Descrierea proiectului: Receptorii orfani cuplati cu proteinele G ...

Descrierea proiectului:
Receptorii orfani cuplati cu proteinele G apartin superfamiliei de receptori cu
sapte domenii transmembranare. Receptorii orfani au fost recent clonati si inca nu au
liganzi sau functii bine cunoscute. Tinand cont de faptul ca aproape 40% din
subtantele prezente in farmacii actioneaza prin intermediul receptorilor cuplati cu
proteine G (GPCR) receptorii orfani reprezinta un imens potential pentru obtinerea
unor noi compusi farmacologici si aparitia unor noi metode terapeutice. In prezent,
dupa unii autori, exista sute de astfel de receptori. Recent, apelin si urotensin II au fost
identificati ca fiind liganzii specifici ai receptoriilor APJ si respectiv - GPR14. “Deorfanizarea”
acestor receptori a dat startul unei adevarate competitii in precizarea
implicatiilor functionale si cailor de semnalizare intracelulara ale acestor receptori.
Tema prezenta se inscrie in domeniul biologei celulare si moleculare avand
drept tinta identificarea atat a cailor de semnalizare intracelulara cat si a
interactiunilor intracelulare ce mediaza efectele angiotensinelor, AP13 si U–II la
nivelul musculaturii netede vasculare si bronsice. Informatiile preconizate a fi
obtinute sunt utile dezvoltarii de noi tehnici de diagnostic sau terapeutice. Cresterea
reactivitatii si hipertrofia muschiului neted au fost evidentiate atat la nivelul cailor
aeriene in hipertensiunea pulmonara cat si la nivelul vaselor pulmonare in bolile
pulmonare obstructive ceea ce sugereaza existenta unor modificari concomitente ale
vaselor pulmonare si bronhiilor.
Numeroase studii clinice si experimentale au indicat NO drept o molecula
cheie implicata in modificarile aparute la nivelul vaselor pulmonare si cailor aeriene
in circumstantele mentionate. De altfel, unii autori considera ca masurarea
concentratiei NO in aerul expirat sau in aerul alveolar furnizeaza informatii
importante pentru conducerea tratamentului unor afectiuni pulmonare cum ar fi
astmul bronsic. Studii recente au aratat ca atat AP13 cat si U-II pot stimula sinteza de
NO la nivelul musculaturii netede modificand, functie de circumstantele
experimentale, tonusul bazal sau efectele contractile ale altor principii bioactive intre
care angiotensinele ocupa un loc central. Ultimii ani au stramutat centrul de greutate
al studiilor asupra SRA din circulatie in tesuturi. Identificarea tuturor componentelor
SRA la nivel tisular a indicat existenta SRA locale ce pot functina independent de
SRA sistemic. De importanta deosebita este implicarea SRA local-pulmonar atat in
modularea tonusului musculaturii netede vasculare sau bronsice cat si in procesele de
remodelare pulmonara. Interactiunile dintre SRA pulmonar si sistemele peptidergice
ligand – receptor orfan, ce implica modificarea sintezei de NO, cu rasunet atat asupra
tonusului cat a hipertrofiei musculaturii netede din vasele pulmonare si caile aeriene
reprezinta provocari ale cercetarii de varf actuale.
Receptorii cuplati cu proteine G(GPCRs) s-au dovedit a fi o tinta terapeutica
pentru o larga clasa de afectiuni. Descifrarea genomului uman a permis identificarea
mai multor proteine ce pot indeplini rolul receptorilor cuplati cu proteine G si care pot
oferi o alternativa pentru medicatia actuala sau solutii pentru noi terapii. Receptorii
cuplati cu proteine G a caror functii si liganzi nu au fost inca identificate au fost
denumiti receptori orfani.
