[X ] = [X] exp -∆G R Curs 8-9 Cataliza chimica Studiile asupra ...

[X ‡ ] = [X] exp -G‡
Curs 8-9
Cataliza chimica
Studiile asupra structurii si a proprietatilor cinetice ale enzimelor converg spre
urmatoarea concluzie: enzimele au situsuri de legare bine definite pentru substratele lor.
In decursul reactiilor enzimatice se formeaza intermediari covalenti. Interactiunile
enzima-substrat implica grupari bazice, acide, sau nucleofile.
Enzimele sunt proteine specifice, lucru care a fost sugerat de Emil Fisher inca din 1894.
Acesta a postulat faptul ca enzima si substratul au forme geometrice complementare,
forme care se potrivesc una peste cealalta. Acest model este cunoscut in literatura sub
numele de lacat-cheie. Desi acest model explica specificitatea enzimelor pentru substrat,
nu poate explica modul in care acestea sunt stabilizate in momentul in care ating starea de
tranzitie. In 1958 Daniel Koshland a sugerat o modificare a modelulul lacat-cheie
deoarece enzimele au structuri flexibile iar situsul activ este modificat ca urmare a
interactiunilor cu substratul. Astfel, substratul nu este captat de un situs catalitic rigid.
Catena laterala a aminoacizilor din situsul catalitic se “muleaza” intr-o maniera care sa-i
permita o interactiune eficienta cu substratul. In unele cazuri (glicozidazele) substratul isi
modifica usor conformatia dupa intrarea in situsul catalitic. Situsul catalitic se schimba
pana in momentul in care substratul este complet legat, moment in care se atinge forma
finala si incarcarile necesare catalizei.
Multe din conceptele catalizei se bazeaza pe teoria starii de tranzitie (principiile si
aplicatiile sale).
1. Teoria starii de tranzitie
Exista cateva teorii (teoria coliziunilor, etc) care descriu cinetica chimica.
Teoria starii de tranzitie este utilizata pentru stabilirea unor corelatii intre structura si
reactivitate. In starea fundamentala sunt considerate entitati fizice numai reactantii pe
cand in starea de tranzitie sunt cosiderati numai speciile instabile (energia libera cea mai
mare). Astfel, starea de tranzitie este caracterizata printr-un maxim in diagrama de
reactie, in care se urmareste dependenta energiei speciilor in decursul reactiei catalizate.
In starea de tranzitie se formeaza legaturi chimice noi concomitent cu ruperea altor
legaturi chimice. In cazul intermediarilor de reactie legaturile chimice sunt pe deplin
formate si energiile acestora sunt mult mai mici comparativ cu energia corespunzatoare
starilor de tranzitie.
Cea mai simpla modalitate de analiza a ratei de descompunere a unei specii este aceea
care considera ca starea fundamentala si starea de tranzitie sunt in echilibru
termodinamic, in asa fel incat concentratia poate fi calculata din diferentele de energie
(dintre starea de tranzitie si starea fundamentala, G
R
‡ ).
In cazul unei reactii unimoleculare concentratia speciei in
starea de tranzitie, [X ‡ ], si cea in stare fundamentala, [X],
depind de diferenta de energie, G ‡ , dintre cele doua stari:
Frecventa la care starea de tranzitie se descompune este
aceeasi cu frecventa de vibratie, , la care legatura se desface. Frecventa se poate obtine
din egalarea energiei corespunzatoare unui oscilator cu aceea calculata din teoria cuantica
(E = h = kT, unde k-constanta lui Boltzmann, h-constanta lui Planck).

