infecţii asimptomatice cu transmitere sexuală. utilitatea ... - Gr.T. Popa
infecţii asimptomatice cu transmitere sexuală. utilitatea ... - Gr.T. Popa infecţii asimptomatice cu transmitere sexuală. utilitatea ... - Gr.T. Popa
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi FACULTATEA DE MEDICINA Domeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Infectii asimptomatice cu transmitere sexuală. Utilitatea clinică a determinării cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor cu risc înalt de HPV Conducător doctorat Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Iancu IAŞI, 2011 Doctorand Ramona Gabriela Ursu
- Page 2 and 3: Membrii - referenți specialiști a
- Page 4 and 5: CUPRINS PARTEA GENERALĂ 1. Introdu
- Page 6 and 7: sistematic raportate, motiv pentru
- Page 8 and 9: importante consecinţe practice pen
- Page 10 and 11: duce la valori total diferite ale i
- Page 12 and 13: Fig. 2: Cele mai frecvente tipuri d
- Page 14 and 15: 5. Optimizarea metodei de detecţie
- Page 16 and 17: Fig. 3: Şablon de interpretare, ma
- Page 18 and 19: Threshold cycle / Ct - primul ciclu
- Page 20 and 21: 7. Validarea tehnicii de genotipare
- Page 22 and 23: laboratoare au utilizat 3 metode, i
- Page 24 and 25: Tabel II: Rezultatele obținute la
- Page 26 and 27: Datele anamnestice ale pacientelor
- Page 28 and 29: Concluzii: • genotiparea prin tes
- Page 30 and 31: C. “RUN”: odată setate godeuri
- Page 32 and 33: Sesiunea I Sesiunea II Sesiunea III
- Page 34 and 35: Cu ajutorul programului SPSS versiu
- Page 36 and 37: 10. Testarea ADN/HPV post-interven
- Page 38 and 39: - retestare prin genotipare la 6 lu
- Page 40 and 41: 11. Evaluarea riscului de evoluție
- Page 42 and 43: Pentru pacientele care au fost pozi
- Page 44 and 45: conțină cunoștinte despre faptul
- Page 46 and 47: pozitive, ar trebui evaluate colpos
- Page 48 and 49: infecţiei persistente, ce impune s
- Page 50 and 51: 15. Perspectivele pe care le deschi
Universitatea de Medicină şi Farmacie<br />
“<strong>Gr</strong>. T. <strong>Popa</strong>” Iaşi<br />
FACULTATEA DE MEDICINA<br />
Domeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE<br />
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT<br />
Infectii <strong>asimptomatice</strong> <strong>cu</strong><br />
<strong>transmitere</strong> <strong>sexuală</strong>. Utilitatea<br />
clinică a determinării cantitative<br />
prin Real Time PCR a genotipurilor<br />
<strong>cu</strong> risc înalt de HPV<br />
Conducător doctorat<br />
Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Ian<strong>cu</strong><br />
IAŞI, 2011<br />
Doctorand<br />
Ramona Gabriela Ursu
Membrii – referenți specialiști ai comisiei de doctorat au fost numiți<br />
prin decizia nr. 15007 din 3.08.2011:<br />
Prof. Univ. Dr. Mircea Onofries<strong>cu</strong> – UMF „<strong>Gr</strong>igore T. <strong>Popa</strong>”, Iași<br />
Prof. Univ. Dr. Simona Ruță – UMF „Carol Davila”, Bu<strong>cu</strong>rești<br />
Prof. Univ. Dr. Roxana Moldovan – UMF „Victor Babeș”, Timișoara<br />
Susținerea publică a tezei de doctorat va avea loc în data de 10.11.2011, ora<br />
9.00, în sala SOCIETĂȚII DE MEDICI ȘI NATURALIȘTI, IAȘI.<br />
2
Universitatea de Medicină şi Farmacie “<strong>Gr</strong>. T. <strong>Popa</strong>” Iaşi<br />
FACULTATEA DE MEDICINA<br />
Domeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE<br />
TEZĂ DE DOCTORAT<br />
REZUMAT<br />
Infecţii <strong>asimptomatice</strong> <strong>cu</strong> <strong>transmitere</strong> <strong>sexuală</strong>.<br />
Utilitatea clinică a determinării cantitative prin Real Time PCR a<br />
genotipurilor <strong>cu</strong> risc înalt de HPV<br />
Conducător doctorat<br />
Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Ian<strong>cu</strong><br />
IAŞI<br />
2011<br />
3<br />
Doctorand<br />
Ramona Gabriela Ursu
CUPRINS<br />
PARTEA GENERALĂ<br />
1. Introducere<br />
2. Stadiul actual al <strong>cu</strong>noașterii<br />
2.1. Structura papillomavirusurilor<br />
2.1.1.Componente virale și proprietăți fizice<br />
2.1.2.Genomul HPV și ciclul replicării virale<br />
2.2. Clasificarea papillomavirusurilor<br />
2.3. Istoria naturală a infecției HPV<br />
2.3.1. Caracteristicile epiteliului cervical<br />
2.3.2. Transmiterea infecției HPV<br />
2.3.3. Progresia leziunilor<br />
2.4. Mecanisme carcinogenetice<br />
2.4.1. Capacitatea transformantă a HPV<br />
2.4.2. Interacțiunea HPV <strong>cu</strong> factorii de mediu<br />
2.5. Metode de diagnostic ale cancerului cervical și a leziunilor precanceroase<br />
2.5.1. Metode de inspecție vizuală<br />
2.5.2. Metode citologice și histologice<br />
2.5.3. Metode de biologie mole<strong>cu</strong>lară<br />
2.6. Alternative terapeutice ale leziunilor precanceroase și ale cancerului<br />
cervical<br />
2.7. Prevalența, incidența, persistența și clearance-ul infecției HPV<br />
2.8. Profilaxia cancerului cervical și a leziunilor precanceroase<br />
Bibliografie<br />
PARTEA PERSONALĂ<br />
3. Obiectivele studiului<br />
4. Epidemiologia infecției <strong>cu</strong> HPV<br />
5. Optimizarea metodei de detecție a 37 genotipuri HPV<br />
6. Optimizarea tehnicii Real Time PCR pentru <strong>cu</strong>antificarea HPV 16 și a HPV 18<br />
7. Validarea tehnicii de genotipare prin participarea la HPV Proficiency Testing,<br />
WHO<br />
8. Prevalența și distribuția genotipurilor HPV în rândul femeilor din zona Moldovei<br />
9. Corelații ale încărcăturii virale a HPV 16 și HPV 18 <strong>cu</strong> gradul displaziei cervicale<br />
și <strong>cu</strong> factorii de risc ai neoplaziei cervicale<br />
10. Testarea ADN/HPV post intervenție chirurgicală excisională<br />
11. Evaluarea ris<strong>cu</strong>lui de evoluție către neoplazia cervicală pentru pacientelor HIV +<br />
12. Infecții <strong>asimptomatice</strong> <strong>cu</strong> <strong>transmitere</strong> <strong>sexuală</strong><br />
13. Concluzii generale<br />
14. Originalitatea contribuțiilor proprii<br />
15. Perspectivele pe care le deschide teza<br />
Bibliografie<br />
4
1. Introducere<br />
Cei mai frecvenți agenți etiologici ai infecțiilor <strong>cu</strong> <strong>transmitere</strong> <strong>sexuală</strong> (ITS)<br />
sunt Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Haemoplilus ducreyi,<br />