Ma voi referi la doi astfel de receptori orfani carora le-a fost identificat recent
ligandul specific: APJ si GPCR14. Ligandul specific al receptorului APJ a fost
identificat recent si a fost denumit apelin. In tesutul de sobolan atat receptorul APJ cat
si ARNm al apelinului s-au gasit in plaman, creier, inima, muschiul scheletic, rinichi,
ficat (Katugampola SD si colab., 2001). Mai mult studiile de imunohistochimie si
hibridizare in situ au aratat ca la nivel pulmonar genele ce codeaza receptorul APJ

sunt intens exprimate (Ocarrol si colab., 2000). La sobolani cea mai puternica
expresie a ARNm a receptorului APJ a fost gasita la nivel pulmonar sugerand un rol
important al apelinului si receptorului APJ in activitatea sistemului respirator (Hosoya
M si colab., 2000). Pe de alta parte, studii recente au aratat ca nivelul plasmatic al AP
este redus la pacientii cu boli pulmonare parenchimatoase cronice (Goetze JP si colab.,
2006). Cu toate acestea, nu se cunoaste nimic despre rolul sistemului AP – APJ la
nivel pulmonar.
Recent U-II uman (hU-II) a fost identificat ca ligand selectiv al unui nou
receptor cuplat cu proteinele G omolog (75%) receptorului “orfan” SENR sau GPR14
de la sobolan (Maguire JJ si Davenport AP, 2002). La om, receptorul pentru U-II si
ARN-ul mesager specific sunt bine exprimati la nivelul inimii si vaselor, creierului,
glandelor endocrine, plamanului, muschilor (Ames RS si colab, 1999, Li Q si colab,
1999, Maguire JJ si colab, 2000). Prin northen blot si reverse transcription polymerase
chain reaction (RT-PCR) a fost pusa in evidenta prezenta ARN- ului mesager al
receptorului U II la nivelul traheei, bronhiilor si parenchimului pulmonar al pisicii
(Behm DJ si colab., 2005). Aceasta distributie a GPR14 sugereaza implicarea acestuia
in multe procese fiziologice. U-II are efecte puternice vasoconstrictoare asupra
arterelor mari coronare, pulmonare si carotide izolate de la diverse specii cum ar fi
sobolani, caini, porci si maimute (Maclean MR si colab., 2000, Douglas SA si colab.,
2003). Se presupune ca U-II influenteaza functia pulmonara prin modularea tonusului
muschiului neted al bronhiilor (Maguire JJ si Davenport AP, 2002; Behm DJ si colab.,
2005). S-a aratat ca la primate hU-II prezinta efecte contractile la nivelul muschilor
netezi ai bronhiilor si vaselor pulmonare de la primate. Contractia maximala
determinata de U-II este din ce in ce mai puternica pe masura ce diametrul cailor
aeriene este mai mic. Astfel, efectele contractile ale U II variaza de la 9% din
contractia produsa de 10 microM carbacol la nivelul traheei la 41% la nivelul
bronhiilor mici. hU II contracta puternic si cu o eficacitate similara atat arterele
pulmonare cat si ramurile acestora. hU II contracta inele de vena pulmonara cu o
eficacitate din ce in ce mai redusa pe masura ce ne departam de atriul stang (Hay DW
si colab., 2000). Recent, Chen YH si colab (2004) au aratat ca, la nivelul celulelor
musculare netede de sobolan, U-II este un mitogen puternic. Totusi, sunt putine studii
despre rolul U-II in remodelarea pulmonara sau despre interactunea dintre U-II si alti
factori ce participa la reglarea functiei pulmonare.
Studiile noastre au aratat ca atat AP13 cat si U-II pot stimula sinteza de NO la
nivelul bronhiilor izolate de sobolan. NO este o molecula cheie implicata atat in
reglarea tonusului musculaturii netede a vaselor pulmonare si a cailor aeriene cat si in
procesele de remodelare pulmonara. De asemenea, NO din aerul expirat este un
biomarker al inflamatiei cailor aeriene avand si un efect protector anti-inflamator la
acest nivel (Larsson AK si colab., 2005). Modificarile vaselor pulmonare si cailor
aeriene au loc simultan. Astfel, s-a evidentiat cresterea reactivitatii si hipertrofia
muschiului neted atat la nivelul cailor aeriene in hipertensiunea pulmonara (Schindler
MB si colab., 2006) cat si la nivelul vaselor pulmonare la subiectii cu hiperreactivitate
bronsica (Tormanen KR si colab., 2005).