Rata de descompunere a speciei X se poate
determina astfel:
Constanta vitezei de reactie de ordinul I
atribuita descompunerii speciei X este:
k1 = kT
h
exp -G‡
R
Astfel, cu cat valoarea G ‡ este mai mare cu
atat constanta de viteza este mai mica.
Explicatia consta in faptul ca numarul de
= [X ‡ -d[X]
] = [X]
dt
k1 = kT
h
exp S‡
R
kT
h
exp -G‡
R
Tinand cont de componentele entalpica si entropica ale
energiei de activare constanta vitezei de reactie se poate scrie:
exp -H‡
RT
molecule de reactant care au suficienta energie termica pentru a atinge starea de tranzitie
scade dramatic cu cresterea G ‡ . Majoritatea reactiilor chimice necesita mai multe etape.
Pentru o reactie care are doua etape: A I P
unde I este intermediarul reactiei, avem de-a face cu doua stari de tranzitie si doua
bariere de activare. Profilul diagramei la starea de tranzitie este in stransa legatura cu
vitezele de reactie relativa a celor doua etape. Daca energia de activare a primei etape
este mai mare decat a celei de-a doua, atunci prima etapa este mai lenta decat cea de-a
doua, si vice-versa. Intr-o reactie chimica care implica mai multe etape, etapa cu energia
starii de tranzitie cea mai ridicata induce o atenuare a vitezei reactiei globale si de aceea
poarta numele de etapa determinanta de viteza.
Catalizatorii reduc G ‡ (Ea)
Catalizatorii actioneaza in asa maniera incat micsoreaza energia libera a starii de tranzitie
comparativ cu reactia necatalizata. Diferenta dintre valorile G ‡ pentru reactiile catalizate
Ea si necatalizate (Ea’) indica eficienta catalizatorului. Cresterea constantei vitezei de
reactie (raportul dintre viteza reactiei catalizate si viteza reactiei necatalizate) este data de
e G‡/RT . De exemplu la 25 C cresterea constantei vitezei de reactie necesita o valoare
pentru G ‡ de 5,71 KJ/Mol, valoare care este apropiata cu jumatate din energia libera a
unei legaturi de hidrogen. Analog, pentru o crestere a vitezei de reactie cu sase ordine de
magnitudine este nevoie de o valoare a G ‡ de 34 KJ/Mol, care constituie o fractiune
din energia libera a unei legaturi covalente.
2. Cataliza acidobazica
generala
O enzima nu altereaza
energia libera de
reactie, in schimb
micsoreaza valoarea
G
Reactie necatalizata Reactie catalizata
‡ permitand astfel
atingerea rapida a
echilibrului chimic (in
care vitezele reactiei
directe si inverse sunt
egale) comparativ cu
situatia in care reactia este necatalizata.

In cazul in care G ‡ 0
(Ea 0) reactia decurge
spontan, iar daca G ‡
0 (Ea 0) are loc reactia
inversa.
Reactie exoterma Reactie endoterma
(reactia directa este favorizata) (reactia inversa este favorizata)
a) Semnificatia si aplicarea teoriei starii de tranzitie
Importanta teoriei starii de tranzitie reiese din diferentele energetice (energia Gibbs) care
apar intre starea de tranzitie si starea fundamentala. Aceaste diferente sunt importante in
special in cazul in care se compara diferenta de reactivitate a unor substrate sau viteza
unei reactii in cazul unui set de conditii (pH, tarie ionica).
b) Postulatul lui Hammond
Postulatul lui Hammond stipuleaza faptul ca daca in decursul unei reactii exista un
“intermediar” instabil atunci starea de tranzitie pentru reactie va avea o structura
asemanatoare cu cea a intermediarului. Aceasta fapt permite aproximarea structurii in
starea de tranzitie, fapt care permite prezicerea tipului de stabilizare necesar acestei stari.
De exemplu, carboxanionii sunt intermediari in reactia catalizata de lizozima. Dat fiind
faptul ca aceste specii sunt instabile se poate aproxima faptul ca starea de tranzitie poate
fi atribuita carboxanionului. Postulatul lui Hammond se aplica in special in cazul
reactiilor de ordinul I.
Principiile catalizei
1. Unde, de ce si cand este necesara cataliza?
Pentru a intelege de ce enzimele sunt eficiente in actul catalitic este necesara explicarea
vitezelor mici a reactiilor necatalizate in solutie.
Un exemplu il constituie chimotripsina sau lizozima, enzime care catalizeaza scindarea
esterilor. In cazul reactiei necatalizate
atacul apei la ester conduce la o stare de
tranzitie in care sarcina pozitiva este
localizata pe atomul de oxigen din
molecula de apa iar cea negativa pe
oxigenul carbonilic. In cazul hidrolizei
unui acetal starea de tranzitie este
caracterizata prin prezenta unei sarcini
pozitive pe atomul de carbon si a unui
ion alcoxid.

