LP1 MD.pdf - Disciplina de Microbiologie

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
Reguli de protecție a muncii în laboratorul de microbiologie
În laboratorul de microbiologie se lucrează cu material infecțios
Pentru a preveni răspândirea germenilor din materialul infecțios, precum și pentru a evita suprainfectarea
acestor materiale cu germeni străini, trebuie respectate anumite reguli de ordine interioară:
• Este strict interzis accesul persoanelor străine în laborator
• Intrarea în laborator și participarea la lucrările practice se va face numai după audierea și
însușirea regulilor de protecție a muncii (dovedită prin semnătură pe un proces verbal)
• Intrarea în laboratorul de microbiologie necesită purtarea obligatorie a echipamentului de
protecție (halat cu mâneci lungi). Se recomandă ca echipamentul de protecție să fie păstrat
separat de hainele utilizate în exterior.
• Toate produsele biologice vor fi considerate ca potențial infectante
• Consumarea de alimente și băuturi, ducerea mâinilor la față în timpul lucrului, fumatul în
laborator sunt strict interzise.
• Este interzisă introducerea în gură a oricărui obiect din laborator
• Este interzisă aducerea în laborator a obiectelor de uz personal
o hainele, servietele, gențile, vor fi lăsate în vestiarul special amenajat
o este permisă aducerea în laborator a materialelor de scris și a lucrurilor de valoare,
acestea din urmă fiind așezate în laborator în locuri special amenajate.
• Este interzisă intrarea în laborator în lipsa unui cadru didactic
• Nu este permisă fuga sau mersul rapid prin laborator
• Lucrul în laboratorul de microbiologie implică contact cu material infecțios! Pentru a preveni
accidentele de lucru, este necesară urmarea strictă a metodelor de lucru și a regulilor de
dezinfecție și antisepsie:
o însămânțările se fac la flacără, flambându-se gâtul recipientelor la deschidere și la
închidere
o ansa și acul de platină se sterilizează înainte și după folosire prin încălzire la roșu, iar
portansa se va flamba
o pipetele și lamele de sticlă contaminate nu se vor decontamina la flacără, ci se scufundă
după folosire în recipiente cu soluție dezinfectantă existente la mijlocul fiecărei mese. Tot
în aceste recipiente se vor introduce lamele și lamelele de sticlă folosite
1

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
o pipetarea cu gura este interzisă. În vederea pipetării se vor folosi dispozitive de pipetare
adecvate
o cutiile Petri, eprubetele, sau alte recipiente și materialele contaminate se introduc după
lucru în găleata de infecte care va fi autoclavată
o manipularea aparatelor se va face respectând instrucțiunile de folosire specifice
o atenție la manipularea substanțelor caustice și inflamabile
o în cazul răspândirii accidentale a materialului infecțios, va fi anunțat cadrul didactic care
conduce lucrările și care va indica măsurile de dezinfecție
• După terminarea lucrului mâinile se antiseptizează prin introducerea lor într-o substanță
antiseptică (cloramină, bromocet) pentru câteva minute, apoi se spală cu apă caldă și săpun.
• Fiecare student are obligația de a-și supraveghea spațiul de lucru, păstrând ordinea și curățenia:
o fiecare student își va alege locul de lucru la începutul primei lucrări practice, loc pe care șil
va păstra până la încheierea semestrului/anului universitar
o orice alterare existentă a zonei de lucru va fi consemnată cadrului didactic la începutul
lucrării practice
2