Chlamydia trachomatis, virusul herpes simplex 2, virusul papilloma uman,<br />
Trichomonas vaginalis. Este bine<strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>t faptul că cele mai multe ITS sunt<br />
simptomatice, dar nu se <strong>cu</strong>noaște frecvența și importanţa <strong>infecţii</strong>lor <strong>asimptomatice</strong><br />
în <strong>transmitere</strong>a ITS. Pe baza prezenței simptomelor, indivizii pot fi divizaţi în mai<br />
multe categorii: indivizi “simptomatici” (simptomele sunt prezente); indivizi <strong>cu</strong><br />
infecţie “inaparentă” (individul prezintă simptome dar nu sunt re<strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>te ca fiind<br />
produse de o ITS); persoane “<strong>asimptomatice</strong>”- aceasta categorie este importantă,<br />
deoarece numai pacienţii “simptomatici” vor solicita tratament specific. Dintre<br />
infecțile produse de agenți etiologici amintiți, numai în cazul şancrului moale,<br />
majoritatea indivizilor sunt simptomatici, <strong>cu</strong> un număr considerabil de <strong>infecţii</strong><br />
inaparente. Studiile de istorie naturală care analizează <strong>infecţii</strong>le <strong>cu</strong> HPV, Neisseria<br />
gonorrhoeae şi Chlamydia trachomatis indică faptul că aceşti indivizi rămân în<br />
mod caracteristic asimptomatici, pe când indivizii <strong>cu</strong> herpes genital prezintă în mod<br />
tipic infecţie inaparentă şi nu asimptomatică.<br />
Dintre toți acești agenți care produc infecții genitale, studiul din cadrul tezei<br />
de doctorat a analizat doar infecțiile produse de HPV.<br />
Cancerul cervical este al treilea cancer diagnosticat ca frecvenţă şi a patra<br />
cauza de deces prin cancer în rândul femeilor din întreaga lume, însumând, pentru<br />
anul 2008, 9% (530.000) din totalul neoplaziilor noi şi 8% (275.000) din totalul<br />
deceselor prin cancer. Peste 85% din decesele înregistate au fost semnalate în țările<br />
în <strong>cu</strong>rs de dezvoltare, incidenţa cea mai ridicată la nivel mondial pentru cancerul<br />
cervical fiind regasită în Africa, Asia și America de Sud, iar cele mai scăzute valori<br />
au fost semnalate în Asia de Est, Australia și America de Nord (1). În lipsa aplicării<br />
unor măsuri preventive susţinute, se preconizează că decesele datorate cancerului<br />
de col uterin ar putea creşte <strong>cu</strong> aproape 25% în următorii 10 ani (2). Pe de altă<br />
parte, majoritatea femeilor din ţările în <strong>cu</strong>rs de dezvoltare nu au acces la programele<br />
de profilaxie a cancerului de col uterin, ceea ce explică diagnosticarea acestei forme<br />
de cancer în stadii care depăşesc prin severitate, capacităţile terapeutice actuale (3).<br />
România, <strong>cu</strong> o populaţie de 9.44 milioane femei <strong>cu</strong> ris<strong>cu</strong>l de a dezvolta<br />
cancer de col uterin, se situează pe primul loc în Europa în ceea ce priveşte<br />
incidenţa (23.9 0/0000) şi mortalitatea (11.6%) prin cancerul de col (iunie 2010)<br />
(4). Estimările actuale indică faptul că în fiecare an aproximativ 3450 de femei sunt<br />
diagnosticate <strong>cu</strong> cancer de col uterin şi aproape 2100 mor din cauza bolii. Deşi după<br />
formularea relaţiei de cauzalitate dintre HPV şi cancerul de col uterin, în<br />
majoritatea ţărilor au fost iniţiate studii extinse în vederea <strong>cu</strong>noaşterii prevalenţei şi<br />
distribuţiei infecţiei <strong>cu</strong> HPV (Human Papilloma Virus), în România, studii similare<br />
au fost întreprinse sporadic, pe loturi nesemnificative, iar datele rezultate nu au fost<br />
5
sistematic raportate, motiv pentru care, despre România se afirmă că „nu sunt date<br />
disponibile” despre aceşti indicatori (Raport OMS, 2009). În acest context, se<br />
justifică necesitatea studiilor privind răspândirea acestei <strong>infecţii</strong>, ca argument<br />
ştiinţific pentru eficienţa vaccinării pe scară largă, şi nu în ultimul rând, pentru<br />
instituirea programelor naţionale de supraveghere şi screening pentru populaţia la<br />
risc (5).<br />
Harald zur Hausen a formulat, în 1976, ipoteza că HPV joacă un rol<br />
important în etiologia cancerului de col uterin, identificând împreună <strong>cu</strong> echipa sa,<br />
în perioada 1983-1984, genotipurile HPV 16 şi HPV 18 în tumori ale cervixului;<br />
descoperirea a fost răsplătită <strong>cu</strong> Premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie (2008)<br />
(6).<br />
Rolul HPV în oncogeneză este demonstrat <strong>cu</strong> certitudine nu numai pentru<br />
cancerul de col uterin ci şi în etiologia altor tipuri de cancere anogenitale (anus,<br />
vulvă, vagin, penis) sau cancere ale capului şi gâtului. Genotipurile HPV 16 şi 18<br />
sunt responsabile pentru aproximativ 70% din toate de cazurile de cancer de col<br />
uterin din întreaga lume, fiind re<strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>te ca înalt oncogene, împreună <strong>cu</strong> alte<br />
serotipuri (e.g. 31, 35, 52 sau 58) (7).<br />
Spre deosebire de alte neoplazii, cancerul de col uterin poate fi prevenit<br />
prin programe de screening concepute pentru a identifica şi trata leziunile<br />
precanceroase. Acestea presupun: metode de inspecție vizuală, metode bazate pe<br />
analiza histologică și citologică a ţesuturilor infectate şi nu în ultimul rând, prin<br />
metode de testare a ADN/HPV. Terapia leziunilor precanceroase poate fi<br />
chirurgicală, prin tehnici distructive (e.g. crioterapie, electrocauterizare,<br />
termocoagulare), sau prin tehnici de excizie, de îndepărtare chirurgicală (LEEP –<br />
loop electrosurgical excision procedure – procedura de excizie prin<br />
diatermocauterizare şi LLETZ –loop electrosurgical excision of the transformation<br />
zone – excizia chirurgicală a zonei de transformare). Urmărirea pacientelor după<br />
aceste proceduri chirurgicale, presupune colposcopie, eventual, testarea ADN /<br />
HPV (8).<br />
Perspectiva studiilor epidemiologice privind incidenţa şi prevalenţa<br />
<strong>infecţii</strong>lor <strong>cu</strong> HPV se va răsfrânge în trecerea de la profilaxia de tip se<strong>cu</strong>ndar<br />
