rezumat RO pt CD.pdf
rezumat RO pt CD.pdf
rezumat RO pt CD.pdf
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ<br />
VETERINARĂ BUCUREŞTI<br />
ŞCOALA DOCTORALĂ A FACULTĂŢII DE HORTICULTURĂ<br />
TEZĂ DE DOCTORAT<br />
Titlul: Obţinerea de biosurfactanţi şi<br />
utilizarea lor în protecţia mediului şi a<br />
culturilor horticole<br />
(REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT)<br />
Conducător ştiinţific:<br />
Prof. univ.Dr. CÂMPEANU GHEORGHE<br />
BUCUREŞTI<br />
2011<br />
Doctorand:<br />
OLTEANU VIOLETA
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
REZUMATUL<br />
tezei de doctorat cu titlul:<br />
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului<br />
şi a culturilor horticole<br />
Lucrarea se bazează pe rezultatele obţinute în cadrul stagiului de pregătire a tezei de doctorat<br />
în perioada 2006-2010 şi abordează o problemă de actualitate, şi anume obţinerea de biosurfactanţi<br />
de la specii bacteriene izolate din medii contaminate cu hidrocarburi şi evidenţierea posibilelor<br />
aplicaţii ale tulpinilor producătoare de biosufactanţi în protecţia culturilor horticole şi bioremediere.<br />
Conţinutul tezei e structurat în două părţi extinse în şase capitole: Consideraţii teoretice asupra<br />
obţinerii de biosurfactanţi şi rolul lor în protecţia plantelor şi în bioremediere, Cercetări proprii<br />
privind izolarea din medii poluate, caracterizarea şi identificarea unor noi tulpini bacteriene din<br />
genul Bacillus, Cercetări proprii privind testarea activităţii antifungice a tulpinilor bacteriene<br />
selectate, Cercetări proprii privind producerea de biosurfactanţi de către tulpinile bacteriene<br />
selectate, Cercetări proprii privind posibilele aplicaţii ale tulpinilor bacteriene producătoare de<br />
biosurfactanţi, Concluzii generale.<br />
În prima parte (Cap. I) sunt sintetizate principalele date bibliografice din literatura de<br />
specialitate cu privire la obţinerea de biosurfactanţi de la diferite specii de microorganisme. S-a pus<br />
accent pe rezultatele obţinute de specialiştii în domeniu în urma folosirii speciilor bacteriene din<br />
genul Bacillus, care produc compuşi lipope<strong>pt</strong>idici cu activitate specifică de surfactanţi. Sunt<br />
prezentate informaţii referitoare la clasificarea şi proprietăţile biosurfactanţilor, factorii care<br />
influenţează producerea acestor compuşi, caracteristicile bacteriilor producătoare de lipope<strong>pt</strong>ide din<br />
genul Bacillus, precum şi aplicaţii ale tulpinilor bacteriene producătoare de biosurfactanţi în<br />
bioremediere şi combaterea biologică a agenţilor patogeni specifici culturilor horticole. Această<br />
parte constituie „Stadiul cunoaşterii problematicii abordate la nivel naţional şi internaţional”<br />
Partea a doua (Cap. 2-6) este structurată în 5 capitole, în care sunt redate sistematic<br />
cercetările proprii axate pe noi tulpini bacteriene din genul Bacillus şi prezentate în ordinea firească<br />
a desfăşurării experimentelor: izolarea din medii poluate, caracterizarea şi identificarea noilor tulpini<br />
din genul Bacillus, testarea activităţii antifungice concomitent cu producerea de biosurfactanţi de<br />
1
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
către tulpinile bacteriene selectate şi evidenţierea posibilelor aplicaţii ale tulpinilor bacteriene<br />
producătoare de biosurfactanţi. Sunt prezentate o serie de metode şi tehnici experimentale variate,<br />
pornind de la tehnici clasice de microbiologie (izolare, cultivare şi păstrare a culturilor bacteriene<br />
pure), de biochimie (teste de identificare a tulpinilor bacteriene, teste specifice privind screening-ul<br />
tulpinilor bacteriene potenţial producătoare de biosurfactanţi, testarea supernatanţilor în vederea<br />
evidenţierii compuşilor de tip biosurfactant şi separarea lor prin cromatografie în strat subţire), de<br />
fitopatologie (testarea in vitro a activităţii inhibitoare a tulpinilor de microorganisme izolate şi a<br />
compuşilor lipope<strong>pt</strong>idici produşi) şi ajungând la tehnici moderne de genetică şi biologie moleculară<br />
bazate pe analiza ADN-ului, pentru caracterizarea noilor izolate bacteriene. În capitolul şase sunt<br />
formulate concluziile, având ca bază rezultatele obţinute pe parcursul derulării experimentelor.<br />
Lucrarea este ilustrată cu un număr de 69 figuri (poze, grafice), 26 tabele şi se bazează pe studiul a<br />
133 lucrări bibliografice.<br />
O parte din experimente s-au realizat prin participarea la proiectul de cercetare-dezvoltare<br />
CNCSIS PN II IDEI-Cercetări privind activitatea unor compuşi biologici cu aplicaţii în protecţia<br />
ecosistemelor agricole-Med_Lab (director de proiect conf. dr. Irina Grebenişan).<br />
Studiile pentru identificarea microorganismelor şi obţinerea biosurfactanţilor s-au realizat în<br />
Laboratorul de Ştiinţele Mediului al Facultăţii de Îmbunătăţiri Funciare şi Ingineria Mediului.<br />
Tehnicile moleculare pentru identificarea tulpinilor bacteriene izolate şi identificarea tulpinilor<br />
producătoare de iturin A, precum şi testele pentru determinarea activităţii antifungice a tulpinilor<br />
bacteriene izolate şi a lipope<strong>pt</strong>idelor produse s-au realizat în Laboratorul de Genetică şi Inginerie<br />
genetică din cadrul Facultăţii de Biotehnologii (prof. dr. Petruţa Călina Cornea). Tehnica PCR s-a<br />
realizat în Laboratorul de Genetică (cercetător ştiinţific Matilda Ciucă), din cadrul Institutului de<br />
Dezvoltare şi Cercetări Agricole, Fundulea.<br />
INT<strong>RO</strong>DUCERE<br />
Un grup aparte de surfactanţi, intens studiaţi, cu aplicaţii în ramurile industriale, agricole,<br />
medicale şi nu în ultimul rând în bioremediere, este reprezentat de biosurfactanţi. Biosurfactanţii<br />
sunt grupaţi într-o clasă de molecule tensioactive (active la suprafaţă), diferite din punct de vedere<br />
structural, care sunt sintetizate de microorganisme. Dezvoltarea cercetărilor din domeniul<br />
biosurfactanţilor este foarte importantă, în principal, datorită preocupării actuale pentru protecţia<br />
mediului. Aceste molecule reduc tensiunea superficială şi tensiunea la interfaţă atât în soluţiile<br />
2
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
apoase cât şi în amestecul de hidrocarburi, ceea ce arată potenţialul lor în bioremediere. Ei intervin<br />
în sporirea solubilităţii şi asimilării poluanţilor hidrofobi, determinând folosirea lor în biodegradare,<br />
în sporirea recuperării ţiţeiului (MEOR - Microbial Enhanced Oil Recovery) şi în procesele de<br />
de-emulsifiere. Surfactanţii de origine microbiană au mai multe avantaje decât surfactanţii chimici<br />
datorită capacităţii lor de a se biodegrada, toxicităţii scăzute şi datorită fa<strong>pt</strong>ului că au eficacitate la<br />
valori extreme de temperatură, pH şi salinitate (Singh şi Cameotra, 2004). Deoarece biosurfactanţii<br />
sunt direct biodegradabili şi pot fi produşi în cantităţi mari de către microorganisme şi astfel nu sunt<br />
dependenţi de produşii derivaţi din ţiţei, ei pot înlocui foarte bine surfactanţii sintetici tradiţionali<br />
(Sarubo şi colab., 2006; Singh şi Cameotra, 2004; Desai şi Banat, 1997). Se poate spune că aceste<br />
substanţe au o compatibilitate mult mai bună cu mediul decât surfactanţii chimici, şi pentru că<br />
biosurfactanţii nu sunt toxici pentru mediul natural şi au o capacitate ridicată de biodegradare, ei<br />
intră în categoria substanţelor „prietenoase cu mediul”. Pot fi utilizaţi ca emulsifianţi,<br />
de-emulsifianţi, agenţi de înmuiere, agenţi de dispersare, agenţi de spumare, ingredienţi alimentari<br />
activi şi detergenţi, cu utilizări în diferite sectoare cum ar fi: petrol şi petrochimie, chimie organică<br />
şi formularea lubrifianţilor, industria alimentară şi a băuturilor, cosmetică şi obţinerea detergenţilor,<br />
industria farmaceutică, industria minieră şi metalurgică, agrochimie şi formularea pesticidelor,<br />
protecţia şi managementul mediului (recuperarea ţiţeiului, favorizarea eliminării din solurile<br />
contaminate a unor metale grele, etc.).<br />
Un alt avantaj al surfactanţilor microbieni constă în capacitatea acestora de a fi sintetizaţi pe<br />