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
în practica medicală
Controlul creșterii microorganismelor
• spitale – secții medicale și chirurgicale – infecții nozocomiale
• cabinete medicale, stomatologice
în microbiologie
• material infecțios – risc pentru contaminarea mediului, îmbolnăvirea personalului
• diagnostic corect: prevenirea contaminării probelor din mediul extern
Definiții
DECONTAMINARE: reducerea numărului de germeni de pe un obiect sau dintr-o substanță până la 0,
poate fi efectuată prin mai multe metode:
ANTISEPSIE: decontaminarea tegumentelor și mucoaselor cu ajutorul unor substanțe chimice antiseptice
bacteriostatice (netoxice pentru tegument): alcool etilic 70%, tinctură de iod 5%, KMnO4 0,1%, detergenți
cationici. Distruge doar formele vegetative
DEZINFECȚIE: distrugerea patogenilor (mai puțin a sporilor) de pe suprafețe, din aer, cu ajutorul unor
substanțe chimice dezinfectante bactericide (toxice pentru țesuturi vii): fenoli, formol, H2CO3. Împiedică
răspândirea bolilor infecțioase.
STERILIZARE: distrugerea sau îndepărtarea tuturor formelor vii (inclusiv spori)
ASEPSIE: absența patogenilor – menținerea sterilității – presupune aplicarea tehnicilor aseptice pentru a
împiedica pătrunderea microbilor într-un substrat steril.
SANITIZARE – măsuri pentru asigurarea sănătății publice
PREZERVARE, CONSERVARE - păstrarea viabilității microorganismelor o durată variabilă de timp
CURAT – lipsit de murdărie organică/anorganică (fără referire la microorganisme)
Factori care influențează eficacitatea metodelor de control
• mărimea populației bacteriene
• moartea bacteriilor este exponențială (mai mulți germeni = mai mult timp)
• timpul de expunere la agentul decontaminant
• creșterea timpului de expunere crește rata distrugerii
• efectul concentrației, a temperaturii și a pH-ului
3

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
• creșterea concentrației crește rata distrugerii
• temperatura, concentrația, pH-ul la care acționează agentul
• stabilitatea agentului la pH, temperatură
• structura germenului
• endospori - clostridii
• chist – Protozoa
• peretele celular - Mycobacterium
• interacțiunea cu mediul înconjurător – protecția germenilor
• prezența substanțelor organice protejează microorganismele (curat – murdar)
• dezinfecție în spitale – selectarea rezistenței
Metode de decontaminare
Metodele se aleg în funcție de situația practică. (materialele care urmează a fi tratate sunt
termostabile/ termorezistente, etc. ?)
Nu toate metodele de decontaminare sunt și metode de sterilizare!
I. Metode fizice
1. Căldura
a. Căldura uscată:
• Încălzirea la roșu – ansa de platină
• Flambare – completarea sterilizării – trecerea obiectului prin flacără
• Incinerarea – arderea cu reducere la cenușă
o indicații: materiale dispozabile din plastic, reziduuri organice solide, carcasele,
cadavrele animalelor
• Sterilizarea prin aer cald – mecanism de acțiune: oxidare
o indicații: sticlărie de laborator, vase din porțelan, instrumentar chirurgical, pulberi
termostabile
4

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
b. Căldura umedă:
o contraindicații: soluții apoase, obiecte din cauciuc, plastic, țesături și vată din
bumbac sau fibră sintetică, materialele contaminate din laborator
o se realizează în etuvă (cuptorul Pasteur, Poupinel)
o 160°C 2h, 180°C 1h
• Fierberea – mecanism de acțiune: denaturare
o distruge formele vegetative, nu și sporii
o nu este metodă de sterilizare
o 100°C, 30 minute
• Vapori fluenți – în vasul Koch, Arnold
• Tindalizarea – sterilizarea fracționată: evită încălzirea la temperaturi de peste100C
o încălzire în 3 zile consecutive, între încălziri incubare la termostat pentru
germinarea sporilor
o tindalizare la 100°C în vasul Koch (Arnold) utilizând vapori fluenți
o tindalizare la 65°C în baie de apă
o sterilizarea unor medii de cultură, alimente
• Sterilizare prin vapori sub presiune – autoclavarea
o mecanism de acțiune: denaturare
o temperatura vaporilor de apă într-un spațiu închis crește proporțional cu
presiunea
0,5 atm – 115°C
1 atm – 121°C
2 atm 134°C
o în microbiologie: 121°C timp de 15’- 30’
o în blocurile operatorii: 134°C timp de 30’
o indicații: sterilizarea materialului infecțios din laborator, medii de cultură
termostabile, instrumente chirurgicale, halate, câmpuri operatorii, etc.
o contraindicații: material plastic, piele, blană
5