In ambele reactii starea de tranzitie este
nefavorabila datorita sarcinilor pozitive si
negative formate. Se impune astfel
stabilizarea acestor sarcini. Aceasta
stabilizare implica scaderea energiei starii de tranzitie.
In cazul sarcinii pozitive prezenta in starea de tranzitie a reactiei esterului cu apa
stabilizarea poate fi obtinuta prin transferul unui proton (de la apa) la o baza in timpul
reactiei. Acesta este un caz de cataliza bazica.
Analog, sarcina negativa care apare pe ionul alcoxi in cazul hidrolizei acetalului poate fi
stabilizata prin transferul protonului de la un acid (cataliza acida). Mai mult, sarcina
negativa poate fi stabilizata de ioni metalici (Zn 2+ , Mg 2+ ) fenomen cunoscut sub
denumirea de cataliza electrofila. Sarcina pozitiva a carbocationului poate fi stabilizata
de un ion carboxilat.
Toate reactiile mai sus mentionate functioneaza prin stabilizarea starii de tranzitie fara a
schimba mecanismul de reactie. Exista si situatii in care catalizatorii recurg la alte
modalitati de reactie. Cataliza nucleofila este intalnita in cazul transferului grupelor acil
sau a reactiilor hidrolitice. Astfel, reactia de hidroliza a anhidridei acetice este mai rapida
in prezenta piridinei datorita formarii rapide a ionului de acetilpiridiniu (intermediar
reactiv).
Cataliza bazica
Cataliza acida

Cataliza nucleofila este un exemplu de cataliza covalenta in care substratul este modificat
“provizoriu” prin formarea unei legaturi covalente cu catalizatorul fapt care conduce la
un intermediar reactiv. Exista si exemple numeroase de cataliza electrofila care se
bazeaza pe acelasi principiu (modificari covalente). De exemplu in reactia piridoxal
fosfatului se formeaza o baza Schiff, iar in cel al tiamin pirofosfatului electronii sunt
stabilizati prin delocalizare.
2. Cataliza acido-bazica generala
a. Detectia si masurarea vitezei de reactie
Vitezele reactiei de hidroliza a esterului sunt masurate prin cresterea concetratie de acid
sau baza din sistem. Viteza reactiei de hidroliza se masoara la un pH constant prin
mentinerea unui raport constant dintre forma bazica si acida a catalizatorului (utilizarea
unei solutii tampon). Este important sa se mentina constanta taria ionica a mediului de
reactie deoarece multe reactii sunt sensibile la schimbari ale concentratiei sarii. Pentru
hidroliza esterului s-a dovedit faptul ca valoarea constantei vitezei de reactie creste odata
cu marirea concentratiei formei bazice si de aceea este o cataliza bazica generala.
Tangenta obtinuta din dependenta vitezei de reactie de concentratia bazei este k2
(constanta de reactie de ordinul II).
b. Eficienta catalizei acido-bazice: ecuatia lui Brönsted
S-a constatat experimental faptul ca hidroliza unui ester (cataliza bazica generala)
este proportionala cu taria bazica a catalizatorului. Relatia dintre constanta de reactie de
ordinul 2 (k2) si concentratia bazei (catalizatorului) este data
de relatia:
Ecuatia (1) este cunoscuta sub denumirea de ecuatie
Brönsted. Valoarea coeficientului exprima sensibilitatea reactiei la valoarea pKa a
acidului conjugat bazei (catalizatorului). A este o constanta a carei valoare difera in
functie de tipul reactiei.
Ecuatiile Brönsted poate fi utilizata si in cataliza
generala acida (ex. hidroliza acetalilor):
log k2 = A + pKa (1)
log k2 = A - pKa (2)
Valorile coeficientilor si sunt intotdeauna
cuprinse intre 0 si 1 pentru cataliza acidobazica, deoarece pentru transferul protonului se
atribuie valoarea 1, iar daca nu exista transfer se atribuie valoarea 0. Valorilele uzuale
pentru hidroliza esterului sunt intre 0,3 si 0,5, iar la hidroliza acetalilor sunt de
aproximativ 0,6. Viteza de reactie (magnitudinea catalizei) depinde astfel de valorile
coeficientilor si respectiv pKa-ul catalizatorului. In termeni mai simpli, cu cat baza
este mai puternica cu atat cataliza bazica este mai eficienta, iar cu cat acidul este mai
puternic cu atat cataliza acida este mai eficienta.
c. Eficienta catalizei acido-bazice depinde de gradul de ionizare a catalizatorului
Gradul de ionizare al catalizatorului este un factor crucial pentru eficienta catalizei.
De exemplu, un acid cu pKa 5 este un catalizator (in cataliza acida) mai eficient la pH 7
decat unul cu pKa 7, deoarece aproximativ 99% din acidul cu pKa 5 este in forma ionizata
(1% este in forma activa). Cataliza acido-bazica este mai efectiva la pH 7 daca valorile
pKaului sunt aproximativ 7. Aceasta valoare poate fi atributa nucleului imidazolic din
histidina (care are o valoare a pKaului de 6-7) sau constantelor dielectrice ale situsului
catalitic din enzima. Multe reactii enzimatice sunt susceptibile la acizi sau baze. Catena

