Tehnica Southern-blot

Metode de
analiză a genelor
Expresia genelor
ADN ARNm Proteină Caracter
5’ 5’-ATTGCAAGATTACCATGT
ATTGCAAGATTACCATGT-3’ 3’ Catena codogenă (netranscrisă)
3’ 3’-TAACGTTCTAATGGTACA
TAACGTTCTAATGGTACA-5’ 5’ Catena anticodogenă (transcrisă)
Transcripţie
5’ 5’-AUUGCAAGAUUACCAUGU
AUUGCAAGAUUACCAUGU-3’ 3’ ARNm
Translaţie
Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid
Maturizare
Caracter fenotipic normal
Secvenţiere
PCR
Analiza genelor
ADN ARN
Proteine
Southern-blot
Hibridare in situ
Northern-blot
RT–PCR
Hibridare in situ
Western-blot
Secvenţiere
Analiza funcţiei
Analiza
histochimică
Expresia genelor
ADN mut ARNm mut Proteină an Caracter an
5’ 5’-ATT ATTACAAGATTACCATGT
CAAGATTACCATGT-3’ 3’ mutaţie G4→A 3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
Transcripţie
5’ 5’-AUU AUUACAAGAUUACCAUGU
CAAGAUUACCAUGU-3’ 3’ ARNm
Translaţie
ARNm mut
Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid polipeptidan Caracter fenotipic anormal
Utilizarea tehnicilor de analiză a
acizilor nucleici în medicină
Analiza ADN:
depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor
genetice (prenatal, postnatal precoce);
identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie
genomică (analiza filiaţiei);
depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul
bolilor infecţioase şi gradului de infectare.
Analiza ARNm:
analiza expresiei genice ţesut-specifică;
evaluarea gradului de expresie a genei normale /
patologice.
12/11/2009
1

Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin
acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)
2,5 kb
10 kb
6 kb
5 kb
10 kb
6 kb
5 kb
-
2,5 kb
Tehnici de analiză a genelor
PCR
Southern - blot
Secvenţierea ADN
+
M
12 kb
10 kb
8 kb
6 kb
4 kb
2 kb
Principii de bază
Etapele principale
Componente necesare (la general)
Indicaţii şi limite
RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z
PCR
reacţia ciclică de polimerizare
Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare
Replicare semiconservativă, repetată
Specificitatea primerilor sintetici pentru gena gena–
ţintă
Hibridizarea ADN ADN-ţintă ţintă – primer ←
complementar:
Denaturare termică a ADN - de cercetat
Modificarea ciclică a temperaturii:
Denaturare
Renaturare
Sinteză
12/11/2009
2

Clonarea in vitro – PCR
(reacţia ciclică de polimerizare a noilor
copii de ADN)
Componentele necesare pentru
clonarea in vitro (PCR):
- ADN de cercetat
- Primeri specifici secvenţei de clonat –
complimentari secvenţelor flancante
- Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă
- Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP)
- Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:
- tº de denaturare ADN
- tº de renaturare (ADN+primer)
- tº de polimerizare (elongarea catenelor noi de
ADN)
Extragerea ADN Pregătirea
componentelor pentru
PCR
Electroforeza
produşilor PCR
Colorarea şi
vizualizarea produşilor
PCR
Amplificarea
ADN-ţintă
Interpretarea
rezultatelor
Etapele tehnicii PCR
A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante
B. Repetarea automată a procedurilor de denaturarerenaturare-elongare
de 30-35 ori
•Denaturarea ADN la 96oC •Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
•Elongarea catenelor ADN la 72oC C. Analiza produşilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor
12/11/2009
3

Avantajele PCR
Metodă rapidă
•Metodă Metodă ieftină
•Utilizarea Utilizarea cantităţilor mici de material analizat
•Nu Nu necesită izotopi radioactivi
•Interpretarea Interpretarea uşoară a rezultatelor
Dezavantajele PCR
•Necesitatea Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice
amplificate
•Necesitatea Necesitatea primerilor sintetici, specifici
secvenţei analizate
Identificarea inserţiilor / deleţiilor
Identificarea agenţilor infecţioşi
Utilizarea PCR
•Identificarea Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice
•Identificarea Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile
nucleotidice)
•Identificarea Identificarea expresiei genice ( (RT RT-PCR PCR)
•Dactiloscopia Dactiloscopia genomică (filiaţie)
•Identificarea Identificarea agenţilor infecţioşi
•Identificarea Identificarea gradului de infecţie ( (quantitative quantitative PCR PCR)
Identificarea mutaţiilor punctiforme
12/11/2009
4

Stabilirea paternităţii (filiaţiei) Tehnica
Southern-blot
Hibridarea acizilor nucleici
•Unirea Unirea complementară a fragmentelor
(moleculelor) de acizi nucleici:
•ADN ADN de cercetat cu
•sonda sonda oligonucleotidică
•În În reacţie participă molecule monocatenare
•Moleculele Moleculele ADN ADN-ţintă ţintă sunt fixate
•Moleculele
Moleculele-sonde sonde sunt marcate radioactiv sau
fluorescent
•Identificarea Identificarea complexelor hibride se realizează
prin intermediul autoradiografiei
Utilizarea tehnicii
Southern Southern-blot blot
• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari
• Identificarea mutaţiilor punctiforme ce
afectează SR
• Dactiloscopia genomică RFLPs
Bazată pe RFLPs
Hibridizare cu sonde marcate
Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un
suport solid (pe membrane de nitroceluloză)
Tehnica Southern Southern-blot blot
Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN
Denaturarea şi
transferul ADN
pe membrane
Hibridare cu sonda
Autoradiografia
Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
RFLPs şi analiza genotipului
Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2
Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C
12/11/2009
C (mm)
B (Nm)
A (NN)
5