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
c. Pasteurizarea
2. Filtrarea
• Denaturarea proteinelor – expunere la temperaturi de sub 100°C
o joasă (LTLT – low temperature long time)
o înaltă (HTST – high temperature short time)
o UHT – ultra high temperature
• produse alimentare termolabile
• nu se distrug: micobacteriile, enterovirusurile
• reținerea microorganismelor din medii lichide sau aer
• trecerea prin membrane cu porozități diferite (0,22, 0,45, 0,8)
• membrane: acetat, nitrat celuloză, policarbonat, teflon
• sterilizarea lichidelor termolabile și sterilizarea aerului pentru crearea unui mediu aseptic (boxe cu
flux de aer laminar – HEPA filter: High-efficiency Particulate Air)
3. Centrifugarea
• pentru virusuri se folosesc viteze mari (10000 rpm)
4. Radiații
• ionizante – distrug ADN-ul
o penetrație mare
o sterilizarea instrumentelor chirurgicale, stomatologice
o nu este o metodă des folosită
• neionizante – alterarea ADN-ului
o ex. razele UV – lampa germicidă
o nu sunt penetrante
o sterilizarea suprafețelor de lucru netede, curate, sanitizarea saloanelor, sălilor de operație
5. Vibrații ultrasonice
6

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
II. Substanțe chimice
1. Agenții alkilanți
• au acțiune sporo- și bactericidă (glutaraldehida, oxidul de etilen); formaldehida are doar efect
dezinfectant
• sterilizarea instrumentelor medicale, a echipamentelor endoscopice, a medicamentelor
• oxidul de etilen: substanță gazoasă cu penetrabilitate mare
• glutaraldehida: soluție apoasă 2%
2. Soluții dezinfectante și antiseptice
• Halogenii, clorul și derivații de clor, hipocloriții, iodoforii
• Derivații fenolici
• Detergenți
• Alcooli – etanol 70-80%
• Substanțe chimice utilizate în microbiologie:
1. Frigul
o pentru dezinfecție: cloramină 5%, fenol 3%, etc.
o pentru antisepsia mâinilor: bromocet 1%o, cloramină 1%, etc.
Metode de prezervare
• refrigerare: 4°C: stare de viață latentă – efect bacteriostatic
• congelare: -21°C – sterilizare
• congelare la -70°C: prezervare
2. Desicare
• liofilizarea – congelare bruscă și desicare: prezervarea pe termen lung a culturilor bacteriene,
• presiune osmotică – îndepărtarea apei din alimente (fructe, lapte praf)
7

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
Controlul sterilizării și al sterilității
• Controlul sterilizării: controlul procesului de sterilizare
o metode fizice – controlul temperaturii (termometru), presiunii (manometru), timpului de
expunere
o metode chimice: se folosesc substanțe cu punct de fuziune apropiat de temperatura la
care se face sterilizarea (acidul benzoic are punctul de fuziune la temperatura de 121C)
o metode biologice: fiole Stearotest – suspensie de spori de Bacillus stearotermophilus;
atingerea temperaturii de 121°C duce la distrugerea sporilor, indicatorul din fiole virează.
• Controlul sterilității: eficiența sterilizării și menținerea sterilității; se realizează prin metode
bacteriologice (recoltarea probelor de pe suprafețe sterile, cultivare)
8