laterala a unor aminoacizi (aspartat, glutamat, histidina, tirozina si lizina) din lantul
polipeptidic al enzimei permite acestora sa actioneze asemeni unor catalizatori acizi sau
bazici. Astfel, abilitatea enzimelor de a aranja cateva grupe catalitice in jurul substratului
lor poate determina un mecanism de reactie de tip acido-bazic.
3. Cataliza intramoleculara
Daca in cazul reactiilor catalizate in solutie constantele vitezelor de reactie sunt de
ordinul 2, in cazul reactiilor care implica complexul enzima-substrat acestea sunt de
ordinul 1, existand grupe acide sau bazice care sunt parte integranta a catalizatorului.
Un exemplu de cataliza bazica este reactia de hidroliza a aspirinei. Comparativ cu
reactia de hidroliza necatalizata a unor compusi similari rata de reactie creste cu
aproximativ 100 de ori.
Vitezele de reactie pot fi masurate in cazul in care produsii de reactie sunt
colorati. Derivatii acidului succinic si ai aspirinei pot da reactii intramoleculare prin
atacul nucleofilului asupra legaturii esterice. Vitezele de reactii obtinute sunt considerabil
mai ridicate in cazul in care atacul este intramolecular:
Unul din cei mai importanti
factori in cataliza enzimatica este
entropia. Reactiile catalitice clasice in
solutie sunt lente deoarece aducerea
in vecinatate a catalizatorului si
subtratului presupune o scadere a
entropiei. Reactiile enzimatice
presupun obtinerea unui complex
enzima-substrat, astfel incat in starea de
tranzitie nu are loc pierderea entropiei de
translatie sau rotatie. Gruparile implicate
in cataliza enzimatica au o concentratie
efectiva mult mai mare comparativ cu
cele din reactiile bimoleculare (in
solutie). Entropia care se pierde este
compensata de energia de legare a
substratului la enzima.
4. Cataliza electrostatica
a) Apa obstructioneaza cataliza electrostatica in solutie apoasa
Energia de interactiune electrostatica dintre doua molecule incarcate aflate la distanta r
intr-un mediu cu constanta dielectrica D este data de:
E = e1e2/Dr
Daca in vid valoarea energiei de interactie a unui proton cu un electron aflati la o
distanta de 3,3 A este de –100 Kcal/Mol in mediul apos (D=79) aceasta valoare scade la
–1,3 Kcal/Mol.
b) Enzimele pot stabiliza starile de tranzitie polare mai eficient decat apa. Proteina este
un mediu heterogen in care constanta dielectrica, D, poate varia. Acest fapt este o
consecinta a suprapunerii dintre resturile alchil nepolare si legaturile amidice polare.
Calculele teoretice au demonstrat existenta a cel putin doua sau trei tipuri de dipoli in

enzima. Acesti dipoli au de obicei o orientare fixa directionandu-se spre substrat.
Enzimele utilizeaza parti din structura lor sau leaga ionii pentru a “solvata” starea de
tranzitie.
Regula lui Lipinski (1997) este una dintre principalele reguli utilizate in farmacocinetica
si are drept scop evaluarea unui potential medicament sau sa determine daca un compus
chimic cu o anumita activitate farmacologica si biologica are proprietati care sa-i permita
includerea acestuia in clasa compusilor activi asupra metabolismului uman. Aceast regula
descrie proprietatile moleculare importante in cazul farmacocineticii din organismul
uman, ce includ absorbtia, distributia, metabolismul si excretia.
Aceasta regula este importanta pentru imbunatatirea proprietatilor unui compus activ cu
scopul de a obtine compusi cu activitate si selectivitate superioara.
Regula lui Lipinski (regula celor 5) mentioneaza faptul ca, in general, un medicament
administrat pe cale orala nu trebuie sa sufere mai mult de o abatere de la criteriile
urmatoare:
Nu mai mult de 5 legaturi de hidrogen donoare;
Nu mai mult de 10 legaturi de hidrogen acceptoare;
O masa moleculara mai mica decat 500 Da;
Un coeficient de partitie, logP, mai mic decat 5.
C
H 3
O
CH3 N
O
O
CH 3
COOH
Aspirina
MW = 180 Da
Leg de H donor = 1
Leg de H accept = 4
logP =2.44
OH
C
Ru-486
MW = 429 Da
Leg de H donor = 1
Leg de H accep = 3
logP =4.74
CCH 3
C
H 3
C
H 3
O
O
O
O
Regula lui Lipinski pentru 4 compusi diferiti
O
H 3 COOC
Artemisinin
MW = 282 Da
Leg de H donor = 0
Leg de H accep = 5
logP =4.15
C
H 3
N
H
Cl
Amlodipina
MW = 407.5 Da
Leg de H donor = 3
Leg de H accep = 7
logP = - 0.17
CH 3
COOCH 2 CH 3
CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2