substraturi din mai multe materii prime ieftine, de exemplu deşeuri rezultate din diferite tehnologii<br />
industriale, agricole şi din industria alimentară, în felul acesta scăzând costul de producţie. Chiar<br />
dacă interesul pentru biosurfactanţi este în creştere, aceşti compuşi nu pot concura din punct de<br />
vedere economic cu surfactanţii sintetici (Moussa şi colab., 2006). Succesul producerii de<br />
biosurfactanţi depinde de dezvoltarea procedeelor ieftine şi de folosirea materiilor prime ieftine care<br />
să justifice 10-30% din costul total al procesului tehnologic (Sarubbo şi colab., 2006). În literatura<br />
de specialitate se arată că o gamă largă de surse de carbon inclusiv resursele refolosibile din<br />
agricultură sunt potrivite pentru obţinerea de biosurfactanţi, fără efecte nocive din punct de vedere<br />
ecologic şi cu cele mai bune proprietăţi în funcţie de domeniile de aplicaţie. Producţiile o<strong>pt</strong>ime de<br />
agenţi tensioactivi sunt obţinute când se folosesc ca substrat carbohidraţii şi uleiurile vegetale.<br />
Biosurfactanţii sunt compuşi amfifilici produşi la nivelul suprafeţelor celulelor microbiene<br />
sau sunt excretate extracelular, conţin jumătăţi hidrofobe şi hidrofile şi reduc tensiunea superficială<br />
şi tensiunile interfeţe, având proprietăţi de emulsionare. Biosurfactanţii pot avea una din următoarele<br />
3
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
structuri: glicolipide, pe<strong>pt</strong>ide, acizi graşi, fosfolipide, acid mycolic, antibiotice, combinaţiile<br />
complexe polizaharide-lipide, lipoproteine, lipope<strong>pt</strong>ide sau însăşi suprafaţa celulei microbiene. Deşi<br />
tipul şi cantitatea de surfactanţi microbieni depinde, în primul rând de organismul producător, factori<br />
precum sursele de carbon, sursele de azot, microelementele, temperatura, pH-ul, gradul de aerare,<br />
pot de asemenea influenţa producerea biosurfactanţilor de către microorganisme (Desai şi Banat,<br />
1997). Aceşti biosurfactanţi sunt produşi de numeroase specii de bacterii, levuri şi fungi filamentoşi<br />
care utilizează o varietate mare de compuşi organici ca sursă de carbon şi energie pentru creşterea<br />
lor.<br />
Deşi mulţi biosurfactanţi sunt consideraţi metaboliţi secundari, câţiva pot avea un rol esenţial<br />
în supravieţuirea microorganismelor producătoare de biosurfactant, favorizând transportul<br />
nutrienţilor, interacţiunile microorganism-gazdă sau inhibarea creşterii unor organisme patogene,<br />
ceea ce explică folosirea acestor substanţe în agricultură, pentru combaterea unor agenţi<br />
fitopatogeni. De asemenea, aceştia determină biodisponibilitatea substraturilor insolubile în apă,<br />
legarea de metale grele, intervin în procesul quorum sensing specific microorganismelor şi în<br />
formarea biofilmelor (Rodrigues şi colab., 2006). Biosurfactanţii prezintă şi activităţi<br />
antimicrobiene, cu acţiune antibacteriană, antifungică şi antivirală. Multe lucrări referitoare la<br />
aplicaţiile biosurfactanţilor au fost focalizate pe folosirea lor în agricultură şi pentru combaterea<br />
poluării mediului, datorită diversităţii lor, acţiunii prietenoase cu mediul, posibilităţii de a fi produşi<br />
pe scară largă şi datorită eficacităţii lor la temperaturi extreme şi valori diferite de pH (Rodrigues şi<br />
colab., 2006). Astfel că biosurfactanţii pot fi folosiţi pentru combaterea unor boli produse de diferiţi<br />
agenţi patogeni (în special bacterii şi fungi) şi fac parte din metodele alternative de combatere a unor<br />
agenţi care produc pagube mari în diferite zone agricole din lume, metode de combatere biologică<br />
care câştigă tot mai mult teren, datorită în principal preocupării actuale pentru protecţia mediului.<br />
OBIECTIVELE CERCETĂRILOR EFECTUATE<br />
Datorită potenţialului aplicativ foarte mare al bacteriilor din genul Bacillus, posibilitatea<br />
cultivării la scară industrială a acestor microorganisme şi obţinerea unor cantităţi suficiente de<br />
biosurfactanţi constituie una dintre principalele preocupări ale cercetătorilor la nivel internaţional.<br />
Lucrarea de faţă şi-a propus izolarea şi identificarea unor noi tulpini bacteriene din genul<br />
Bacillus potenţial producătoare de biosurfactanţi, obţinerea compuşilor tensioactivi în condiţii<br />
o<strong>pt</strong>ime de cultivare a izolatelor bacteriene selectate şi studierea posibilelor aplicaţii atât ale tulpinilor<br />
4
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
bacteriene selectate cât şi a compuşilor cu activitate de surfactant punându-se accent, în special, pe<br />
activitatea antifungică.<br />
În acest scop principalele obiective urmărite au fost:<br />
1. Izolarea şi caracterizarea unor noi tulpini bacteriene capabile să producă biosurfactanţi.<br />
Pentru aceasta au fost utilizate probe de sol contaminat cu hidrocarburi şi ape reziduale din<br />
diferite locaţii, din care au fost izolate diverse tulpini bacteriene, precum şi metode specifice<br />
de evidenţiere a producerii de compuşi tensioactivi. Cercetările au fost orientate în vederea<br />
stabilirii condiţiilor o<strong>pt</strong>ime de producere a biosurfactanţilor bacterieni.<br />
2. Stabilirea unor metode eficiente de identificare a noilor izolate bacteriene prin realizarea<br />
unei abordări polifazice, ce a presupus o combinare a unor metode microbiologice clasice, cu<br />
metode moderne, inclusiv moleculare.<br />
3. Evidenţierea capacităţii tulpinilor bacteriene selectate şi a biosurfactanţilor sintetizaţi de<br />
acestea de a inhiba fungi fitopatogeni precum şi de a reduce nivelul unor hidrocarburi<br />
poluante.<br />
4. Testarea in vitro a unor posibile aplicaţii ale tulpinilor bacteriene selectate, în condiţiile<br />
evidenţierii inocuităţii acestora.<br />
CERCETĂRI P<strong>RO</strong>PRII<br />
Capitolul II: Cercetări proprii privind izolarea din medii poluate, caracterizarea şi<br />
identificarea unor noi tulpini bacteriene din genul Bacillus<br />
Cercetările care au făcut obiectul acestui capitol au fost abordate în vederea:<br />
1. Izolării şi caracterizării unor tulpini bacteriene capabile să producă biosurfactanţi;<br />
2. Stabilirii unor metode eficiente de identificare a noilor izolate bacteriene printr-o abordare<br />
polifazică, ce presupune o combinare a metodelor microbiologice clasice, cu metode<br />
moderne, inclusiv moleculare.<br />
Recoltarea probelor pentru izolarea microorganismelor producătoare de biosurfactanţi s-a<br />
realizat în perioada 15-17 iulie 2007. Prin izolarea bacteriilor din diverse surse naturale poluate s-au<br />
obţinut un număr total de 80 colonii bacteriene, care au fost testate pe mediu ce conţine ulei uzat.<br />
Izolarea tulpinilor bacteriene şi obţinerea culturilor pure s-au realizat prin metode<br />
bacteriologice clasice. Pentru izolarea tulpinilor bacteriene s-au folosit mediile de cultură<br />
Luria-Bertani şi geloză. Selectarea tulpinilor bacteriene potenţial producătoare de biosurfactanţi s-a<br />
5
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
făcut prin cultivarea coloniilor bacteriene izolate din sol şi apă în mediul MSM cu zaharoză (Wilson<br />
şi Zajic, 1985) şi în mediul MSM în care zaharoza a fost înlocuită cu ulei uzat 3%. La sfârşitul<br />
perioadei de incubare de 7 zile la 28 0 C, s-a examinat intensitatea creşterii bacteriilor, aspectul<br />
peliculei de ţiţei şi formarea de emulsii, acestea fiind principalele efecte prin care s-ar demonstra că<br />
bacteriile testate ar produce substanţe tensioactive ce permit formarea de emulsii stabile. Dintre<br />
noile izolate bacteriene, doar 28 au fost capabile de a forma emulsii în mediul testat. Studiile s-au<br />
concentrat asupra bacteriilor Gram-pozitive, aparţinând genului Bacillus, scopul nostru fiind de a<br />
identifica noi tulpini bacteriene capabile de a produce compuşi tensioactivi şi să fie sigure pentru<br />
mediu şi sănătatea omului. De aceea, din cele 80 noi izolate au fost selectate 18 tulpini<br />
Gram-pozitive, dintre care doar 10 au manifestat capacitatea de a produce biosurfactanţi.<br />
Pentru a limita şi mai mult numărul de tulpini bacteriene care să fie utilizate în experimentele<br />