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1
Recoltarea și transportul produselor patologice
Obținerea unui rezultat corect la examenul microbiologic impune respectarea unor reguli privind:
modul de recoltare al produsului patologic (PP)
metodele de conservare
modalitățile de transport
Se pun următoarele întrebări:
Ce se recoltează? – care este PP în care se pot găsi microorganismele suspectate
- Căutăm microbul:
- la poarta de intrare
- în organe țintă
- în focare metastatice nespecifice
- căile de răspândire (sânge, ganglioni)
- căile de eliminare (intestin, căi urinare)
- Căutăm antigenele microbiene:
- umori
- exsudate – LCR, spută
- sânge
- urină
Cum se recoltează? – care este calea de acces indicată pentru prelevarea PP
Cât se recoltează? – cantitatea produsului prelevat
Când se recoltează? – care este momentul optim de recoltare
În ce scop se recoltează? – precizarea examenelor de laborator solicitate
Se ține cont de următoarele reguli:
prelevarea se face înaintea instituirii tratamentului antimicrobian
se folosesc recipiente curate și sterilizate pentru a preveni contaminarea probelor
evitarea contactului cu substanțe bacteriostatice sau bactericide a produsului
în unele cazuri trebuie folosite medii de transport sau lichide conservante
recipientele de transport se închid ermetic pentru a preveni contaminarea mediului și a
personalului care manipulează PP
produsul să fie însoțit de un bilet de trimitere completat corect
probele să fie etichetate și transportate la laborator în cel mai scurt timp posibil
9

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1 MD
10
Produsul patologic Examen bacteriologic
1. Exsudatul faringian • Înainte de tratament bacterian
2. Secreția nazală • Pacientul suflă nasul
• Înainte sau la 3-4 ore de la toaleta gurii, alimentație
• Pacientul
o Pe scaun, gâtul în extensie, deschide gura, spune “A”
• Medicul
o Deprimă limba cu apăsătorul steril, șterge ferm cu tamponul:
Amigdalele
Peretele posterior al faringelui
!!! recoltare de pe zonele inflamate, leziuni, depozite purulente
o Introduce tamponul în tubul protector, notează datele pacientului
o Examinare în maxim 3 ore de la recoltare
• Medicul
o umectează tamponul faringian în ser fiziologic
o șterge, pe rând , vestibulul foselor nazale
• Examinare 2-3 ore de la recoltare
• Folosită pentru depistarea portajului de Staphylococcus aureus
3. Secreția nazo-faringiană • pacientul așezat, capul flectat pe spate
4. Sputa • La internare
• medicul
o introduce tamponul nazo-faringian printr-o nară, până la peretele posterior al nazo-faringelui
o lasă câteva secunde, după care rotește ușor, apoi retrage puțin
o reinseră, rotește, retrage definitiv
• Examinare 2-3 ore de la recoltare
• Folosită pentru depistarea portajului de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus, Moraxella
• Instruirea bolnavului: periajul dinților, clătirea gurii cu apă (sterilă)

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1 MD
11
• Tuse spontană, intensă, supravegheată
• Cantitate: 1-2 ml probă purulentă
• tușitori cronici, TBC, fungi
o toată sputa de la expectorația matinală sau expectorată în interval de 1 – 2 ore
• tuse slab productivă
o stimularea expectorației
!! nu se examinează probele de spută adunate în 24 de ore
5. Sânge • Recoltare în recipiente speciale pentru hemocultură
• 1 set = 1 flacon aerob + 1 flacon anaerob
• Se recomandă recoltarea sângelui
o din 2 locuri diferite
o 2 seturi
• Volum recoltat: 10 ml (1-3 ml la copii)
• Recoltarea pentru hemocultură, presupune lipsa tratamentului cu antibiotice, altfel există riscul ca germenii să nu
crească
• Tehnica
o Antiseptizarea tegumentului cu iod, apoi cu alcool
o Se așteaptă uscarea zonei antiseptizate
o Recoltarea sângelui cu ac și siringă
o Decontaminarea dopului la flacoanele de hemocultură
o Transferul sângelui din seringă în flacoane
• Nu se refrigerează
6. LCR • Prin puncție lombară
• Condiții stricte de asepsie
• nu se refrigerează (Neisseria meningitidis)
• recoltare cu prudență la pacienți cu HIC
7. Urina • Pacientul trebuie educat (explicat pe înțelesul fiecărui bolnav) – pentru prevenirea contaminării probei