Regula lui Lipinski poate fi verificata pe diversi compusi. In figura anterioara sunt
calculati acesti parametri pentru aspirina, artemisinina (medicament care actioneaza
asupra unelor tulpini ale malariei), Ru-486 (compus care inhiba receptorii celulari ai
progesteronului si este folosit la intreruperea voluntara a sarcinii) si a amlodipinei
(substanta care blocheaza canalele de Ca 2+ ; folosit drept antihipertensiv-relaxeaza
muschii intinsi din peretele arterial, descrescand rezistenta periferica reducand astfel
presiunea sangvina).
5.Cataliza ionilor metalici
a. Cataliza electrofila.
In metalo-enzime ionii metalici joaca rol
de catalizator electrofilic, stabilizand sarcina
negativa care se formeaza. De exemplu, in cazul
carboxipeptidazei oxigenul carbonilic din
gruparea amidica a substratului este coordinat
cu ionul de zinc al enzimei. Coordinarea
polarizeaza legatura amidica la atacul nucleofil
si stabilizeaza intermediarul tetraedric. Formarea acestui tip de complex determina o
crestere a vitezei de reactie cu peste patru ordine de magnitudine.
b. Nucleofili la pH neutru.
Studii cinetice din chimia anorganica au dovedit faptul ca moleculele de apa care
se leaga de ionii metalici sunt potentiali agenti nucleofili. De exemplu, anhidraza
carbonica, o enzima care catalizeaza hidratarea CO2, are in interiorul situsului catalitic un
ion de zinc care este coordinat de trei cicluri imidazolice (provenite de la trei resturi de
histidina). Cel de-al patrulea ligand este o molecula de apa (pKa =7). Specia reactiva este
considerata a fi gruparea hidroxilica (provenita
din ionizarea apei) legata de ionul de zinc.
Mecanismul de actiune al anhidrazei carbonice

Exista si situatii mai complexe in cataliza cu ioni metalici. De exemplu, cobaltul din
vitamina B12 formeaza legaturi covalente cu atomii de carbon din substrat. De asemenea,
metalele actioneaza ca transportori de electroni in reactiile redox. Un exemplu il
constituie oxidarea reversibila a ionului de fier din hemul citocromului c.
6. Cataliza covalenta
a) Cataliza electrofila prin intermediul unei baze Schiff.
Un exemplu de activare a unui substrat este acela de formare a unei baze Schiff prin
condensarea unei amine cu un compus carbonilic. Baza Schiff rezultata poate fi protonata
la pH neutru . Sarcina pozitiva astfel formata poate stabiliza formarea sarcinii negative de
la atomul de carbon din pozitia . Dupa tautomerizarea la forma enaminica carbonul
metilenic este activat ca un nucleofil.
Acetoacetat decarboxilaza
Enzima catalizeaza decarboxilarea
acetatului la acetona si dioxid de
carbon. Reactia neenzimatica implica
expulzarea ionului enolat la pH
neutru.
Reactia enzimatica are loc prin formarea intermediara a unei baze Schiff cu un rest de
lizina. Dupa decarboxilarea produsului de condensare imina protonata este rapid
eliminata. Acest proces poate fi imitat in solutie prin folosirea anilinei drept catalizator.

Evidenta aparitiei acestui intermediar este demonstrata prin reducerea bazei Schiff cu
borohidrura, enzima rezultata avand un rest de izopropil-lizina.
Aldolaza si transaldolaza
Condensarea aldolica si reactia de clivare inversa pot fi catalizate de aceste
enzime ambele reactii decurgand prin intermediul unei baze Schiff. Reactia este similara
cu cea a acetoacetat carboxilazei. Reactia de condensare ilustreaza o alta functie a bazei
Schiff-activarea carbonului prin intermediul unei enamine.
b) Cataliza electrofila in cazul piridoxal fosfatului
Piridoxal-fosfatul (coenzima) poate fi implicat in formarea unei baze Schiff.
Nucleul de piridina stabilizeaza o sarcina negativa:
Indepartarea atomului de hidrogen din pozitia conduce la un intermediar care
poate reactiona in doua moduri diferite:
-racemizarea-atacul protonului la iminoacid;