ulterioare, cele 10 izolate au fost testate şi în privinţa activităţii antagoniste faţă de fitopatogenul<br />
Alternaria tenuis, evidenţiindu-se fa<strong>pt</strong>ul că doar două tulpini au prezentat o activitate inhibitoare<br />
foarte clară. Aceste tulpini au fost notate B1 (tulpină izolată din sol poluat cu hidrocarburi) şi B2<br />
(tulpină izolată din sol, din zona Techirghiol), ele fiind utilizate în experimente de identificare şi<br />
caracterizare a proprietăţilor utile.<br />
Pentru studii comparative, mai ales în privinţa identificării, s-a utilizat şi o tulpină de bacili<br />
Gram-negativi, izolată din apă de mare, capabilă de a produce substanţe tensioactive. Această<br />
tulpină, pe baza unor teste preliminare de identificare, a fost identificată ca aparţinând genului<br />
Pseudomonas. Identificarea izolatelor bacteriene s-a făcut prin utilizarea unei abordări polifazice,<br />
pornind de la metode microbiologice clasice până la tehnici moleculare, moderne:<br />
1. Evidenţierea particularităţilor bacteriilor izolate şi dezvoltate pe medii solide, de geloză, prin<br />
coloraţia Gram;<br />
2. Identificarea tulpinilor bacteriene prin utilizarea sistemului BIOLOG, bazat pe reacţii<br />
chimice metabolice de reducere a tetrazoliului, folosind microplăcile Biolog GP2 şi GN2,<br />
pentru bacterii Gram-pozitive şi respectiv, Gram-negative;<br />
3. Analizarea comunităţilor microbiene din probele naturale de sol şi apă prin tehnica FISH, o<br />
tehnică moleculară de hibridizare in situ.<br />
4. Caracterizarea noilor izolate bacteriene prin tehnici moleculare bazate pe:<br />
Izolarea ADN-ului cromozomal bacterian prin folosirea kitului Wizard Genomic DNA<br />
Purification Promega şi prin metoda Hopwood şi colab. (1985) ada<strong>pt</strong>ată;<br />
Verificarea electroforetică a ADN-ului în gel de agaroză;<br />
6
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
Amplificarea ADN-ului bacterian prin tehnologia PCR (Polymerase Chain Reaction).<br />
În urma folosirii microplăcilor Biolog GP2 s-a evidenţiat profilul fiziologic al tulpinilor<br />
bacteriene B1 şi B2 şi s-a stabilit apartenenţa noilor izolate la genul Bacillus, specia B. subtilis,<br />
probabilitatea de identificare fiind de 85% pentru ambele tulpini.<br />
Analizarea probelor în vederea identificării tulpinilor prin tehnica FISH, s-a realizat la cele<br />
două tulpini bacteriene Gram-pozitive izolate, B1 şi B2, şi la tulpina Gram-negativă,<br />
Pseudomonas sp. Prin folosirea sondelor moleculare marcate fluorescent şi examinarea produşilor<br />
de hibridizare la microscopul cu epifluorescenţă, s-au evidenţiat unele deosebiri între cele două<br />
izolate aparţinând genului Bacillus şi a izolatului din genul Pseudomonas, dar nu au permis<br />
identificarea speciilor cărora le aparţin izolatele testate.<br />
Prin analize moleculare, ADN-ul genomic a fost utilizat în reacţii de amplificare distincte,<br />
utilizând diferite tipuri de primeri, atât pentru tulpina Pseudomonas sp., cât şi pentru cele două<br />
tulpini de Bacillus. Rezultatele obţinute arată că noul izolat de Pseudomonas aparţine speciei<br />
Ps. aeruginosa şi că noile tulpini B1 şi B2 prezintă un comportament similar celui evidenţiat la<br />
tulpina de referinţă B. subtilis ATCC 6633, ceea ce ar sugera că aparţin speciei B. subtilis.<br />
Deşi în cercetările noastre am pornit de la o bază de date deja existentă în ceea ce priveşte<br />
izolarea, identificarea şi caracterizarea micoorganismelor, am considerat necesară testarea metodelor<br />
de identificare şi caracterizare, astfel încât rezultatele să fie comparabile cu cele obţinute pe plan<br />
internaţional. Principalele contribuţii au fost axate pe două direcţii: (a) izolarea unor noi tulpini de<br />
Bacillus din medii poluate cu hidrocarburi şi (b) o abordare polifazică pentru identificarea noilor<br />
izolate bacteriene prin combinarea metodelor microbiologice clasice cu cele moleculare.<br />
Capitolul III: Cercetări proprii privind testarea activităţii antifungice a tulpinilor bacteriene<br />
selectate<br />
Cercetările prezentate în acest capitol au avut ca obiectiv, evidenţierea capacităţii tulpinilor<br />
bacteriene selectate de a inhiba fungi fitopatogeni in vitro şi in vivo (în condiţii de laborator). Pentru<br />
analizarea eficacităţii tulpinilor de interes B1 şi B2 ca agenţi de combatere biologică au fost realizate<br />
teste de apreciere a antagonismului faţă de fungii fitopatogeni. Scopul acestor experimente a fost de<br />
a evidenţia dacă izolatele bacteriene luate în studiu sunt competitive.<br />
Pentru testarea in vitro s-au folosit fungii fitopatogeni Alternaria tenuis, Fusarium<br />
oxysporum var. lycopersici, Sclerotium bataticola, Rhizoctonia solani, Pythium spp., cultivaţi în<br />
plăci Petri cu mediul PDA. Testarea s-a făcut prin inocularea tulpinilor în poziţii juxtapuse, în vase<br />
7
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
Petri ce conţin mediu agarizat. Prin folosirea mai multor specii de fungi fitopatogeni, s-a examinat<br />
spectrul de acţiune al celor două tulpini bacteriene selectate.<br />
S-a constatat că ambele tulpini bacteriene nu au capacitatea de a inhiba creşterea fungilor din<br />
speciile Sclerotium bataticola şi Rhizoctonia solani. Cu toate acestea s-a observat că, deşi în zona de<br />
interacţiune directă dintre tulpinile bacteriene B1, B2 şi fungii din cele două specii menţionate nu<br />
s-a format o zonă clară de inhibare, creşterea coloniei fungice a fost încetinită, marginile coloniei<br />
fungice nedepăşind marginea coloniei bacteriene sau depăşind-o foarte puţin, ceea ce sugerează un<br />
efect fungistatic al celor două izolate bacteriene.<br />
Testarea in vivo s-a făcut după ce în prealabil tulpinile bacteriene au fost cultivate în mediu<br />
de cultură lichid cu săruri minerale, pentru obţinerea biomasei bacteriene necesară tratamentului in<br />
vivo. Prin cultivarea tulpinilor B1 şi B2 în mediu MSM, s-a remarcat că tulpina B2 a crescut mai<br />
bine, cantitatea de biomasă fiind mai mare.<br />
În acest experiment s-a urmărit activitatea antifungică faţă de Alternaria spp., tulpini fungice<br />
izolate de pe fructele de ardei şi tomate, identificate ca Alternaria alternata (A. tenuis) şi respectiv<br />
A. alternata f.sp. lycopersici. S-au ales trei variante experimentale, concretizate prin tratarea<br />
seminţelor cu: (1) suspensie bacteriană din tulpinile B1 şi B2, (2) cu suspensie bacteriană şi<br />
suspensie fungică de Alternaria alternata f.sp. lycopersici/Alternaria tenuis şi (3) numai cu<br />
suspensie fungică.<br />
S-a constatat că, atât la ardei cât şi la tomate, plantele tratate doar cu suspensiile bacteriene<br />
au crescut viguros (varianta V1), fără urme de stres, în timp ce plantele tratate cu bacterii şi<br />
suspensie fungică au fost mai mici ca dimensiuni, dar aparent sănătoase (varianta V2). În cazul<br />
variantei V3, s-a observat că tratamentul exclusiv cu fungii fitopatogeni nu a permis dezvoltarea<br />
plantelor. În urma testării, s-a observat că tulpina bacteriană B2 are o acţiune pozitivă asupra<br />
dezvoltării plantelor testate, atât la ardei cât şi la tomate, ceea ce arată potenţialul acestei specii<br />
bacteriene de a favoriza creşterea plantelor. De asemenea, aceasta are un potenţial antifungic mai<br />
bun faţă de fungii fitopatogeni testaţi, comparativ cu tulpina B1, datorită producerii compuşilor<br />
antifungici.<br />
Din literatura de specialitate se cunoaşte că efectul de stimulare a creşterii plantelor realizat<br />
de unele bacterii antagoniste se datorează producerii de auxine, şi în principal de acid 3-indolil-<br />
acetic (IAA). Pentru evidenţierea producerii de IAA de către tulpinile bacteriene B1 şi B2 s-a folosit<br />
metoda descrisă de Brie (1991). În afară de cele două tulpini bacteriene s-a folosit şi un alt izolat<br />
natural aparţinând genului Bacillus, notat BW şi o tulpină de B. subtilis de colecţie ATCC 6633.<br />
8
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
Aceste tulpini bacteriene au fost crescute pe mediu NB simplu şi mediu NB suplimentat cu tri<strong>pt</strong>ofan,<br />