Un rol vital in procesele fiziologice si patologice care au loc la nivel pulmonar
revine sistemului renina angiotensina (SRA). SRA sistemic sau local, actionand direct
sau prin modificarea efectelor altor peptide biologic active, poate determina
modificarea activitatii pulmonare prin cresterea permeabilitatii si tonusului vaselor
pulmonare, cresterea activitatii fibroblastelor, reducerea duratei de viata a celulelor
epiteliului alveolar, modificarea tonusului muschiului neted al cailor aeriene. Se stie
ca angiotensina II (Ang II) exogena are efecte bronhoconstrictoare atat directe cat si

indirecte amplificand bronhoconstrictia indusa de alti agenti contractanti (Brown AJ si
Nally JE., 2001). Noi am aratat ca si Ang II sintetizata local are efecte contractile
subliniind implicarea SRA pulmonar in reglarea tonusului cailor aeriene (Dumitriu IL
si colab., 2006). Exista date si despre caile intracelulare utilizate de Ang II in
producerea efectelor contractile. La nivelul inelelor de bronhie umana Ang II induce o
contractie bifazica a carei faza sustinuta este aproape inhibata complet de (+)-(R)trans-4-(1-aminoetil)-N-(4-piridil)
ciclohexan carboxamida Y-27632 (inhibitor de
Rho-kinaza) sugerand implicarea unor cai enzimatice dependente de Rho-kinaza.
(Grosens R si colab., 2004). SRA este activat in criza severa de astm bronsic si se
considera ca Ang II este un posibil mediator al astmului bronsic. Myou S (2000)
demonstreaza clar implicarea receptorilor AT1 in hiperreactivitatea bronsica a
pacientilor cu astm bronsic la testul cu metacolina. Administrarea de losartan
(antagonist nespecific al receptorilor AT1) reduce hiperreactivitatea bronsica la
metacolina a pacientilor astmatici. Administrarea de candesartan cilexetil (antagonist
specific al receptorilor AT1) are aceleasi efecte ca si administrarea de losartan.
Autorii au concluzionat ca receptorii AT1 sunt implicati in hiperreacvitatea bronsica
la pacientii asmatici (Myou S si colab., 2002). Antagonistii receptorilor AT1 nu
produc tuse la pacientii cu hipertensiune arteriala necomplicata si BPOC asa cum se
intampla in cazul inhibitorilor enzimei de conversie a Ang I care pot produce tuse si
exacerba sau chiar induce criza de astm bronsic (Cazzola M si colab., 2002). La nivel
pulmonar Ang II poate juca si rolul de factor de crestere. Valsartanul, antagonist al
receptorului Ang II poate reduce atat sinteza de colagen III si V cat si expresia ARNm
TGF-beta1 si a proteinelor din peretii cailor aeriene la sobolanii sensibilizati.
Valsartanul reduce remodelarea cailor aeriene si ar putea fi utilizat in terapia astmului
bronsic (Du YC, 2004). Deoarece factorii de crestere sunt asociati cu unele stari
patologice cum ar fi astmul bronsic, inhibarea Rho-kinazei ar putea avea un efect
benefic (Gosens R si colab., 2004). Cresterea expresiei factorilor de transcriptie
indusa de Ang II poate regla expresia genelor autocrine cum ar fi TGF-beta1. Sinteza
de ADN stimulata de Ang II in epiteliocite si in celulele musculare netede din trahee
si bronhii intensifica peroxidarea lipidelor si activeaza sistemul antioxidant defensiv
din plamani la sobolanii noi nascuti (Lebedko OA si colab., 2000).
Vom studia atat influenta AP13/U-II asupra contractiei induse de dozele
cumulative de acetilcolina cat si interactiunile cu Ang II la nivelul bronhiilor si
vaselor pulmonare izolate de sobolan normal, hipersensiblizat la ovalbumina si cu
hipertensiune pulmonara indusa cu monocrotalin. Precizam ca ambele modele
experimentale au fost implementate si sunt bine cunoscute de membrii echipei de
cercetare. De asemenea vor fi urmarite in dinamica atat procesele inflamatorii si de
remodelare tisulara cat si distributia receptorilor APJ/GPR14 la nivel pulmonar in
absenta sau prezenta blocantilor SRA. Rezultatele obtinute in vitro vor fi intregite de
studiile in vivo - prin metode neinvazive – a reactivitatii bronsice la toate modelele
experimentale studiate atat in absenta cat si dup administrarea inhalatorie a AP sau
UII.