-transaminarea-atacul protonului la carbonul carbonilic din piridoxal conduce la o
baza Schiff a unui -cetoacid cu piridoxamina. Hidroliza acestei baze conduce la cetoacid
cu piridoxamina.
-decarboxilarea
In cazul in care
aminoacidul este
aspartat produsul
intermediar este o baza
Schiff care faciliteaza
decarboxilarea
acetoacetatului:
Cataliza electrofilatiamin
pirofosfat
Tiamin pirofosfatul
este o coenzima care
se leaga covalent la
substrat pentru a
stabiliza o sarcina negativa. Sarcina pozitiva de pe atomul de azot permite ionizarea
atomului de carbon din pozitia 2 prin stabilizare electrostatica. Carbonul ionizat este un
potential nucleofil care poate ataca compusii carbonilici pentru a forma legaturi carboncarbon.
Transcetolaza este o enzima care contine tiamin pirofosfatul si poate transfera printr-o
reactie similara o grupa dihidroxietilica intre 5-fosfatul de D-xiluloza 5-fosfatul de Driboza.
Cataliza nucleofila
In enzime, cele mai frecvente grupari nucleofile care intervin in cataliza sunt:
a) gruparea hidroxil a serinei-intalnita in serin proteaze, colinesteraze, esteraze,
lipaze si fosfataze (acide si alcaline);
b) gruparea hidroxi tirozinica este agent nucleofil in glutamin sintetaza si in
topoizomeraze;
c) gruparea tiolica a cisteinei-intalnita la tiol proteaze (papaina, ficina si bromelaina)
si gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza;
d) imidazolul din histidina functioneaza de obicei in cataliza acido-bazica prin
cresterea nucleofilicitatii gruparilor hidroxilice si tiolice mai sus mentionate, dar
exista si situatii cand actioneaza ca nucleofil (in transferul grupei fosfat);
e) gruparea amino (lizinica) intervine in cataliza acetoacetat decarboxilazei,
aldolazei, transladolazei;
f) gruparea carboxilica (aspartat) este des intalnita in ATPaze (K + /Na + , Ca 2+ ).
Hidroliza peptidelor de catre proteaze constituie un exemplu clasic de cataliza nucleofila.
Peptidele, compusi relativ stabili, sunt convertiti la specii mult mai reactive (tio/ester acilenzime),
care sunt rapid hidrolizate.

Concluzii-factorii implicati in cataliza enzimatica
Reactiile necatalizate sunt reactii mai lente deorece ele implica formarea unei sarcini
positive sau negative mai putin stabilizate in starea de tranzitie. Aceste reactii necesita
aducerea unor molecule in vecinatate, lucru care este corelat cu pierderea entropiei.
Aceste neajunsuri sunt atenuate in cazul reactiilor catalizate de enzime: starile de tranzitie
sunt stabilizate electrostatic prin prezenta unor resturi acide, bazice, a ionilor metalici sau
a unor dipoli prezenti in enzima. Cataliza covalenta este folosita pentru a crea trasee de
reactie cu energie cat mai redusa. In acest tip de cataliza entropia scade datorita formarii
legaturilor covalente care apar in decursul formarii complexului enzima substrat. Energia
castigata in reactiile enzimatice este consumata pentru sinteza enzimelor si pentru legarea
substratului la enzima.
Efecte cinetice izotopice
Informatii despre natura legaturilor formate sau disociate in starea de tranzitie pot fi
observate prin intermediul efectelor izotopice de substitutie asupra vitezei de reactie.
Efecte izotopice primare
Efectul isotopic primar se observa in urma clivarii unei legaturi chimice in cazul
substitutiei unui atom (implicat in aceasta legatura) cu izotopul sau in situatia cand
aceasta scindare survine in etapa determinanta de viteza. De exemplu, s-a constatat faptul
ca rata de clivare a unei legaturi C-D este de cateva ori mai lenta decat a legaturii C-H.
Cu cat atomul este mai greu cu atat frecventa de vibratie a legaturii este mai mica si
implicit energia starii fundamentale este mai joasa. Moleculele sau atomii mai usori au
frecvente de vibratie mai mari si ca atare energii mai mari. La 25 C ruperea legaturii C-
H este de 7 ori mai eficienta decat a legaturii C-D. In practica efecte izotopice cinetice
intre 2 si 15 indica faptul ca o legatura C-H este scindata in starea de tranzitie. De
exemplu, valori de 3-5 au fost gasite pentru kH/kD in cazul transferului ionului de hidrura
de la substrat la NAD + in reactia catalizata de alcool dehidrogenaza.
Legaturile C-T sunt disociate mult mai greu decat legatura C-D datorita masei
mari a tritiului.
In cazul substitutiei 14 N cu 15 N sau a 16 O cu 18 O rata de disociere difera doar cu
cateva procente. Efectele izotopice cinetice 16 O / 18 O au fost utilizate pentru a dovedi ca
exista o schimbare in etapa determinanta de viteza a reactiei catalizate de galactoxidaza.
Efecte izotopice secundare
Aceste efecte sunt cauzate de clivarea unei legaturi dintre un atom adiacent
atomului substituit (izotopului). Efectele izotopice secundare sunt cauzate mai mult de
schimbarile de hibridizare care insotesc ruperea legaturii decat cele care apar la clivarea
acesteia. Cel mai elocvent exemplu este cel al substitutiei atomului de hidrogen cu tritiu
la atomul de carbon din pozitia 1 al substratului lizozimei. Un ion de carboniu (hibridizat
sp 2 ) este format in reactia de clivare a substratului:
R’
R
C
OPh
D
R’
R
+
C D