(screening), la profilaxia primară (prin vaccinare), în paralel <strong>cu</strong> eficientizarea<br />
programelor de promovare a sănătăţii (9).<br />
În prezent sunt comercializate pe scară largă, la nivel mondial, două<br />
vaccinuri HPV. Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) re<strong>cu</strong>noaşte importanţa<br />
cancerului de col uterin ca problemă globală de sănătate publică şi recomandă<br />
vaccinarea HPV, ca vaccinare de rutină (10).<br />
6
3. Obiectivele studiului<br />
Lipsa datelor într-o țară aflată pe primul loc în Europa în ceea ce<br />
privește incidenta si mortalitatea prin cancer cervical, necesitatea<br />
a<strong>cu</strong>mulării de date științifice utile decidenților politici pentru stabilirea<br />
strategiei de prevenire și control a BTS (boli <strong>cu</strong> <strong>transmitere</strong> <strong>sexuală</strong>),<br />
inclusiv infecțiile HPV, au condus la stabilirea următoarelor obiective<br />
științifice ale acestei teze de doctorat:<br />
1. optimizarea și validarea metodelor de genotipare utilizate pentru<br />
diagnosti<strong>cu</strong>l <strong>infecţii</strong>lor determinate de HPV și pentru determinarea<br />
încărcăturii virale;<br />
2. evaluarea prevalenței și distribuției infecției HPV în lotul de studiu,<br />
ca argument util strategiilor de vaccinare;<br />
3. evaluarea corelațiilor între nivelul încărcăturii virale a ADN HPV 16<br />
& 18 și gradul displaziei cervicale, în vederea intervenţiei terapeutice<br />
în stadii incipiente;<br />
4. evaluarea prin teste ADN HPV a pacientelor post intervenție<br />
excisională, pentru aprecierea statusului eradicării /persistenţei<br />
infecţiei;<br />
5. evaluarea prevalenței infecției HPV în rândul pacientelor HIV<br />
pozitive;<br />
6. evaluarea prevalenței infecției HPV în rândul persoanelor<br />
<strong>asimptomatice</strong>;<br />
7. aprecirea contribuţiei co-factorilor implicaţi în oncogeneza cervicală.<br />
4. Epidemiologia infecţiei <strong>cu</strong> HPV<br />
La începutul anilor ’90 studii epidemiologice bazate pe tehnici de<br />
biologie mole<strong>cu</strong>lară şi cercetări privind istoria naturală a infecţiei <strong>cu</strong> Human<br />
Papilloma Virus (HPV) localizată la nivelul tractului genital, au adus dovezi<br />
suficient de puternice pentru a atribui un rol cauzal determinant al HPV în<br />
inducerea cancerului cervical.<br />
Această asociere a fost evaluată pe baza criteriilor de cauzalitate<br />
elaborate de experţi din colectivitaţi de cercetare, de la institute internaţionale de<br />
renume. Modelul propus de această relaţie de cauzalitate este valabil la nivel<br />
mondial şi nu există alte dovezi alternative care să explice etiologia cancerului<br />
cervical. HPV a fost astfel propus drept “cauză necesară” a cancerului cervical.<br />
Concret, conceptul de cauză necesară implică faptul că neoplazia cervicală nu se<br />
poate dezvolta în absenţa persistenţei AND/HPV. Stabilirea acestei relaţii de<br />
cauzalitate a condus la dezvoltarea sistemelor de detecţie ADN/HPV, <strong>cu</strong><br />
7
importante consecinţe practice pentru diagnosti<strong>cu</strong>l precoce al displaziilor<br />
cervicale şi pentru monitorizarea încărcăturii virale a ADN-ului genotipurilor<br />
oncogene. De asemenea, această descoperire a dus la iniţierea programelor de<br />
prevenţie primară a infecţiei determinate de HPV, prin descoperirea formulei<br />
vaccinale.<br />
Dovada etiologică a implicării HPV în producerea cancerului cervical a<br />
fost demonstrată de studii populaţionale în întreaga lume.<br />
Studii de prevalenţă au demonstrat că, în condiţii optime de testare<br />
(probe de ţesut adecvate şi tehnici sensibile de diagnostic), ADN/HPV poate fi<br />
identificat în toate probele de cancer cervical. Fac excepţie doar forme rare de<br />
limfoame cervicale, sarcoame şi alte tipuri histologice rare.<br />
Studiile caz-control au demonstrat în mod constant ris<strong>cu</strong>l pentru femeile<br />
pozitive <strong>cu</strong> genotipuri înalt oncogene (genotipuri HR HPV – High Risk HPV). De<br />
a dezvolta cancer cervical pentru femeile HR HPV pozitive, în comparaţie <strong>cu</strong><br />
loturile martor. Studiile comparative au presupus testarea femeilor care aveau<br />
caracteristici similare <strong>cu</strong> cele ale pacientele din lotul de studiu: vârstă, status<br />
educaţional, expunerea la factori de risc adiţionali. Pacientele HPV pozitive<br />
pentru 16 sau 18 se consideră a avea un risc mult mai cres<strong>cu</strong>t decât pacientele<br />
infectate <strong>cu</strong> alte serotipuri. Din acest motiv, serotipurile 16 şi 18 fac parte din<br />
categoria HR HPV, împreună <strong>cu</strong> genotipurile 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,<br />
59, 68.<br />
Sudiile de cohortă (femei care au fost urmărite în timp prin repetarea<br />
testării ADN/HPV şi a examenelor citologice Papanicolau) au demonstrat că<br />
ris<strong>cu</strong>l absolut de progresie a leziunilor induse de HPV 16 sau 18 către neoplazia<br />
cervicală intraepitelială de grad 3 (CIN – Cervical Intraepithelial Neoplasia) este<br />
foarte mare în comparaţie <strong>cu</strong> infecţia <strong>cu</strong> celelalte genotipuri înalt oncogene (1).<br />
Programele de prevenţie primară (prin vaccinare) şi se<strong>cu</strong>ndară (prin<br />
screening) au demonstrat că prin reducerea expunerii la HPV este posibilă<br />
reducerea incidenţei CIN 2 / 3 şi, prin extensie, este posibilă reducerea incidenţei<br />
cancerului cervical.<br />
În ţările în <strong>cu</strong>rs de dezvoltare sunt înregistrate 80% din cazurile de<br />
cancer cervical; pentru anumite colectivitaţi ris<strong>cu</strong>l <strong>cu</strong>mulativ este <strong>cu</strong>prins între<br />
1,5 – 3 %, în timp ce în ţările dezvoltate se situează în jurul valorii de 3,6% din<br />
totalul de cazuri noi, <strong>cu</strong> un risc <strong>cu</strong>mulativ de 0,8% în rândul femeilor până la<br />
vârsta de 65 ani. În general, cele mai scăzute rate (< 15/100.000) sunt înregistrate<br />
în Europa (<strong>cu</strong> excepţia ţărilor din Europa de Est), America de Nord şi Japonia.<br />