BIBLIOGRAFIE
1. Ames RS, Sarau HM, Chambers JK, Willette RN, Aiyar NV, Romanic AM,
Louden CS, Foley JJ, Sauermelch CF, Coatney RW, Ao Z, Disa J, Holmes SD, Stadel
JM, Martin JD, Liu WS, Glover GI, Wilson S, McNulty DE, Ellis CE, Elshourbagy
NA, Shabon U, Trill JJ, Hay DW, Ohlstein EH, Bergsma DJ, Douglas SA. Human
urotensin-II is a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14.

Nature. 1999 Sep 16;401(6750):282-6. Erratum in: Nature 1999 Dec 23-
30;402(6764):898.
2. Behm DJ, Ao Z, Camarda V, Aiyar NV, Johns DG, Douglas SA. Inhibitory
effects of putative peptidic urotensin-II receptor antagonists on urotensin-II-induced
contraction of cat isolated respiratory smooth muscle. Eur J Pharmacol. 2005 Jun
15;516(3):276-81.
3. Brown AJ, Nally JE. Hydrocortisone abolishes the angiotensin II-mediated
potentiation of endothelin-1 in bovine bronchi. Clin Sci (Lond). 2001 Jan;100(1):19-
23.
4. Cazzola M, Noschese P, D'Amato G, Matera MG.The pharmacologic
treatment of uncomplicated arterial hypertension in patients with airway
dysfunction.Chest. 2002 Jan;121(1):230-41.
5. Chen YH, Zhao MW, Yao WZ, Pang YZ, Tang CS. The signal transduction
pathway in the proliferation of airway smooth muscle cells induced by urotensin II.
Chin Med J (Engl). 2004 Jan;117(1):37-41.
6. Douglas SA. Human urotensin-II as a novel cardiovascular target: 'heart' of the
matter or simply a fishy 'tail'? Curr Opin Pharmacol. 2003 Apr;3(2):159-67. Review.
7. Du YC, Xu JY, Zhang SJ. Effects of angiotensin II receptor antagonist on
expression of collagen III, collagen V, and transforming growth factor beta1 in the
airway walls of sensitized rats. Chin Med J (Engl). 2004 Jun;117(6):908-12.
8. Dumitriu I.L., Gurzu B., Slatineanu S.M., Costuleanu M., Petrescu G.
Interactions between angiotensin i and acethylcholine on rat left main bronchial rings.
Rev Med Chi.r Soc Med Nat Iasi 2006: 122 (1): .
9. Gosens R, Schaafsma D, Grootte Bromhaar MM, Vrugt B, Zaagsma J, Meurs
H, Nelemans SA. Growth factor-induced contraction of human bronchial smooth
muscle is Rho-kinase-dependent. Eur J Pharmacol. 2004 Jun 21;494(1):73-6.
10. Goetze JP, Rehfeld JF, Carlsen J, Videbaek R, Andersen CB, Boesgaard S,
Friis-Hansen L. Apelin: a new plasma marker of cardiopulmonary disease. Regul.
Pept. 2006 Jan 15;133(1-3):134-8.
11. Hay DW, Luttmann MA, Douglas SA. Human urotensin-II is a potent
spasmogen of primate airway smooth muscle. Br J Pharmacol. 2000 Sep;131(1):10-2.
12. Hosoya M, Kawamata Y, Fukusumi S, Fujii R, Habata Y, Hinuma S, Kitada C,
Honda S, Kurokawa T, Onda H, Nishimura O, Fujino M. Molecular and functional
characteristics of APJ. Tissue distribution of mRNA and interaction with the
endogenous ligand apelin. J Biol Chem. 2000 Jul 14;275(28):21061-7.