Valoarea raportului kH/kD este de 1.11 pentru reactiile enzimatice.
Efecte izotopice de solvent
Aceste efecte au fost evidentiate prin compararea constantelor vitezelor de reactie
in H2O si D2O. Solvatarea substratului si enzimei precum si efectele izotopice secundare ,
efecte cauzate de schimbarea atomilor de H cu D din substrat, pot contribui la efecte
izotopice de solvent. Efectele izotopice din reactiile enzimatice sunt mult mai dificil de
analizat deoarece proteina are o multime de protoni care pot fi schimbati cu atomii de
deuteriu din D2O. Exista si situatii in care se masoara ratele de reactie in amestecuri
izotopice (H2O si D2O). Aceasta analiza poate oferi informatii utile la numarul situsurilor
implicate in reactia catalitica.
Determinarea vitezei de reactie
Pentru determinarea vitezei de reactie este necesar sa se obtina o curba de reactie.
Pentru transformarea substratului (S) in produs (P) curba de conversie consta intr-o
descrestere (crestere) exponentiala a concentratiei substratului (produsului):
[S - Smin] = [S0 - Smin] e -kt
[S0], [P0] – concentratiile initiale ale
substratului si produsului de reactie
[Smin] – concentratia minima a substratului
(t )
[Pmax] – concentratia maxima a produsului
[S], [P] – concentratiile substratului si
produsului de reactie la momentul t.
Viteza de reactie corespunde tangentei
rezultate din curba de consumare a
substratuui sau de formare a produsului:
v = - dS
dt
=
dP
dt
[P – P0] = [Pmax – P0] (1 - e -kt ) unde:
Din curbele de reactie se poate observa faptul ca viteza de reactie scade in timp. Aceasta
scadere poate fi asociata cu urmatoarele cause: descresterea stabilitatii si a gradului de
saturare a acestora, cresterea vitezei reactiei inverse (creste concentratia produsului de
reactie).
Enzimologistii utilizeaza viteza de reactie initiala drept o masura constantele vitezei de
reactie. In faza initiala a unei reactii enzimatice conversia substratului in produs este mica
si poate fi considerata constanta si egala cu concentratia initiala a substratului. Astfel,
reactia inversa poate fi neglijata, iar posibilele efecte de inhibitie ale produsului nu sunt
semnificative. In stadiul initial al reactiei stabilitatea enzimei este maxima. Pentru a
obtine viteza initiala se traseaza o tangenta la curba de reactie (cat mai aproape de
punctul de start). Curbele de reactie au portiuni liniare la conversie mai mica de 20% a
substratului in produs. Viteza de reactie initiala trebuie sa fie proportionala cu
concentratia enzimei.
Concetratia
S O
P O
Timp
P max
S min
Figura 1. Modificarea concentratilor substratului (S) si a
produsului de reactie (P) pornind de la valorile initiale (S0 si
P0) pentru a obtine valorile finale (S min si P max)