Incidenţa este cres<strong>cu</strong>tă mod deosebit în America Latină (33,5/100.000),<br />
Africa Subsahariană (31,0) şi în Asia de Sud Est (18.3). Numitorul comun pentru<br />
ţările în <strong>cu</strong>rs de dezvoltare este reprezentat de status-ul socieoeconomic scăzut şi<br />
8
de lipsa programelor de screening indispensabile în detectarea precoce a<br />
leziunilor canceroase şi precanceroase.<br />
La nivel global modalităţile de diagnostic şi tratament duc de multe ori la<br />
stoparea evoluţiei leziunilor, rata de mortalitate fiind substanţial mai scăzută<br />
decât incidenţa, situându-se în jurul valorii de 55%. Pe de altă parte, cancerul<br />
cervical afectează femei relativ tinere, ceea ce duce automat la scăderea speranţei<br />
de viaţă. O estimare recentă concluzionează că neoplazia cervicală este cea mai<br />
importantă cauză de “pierdere de ani de viata” pentru ţările în <strong>cu</strong>rs de dezvoltare.<br />
În America Latină, Caraibe şi Europa Centrală, cancerul cervical aduce o<br />
contribuţie mai mare la pierderea anilor de viaţă, în comparaţie <strong>cu</strong> boli ca<br />
tuber<strong>cu</strong>loza sau SIDA.<br />
HPV este considerat în prezent al doilea factor de risc neoplazic<br />
(după fumat), fiind implicat în inducerea a 5% dintre cancerele umane în<br />
total, a 10% din neoplaziile la femei şi înregistrând 15% dintre cancerele<br />
femeilor din ţările în <strong>cu</strong>rs de dezvoltare (2).<br />
Proiectul GLOBOCAN (bază de date a Agenţiei Internaţionale<br />
pentru Studiul Cancerului ; IARC – International Agency for Research on<br />
Cancer) are ca scop furnizarea estimărilor actualizate ale incidenţei şi<br />
mortalităţii principalelor categorii de cancer, la nivel naţional, pentru toate<br />
ţările din lume. Estimările GLOBOCAN sunt publicate pentru anul 2008<br />
(42), pe sexe şi pe grupe de vârstă, bazându-se pe datele recente furnizate de<br />
IARC; la acestea se adaugă informaţiile oficiale disponibile pe site-urile<br />
instituţiilor de sănătate publică şi datele provenite din “surse locale”.<br />
Difi<strong>cu</strong>ltăţile în interpretarea acestor date sunt explicate măcar în parte de<br />
faptul că sursele de date sunt în continuă creştere şi ele nu pot fi<br />
sistematizate şi comparate deoarece înregistrarea acestora nu se face după o<br />
metodologie unitară şi deci, există inegalităţi în ceea ce priveşte colectarea<br />
de date atât calitativ cât şi cantitativ. În ultimii ani există mai ales pentru<br />
ţările din S-E Europei preo<strong>cu</strong>parea de a crea o bază de date unică în care<br />
datele sa fie <strong>cu</strong>lese unitar, după aceeaşi metodologie, în vederea creeării<br />
registrului naţional de cancere.<br />
În România există această preo<strong>cu</strong>pare pentru formarea a 8 registre<br />
de cancer, deoarece recomăndările experţilor presupun creearea unui<br />
registru de cancer pentru populaţii <strong>cu</strong>prinse între 4 – 5 milioane de<br />
lo<strong>cu</strong>itori. Aceste precizări privind calitatea datelor înregistrate (incidenţă,<br />
mortalitate, morbiditate) sunt utile atunci când tentăm să comparăm valori<br />
ale diferitelor forme de cancer înregistrate, în diferite ţări de pe glob. De<br />
multe ori, diferenţele observate pot fi rezultatul utilizării unei metodologii<br />
diferite, sau care se modifică în timp, pentru aceeaşi ţară, ceea ce poate<br />
9
duce la valori total diferite ale incidenţei pentru aceeaşi ţară. Utilizând<br />
informaţiile online furnizate de proiectul GLOBOCAN, identificăm pentru<br />
România o incidenţă de 23.9/0000 pentru neoplazia cervicală şi 3402<br />
cazuri de cancer cervical.<br />
Pe baza acestor date putem observa incidenţa extrem de scăzută a<br />
cazurilor de cancer de col uterin în ţările din Europa de vest şi în Ţările Nordice,<br />
în America de Nord şi Australia. La pol opus se remarcă valorile îngrijorătoare<br />
întâlnite în ţările din Africa, America de Sud (50 – 56.3), India şi Romania. Lipsa<br />
programelor eficiente de screening pre<strong>cu</strong>m şi gradul scăzut de informare al<br />
populaţiei feminine <strong>cu</strong> risc, sunt probabil principalele cauze ce au dus la creşterea<br />
incidenţei cancerului de col uterin în aceste zone ale globului. Date recente (iunie<br />
2010) situează România pe primul loc în Europa în ceea ce priveşte incidenţa<br />
(23.9) şi mortalitatea (11.6) prin cancerul de col, din totalul celor 20 de ţări<br />
europene analizate (4).<br />
Fig. 1: Incidenţa şi mortalitatea estimată pentru cancerul de col uterin, pentru 20<br />
de ţări din Europa (4) (http://globocan.iarc.fr)<br />
10
Din ianurie 2010, Centrul de Informare pentru HPV şi cancerul<br />
cervical (WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer) a<br />
dat publicităţii date oficiale privind incidenţa cancerului cervical. (2) În<br />
acest raport, pentru România se menţionează că “nu sunt date disponibile<br />
referitoare pentru primele 10 genotipuri HPV, în rândul femeilor <strong>cu</strong> şi fără<br />
leziuni cervicale”, în comparaţie <strong>cu</strong> datele disponibile pentru Europa sau<br />
cele de la nivel mondial.<br />
Lipsa acestor date pentru România poate fi explicată, macar în<br />
parte, prin difi<strong>cu</strong>ltatea centralizării unor date după o metodologie unică şi<br />
prin absenţa unui soft-ware dedicat, pentru înregistrarea corectă, completă<br />
şi unitară a datelor privind cancerele înregistrate la nivel regional, respectiv<br />
naţional. O a doua explicaţie este lipsa fondurilor necesare testării prin<br />
tehnici de biologie mole<strong>cu</strong>lară, în vederea stabilirii prevalenţei şi<br />
distribuţiei genotipurilor HPV în rândul populaţiei feminine.<br />
În acest context, studiul propus, are ca prim obiectiv estimarea<br />
prevalenţei infecţiei <strong>cu</strong> HPV în rândul femeilor din zona de Nord Est a<br />
Moldovei, pre<strong>cu</strong>m şi distribuţia genotipurilor HPV în raport <strong>cu</strong> gradul<br />
displaziei cervicale, prin utilizarea unei metode sensibile de detecţie a<br />
genotipurilor de HPV. Al doilea obiectiv este acela de a stabili rolul<br />
încărcăturii virale ca biomarker în diagnosticarea leziunilor displazice,<br />