acesta fiind precursorul IAA. Mediile de cultură şi metoda de testare sunt descrise în capitolul III al<br />
tezei, subcapitolul Rezultate şi discuţii. Rezultatele obţinute au arătat că toate cele trei izolate<br />
naturale produc IAA, cel mai ridicat nivel fiind evidenţiat la tulpina B2, acesta crescând şi mai mult<br />
atunci când cultivarea s-a realizat în mediu suplimentat cu tri<strong>pt</strong>ofan.<br />
S-a constatat că, în urma interacţiunii cu tulpina bacteriană B2, au apărut modificări la<br />
nivelul hifelor fungice, reprezentate prin alungiri ale hifelor, îngroşări ale peretelui celular,<br />
plasmoliză, fragmentarea membranelor citoplasmatice şi ruperea peretelui celular cu eliminarea<br />
conţinutului citoplasmatic (pe imagini apar formaţiuni alungite asemănătoare unor vezicule la<br />
capătul hifelor fungice). La toate preparatele fungice analizate, cea mai frecventă modificare<br />
observată a fost plasmoliza (fig. 3.1, săgeata – fig. 3.8 b din teză).<br />
Fig. 3.1 (Fig. 3.8.b – Teză): Modificările hifelor de Alternaria tenuis în urma interacţiilor cu tulpina<br />
bacteriană B. subtilis B2; săgeata: fenomenul de plasmoliză.<br />
În acest capitol am abordat tematica din perspectiva testării activităţii antifungice a izolatelor<br />
bacteriene B1 şi B2 în două direcţii: (a) testare in vitro şi (b) testare in vivo. Am demonstrat<br />
activitatea antifungică a tulpinilor B1 şi B2 faţă de fungii testaţi, evidenţiind efectele antagoniste<br />
mai puternice în cazul tulpinii B2. Prin testarea in vivo am demonstrat că tulpina B2 manifestă, în<br />
plus, şi o activitate de stimulare a creşterii răsadurilor de ardei sau roşii, punând în evidenţă<br />
capacitatea mai mare a acestei tulpini de a produce acid indolil acetic. Extrem de interesante au fost<br />
rezultatele obţinute în urma examinării microscopice a hifelor de A. alternata în urma interacţiunii<br />
cu tulpinile bacteriene B1 şi B2, în special, concretizate prin modificările hifelor, apariţia<br />
plasmolizei şi ruperea peretelui celular cu eliberarea conţinutului citoplasmatic (vizualizată prin<br />
formarea unor vezicule, mai ales la capătul hifelor fungice).<br />
9
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
Capitolul IV: Cercetări proprii privind producerea de biosurfactanţi de către tulpinile<br />
bacteriene selectate<br />
Obiectivele urmărite în acest capitol au constat în:<br />
1. Stabilirea condiţiilor o<strong>pt</strong>ime de producere a biosurfactanţilor bacterieni;<br />
2. Evidenţierea producerii compuşilor tensioactivi prin metode specifice.<br />
Pentru realizarea obiectivelor menţionate s-au folosit mai multe tipuri de tulpini bacteriene,<br />
dintre care unele de colecţie şi altele nou izolate (tabelul 4.1 – tabelul 4.1 din teză).<br />
Tulpini bacteriene utilizate în experimente<br />
10<br />
Tabelul 4.1 (Tabelul 4.1 – Teză)<br />
Tulpina Particularităţi Origine<br />
B. subtilis B1 Activitate antifungică slabă Izolat din sol poluat cu hidrocarburi<br />
B. subtilis B2 Activitate antifungică Izolat din sol poluat cu diverse deşeuri<br />
B. subtilis ATCC Tulpină de referinţă Colecţia Laboratorului de Genetică şi inginerie<br />
6633<br />
genetică, Facultatea de Biotehnologii<br />
Bacillus sp. BW Activitate antifungică şi Colecţia Laboratorului de Genetică şi inginerie<br />
antibacteriană<br />
genetică, Facultatea de Biotehnologii<br />
Bacillus sp.OS15 Activitate antifungică faţă Drd.Oana Sicuia, Institutul pentru Protecţia<br />
de Fusarium oxysporum<br />
Bacillus sp.OS17 Activitate antifungică faţă<br />
de Fusarium oxysporum<br />
Plantelor Bucureşti<br />
Drd.Oana Sicuia, Institutul pentru Protecţia<br />
Plantelor Bucureşti<br />
Pentru detectarea producerii de biosurfactanţi s-au folosit două metode: testul hemolizei, prin<br />
cultivarea bacteriilor pe mediul cu geloză-sânge, şi testul cu CTAB-agar, ambele descrise în<br />
subcapitolul Materiale şi metode din capitolul IV al tezei. În cazul utilizării tehnicii de cultivare pe<br />
geloză-sânge, s-a observat un halou clar de hemoliză în jurul tuturor coloniilor bacteriene testate, cel<br />
mai mare fiind înregistrat la coloniile tulpinilor B1 şi B2. În schimb, în urma testării tulpinlor<br />
bacteriene prin cultivare pe mediu cu CTAB nu s-au observat prezenţa halourilor albastre-violete în<br />
jurul coloniilor bacteriene. Pentru verificarea rezultatelor s-au testat şi patru tulpini de<br />
Pseudomonas sp., unde rezultatele au fost pozitive.<br />
Pentru obţinerea unor cantităţi suficiente de biosurfactanţi, bacteriile de interes au fost<br />
cultivate în două tipuri de medii de cultură, recomandate în literatura de specialitate în acest scop.<br />
Astfel, s-au folosit mediile MSM şi McKeen, ultimul cu o formulă uşor modificată. Compoziţia<br />
mediilor de cultură şi protocolul de lucru sunt prezentate în subcapitolul menţionat anterior. În urma<br />
cultivării tulpinilor bacteriene B1, B2, B17 (B. subtilis ATCC 6633) în mediul MSM cu 30 g/L<br />
sucroză ca sursă de carbon, s-au obţinut curbe de creştere tipice pentru o cultură bacteriană, fără<br />
diferenţe semnificative între tulpinile analizate. Rezultatele obţinute în urma cultivării tulpinilor<br />
bacteriene în mediul McKeen cu 2,5 % glucoză ca sursă de carbon, arată că după 12 ore de incubare
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
are loc o creştere progresivă a turbidităţii mediului de cultură la toate tulpinile bacteriene testate.<br />
Faza de creştere exponenţială se întinde, la toate cele trei tulpini bacteriene, pe parcursul a 36 ore,<br />
deşi, în cazul tulpinii B1 şi B2 are loc o creştere rapidă în primele 12 ore, după care ritmul de<br />
creştere încetineşte. De remarcat că, la toate cele trei tulpini testate, s-a observat un vârf de creştere<br />
la aproximativ 84 ore. În cazul celorlalte trei tulpini bacteriene luate în studiu, BW, OS15 şi OS17,<br />
se constată o creştere exponenţială a bacteriilor timp de 12 ore, după care, rata de creştere scade<br />
foarte mult, intrându-se practic într-o fază staţionară prelungită. După 96 ore, numai tulpinile OS15<br />
şi OS17 au intrat în faza de declin, datorită limitării conţinutului de nutrienţi; la tulpina BW valorile<br />
absorbanţei la 600 nm rămânând constante.<br />
Evidenţierea prezenţei compuşilor lipope<strong>pt</strong>idici în supernatantele culturilor bacteriene prin<br />
testarea activităţii de dispersare a petrolului, s-a făcut prin măsurarea diametrului zonei clare de<br />
dispersie, formată prin deplasarea substratului. Testările s-au făcut pe diferite substraturi uleioase:<br />
ulei de floarea soarelui, ulei de măsline, kerosen şi kerosen cu 20% motorină. Rezultatele prezentate<br />
în tabelul 4.2 (tabelul 4.5 din teză) arată că activitatea cea mai bună de dispersare o are tulpina B2.<br />
11<br />
Tabelul 4.2 (Tabelul 4.5 – Teză)<br />
Evidenţierea producerii de biosurfactanţi de către tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC 6633 şi<br />
BW pe diferite substraturi<br />
Tulpini<br />
Zona clară formată (mm)<br />
bacteriene Ulei de floarea Ulei de măsline Kerosen Kerosen cu 20%<br />
soarelui<br />
motorină<br />
B1 4 5 26 26<br />
B2 6 9 56 54<br />
ATCC 6633 3 5 13 12<br />
BW 3 6 18 15<br />
De remarcat că valorile maxime ale zonei de dispersie au fost obţinute pe kerosen şi pe<br />
kerosen cu motorină. Pornind de la diametrul zonei de dispersie pe substratul kerosen şi kerosen cu<br />
motorină, s-a calculat aria de dispersie (în cm 2 ), rezultatele fiind prezentate în tabelul 4.3 (tabelul 4.6<br />
din teză).<br />
Tabelul 4.3 (Tabelul 4.6 – Teză)<br />
Aria de dispersie faţă de kerosen şi kerosen cu 20% motorină a tulpinilor bacteriene testate<br />
Tulpina<br />
Kerosen Kerosen cu 20% motorină<br />
bacteriană Diametrul zonei Aria zonei de<br />
de dispersie (cm) dispersie (cm 2 Diametrul zonei Aria zonei de<br />
) de dispersie (cm) dispersie (cm 2 )<br />
B1 26 5,3 26 5,3<br />
B2 56 24,61 54 22,89<br />
ATCC 6633 13 1,32 12 1,13<br />
BW 18 2,54 15 1,76
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
Fa<strong>pt</strong>ul că faţă de kerosen şi kerosen cu 20% motorină, acţiunea de dispersare a fost ridicată<br />