13. Katugampola SD, Maguire JJ, Matthewson SR, Davenport AP. [(125)I]-
(Pyr(1))Apelin-13 is a novel radioligand for localizing the APJ orphan receptor in
human and rat tissues with evidence for a vasoconstrictor role in man.Br J Pharmacol.
2001 Mar;132(6):1255-60.
14. Kishi K, Jin D, Takai S, Muramatsu M, Katayama H, Tamai H, Miyazaki M.
Role of chymase-dependent angiotensin II formation in monocrotaline-induced
pulmonary hypertensive rats. Pediatr Res. 2006 Jul;60(1):77-82.
15. Larsson AK, Back M, Hjoberg J, Dahlen SE. Inhibition of nitric-oxide
synthase enhances antigen-induced contractions and increases release of cysteinylleukotrienes
in guinea pig lung parenchyma: nitric oxide as a protective factor. J
Pharmacol Exp Ther. 2005 Oct;315(1):458-65.
16. Lebed'ko OA, Timoshin SS, Bespalova NN. Effects of angiotensin II on
proliferative activity of epitheliocytes and smooth muscle cells of the
tracheobronchial system in newborn albino rats. Bull Exp Biol Med. 2000
Jul;130(7):636-8.

17. Lefebvre F, Prefontaine A, Calderone A, Caron A, Jasmin JF, Villeneuve L,
Dupuis J. Modification of the pulmonary renin-angiotensin system and lung structural
remodelling in congestive heart failure. Clin Sci (Lond). 2006 Sep;111(3):217-24.
18. Liu Q, Pong SS, Zeng Z, Zhang Q, Howard AD, Williams DL Jr, Davidoff M,
Wang R, Austin CP, McDonald TP, Bai C, George SR, Evans JF, Caskey CT.
Identification of urotensin II as the endogenous ligand for the orphan G-proteincoupled
receptor GPR14. Biochem Biophys Res Commun. 1999 Dec 9;266(1):174-8.
19. MacLean MR, Alexander D, Stirrat A, Gallagher M, Douglas SA, Ohlstein EH,
Morecroft I, Polland K. Contractile responses to human urotensin-II in rat and human
pulmonary arteries: effect of endothelial factors and chronic hypoxia in the rat. Br J
Pharmacol. 2000 May;130(2):201-4.
20. Maguire JJ, Davenport AP. Is urotensin-II the new endothelin? Br J Pharmacol.
2002 Nov;137(5):579-88. Review.
21. Maguire JJ, Kuc RE, Davenport AP. Orphan-receptor ligand human urotensin
II: receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses
with endothelin-1. Br J Pharmacol. 2000 Oct;131(3):441-6.
22. Myou S, Fujimura M, Kamio Y, Ishiura Y, Kurashima K, Tachibana H, Hirose
T, Hashimoto T. Effect of losartan, a type 1 angiotensin II receptor antagonist, on
bronchial hyperresponsiveness to methacholine in patients with bronchial asthma. Am
J Respir Crit Care Med. 2000 Jul;162(1):40-4
23. Myou S, Fujimura M, Kamio Y, Kita T, Watanabe K, Ishiura Y, Hashimoto T,
Nakao S. Effect of candesartan, a type 1 angiotensin II receptor antagonist, on
bronchial hyper-responsiveness to methacholine in patients with bronchial asthma. Br
J Clin Pharmacol. 2002 Dec;54(6):622-6.
24. O'Carroll AM, Selby TL, Palkovits M, Lolait SJ. Distribution of mRNA
encoding B78/apj, the rat homologue of the human APJ receptor, and its endogenous
ligand apelin in brain and peripheral tissues. Biochim Biophys Acta. 2000 Jun
21;1492(1):72-80.
25. Schindler MB, Hislop AA, Haworth SG. Porcine pulmonary artery and
bronchial responses to endothelin-1 and norepinephrine on recovery from hypoxic
pulmonary hypertension. Pediatr Res. 2006 Jul;60(1):71-6.
26. Tormanen KR, Uller L, Persson CG, Erjefalt JS. Allergen exposure of mouse
airways evokes remodeling of both bronchi and large pulmonary vessels. Am J Respir
Crit Care Med. 2005 Jan 1;171(1):19-25.