Curbele de progres ale reactiei variaza in functie de pH, temperatura, tarie ionica,
polaritate, natura substratului si de concentratiile enzimei si a coenzimei.
Ecuatii folosite in cinetica enzimatica
Cinetica starii stationare
Conceptul de stare stationare este larg utilizat pentru sistemele dinamice. Acesta
se refera in general la situatii in care o cantitate particulara este constanta (in stare
stationara) deoarece rata de formare a sa este egala cu rata sa de distrugere. De exemplu,
populatia unei tari este in stare stationara atunci cand rata natalitatii si a imigratiei sunt
egale cu rata mortalitatii si a emigratiei. In mod analog, concentratia unui metabolit intr-o
celula este in stare stationara cand acest compus este produs cu o viteza egala cu viteza sa
de degradare. In cazul unei reactii dintre o enzima si o cantitate mare de substrat exista o
etapa initiala (stare prestationara) in care concentratiile intermediarilor cresc pana la
stabilirea starii stationare a fiecaruia. O data ce intermediarii ating starea stationara,
viteza de reactie se schimba incet in decursul timpului. Starea stationara este o
aproximatie deoarece substratul este consumat in decursul procesului enzimatic, dar
poate oferi informatii asupra vitezei de reactie intr-un interval ingust de timp (atunci cand
concentratia substratului nu se modifica semnificativ).
Daca pentru analiza mecanismelor chimice din cadrul catalizei enzimatice sunt
adecvate determinarile cinetice in starea prestationara aplicarea cineticii starii stationare
este importanta pentru intelegerea metabolismului, deoarece permite masurarea
activitatea catalitice a enzimei in conditiile starii stationare din vivo (celula).
Ecuatia Michaelis-Menten
Pentru obtinerea acestei ecuatii se pleaca de la urmatoarele premize: concentratia enzimei
este neglijabila comparativ cu concentratia substratului (datorita eficientie catalitice
deosebite a enzimei), viteza de reactie initiala (bazata pe formarea primelor catorva
procente de produs sau pe consumul de substrat) schimbarile de concentratie ale
produsului sau substratului nu sunt semnificate. De aceea in aceste modificarile care apar
la concentratiile reactivilor sunt in general liniare cu desfasurarea reactiei (in timp).
S-a constat experimental faptul ca v este direct proportional cu concentratia enzimei, [E]0.
Oricum, viteza de reactie urmeaza o cinetica de “saturatie” in raport cu concentratia
substratului, [S]. La concentratii
suficient de mici ale substratului, v
creste liniar cu [S].
Odata cu cresterea lui [S] aceasta
relatie de liniaritate dispare si v creste
mai lent comparativ cu [S] (la o
valoare de saturatie a acesteia)
atingand o valoare limita a vitezei
vmax. Acest lucru poate fi exprimat
cantitativ de ecuatia Michaelis-
Manten, una dintre ecuatiile de baza
din cinetica enzimatica:

unde: kcat [E]0 = vmax
Concentratia substratului la care v = vmax/2 este cunoscuta sub numele de constanta
Michaelis, KM. La concentratii foarte mici ale substratului ([S]KM) viteza este direct
proportionala cu concentratia substratului:
Interpretarea fenomenelor cinetice pentru reactia enzimei cu un singur substrat
In 1913, L. Michaelis and M. L. Menten au dezvoltat teoriile cercetatorilor anteriori. Ei
au propus urmatoarea schema:
Reactia catalitica poate fi divizata in doua procese: enzima si substratul se combina intr-o
prima etapa pentru a da nastere la complexul enzima-substrat, ES. Aceasta etapa este
rapida si reversibila si nu este insotita de schimbari chimice (enzima si substratul
interactioneaza prin intermediul fortelor fizice). Procesul chimic se desfasoara in a doua
etapa cu o constanta catalitica de ordinul I, kcat. Ecuatiile care conduc la expresia
Michaelis Menten sunt:
De asemenea, concentratia totala a enzimei, [E]0, si cea a enzimei libere , [E], pot fi
corelate prin ecuatia:
Din cele 3 ecuatii mai sus mentionate rezulta
urmatoarea expresie:
si implicit la relatia:
Ultima ecuatie este de fapt ecuatia Michaelis Menten unde constanta de disociere Ks este
egala cu KM.
Exista, desigur, si un complex enzima-produs, EP, a carei formare poate fi reversibila. In
analizele mai sus mentionate se considera faptul ca disocierea acestui complex (EP) este
atat de rapida incat reactia inversa poate fi ignorata. Dat fiind faptul ca vitezele de reactie
sunt masurate in momentul in care o cantitate mica de substrat este scindata (respectiv o
cantitate mica de produs este formata) se poate neglija acumularea lui EP.