong>ale</strong>, L., 1980, Enzymes as by-products during biosynthesis of antibiotics, în<br />
Industrial and Clinical Enzymology, Ed. Vit<strong>ale</strong>, L., Simeon, V., Pergamon Press Oxford, p.<br />
13-25.<br />
54. Pongs, O., 1979, Cloramphenicol, în Antibiotics, Ed.Hahn, F. E., Springer Verlag, 5,<br />
p. 26-42.<br />
55. Ramachandra, M., Crawford, D. L., Pometta, A. L., 1987, Extracellular enzyme activities<br />
during lignocellulose degradation by Streptomyces spp.: a comparative study of wild-type<br />
and genetically manipulated strains, Appl. Envir. Microbiol., 53, p. 2754-2760.<br />
56. Robson, J. M., Chambliss, G. H., 1989, Cellulases of bacterial origin, Enzyme Microbiol.<br />
Technol., 11, p. 626-644.<br />
57. Schlochtermeier, A., Miemeier, F., Schrempf, H., 1992, Biochemical and electron<br />
microscopic studies of the Streptomyces reticuli cellulase (avicelase) in its myceliumassociated<br />
and extracellular forms, Appl. Environ. Microbiol., 58, p. 3240-3248.<br />
58. Schlochtermeier, A., Walter, S., Schroder, J., Moorman, M., Schrempf, H., 1992, The gene<br />
enco<strong>din</strong>g the cellulase (avicelase) Cel1 from Streptomyces reticuli and analysis of protein<br />
domains, Molec. Microbiol., 6, p. 3611-362.<br />
59. Srinivasan, M. C., Laxman, R. S., Deshpande, M. V., 1991, Physiology and nutritional<br />
aspects of actinomycetes: an overview, World J. Microbiol. Biotechnol., 7, p. 171-184.<br />
60. Tiraby, G., Bejar, S., Reynes, J. P., Sicard, P. J., Farber, G. K., Ringe, D., Petsko, G. A.,<br />
1989, Genetic, enzymatic and crystallographic studies of the glucose isomerase of two<br />
Streptomyces species, în Genetics and molecular biology of industrial microorganisms, Ed.<br />
Hershberger, C. L., Queener, S. W., Hegeman, G., ASM, p. 119-126.<br />
61. Vining, L. C., 1990, Functions of secondary metabolites, Ann. Rev. Microbiol., 44, p. 395-<br />
427<br />
161
Rodica Mateescu, Călina Petruţa Cornea, Irina Grebenişan, Gh. Câmpeanu<br />
62. Vining, L. C., 1992, Secondary metabolism, inventive evolution and biochemical diversity: a<br />
review, Gene, 115, p. 135-140.<br />
63. Wachinger, G., Bronnenmeier, K., Staudenbauer, W. L., Schrempf, H., 1989, Identification<br />
of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli, Appl. Environ. Microbiol., 55,<br />
p. 2653-2657.<br />
64. Wilson, D. B., 1992, Biochemistry and genetics of actinomycete cellulase, Crit.Rev.<br />
Biotechnol., 12, p. 45-63.<br />
65. Winkelmann G., Allgaier H., Lupp R., Jung G., Iturin AL- a new long chain iturin a<br />
possessing an unusual high content of C16-β-amino acids, J Antibiot (Tokyo) 1987 Apr.,<br />
40(4): 437-42.<br />
66. Wood, T. M., Bhat, K. M., 1988, Methods for measuring cellulase activities, Methods<br />
Enzymol., 160, p. 87-112.<br />
67. Zarnea, G., 1984, Tratat de microbiologie generală, 1, Ed. Academiei.<br />
68. Zimmermann, W., 1989, Hemicellulolytic enzyme systems from actinomycetes, în Enzyme<br />
systems for lignocellulose degradation, Ed. Coughlan, M. P., Elsevier Applied Science, p.<br />
167-181.<br />
69. Zimmermann, W., Davis, B., Winter, B., Shou,W., 1992, Actinomycetes and their enzymes<br />
for applications in the pulp and paper industry, în Biotechnology in Pulp and Paper Industry,<br />
Ed. Kuwahara, M., Shimada, M., Uni Publishers, Co. LdT, p. 145-150.<br />
162