Tehnica Northern Northern-blot blot
Extragerea ARN Electroforeza ARN
Transferul ARN
pe membrane
Identificarea nivelului
de expresie şi a variantei
de splicing
Hibridare cu sonda
Autoradiografia
Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
Tehnica
Northern Northern-blot blot
•Extragerea Extragerea ARN din ţesutul ţintă
•Electroforeza Electroforeza ARN în condiţii de
denaturare
•Transfer Transfer pe membrană de
nailon
•Hibridarea Hibridarea cu sonda marcată
•Autoradiografia
Autoradiografia
Utilizarea tehnicii
Northern Northern-blot blot
•Identificarea Identificarea expresiei genice în anumite
ţesuturi, anumite condiţii
•Identificarea Identificarea variantei de splicing a proARNm
•Identificarea Identificarea nivelului de expresie
•Identificarea Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri)
12/11/2009
6

Secvenţierea ADN
Stabilirea secvenţei de nucleotide
Metoda chimică (tehnica Maxam Maxam-Gilbert, Gilbert, 197 1973)
Metoda dideoxi (tehnica SSanger,
nger, 197 1975)
Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi)
5’-ATTACA ATTACAAGATTACCATGT
GATTACCATGT-3’ 3’ catena codogen codogenă
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’ catena anticodogenă (matriţă)
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
5’-ATTA ATTAC-3’ 3’
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
5’-ATTA ATTACA-3’ 3’
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
5’-ATTA ATTACA CAA-3’ 3’
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
5’-ATTA ATTACA CAAG-3’ 3’
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
5’-ATTA ATTACA CAAGA-3’ 3’
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
5’-ATTA ATTACA CAAGA GAT-3’ 3’
3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
5’-ATTA ATTACA CAAGAT GATT-3’ 3’
A
T
G
C
5’-ATTA ATTACA-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAA-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGA-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGATT GATTA-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACC GATTACCA-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGA GAT-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGAT GATT-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACCA
GATTACCAT-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACCATG
GATTACCATGT-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAG-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACCAT
GATTACCATG-3’ 3’
5’-ATTA ATTAC-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGATTA GATTAC-3’ 3’
5’-ATTA ATTACA CAAGATTAC GATTACC-3’ 3’
5’-ATTA ATTA -- primer marcat P32 pentru ADN-polimerază
A, T, C, T – dNTP (2 (2’-dNTP) dNTP)
pentru sinteza noilor catene
A, T, C, T – ddNTP (2 (2’,3 ,3’-ddNTP dNTP)
pentru stoparea sintezei
A T C G
5’-ATTA ATTACA CAAGATTACCATGT
GATTACCATGT-3’ 3’
-
+
ADN mut ARNm mut Proteină an Caracter an
5’-ATT ATTACA CAAGATTACCATGT
GATTACCATGT-3’ 3’ mutaţie G G4→A 3’ 3’-TAA TAATGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA-5’ 5’
Transcripţie
5’-AUU AUUACA CAAGAUUACCAUGU
GAUUACCAUGU-3’ 3’ ARNm ARNmmut Translaţie
Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid polipeptidan Caracter fenotipic anormal
•Sinteza Sinteza enzimatică a
ADN
•Utilizarea Utilizarea în paralel a
nucleotidelor ce
conţin deoxiriboză şi
dideoxiriboză
•Stoparea Stoparea sintezei în
cazul incorporării
ddNTP
•Extragerea Extragerea ADN
•Denaturarea Denaturarea ADN
•Sinteza Sinteza catenelor
complementare utilizând
primeri marcaţi cu 32 P în
prezenţa dNTP şi ddNTP
•Electroforeza Electroforeza în condiţii
de denaturare
•Vizualizarea Vizualizarea fragmentelor
marcate prin
autoradiografie
Tehnica dideoxi
Tehnica dideoxi
12/11/2009
7

-
+
•Pregătirea Pregătirea
preparatelor de
cromozomi
•Denaturarea Denaturarea ADN
•Hibridarea Hibridarea cu sonda
marcată
•Vizualizarea Vizualizarea la
microscopul optic
(+) 5' TAAATGGCTA
TAAATGGCTA.......3'(-)
Hibridarea in situ
Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenţelor ARN
Hibridarea in situ cu
utilizarea probei sens (stânga)
şi antisens (dreapta)
Analiza
histochimică –
identificarea
proteinelor în ţesut
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici
Metoda automată
Hibridarea in situ pentru
depistarea secvenţelor ADN
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
cu nuclei interfazici
12/11/2009
8

Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor
nucleici:
1. Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de
gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de
reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor.
2. Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice
- prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii
copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor
patologii severe.
3. Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea
vectorilor de gene etc.).
4. Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în
diagnosticul bolilor infecţioase.
5. Identificarea polimorfismelor individuale în analiza
filiaţiei, în criminalistică.
12/11/2009
9