la toate tulpinile testate, sugerează nu numai că acestea produc substanţe tensioactive ci şi că ele ar<br />
putea fi folosite în practică, în experimente de bioremediere dacă, alături de proprietatea menţionată,<br />
tulpinile bacteriene manifestă şi capacitate de a forma emulsii stabile.<br />
Activitatea de emulsionare a fost testată prin două metode: măsurarea densităţii o<strong>pt</strong>ice a<br />
supernatantelor cu diferite substraturi şi măsurarea stabilităţii emulsiei formate după 24 ore,<br />
respectiv calcularea indicelui de emulsonare la 24 ore (E24). În urma măsurării densităţii o<strong>pt</strong>ice la<br />
lungimea de undă de 540 nm, s-a constatat că valorile cele mai ridicate au fost obţinute la tulpina B2<br />
(tabelul 4.4 – tabelul 4.7 din teză).<br />
12<br />
Tabelul 4.4 (Tabelul 4.7 – Teză)<br />
Testarea activităţii de emulsionare a biosurfactanţilor obţinuţi de la tulpinile bacteriene izolate Bacillus<br />
subtilis B1, B2, ATCC 6633, BW, prin măsurarea densităţii o<strong>pt</strong>ice la 540 nm<br />
Substraturi Activitatea de emulsionare prin măsurarea densităţii o<strong>pt</strong>ice la 540 nm<br />
B1 B2 ATCC 6633 BW<br />
Ulei de floarea<br />
0,093 1,177 0,109 0,17<br />
soarelui<br />
Ulei de măsline 0,107 1,284 0,281 0,178<br />
Kerosen<br />
Kerosen cu 20%<br />
0,058 0,391 0,110 0,180<br />
motorină<br />
0,060<br />
0,577<br />
0,038<br />
0,227<br />
Se remarcă fa<strong>pt</strong>ul că şi valorile indicelui de emulsionare sunt mai mari în cazul tulpinii B2.<br />
În tabelul 4.5 (tabelul 4.8 din teză) sunt prezentate valorile indicelui de emulsionare la 24 ore.<br />
Tabelul 4.5 (Tabelul 4.8 – Teză)<br />
Valorile indicelui de emulsionare la 24 ore (E24) la tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC 6633<br />
şi BW<br />
Tulpini<br />
Indicele de emulsionare la 24 ore (E24) (%)<br />
bacteriene Ulei de floarea Ulei de măsline Kerosen Kerosen cu 20%<br />
soarelui<br />
motorină<br />
B1 43,90 40,24 58,54 51,22<br />
B2 54,88 51,22 71,35 60,37<br />
ATCC 6633 43,90 45,73 51,22 47,56<br />
BW 47,56 49,39 64,03 53,05<br />
Se observă că valorile cele mai ridicate ale indicelui de emulsionare s-au obţinut la tulpina<br />
B2, în special la kerosen 71,35% şi la kerosen cu 20% motorină de 60,37%. Aceste rezultate arată că<br />
tulpinile bacteriene testate, în special tulpina B2, produc compuşi cu proprietăţi de emulsionare şi de<br />
stabilizate a emulsiei. În plus, chiar dacă zonele de dispersie a uleiurilor vegetale utilizate, au fost<br />
reduse la toate tulpinile testate, indicele de emulsionare a fost ridicat pentru aceste substraturi, ceea
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
ce sugerează posibile aplicaţii ale tulpinilor bacteriene selectate pentru degradarea uleiurilor<br />
vegetale uzate (arse).<br />
Pentru că rezultatele obţinute au arătat capacitatea tulpinilor bacteriene B1, B2, B17 şi BW<br />
de a produce agenţi tensioactivi, ne-am propus să examinăm dacă aceste tulpini sunt potenţial<br />
producătoare de lipope<strong>pt</strong>ide de tip iturin, folosind două perechi de primeri ituD şi lpa14. Rezultatele<br />
obţinute sunt prezentate în mod sintetic în tabelul 4.6 (tabelul 4.9 din teză).<br />
Rezultatele testului PCR<br />
13<br />
Tabelul 4.6 (Tabelul 4.9 – Teză)<br />
Tulpina<br />
bacteriană<br />
Rezultate PCR Comentarii<br />
B. subtilis ATCC Ampliconul de 1203 pb specific pentru<br />
6633<br />
ituD este clar, în timp ce ampliconul de<br />
675 pb corespunzător genei lpa-14 nu<br />
este foarte clar<br />
Posibil producător de iturin<br />
B. subtilis B1 Ambii ampliconi sunt prezenţi Producător de iturin<br />
B. subtilis B2 Niciunul dintre produşii de amplificare Nu produce iturin, biosurfactanţii pe<br />
nu a fost detectat<br />
care îi sintetizează sunt de alt tip<br />
B. subtilis BW Ambii ampliconi sunt prezenţi Producător de iturin<br />
Extracţia biosurfactanţilor s-a făcut după o metodă ada<strong>pt</strong>ată după mai multe metode<br />
prezentate în literatura de specialitate, fiind descrisă în capitolul IV al tezei, subcapitolul Materiale<br />
şi metode. În experimentele noastre, în urma evaporării metanolului, s-a obţinut, pentru toate<br />
tulpinile bacteriene luate în studiu, un depozit de culoare brun-gălbuie, fiind considerat biosurfactant<br />
brut. S-au constatat, totuşi, diferenţe în privinţa mărimii depozitului: cel mai mare depozit s-a<br />
obţinut la tulpina B2. În vederea evidenţierii biosurfactanţilor prin cromatografie în strat subţire<br />
(TLC) şi pentru determinarea eventualei activităţi antifungice, sedimentele de biosurfactant au fost<br />
reluate în 100 µl metanol sau în 100 µl n-butanol.<br />
Pentru detectarea biosurfactanţilor prin TLC, s-a folosit sistemul solvent cloroform-metanol-<br />
apă (65:25:4 v/v/v), iar ca soluţie de revelare o soluţie alcoolică de ninhidrină 0,2%. Aplicarea<br />
extractelor metanolice sau butanolice pe plăcile cu silicagel, a condus la evidenţierea unor spoturi de<br />
culoare violet, indicând prezenţa lipope<strong>pt</strong>idelor.<br />
Deşi în cercetările noastre am pornit de la o platformă de cunoştinţe deja existente în ceea ce<br />
priveşte creşterea acestui tip de microorganisme, având în vedere dificultatea alegerii unui mediu<br />
bun pentru cultivarea izolatelor bacteriene selectate, potenţial producătoare de biosurfactanţi, am<br />
considerat necesară testarea şi o<strong>pt</strong>imizarea creşterii tulpinilor bacteriene, astfel încât rezultatele<br />
obţinute în cadrul etapelor următoare să fie comparabile cu cele obţinute pe plan internaţional. Am
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
arătat că prin folosirea mediului de cultură McKeen cu 2,5% glucoză, ca sursă de carbon, creşterea<br />
bacteriilor a fost mai bună, permiţând producerea unei cantităţi mai mari de biosurfactanţi.<br />
Prin verificarea indicelui de emulsionare faţă de uleiul de floarea soarelui şi cel de măsline,<br />
s-a demonstrat că toate tulpinile bacteriene testate au manifestat valori ridicate, ceea ce sugerează<br />
posibile aplicaţii pentru degradarea uleiurilor vegetale testate.<br />
Pe lângă utilizarea mediului de cultură McKeen pentru obţinere de biosurfactanţi, ca element<br />
de noutate putem menţiona diferenţele tulpinilor B1 şi B2 în evidenţierea producerii de lipope<strong>pt</strong>ide<br />
de tip iturin A cu două perechi de primeri (pentru genele ituD şi lpa-14). S-a demonstrat că în<br />
genomul B1 se găsesc ambele gene ţintă, implicate în biosinteza iturinului, observându-se clar<br />
ampliconul de 1203 pb pentru gena ituD şi cel de 675 pb corespunzător genei lpa-14. La tulpina B2<br />
nu s-au observat produşii de amplificare pentru genele menţionate, demonstrându-se astfel că tulpina<br />
bacteriană poate să producă alte tipuri de biosurfactanţi lipope<strong>pt</strong>idici.<br />
De asemenea, s-a pus la punct o metodă de extracţie, ada<strong>pt</strong>ată după mai multe metode<br />
prezentate în literatura de specialitate, reuşindu-se obţinerea unui biosurfactant lipope<strong>pt</strong>idic brut, sub<br />
formă de sediment brun-gălbui, acesta fiind folosit în testările ulterioare sub formă de extracte<br />
lipope<strong>pt</strong>idice metanolice şi butanolice.<br />
Capitolul V: Cercetări proprii privind posibilele aplicaţii ale tulpinilor bacteriene<br />
producătoare de biosurfactanţi<br />
Cercetările care fac obiectul acestui capitol au fost abordate în vederea:<br />
1. Evidenţierii capacităţii biosurfactanţilor sintetizaţi de tulpinile bacteriene selectate de a<br />
inhiba fungi fitopatogeni;<br />
2. Evidenţierii capacităţii tulpinilor bacteriene selectate de a reduce nivelul unor hidrocarburi<br />
poluante;<br />
3. Testării in vitro a unor posibile aplicaţii ale tulpinilor bacteriene selectate, în condiţiile<br />
evidenţierii inocuităţii acestora.<br />
Pentru determinarea capacităţii de degradare a uleiurilor uzate, s-a folosit numai tulpina<br />
B. subtilis B2, pentru că aceasta a dovedit cea mai bună activitate de emulsifiere a diverselor<br />
categorii de uleiuri şi kerosen. S-au folosit trei medii de cultură cu săruri minerale: MSM1, MSM2<br />
şi McKeen. Compoziţia mediilor de cultură şi protocolul de lucru sunt prezentate în capitolul V al<br />