obiectiv care presupune selectarea pacientelor HPV 16 şi HPV 18 pozitive,<br />
monitorizarea încărcăturii virale, astfel încât să putem stabili acea valoare<br />
prag a încărcăturii virale utilă diagnosti<strong>cu</strong>lui precoce, în vederea instituirii<br />
măsurilor terapeutice în timp util.<br />
Tranziţia de la cercetare la implementarea de rutină<br />
Multiple studii transversale au demonstrat faptul că testarea ADN/HPV<br />
este mult mai sensibilă pentru CIN2 decât citologia, dar mai puţin specifică<br />
(14).<br />
Tabel I: Comparație între sensibilitate, specificitate pentru citologie vs testare<br />
ADN/HPV<br />
Sensibilitate Specificitate<br />
HPV 96 (94 – 97) 91 (90 – 91)<br />
Citologie 53 (49 – 57) 96 (96 – 97)<br />
Rezultatele prezentate în Tabelul II au fost obţinute prin analiza<br />
rezultatelor a mai multor triale randomizate (NTCC – Italia, Public Health<br />
Trial – Finlanda, Swedescreen, POBASCAN – Olanda, ARTISTIC –<br />
Anglia), realizate între anii 2006 – 2008.<br />
11
Fig. 2: Cele mai frecvente tipuri de HPV în rândul femeilor <strong>cu</strong> / fără leziuni<br />
cervicale, în ţări din Europa de Est şi la nivel mondial<br />
(http://www.who.int/hpvcentre/en) (2)<br />
Tranziţia de la cercetarea la implementarea rezultatelor cercetării<br />
necesită un timp îndelungat şi este în mod parti<strong>cu</strong>lar dificilă atunci când<br />
este deja stabilit un program de screening. Toate acestea reprezintă o<br />
provocare pentru noile modalităţi de testare, pentru că implementarea de<br />
noi metode de screening naţional presupune şi consideraţii politice. O<br />
asemenea problemă s-a pus în Anglia, şi anume, un proiect multicentric<br />
randomizat şi-a propus să evalueze dacă testarea HPV poate reduce<br />
incidenţa cancerului cervical într-o manieră cost – eficientă.<br />
12
Discrepanţa între cercetare şi implementare poate fi diminuată prin<br />
proiecte randomizate, <strong>cu</strong>m ar fi programe naţionale de screening. Prin<br />
asemenea tipuri de proiecte se poate demonstra că utilizând o singură rundă<br />
de testare HPV se poate cheltui mai puţin decât realizând 2 runde de<br />
citologie în mediu lichid. Un asemenea proiect poate fi indeplinit în ţări<br />
unde există un program de screning al cancerului cervical foarte bine<br />
organizat şi sistematizat. Implementarea presupune de asemenea ca femeile<br />
testate să primească mai multe informaţii despre testarea ce urmează a li se<br />
realiza, pre<strong>cu</strong>m şi o infrastructură adecvată pentru urmărirea pe termen<br />
îndelungat (programe de screening organizate şi iniţiative ale guvernelor de<br />
a participa la aceste acţiuni) (15).<br />
Suntem pregătiţi pentru implementarea testării AND HPV ca metodă<br />
de screening primar ?<br />
Una din cele mai importante descoperiri medicale în ultimii 50 de<br />
ani a fost indentificarea HPV drept cauză primară a cancerului cervical.<br />
Este <strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>t faptul că, virtual, toate cazurile de cancer cervical sunt<br />
produse de HPV, iar această informaţie a fost utilizată pentru a obţine<br />
vaccinuri împotriva a două tipuri majore de HPV (16 şi 18), care cauzează<br />
aproximativ 70% din toate neoplaziile cervicale la nivel mondial. De<br />
asemenea, aceaaşi informaţie a condus la dezvoltarea de teste screening<br />
care identifică virusul direct în celulele cervicale, în opoziţie <strong>cu</strong> abordarea<br />
convenţională de a observa anomaliile citologice cauzate de virus. Rolul<br />
screening-ului pentru tipurile HR HPV se regăseşte în 3 situaţii:<br />
a. managementul leziunilor <strong>cu</strong> risc scăzut, în care prezenţa<br />
unui HR HPV sugerează o leziune CIN;<br />
b. “test of <strong>cu</strong>re” în cazul femeilor tratate pentru leziunile CIN<br />
<strong>cu</strong> grad înalt;<br />
c. test de screening primar: sensibilitatea cres<strong>cu</strong>tă a testării<br />
HPV indică faptul că testele ADN pot fi folosite ca test<br />
unic de screening primar, iar citologia poate fi utilizată ca<br />
test de triaj pentru femeile HPV pozitive.<br />
Specialişti în domeniu au revizuit o multitudine de teste care au<br />
evidenţiat că testarea HPV este mult mai sensibilă decât citologia şi poate<br />
fi, în mod sigur realizată la intervale mai mari de timp. Studii viitoare vor<br />
propune un nou algoritm pentru utilizarea testării HPV ca unic test de<br />
screening pentru femeile <strong>cu</strong> vârsta peste 30 de ani (15).<br />
13
5. Optimizarea metodei de detecţie a 37 tipuri HPV<br />
<strong>cu</strong> ajutorul kitului Linear Array HPV Genotyping Test<br />
Principiul procedurii – testul Linear Array HPV Genotyping test se<br />
bazează pe 4 etape majore:<br />
1. prelucrarea probelor recoltate de la paciente;<br />
2. amplificarea PCR a ţintelor ADN, utilizând primeri HPV;<br />
3. hibridizarea ampliconilor;<br />
4. detecţia prin determinare colorimetrică a produselor amplificate.<br />
1. Recoltarea produselor patologice de la nivelul colului uterin se<br />
realizează <strong>cu</strong> ajutorul periuţelor Cervex Brush care se descarcă în<br />
recipientele pentru transportul probei (ThinPrep PreservCyt Solution). După<br />
descărcarea periuţei în soluţia ThinPrep, aceasta se aruncă.<br />
2. Amplificarea ţintelor:<br />
Amplificarea ţintelor ADN HPV este realizată <strong>cu</strong> ajutorul polimerazei<br />
AmpliTaq Gold care facilitează amplificarea “hot start”, pre<strong>cu</strong>m şi <strong>cu</strong> ajutorul<br />
beta globinei ca şi control. Iniţial, mixul reacţiei PCR este încălzit pentru a<br />
activa polimeraza AmpliTaq Gold, ceea ce favorizează denaturarea ADN-ului<br />
viral şi a celui genomic, pre<strong>cu</strong>m şi punerea în contact <strong>cu</strong> secvenţele primerilor<br />
ţintă. Pe masură ce ameste<strong>cu</strong>l se răceşte, primerii (upstream şi downstream) se<br />
fixează pe ţinta ADN. Polimeraza, în prezenţa Mg 2+ şi a excesului de dNTPs,<br />
extinde fixarea primerilor până la formarea unui ADN dublu catenar de 450<br />
perechi de baze, sau 268 perechi de baze pentru ampliconul de beta globină.<br />