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1 MD
8. Secrețiile genitale – la
femei
9. Secrețiile genitale – la
bărbați
12
• Momentul prelevării
o Prima urină de dimineață
o Recoltare după cel puțin 3 ore de la micțiunea anterioară
• Recoltarea
o se face după toaleta riguroasă a organelor genitale externe cu apă călduță și săpun
o din jetul mijlociu
o în recipiente sterile speciale pentru recoltarea urinii
• cantitatea necesară: 10-20 ml
• pentru nou-născuți se folosesc pungi sterile din material plastic
• se mai poate preleva urina prin puncție suprapubiană sau prin cateter
• indiferent de prelevare, examenul microbiologic al urinii trebuie efectuat în cel mult 2 ore de la prelevare
o dacă acest interval nu poate fi respectat, probele trebuie păstrate la 4ºC imediat după recoltare
• vaginite
o din fundul de sac vaginal, cu tampon steril care apoi se introduce în mediu de transport
o se efectuează două frotiuri
• cervicite
o cu un tampon steril se îndepărtează mucusul de la nivelul cervixului
o cu un alt tampon se recoltează produsul patologic prin introducerea și rotirea în canalul cervical
o evitarea contaminării probei cu flora vaginală
o se efectuează două frotiuri
• la fetițe
o tamponarea secreției de la nivelul vulvei
o cu ajutorul unui cateter se introduc în vagin 2 ml ser fiziologic steril, apoi se colectează lichidul de spălătură
o se efectuează două frotiuri
• nu se refrigerează (Neisseria gonorrhoeae)
• uretrite
o se recoltează secreție uretrală cu tampon steril, care se introduce în mediu de transport

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1 MD
13
o se efectuează două frotiuri
o se poate recolta și urină – primul jet
• prostatite
o se recoltează secreție prostatică după masaj prostatic
o ejaculat colectat în recipient steril
10. Materii fecale • scaun emis spontan
o defecare în containere de unică utilizare de carton sau material plastic
cu tampon / lingurița coprorecoltorului
porțiuni lichide, mucoase, sanguinolente
volum 3 – 5 cm 3
• prelevare rectală
o cu sonda Nelaton
umectarea sondei în ser fiziologic steril
penetrarea sfincterului anal prin rotare lentă
introducere intrarectală ≈ 15 cm
adaptarea unei siringi sterile de 10 ml
1 – 2 aspirații
Introducerea aspiratului în tub steril cu dop, cu mediu de conservare lichid
• Pentru depistare Clostridium difficile
o Recoltare de scaun diareic (lichid sau moale) în recipient curat, fără mediu de transport
11. Leziuni tegumentare • Recoltarea puroiului
o Ocazie unică, frecvent irepetabilă
o Cu tampon steril (cantitate redusă)
o Prin aspirație (cantitate suficientă)
o Biopsie, secreții (intervenții chirurgicale) – materialul bioptic se introduce în ser fiziologic steril

Disciplina de Microbiologie UMF Tg. Mureș
LP1 MD
Metode directe
14
Schema diagnosticului bacteriologic
1. Examenul direct al produsului patologic
• examen macroscopic
• examen microscopic
• evidențierea antigenelor bacteriene prin metode serologice
• detectarea ADN-ului microbian (reacții de hibridizare, amplificare genică – PCR)
2. Izolarea germenului în cultură pură
• însămânțarea și cultivarea pe medii de cultură
• inoculare la animale de laborator
3. Identificarea germenului izolat din cultură pură:
• cercetarea caracterelor de cultură și morfotinctoriale
• cercetarea caracterelor biochimice și de metabolism
• determinarea structurii antigenice prin:
o reacții de aglutinare
o reacții de precipitare
o reacții de umflare a capsulei
• determinarea sensibilității la bacteriofagi (lizotipia)
• tehnici de detectare a ADN microbian
4. Determinarea patogenității germenului izolat prin:
• teste in vitro
• teste in vivo (boala experimentală)
5. Determinarea sensibilității germenului la antibiotice și chimioterapice
(antibiograma)
Metode indirecte
• detectarea anticorpilor din serul bolnavilor (anticorpii se urmăresc în dinamică)
• reacții biologice cutanate de diagnostic (IDR)