tezei, subcapitolul Materiale şi metode. În toate mediile de cultură s-a adăugat glucoză numai pentru<br />
14
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
culturile preinocul. Pentru evidenţierea creşterii tulpinii bacteriene B2 în medii cu hidrocarburi s-a<br />
înlocuit glucoza cu ulei ars de motor. Determinările s-au făcut eşalonat la 5, 10, 15 şi 20 zile.<br />
În urma testării, s-a constatat că în mediul MSM2 s-a obţinut cel mai bun nivel al creşterii<br />
bacteriene. Se remarcă fa<strong>pt</strong>ul că, după 10 zile de incubare, nivelul creşterii bacteriilor se menţine<br />
ridicat, ceea ce ilustrează viabilitatea şi, prin urmare, activitatea metabolică a acestora. Determinarea<br />
viabilităţii bacteriilor în mediile respective (prin însămânţarea unor plăci Petri ce conţin mediu LB<br />
agarizat cu diluţii ale suspensiilor bacteriene), susţine ideea că bacteriile continuă să rămână viabile<br />
şi active din punct de vedere metabolic o lungă perioadă de timp, fa<strong>pt</strong> ce reprezintă importanţă în<br />
condiţiile utilizării in vivo a acestora. În plus, s-a observat emulsionarea uleiului de motor, ceea ce<br />
semnifică producerea unui compus lipope<strong>pt</strong>idic extracelular cu activitate de biosurfactant. Putem<br />
spune că activitatea de emulsionare a tulpinii B2 faţă de uleiul uzat este ridicată, iar tipul de mediu<br />
utilizat nu influenţează în mod semnificativ această activitate. De altfel, rezultatele confirmă datele<br />
prezentate în capitolul IV, care au arătat că nivelul activităţii de emulsionare rămâne ridicat, cel<br />
puţin pentru tulpina B2, indiferent de varianta de mediu sintetic utilizată pentru testări.<br />
În vederea evidenţierii capacităţii antifungice a biosurfactanţilor bacterieni, extractele<br />
lipope<strong>pt</strong>idice de la tulpinile bacteriene B1, B2, ATCC 6633 şi BW au fost testate pe speciile fungice<br />
A. tenuis şi S. bataticola, în timp ce extractele de la tulpinile bacteriene OS15 şi OS17 au fost testate<br />
pe F. oxysporum var. lycopersici. Plăcile Petri s-au însămânţat cu extractele metanolice şi butanolice<br />
ale lipope<strong>pt</strong>idelor produse de tulpinile bacteriene, cu tulpina bacteriană testată şi cu sedimente<br />
bacteriene rezultate de la cea de-a treia extracţie cu metanol, în patru puncte la o distanţă de 1 cm de<br />
porţiunea centrală reprezentată de specia fungică de interes.<br />
Rezultatele obţinute în urma testării activităţii antifungice a extractelor lipope<strong>pt</strong>idice<br />
demonstrează capacitatea lor de a inhiba creşterea speciilor fungice testate. În a patra zi de<br />
observaţii a interacţiunilor dintre tulpinile bacteriene B1, B2, ATCC 6633 şi BW faţă de A. tenuis,<br />
se observă zone clare de inhibiţie a creşterii miceliului la toate zonele delimitate pe plăcile Petri, în<br />
cazul tulpinilor bacteriene BW şi B2 (fig. 5.1 – fig. 5.14 din teză).<br />
15
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
Fig. 5.1 (Fig. 5.14 – Teză): Interacţiile dintre tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC<br />
6633 (notată A), BW şi a extractelor lipope<strong>pt</strong>idice metanolice şi butanolice faţă de Alternaria<br />
tenuis, după 96 ore la 28 0 C<br />
În urma interacţiilor faţă de S. bataticola, rezultatele obţinute sunt negative. Extractele<br />
lipope<strong>pt</strong>idice metanolice şi butanolice ale tulpinilor bacteriene nu au activitate antifungică faţă de<br />
specia patogenă testată. La tulpinile B1 şi B2 rezultatele obţinute sunt confirmate de testele in vitro<br />
privind activitatea antifungică prezentate în capitolul III al tezei.<br />
În urma măsurătorilor realizate la plăcile cu tulpinile bacteriene OS15 şi OS17, privind<br />
activitatea antifungică faţă de F. oxysporum var lycopersici, s-a constatat că miceliul fungic s-a<br />
dezvoltat predominant în zonele cu extracte lipope<strong>pt</strong>idice metanolice şi butanolice. Inhibiţia s-a<br />
observat la nivelul tulpinilor bacteriene şi a sedimentului bacterian, fa<strong>pt</strong> ce demonstrează activitatea<br />
antifungică a izolatelor bacteriene asupra fungului patogen testat (fig. 5.2 – fig. 5.16 din teză).<br />
16
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
Fig. 5.2 (Fig. 5.16 – Teză): Interacţiile dintre tulpinile bacteriene Bacillus subtilis OS15, OS17 şi a<br />
extractelor lipope<strong>pt</strong>idice metanolice şi butanolice faţă de Fusarium oxysporum var. lycopersici, după<br />
96 ore la 28 0 C<br />
Analizând rezultatele obţinute la tulpinile de interes B. subtilis B1 şi B2, putem spune că<br />
lipope<strong>pt</strong>idele produse de B2 sunt mult mai active decât cele produse de tulpina B1, având o<br />
activitate antifungică mult mai pregnantă faţă de A. tenuis.<br />
S-au realizat preparate microscopice pentru a vizualiza modificările hifelor fungice în urma<br />
interacţiilor cu extractele metanolice ale lipope<strong>pt</strong>idelor produse de tulpina bacteriană B2 (fig. 5.3 –<br />
fig. 5.21 din teză).<br />
Fig. 5.3 (Fig. 5.21 – Teză): Modificările hifelor fungice de Alternaria tenuis în urma interacţiilor cu<br />
extractele lipope<strong>pt</strong>idice metanolice ale tulpinii bacteriene Bacillus subtilis B2<br />
Se constată îngroşarea hifelor, întreruperi ale membranelor citoplasmatice, condensarea<br />
citoplasmei şi ruperea membranelor, observându-se formaţiuni asemănătoare unor picături la capătul<br />
hifelor, care ar putea fi conţinut cioplasmatic.<br />
Pentru a demonstra posibilitatea obţinerii unui biopreparat din una sau mai multe tulpini<br />
bacteriene care au capacitatea de a produce biosurfactanţi, s-au făcut interacţii între tulpinile<br />
bacteriene testate, pentru a evidenţia dacă apar reacţii antagoniste, de inhibare a creşterii coloniilor<br />
bacteriene. Din observaţiile preliminare s-a constatat că tulpinile bacteriene B2, OS15 şi OS17<br />
prezintă un uşor antagonism faţă de BW. Tulpinile bacteriene B2, OS15 şi OS17 nu prezintă<br />
17
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
antagonism între ele, ceea ce ar favoriza folosirea acestor tulpini pentru obţinerea unui biosurfactant<br />
care să prezinte activitate antifungică bună faţă de F. oxysporum var. lycopersici şi alte specii<br />
fungice care produc daune culturilor de tomate şi ardei.<br />
Pentru folosirea tulpinilor bacteriene precum şi a compuşilor cu activitate de surfactant în<br />
combaterea biologică a agenţilor patogeni şi bioremediere, se impune determinarea toxicităţii<br />
bacteriilor de interes. În acest scop noi am folosit metoda BACTOX, o analiză rapidă care foloseşte<br />
ca organism senzor, protozoarul ciliat Tetrahymena pyriformis. Acesta este nepatogen, are formă de<br />
lacrimă şi poate fi folosit în medii ieftine. Pentru testarea toxicităţii s-au folosit tulpinile bacteriene<br />
B1 şi B2. Testarea propriu-zisă s-a realizat pe plăci de culturi tisulare cu 12 orificii, în care s-au<br />
pipetat suspensia de protozoare şi cea bacteriană. Monitorizarea s-a făcut prin observarea fiecărui<br />
orificiu al plăcii de culturi tisulare, cu ajutorul unui microscop cu fază inversată după 10 minute, 2, 4<br />
şi 8 ore de incubare. Prin cuantificarea rezultatelor după o scală ada<strong>pt</strong>ată de Shlimme şi colab.<br />
(1999), s-a constatat că tulpinile bacteriene testate nu au efecte asupra protozoarului ciliat, ceea ce<br />
corespunde cu un indice de toxicitate de 0% echivalent cu aproximativ 100% protozoare vii.<br />
Prin realizarea obiectivelor propuse în acest capitol putem menţiona ca element de noutate<br />
demonstrarea viabilităţii tulpinii B2 în medii de cultură lichide cu adaos de ulei de motor, ca unica<br />
sursă de carbon. S-a observat că tulpina bacteriană a rămas activă din punct de vedere metabolic şi<br />
după 20 zile de incubare în mediile cu ulei de motor. Prin testele realizate s-a observat emulsionarea<br />
uleiului de motor în toate mediile de cultură folosite, ceea ce demonstrează că tulpina B2 produce un<br />
compus lipope<strong>pt</strong>idic extracelular cu activitate de biosurfactant.<br />