Acest process este repetat pentru un anumit număr de cicluri (40), în fiecare<br />
ciclu având loc dublarea cantităţii de amplicon. Amplificarea are loc numai în<br />
regiunea genomului HPV sau a beta globinei, între cele mai apropiate perechi<br />
de primeri; nu are loc amplificarea întregului genom.<br />
Amplificarea selectivă:<br />
Amplificarea selectivă a ţintelor de acid nucleic este obţinută prin utilizarea<br />
enzimei AmpErase (uracil-N-glicozilaza) şi a deoxiuridin trifosfat. Enzima<br />
AmpErase re<strong>cu</strong>noaşte şi catalizează denaturarea lanţurilor ADN care conţin<br />
deoxyuridina, dar nu şi pe acele lanţuri ADN care conţin deoxitimidină.<br />
Deoxiuridina nu este prezentă în ADN-ul natural, dar este prezentă întotdeauna<br />
în ampliconi, datorită faptului că Mastermix-ul conţine deoxiuridină – trifosfat;<br />
prin urmare, numai ampliconii conţin deoxiuridină. Enzima AmpErase, care<br />
este inclusă în Mastermix, catalizează desfacerea deoxiuridenei care conţine<br />
ADN, în reziduuri de deoxiuridină, prin deschiderea lanţului de deoxiriboză la<br />
nivelul C1. În timpul primului ciclu termic, la pH-ul alcalin al Mastermixului,<br />
lanţurile de ADN ale ampliconilor se rup la poziţia deoxiuridinei. Enzima<br />
14
AmpErasa este inactivă la temperaturi peste 55 ºC, şi, prin urmare nu va<br />
distruge ampliconii ţintă. După amplificare, orice rest enzimatic este denaturat<br />
prin adaugarea soluţiei de denaturare, ceea ce previne degradarea ampliconilor.<br />
3. Reacţia de hibridizare:<br />
După amplificarea PCR, ampliconii HPV şi de beta globină sunt chimic<br />
denaturaţi şi formează un singur lanţ de ADN, prin adăugarea soluţiei de<br />
denaturare. Ampliconii denaturaţi sunt trasferaţi în godeurile corespunzatoare<br />
din taviţa de hibridizare, godeuri care conţin lichidul de hibridizare şi un<br />
singur strip din kit (strip care conţine probe de HPV şi beta globină).<br />
Ampliconii fixaţi de biotină vor hibridiza acele probe oligonucleotidice care<br />
conţin secvenţa corespunzătoare probei complementare. În plus, stripurile<br />
kitului sunt sensibilizate şi pentru o probă oligonucleotidică cross-reactivă care<br />
hibridizează <strong>cu</strong> genotipurile HPV 33, 35, 52 58. Ampliconul care conţine<br />
secvenţe apropiate (1 până la 3 neconcordanţe), complementare probei, vor<br />
hibridiza <strong>cu</strong> această bandă.<br />
4. Reacţia de detecţie:<br />
După reacţia de hibridizare, stripurile sunt spălate pentru a îndepărta materialul<br />
nefixat. Se adaugă în tăviţa de hibridizare un conjugat: peroxidaza de hrean –<br />
streptavidina. Aceasta se va fixa pe ampliconii hibridizaţi <strong>cu</strong> oligonucleotidele<br />
de pe strip. Stripul este supus unor etape de spălare pentru a îndeparta excesul<br />
de streptavidina. Se adaugă un substrat – soluţie care conţine peroxid de<br />
hidrogen şi 3, 3’, 5, 5’ tetrametilbenzidină (TMB). În prezenţa peroxidului de<br />
hidrogen, streptavidina fixată catalizează oxidarea TMB către formarea unui<br />
complex albastru, care precipită la poziţia probei unde a fost relizată<br />
hibridizarea. Stripul este citit vizual prin compararea benzilor de pe strip <strong>cu</strong><br />
şablonul din kitul Linear Array HPV Genotyping Test (16).<br />
Interpretare rezultate Linear Array HPV Genotyping test:<br />
test calitativ in vitro ce detectează prezenţa a 37 genotipuri HPV:<br />
• 13 genotipuri <strong>cu</strong> risc înalt oncogen: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,<br />
52, 56, 58, 59, 68;<br />
• 24 genotipuri <strong>cu</strong> risc intermediar şi scăzut oncogen: 6, 11, 26, 40,<br />
42, 45, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82,<br />
83, IS39, CP6108;<br />
• beta globina – martor de recoltare, purificare, amplificare corecte<br />
a ADN / HPV.<br />
15
Fig. 3: Şablon de interpretare, martor pozitiv şi negativ, stripul pacientei 24,<br />
pozitiv pentru HPV 16 – infecţie unică<br />
Fig. 4: Şablon de interpretare, martor pozitiv şi negativ, stripul pacientei 14,<br />
pozitiv pentru HPV 16 şi HPV 18– infecţie multiplă<br />
Concluzii:<br />
1. Îndeplinirea criteriilor de validare impuse de protocoalele de lucru<br />
ale producătorilor ne-au permis confirmarea rezultatelor şi<br />
optimizarea tehnicii de lucru pentru genotiparea HPV.<br />
2. Validarea în cazul testului de genotipare a fost posibilă prin<br />
îndeplinirea criteriilor de calitate pentru martorul pozitiv şi negativ,<br />
cat şi prin prezenţa benzilor de beta globină (<strong>cu</strong> cele două valori,<br />
“high”, respectiv “low”).<br />
16
6. Optimizarea tehnicii Real Time PCR pentru <strong>cu</strong>antificarea<br />
ADN/HPV 16 și a ADN/HPV 18<br />
În anul 1996, compania Applied Biosystems (ABI) a realizat primul<br />
instrument Real Time PCR (PCR în timp real) comercial – instrumentul<br />
denumit ABI 7700. De atunci, RT qPCR (RT CPCR – PCR cantitativ în<br />
timp real) a devenit cea mai exactă şi sensibilă metodă pentru detecţia şi<br />
<strong>cu</strong>antificarea acizilor nucleici. Principiul RTPCR: intensitatea fluorescenţei<br />
din sistemul de reaţie este direct proporţională <strong>cu</strong> cantitatea iniţială a<br />
produsului de amplificat; vizualizarea este posibilă prin utilizarea unei<br />
mole<strong>cu</strong>le fluorescente (26).<br />
Comparaţie PCR versus RT PCR :<br />
o fluorescenţa este măsurată în timpul fiecărui ciclu de amplificare<br />
(semnalul este direct propoţional <strong>cu</strong> cantitatea produsului PCR) ;<br />
o <strong>cu</strong>rbele de amplificare cresc după un număr de cicluri care este<br />
proporţional <strong>cu</strong> cantitatea iniţială de matriţă (template) ADN;<br />
o raportarea la valorile <strong>cu</strong>rbei standard va oferi date legate de<br />
<strong>cu</strong>antificarea produsului dorit (27).<br />
o momentul în care se vizualizează produsul reacţiei de amplificare:<br />
în reacţia PCR clasică, rezultatele se evidenţiază în gelul de<br />
electroforeză, după ce amplificarea s-a finalizat şi când pot apare<br />
inhibitori ai reacţiei;<br />
în RT PCR, măsurarea fluorescenţei se realizează în timpul<br />