În acest capitol cercetările au fost extinse şi prin demonstrarea unei activităţii antifungice<br />
bune a extractelor lipope<strong>pt</strong>idice produse de tulpina bacteriană B2 faţă de A. tenuis. De asemenea s-a<br />
evidenţiat efectele extractelor metanolice ale lipope<strong>pt</strong>idelor produse de tulpina B2 faţă de hifele<br />
fungice de A. tenuis, concretizate prin îngroşarea hifelor, condensarea citoplasmei, ruperea pereţilor<br />
celulari, observându-se formaţiuni asemănătoare unor picături, mai ales la capătul hifelor.<br />
Un alt aspect important prezentat în acest capitol constă în absenţa antagonismului între<br />
tulpinile bacteriene cu potenţial antifungic testate. Acesta este un avantaj important în perspectiva<br />
folosirii tulpinilor respective pentru obţinerea unui biopreparat cu activitate antifungică.<br />
Un alt aspect de noutate îl constituie testarea toxicităţii tulpinilor B1 şi B2 asupra<br />
protozoarului Tetrahymena pyriformis. S-a demonstrat că aceste tulpini nu au efecte negative asupra<br />
organismului test menţionat, extrem de sensibil la modificările apărute în mediu, astfel că tulpinile<br />
18
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
bacteriene B1 şi B2 pot fi folosite în combaterea biologică, iar biopreparatele care ar putea fi<br />
obţinute pot fi sigure pentru mediu.<br />
CONCLUZII GENERALE<br />
1. În experimente au fost utilizate 20 probe de sol şi de apă prelevate din diferite zone ale ţării:<br />
5 probe de sol contaminat cu hidrocarburi provenit din Ploieşti Prahova, din apropierea<br />
zonelor de extracţie petrolieră; 5 probe de sol din localitatea Techirghiol, de pe un teren<br />
poluat cu deşeuri menajere, ape reziduale menajere şi hidrocarburi (în special benzină şi<br />
motorină); 5 probe de apă din Marea Neagră din zona Cazinoului şi zona Pescărie,<br />
Constanţa; 5 probe de apă din lacul Techirghiol.<br />
2. Metoda de izolare a bacteriilor din sursele naturale poluate a permis obţinerea unui număr<br />
total de 80 colonii izolate a căror morfologie a fost examinată. Toate cele 80 de colonii<br />
bacteriene au fost testate pe mediu ce conţine ulei uzat, pentru alegerea izolatelor capabile de<br />
a produce biosurfactanţi. Dintre noile izolate bacteriene, numai 28 au fost capabile de a<br />
forma emulsii stabile în mediul testat.<br />
3. Pentru că scopul principal al cercetărilor este acela de a identifica noi tulpini bacteriene<br />
capabile de a manifesta proprietăţi utile şi care să fie sigure pentru mediu şi pentru om, deci<br />
să nu fie patogene, studiile s-au concentrat asupra bacteriilor Gram-pozitive, aparţinând<br />
genului Bacillus. De aceea, cele 80 noi izolate au fost examinate în privinţa caracterului<br />
Gram, selectându-se în final 18 tulpini Gram-pozitive, dintre care doar 10 au manifestat<br />
capacitatea de a produce compuşi tensioactivi.<br />
4. Pentru a limita şi mai mult numărul de bacterii de studiat, cele 10 de izolate Gram-pozitive<br />
posibil capabile de a produce biosurfactanţi au fost examinate şi în privinţa activităţii<br />
antifungice, faţă de o tulpină de Alternaria alternata (A. tenuis). În final doar două tulpini<br />
bacteriene au prezentat proprietăţile dorite, ele fiind notate B1 (izolată din sol poluat cu<br />
hidrocarburi din Ploieşti, Prahova) şi B2 (izolată din probele de sol poluat cu deşeuri<br />
menajere, ape reziduale menajere şi hidrocarburi - motorină, benzină, recoltate din<br />
localitatea Techirghiol).<br />
5. Deoarece aplicaţiile practice ale oricărui organism nou sunt condiţionate, între altele, de<br />
identificarea speciei căreia îi aparţine, în experimente a fost utilizată o abordare polifazică<br />
19
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
pentru identificarea celor două tulpini bacteriene. Metodele aplicate au fost variate: sistemul<br />
BIOLOG, tehnica FISH şi metode moleculare (ARDRA, PCR-specie specific).<br />
6. Prin utilizarea sistemului BIOLOG s-a ajuns la concluzia că cele două izolate ar aparţine<br />
speciei B. subtilis, cu o probabilitate de aproximativ 85%. Tehnica FISH a permis<br />
diferenţierea între două noi izolate aparţinând genului Bacillus şi un izolat Gram-negativ,<br />
aparţinând genului Pseudomonas. Sondele moleculare utilizate au condus la evidenţierea<br />
unor deosebiri dar nu au permis identificarea speciilor cărora le aparţin izolatele testate.<br />
7. Metodele moleculare constituie, de regulă, metodele ce asigură confirmarea de precizie a<br />
încadrării taxonomice a unor noi izolate. Deoarece condiţia de bază pentru a realiza<br />
asemenea experimente este izolarea şi purificarea ADN genomic, s-au testat mai multe<br />
metode de izolare, cele mai bune rezultate fiind obţinute cu ajutorul kit-ului comercial<br />
Promega. De asemenea, prin aplicarea tehnicilor moleculare bazate pe tehnologia PCR<br />
pentru analiza regiunilor din ADN ce codifică sinteza ARNr respectiv ARNt, a fost<br />
confirmat fa<strong>pt</strong>ul că tulpinile bacteriene B1, B2 şi B17 (tulpina de referinţă) aparţin aceleiaşi<br />
specii, Bacillus subtilis.<br />
8. Tulpinile bacteriene, B1 şi B2 au manifestat, in vitro, activitate inhibitoare faţă de mai multe<br />
specii de fungi fitopatogeni: tulpini de A. alternata izolate de pe ardei sau de pe roşii,<br />
Fusarium oxysporum var. lycopersici şi, parţial faţă de Pytium spp., dar nu au avut efect<br />
inhibitor clar faţă de Sclerotium bataticola şi Rhizoctonia solani. Efectele antagoniste au fost<br />
mai evidente în cazul tulpinii B2, tulpina respectivă fiind folosită pentru teste in vivo.<br />
9. În urma testărilor in vivo s-a constatat că tulpina B2 manifestă o activitate de stimulare a<br />
creşterii răsadurilor de ardei sau roşii. De asemenea, cele două tulpini bacteriene, în prezenţa<br />
fitopatogenului A. alternata f.sp. lycopersici la roşii sau A. tenuis (A. alternata) la ardei au<br />
asigurat protecţie pentru plantele tratate faţă de infecţia fungică.<br />
10. Cercetările ce au avut ca scop determinarea unora dintre mecanismele de acţiune ale<br />
bacteriilor care au determinat stimularea creşterii plantelor, au permis evidenţierea producerii<br />
de către tulpina B2 a unei cantităţi importante de acid indolil acetic (IAA).<br />
11. Prin examinarea microscopică a efectelor produse in vitro asupra hifelor de A. alternata, de<br />
interacţiunea cu tulpinile bacteriene B1 şi B2, s-au constatat o serie de alungiri ale hifelor,<br />
îngroşări ale peretelui celular, plasmoliză, fragmentarea membranelor citoplasmatice şi<br />
ruperea peretelui celular cu eliberarea conţinutului citoplasmatic. Efectele produse de<br />
bacterii asupra fungilor ţintă se datorează unor compuşi solubili, excretaţi de celulele<br />
20
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
bacteriene în mediu şi care acţionează la distanţă (inhibarea creşterii fungilor nu implică un<br />
contact direct cu celulele bacteriene).<br />
12. Prin cultivarea tulpinilor bacteriene pe mediile de MSM cu 30 g/l sucroză şi McKeen cu<br />
2,5% glucoză nu s-au observat diferenţe semnificative în privinţa profilului curbelor de<br />
creştere şi a acumulării de biomasă. În experimentele ulterioare a fost utilizat mediul<br />
McKeen pentru fa<strong>pt</strong>ul că se foloseşte glucoza ca unică sursă de carbon, iar creşterea<br />
bacteriilor a fost mai bună, permițând producerea unei cantităţi mai mari de biosurfactanţi.<br />
13. Pentru evidenţierea şi cuantificarea producerii de biosurfactanţi s-au utilizat două metode:<br />
testul răspândirii petrolului şi testul emulsionării. La tulpinile B1 şi B2 s-a observat o acţiune<br />
de dispersare ridicată faţă de kerosen şi kerosen cu motorină, ceea ce sugerează că acestea<br />
produc substanţe tensioactive. De asemenea, cele mai mari valori ale indicelui de<br />
emulsionare faţă kerosen şi kerosen cu motorină au fost înregistrate la tulpinile B2 şi BW<br />
(71,35% cu 60,37% şi respectiv 64,03% cu 53,05%). De remarcat că indicele de emulsionare<br />
faţă de uleiurile vegetale testate (uleiul de floarea soarelui şi cel de măsline) a fost ridicat la<br />
toate tulpinile bacteriene testate, ceea ce sugerează posibile aplicaţii pentru degradarea<br />
uleiurilor vegetale uzate.<br />