fiecărui ciclu de amplificare. Aceasta permite <strong>cu</strong>antificarea ţintei<br />
înainte de a<strong>cu</strong>mularea inhibitorilor, inactivarea polimerazei.<br />
Evaluarea datelor qPCR<br />
Odată ce experimentul a fost finalizat, se realizează analiza datelor<br />
obţinute. Această analiză presupune anumiţi paşi:<br />
o Analiza preliminară a datelor:<br />
corectia baseline;<br />
setarea threshold cycle;<br />
verificarea controalelor negative / pozitive;<br />
verificarea probelor ne<strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>te;<br />
realizarea analizei specifice a experimentului:<br />
• <strong>cu</strong>rba standard - <strong>cu</strong>antificarea absolută / parametri;<br />
• quantificarea relativă;<br />
• “<strong>cu</strong>rba de melting” / topire (doar pentru SYBR <strong>Gr</strong>een).<br />
Baseline – este ciclul iniţial în RTPCR când se poate observa o mică<br />
schimbare în semnalul fluorescent, de obicei regăsindu-se la ciclurile 3-15.<br />
17
Threshold cycle / Ct – primul ciclul PCR la care fluorescenţa măsurată de<br />
instrument este determinată peste nivelul semnalului de fond (back-ground)<br />
(fig 24).<br />
Cuantificarea absolută:<br />
• presupune construirea unei <strong>cu</strong>rbe standard pentru fiecare ţintă;<br />
• <strong>cu</strong>rba standard este realizată dintr-o serie de diluţii ale unei probe<br />
<strong>cu</strong> o concentraţie <strong>cu</strong>nosctă;<br />
• Ct-ul fiecărui standard se situează pe axa orizontală, iar pe axa<br />
verticală sunt notate valorile logaritmice ale concentraţiilor<br />
<strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>te;<br />
• <strong>cu</strong>rba standard este utilizată pentru a estima concentraţia probelor<br />
ne<strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>te.<br />
Parametrii unei <strong>cu</strong>rbe standard corect realizată:<br />
o eficienţă înaltă: 90% - 110%;<br />
o precizie bună: 0,985 – 1,00;<br />
o variabilitate scăzută între standarde.<br />
Etapele de lucru:<br />
recoltare produse patologice;<br />
purificare ADN – HPV;<br />
<strong>cu</strong>antificare AND/HPV 16 şi HPV 18 prin Real Time PCR.<br />
1. Recoltarea produselor patologice şi purificarea ADN HPV se<br />
realizează similar testului de genotipare, anterior detaliat. Singura<br />
deosebire este faptul că protocolul nu presupune concentrarea probei<br />
prin centrifugare, tehnica Real Time PCR fiind mult mai sensibilă<br />
decât PCR –ul clasic.<br />
2. Quantificarea HPV 16 şi 18 utilizând kiturile Path-HPV16 Real-time<br />
PCR detection kit for Human Papillomavirus, Path-HPV18 Real-time<br />
PCR detection kit for Human Papillomavirus, 2 x Precision TM<br />
Mastermix, PrimerDesign, <strong>cu</strong> ajutorul instrumentului qPCR –<br />
STRATAGENE, MX3000P:<br />
Fig. 5: Termocyclerul Stratagene MX3005P<br />
18
Kitul 2 x Precision TM Mastermix conţine: buffer, 0,025 U/ µl<br />
Taq Polimerază, 5 mM MgCl2, dNTP Mix (200 µM pentru<br />
fiecare dNTP) (29).<br />
Kiturile Path-HPV16 Real-time PCR detection kit for Human<br />
Papillomavirus şi Path-HPV18 Real-time PCR detection kit for<br />
Human Papillomavirus conţin:<br />
Probe lucrate şi optimizate:<br />
a. Pacienta H. L., 29 ani, <strong>cu</strong> următorul istoric:<br />
- 6.04.09: HSIL;<br />
- 12.04.09: HPV 16 pozitivă.<br />
Parametrii generaţi de soft-ul instrumentului pe baza celor 5 standarde s-a<br />
încadrat in limitele normale (fig. 8):<br />
o eficienţă înaltă: 99,2 % (90% - 110%);<br />
o precizie bună: 0,999 (0,985 – 1,00);<br />
Fig 6: Curba standard optimizată realizată pentru 5 standarde<br />
b. Pacienta V. D, 23 ani, pozitivă pentru HPV 18, 53, 54.<br />
Fig 7: Curba standard (pacienta V.D.)<br />
o eficienţă înaltă: 93,5% (90% - 110%);<br />
o precizie bună: 0,997 (0,985 – 1,00).<br />
Concluzie: În această etapă a cercetării a fost optimizată <strong>cu</strong>antificarea<br />
încărcăturii virale prin RT PCR, pentru genotipurile înalt oncogene de<br />
HPV, respectiv tipurile 16 şi 18.<br />
19
7. Validarea tehnicii de genotipare prin participarea la HPV<br />
Proficiency Testing<br />
(WHO HPV LabNet Report on HPV DNA Proficiency Panel 2010)<br />
Evaluarea vaccinării HPV, implementarea efectivă și monitorizarea<br />
programului de vaccinare HPV necesită utilizarea de metode corecte de<br />
detecție și de tipare a ADN HPV, care pot fi comparate la nivel<br />
internațional.<br />
WHO Global HPV LabNet este o inițiativă a OMS (Organizația<br />
Mondială a Sănătații) al cărei scop este sprijinirea implementării vaccinării<br />
HPV la nivel mondial, prin standardizarea laboratoarelor și asigurarea<br />
calității testării HPV și a metodelor de genotipare utilizate pentru evaluarea<br />
vaccinării anti HPV și pentru supravegherea și monitorizarea programelor<br />
de vaccinare. (http://www.who.int/biologicals/vaccines/hpv/en/index.html ).<br />
O strategie importantă pentru atingerea acestui demers este<br />
dezvoltarea, pregătirea și validarea unui panel de proficiență pentru a<br />
califica metodele de genotipare și laboratoarele în care se utilizează aceste<br />
metode.<br />
Apelul pentru participarea la acest studiu de competenţă a fost<br />
publicat pe site-ul OMS și trimis apoi birourilor regionale ale OMS în data<br />
de 10 aprilie 2010, pentru publi<strong>cu</strong>l larg.<br />
Scopurile acestui panel au fost:<br />
a. Evaluarea competenţei metodelor de tipare a HPV utilizate în mod<br />
<strong>cu</strong>rent în laboratoare la nivel mondial;<br />
b. Evaluarea sensibilității detecției tipurilor specifice de HPV, prin<br />
diferite metode de lucru;<br />
c. Identificarea problemelor fiecărei metode utilizate de rutină.<br />
Metoda de realizare a testului de proficiență<br />
Compoziția panelului: în laboratorul de referință LabNet Global Reference<br />
Laboratory (GRL) al University Hospital in Malmö, Suedia, au fost primite<br />
genóme complete ale HPV clonate în plasmide, însoțite de apobarea scrisă<br />
a aparținătorilor de a fi utilizate în acest panel de proficiență OMS.<br />
Toate probele au fost plasmide diluate în ADN uman placentar<br />
(Sigma-Aldrich no 7011), până la o concentrație de 10 ng/l. Tipurile de<br />