14. Capacitatea tulpinilor bacteriene selectate de a produce biosurfactanţi, în principal din<br />
categoria lipope<strong>pt</strong>idelor a fost examinată şi prin utilizarea unor tehnici moleculare. Astfel, au<br />
fost folosite două perechi de primeri, specifici pentru două gene bacteriene implicate in<br />
producerea iturinului (pentru genele ituD şi lpa-14). S-a constatat că în genomul tulpinilor<br />
B1 şi BW se găsesc ambele gene ţintă, observându-se clar ambii ampliconi specifici<br />
(ampliconul de 1203 pb pentru gena ituD şi cel de 675 pb corespunzător genei lpa-14), în<br />
timp ce la tulpina B2 aceşti produşi au fost absenţi. Aceasta sugerează fa<strong>pt</strong>ul că tulpina B2 ar<br />
putea să producă alte tipuri de biosurfactanţi lipope<strong>pt</strong>idici: surfactin, fengycin sau alţi<br />
membri ai familiei lipope<strong>pt</strong>idice iturin (mycosubtilin, bacillomycin L, D şi F).<br />
15. Studierea particularităţilor biosurfactanţilor bacterieni ca şi a efectelor antifungice este<br />
condiţionată de extracţia acestora. Metoda aplicată a permis obţinerea unui sediment de<br />
culoare brun gălbui (biosurfactantul brut) care a fost supus cromatografiei în strat subţire,<br />
pentru separarea componentelor specifice. Spoturile de culoare violet evidenţiate pe plăcile<br />
cu silicagel au indicat prezenţa lipope<strong>pt</strong>idelor la toate tulpinile bacteriene testate.<br />
16. Pentru evidenţierea unor eventuale aplicaţii practice ale bacteriilor selectate, au fost<br />
o<strong>pt</strong>imizate condiţiile de cultivare în vederea obţinerii unei cantităţi crescute de biomasă<br />
21
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
celulară. Pentru această testare au fost selectate mediile de cultură lichide MSM1, MSM2 şi<br />
McKeen cu adaos de ulei de motor ca unica sursă de carbon, acestea permiţând tulpinii B2 o<br />
creştere semnificativă şi menţinerea viabilităţii pe o perioada lungă de timp (cel puţin 20<br />
zile). Datele obţinute sunt relevante, superioare celor raportate în literatura de specialitate<br />
pentru tulpini bacteriene similare (aparţinând aceleiaşi specii sau unor specii înrudite): astfel,<br />
procentul de biodegradare al uleiului de motor uzat obţinut cu tulpina B2 a fost de<br />
aproximativ 66,67%, ceea ce conferă tulpinii respective importanţă în procesul de<br />
bioremediere a unor medii poluate cu astfel de produse.<br />
17. Extractele de biosurfactanţi bacterieni au fost examinate în vederea evidenţierii efectului<br />
antifungic, demonstrându-se că extractele lipope<strong>pt</strong>idice de la tulpinile bacteriene B2 şi BW<br />
au activitate antifungică bună faţă de A. tenuis. S-au obţinut valori ale eficacităţii extractelor<br />
lipope<strong>pt</strong>idice metanolice şi butanolice de 77,50% şi 78,75% pentru tulpina bacteriană BW, în<br />
timp ce la tulpina B2 valorile au fost de 73,75% şi respectiv 77,50%.<br />
18. Extractele metanolice ale lipope<strong>pt</strong>idelor produse de tulpina bacteriană B2 acţionează asupra<br />
hifelor fungice de A. tenuis, determinând îngroşarea hifelor, condensarea citoplasmei,<br />
întreruperi ale membranelor citoplasmatice şi ruperea membranelor observându-se<br />
formaţiuni asemănătoare unor picături, în principal la capătul hifelor.<br />
19. Datele obţinute în legătură cu potenţialul antifungic al biosurfactanţilor produşi de bacteriile<br />
selectate evidenţiază fa<strong>pt</strong>ul că acestea sunt capabile de efecte importante, posibil sinergice.<br />
Din acest motiv, pentru o eventuală condiţionare a culturilor bacteriene în vederea obţinerii<br />
de biopreparate cu activitate antifungică, este important ca tulpinile bacteriene utilizate să nu<br />
manifeste antagonism între ele. Rezultatele au evidenţiat absenţa acestui antagonism, ceea ce<br />
înseamnă că ele ar putea fi folosite pentru obţinerea unui biopreparat cu activitate antifungică<br />
faţă de unele specii fungice.<br />
20. Utilizarea practică a unor biopreparate microbiene este deseori blocată de lipsa informaţiilor<br />
legate de inocuitatea acestora. Din acest motiv, pentru tulpinile bacteriene selectate a fost<br />
aplicat, pentru prima dată în România, testul BACTOX, una dintre puţinele metode de<br />
determinare a ecotoxicităţii atât a bacteriilor cât şi a produşilor microbieni folosiţi în<br />
combaterea biologică. Testul s-a realizat prin co-incubarea bacteriilor cu protozoarul ciliat de<br />
apă dulce Tetrahymena pyriformis, dovedindu-se că tulpinile bacteriene B1 şi B2 nu au<br />
efecte toxice asupra acestuia (rezultatele au arătat un indice de toxicitate de 0% ceea ce<br />
corespunde cu aproximativ 100% protozoare vii). Fa<strong>pt</strong>ul că aceste tulpini bacteriene nu au<br />
22
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
efecte negative asupra protozoarului T. pyriformis, organism test extrem de sensibil la<br />
modificările apărute în mediu, demonstrează că tulpinile bacteriene selectate ar putea fi<br />
utilizate în cadrul unor tehnologii de bioremediere a mediilor poluate cu hidrocarburi şi/sau<br />
de obţinere de biopreparate antifungice.<br />
CONTRIBUŢII ORIGINALE ALE TEZEI<br />
Tema de cercetare propusă prezintă importanţă la nivel internaţional, prin fa<strong>pt</strong>ul că poate<br />
contribui la elaborarea unor metode biotehnologice netoxice pentru mediu, utile pentru protecţia<br />
plantelor şi pentru bioremedierea solurilor poluate, în general, cu hidrocarburi. Deşi există produse<br />
biologice pe bază de microorganisme deja comercializate, cercetările în acest domeniu vor prezenta<br />
interes deoarece pot fi utilizate noi microorganisme pentru producerea biosurfactanţilor. Abordarea<br />
cercetărilor în cadrul acestei teze prezintă noutate şi originalitate, îmbinând o gamă diversă de<br />
metode de studiu în vederea identificării şi evidenţierii aplicaţiilor unor microorganisme utile din<br />
punct de vedere practic.<br />
Materialul biologic utilizat în experimente este nou, tulpinile bacteriene selectate fiind pentru<br />
prima dată descrise şi utilizate pentru evidenţierea capacităţii de a utiliza uleiul uzat şi, în acelaşi<br />
timp, de a inhiba o serie de agenţi fitopatogeni. Din acest punct de vedere, rezultatele obţinute au<br />
caracter de originalitate: tulpinile bacteriene selectate manifestă simultan proprietăţi antagoniste faţă<br />
de fungi fitopatogeni precum şi capacitate de a degrada o serie de hidrocarburi poluante pentru<br />
mediu. S-a analizat capacitatea tulpinilor bacteriene izolate de a creşte pe medii de cultură cu ulei<br />
uzat de motor, pentru evidenţierea capacităţii bacteriilor de a utiliza uleiul uzat şi de a fi folosite în<br />
aplicaţii de bioremediere.<br />
Prin studierea cineticii şi parametrilor care influenţează producerea biosurfactanţilor<br />
bacterieni realizată în cadrul acestei lucrări, sunt create bazele pentru o o<strong>pt</strong>imizare viitoare a<br />
proceselor biotehnologice în care acestea ar fi utilizate, putându-se astfel obţine bioproduse la un<br />
nivel de cost scăzut, produse care pot înlocui, în anumite situaţii, o parte a produselor chimice care<br />
au dezavantajul că sunt toxice şi prezintă risc de poluare a mediului. S-a descris o metodă de<br />
extracţie a compuşilor lipope<strong>pt</strong>idici, care a fost ada<strong>pt</strong>ată prin studierea unui număr mare de tehnici<br />
de extracţie folosite pe plan internaţional.<br />
S-au făcut studii privind toxicitatea tulpinilor bacteriene izolate şi respectiv a compuşilor<br />
produşi de acestea faţă de organisme acvatice dulcicole, Tetrahymena pyriformis, ceea ce constituie<br />
23
Obţinerea de biosurfactanţi şi utilizarea lor în protecţia mediului şi a culturilor horticole<br />
un element de noutate pe plan naţional şi internaţional şi contribuie la dezvoltarea cunoştinţelor în<br />
acest domeniu.<br />
S-a studiat activitatea antifungică a tulpinilor bacteriene izolate şi, mai ales, a<br />
biosurfactanţilor produşi de acestea, pentru obţinerea unui biopreparat care să poată fi folosit în<br />
combaterea biologică a fungilor patogeni care produc pagube culturilor legumicole de tomate şi<br />
ardei.<br />
24