HPV incluse au fost: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,<br />
66, 68a (HPV 68 prototip) și 68b (ME 180 izolat prin microscopie<br />
electronică). Trei probe suplimentare, A, B și C au fost linii celulare<br />
utilizate ca și control pentru purificarea ADN, primul pas al genotipării<br />
HPV. Compoziția panelului este redată în tabelul XV.<br />
20
Distribuirea PP: după validare, PP a fost distribuit în perioada iunie –<br />
august, 2010, către 105 laboratoare din 6 regiuni OMS, în urma apelului de<br />
participare și urmare a solicitărilor primite din partea laboratoarelor. Nu a<br />
fost solicitată nici o taxă de participare din partea laboratoarelor.<br />
Distribuirea PP a fost de asemenea plătita de către WHO HPV LabNet.<br />
Numărul laboratoarelor incluse în PP, în funcție de regiune OMS a fost<br />
(fig. 39):<br />
o 1 (AFRO – Regional Office for Africa);<br />
o 5 (EMRO – Regional Office for the Eastern Mediterranean);<br />
o 49 (EURO – Regional Office for Europe);<br />
o 9 (SEARO – Regional Office for South East Asia);<br />
o 18 (WPRO – Regional Office for Western Pacific);<br />
o 23 (Regional Office for the Americas – AMRO, sau Pan American<br />
Health Organization – PAHO).<br />
Fig 8: Distribuirea la nivel mondial a laboratoarelor care au trimis rezultatele<br />
pentru panelul de proficiență ADN/ HPV<br />
Au fost returnate către GRL 132 seturi de date <strong>cu</strong> rezultatele<br />
genotipării HPV, înainte de dead-line, de la 98 de laboratoare. 73 de<br />
laboratoare au trimis datele obținute utilizând o singură metodă de<br />
genotipare, 17 laboratoare au utilizat câte 2 metode de genotipare HPV, 7<br />
21
laboratoare au utilizat 3 metode, iar un laborator a genotipat probele<br />
utilizând 4 metode diferite.<br />
În anul 2008, panelul HPV – OMS a fost pregătit, administrat și<br />
distribuit de laboratorul de referință din Suedia. Datorită resurselor limitate<br />
ale laboratorului de referință, în 2010, acesta doar a pregătit materialele, iar<br />
subcontractarea, administrarea și distribuția probelor a fost realizată de<br />
compania non-profit EQUALIS (External Quality Assurance in Laboratory<br />
Medicine In Sweden), activă în domeniul asigurării controlului extern.<br />
Modelul utilizat pentru testarea din 2010 a de<strong>cu</strong>rs bine și este considerat un<br />
model de organizare pe termen îndelungat, în ceea ce privește distribuirea<br />
panelurilor de proficiență HPV în fiecare an.<br />
Analiza datelor: datele analizate în acest raport includ toate rezultatele<br />
care au fost trimise înainte de data de 1 noiembrie 2010. Datele au fost<br />
compilate de către EQUALIS și transferate apoi GRL pentru analiza<br />
rezultatelor. Fiecare set de date a primit un număr <strong>cu</strong>prins între 1 și 132.<br />
Aceste date au fost analizate în funcție de regiunea laboratorului și de<br />
metoda utilizată pentru genotipare.<br />
Din datele trimise, s-a remarcat faptul că laboratoarele participante<br />
au utilizat metode comerciale pre<strong>cu</strong>m și metode „in-house” (Tabelul 2).<br />
Proporția rezultatelor corecte pentru genotiparea HPV, raportate de fiecare<br />
laborator în parte, a fost analizată în funcție de metoda utilizată. Un set de<br />
date analizat a fost considerat proficient / competent dacă a detectat cel<br />
puțin 50 unități internaționale (UI) de HPV 16 și HPV 18 în 5 µl proba și<br />
500 genóme echivalent (GE) în 50 µl pentru alte tipuri HPV, fie în infecții<br />
unice, fie in infecții multiple. Pentru stabilirea proficienței/competenței, a<br />
fost de asemenea stabilită condiția de a nu se fi raportat mai mult de un<br />
genotip ca reacție fals pozitivă. Aceasta corespunde unei specificități de 97<br />
%.<br />
Rezultate: 98/105 laboratoare au raportat 132 seturi de date. 4 seturi de<br />
date au fost obținute utilizând metode care nu au diferențiat genotipurile<br />
HPV sau rezultatele au fost raportate ca HPV 16, 18 „și alte genotipuri HR<br />
HPV”. Aceste seturi de date nu au fost incluse în analiza genotip –<br />
specifică din acest raport. Fiecare set de date trimis de fiecare laborator în<br />
parte a fost analizat, iar participanții au primit o scrisoare de feed back în<br />
noiembrie 2010.<br />
Fig. 41 include numai datele care au fost obținute prin testarea a<br />
mai mult de două genotipuri HPV (118 seturi de date). Rezultatele<br />
laboratoarelor care au au genotipat numai HPV 16 și 18 au fost excluse din<br />
această figură.<br />
22
Fig. 9: Proficiența testării ADN/HPV în funcție de regiunea OMS<br />
Fig. 10: Imaginea celor 48 de stripuri obţinute prin prelucrarea probelor<br />
ADN/HPV – OMS<br />
Rezultatele obținute în laboratorul de Virusologie Mole<strong>cu</strong>lară al<br />
UMF „<strong>Gr</strong>igore T. <strong>Popa</strong>”, Iași, pentru care am fost evaluați ca fiind<br />
proficienți pentru genotiparea HPV, sunt redate în tabelul XVIII (42).<br />
23
Tabel II: Rezultatele obținute la HPV Proficiency Testing 2010, OMS<br />
Panel ID HPV type(s) in the panel Content<br />
(IU or GE per 5 µl)<br />
1<br />
24<br />
Your results<br />
Linear Array<br />
50 µl input volume<br />
59 50 HPV 59<br />
2 31 500 HPV 31<br />
3<br />
6, 16, 18, 51 500 HPV 6, 16, 18, 51<br />
4<br />
45 500 HPV 45<br />
5 16 50 HPV 16<br />
6<br />
35, 59, 66, 68ME 500 HPV 35, 59, 66, 68; *<br />
7<br />
56 500 HPV 56<br />
8<br />
18<br />
50<br />
NEGATIVE<br />
9<br />
35 500 HPV 35;*<br />
10<br />
68ME 500 HPV 68<br />
11<br />
HPV 11, 16, 31, 33,<br />
11, 16, 31, 33, 58 50<br />
58;*.<br />
12 51 50 HPV 51<br />
13<br />
6 500 HPV 6<br />
14<br />
58 500 HPV 58; *<br />
15<br />
66 50 HPV 66<br />
16<br />
39, 45, 52, 56, 68 a<br />
500<br />
HPV 39, 45, 56, 52.<br />
17<br />
33 500 HPV 33<br />
18<br />
39 50 HPV 39<br />
19<br />
52 500 HPV 52.<br />
20<br />
68 50 NEGATIVE<br />
21 11 500 HPV 11<br />
22<br />
HPV 11, 16, 31, 33,<br />
11, 16, 31, 33, 58 500<br />
58;*<br />
23 16 5 HPV 16<br />
24<br />
56 50 HPV 56<br />
25 33 50 HPV 33<br />
26<br />
6, 16, 18, 51 50 HPV 6, 16, 18, 51.<br />
27<br />
Negative 0 NEGATIVE<br />
28 35 50 HPV 35; *<br />
29<br />
18 5 HPV 18<br />
30<br />
58 50 HPV 58; *<br />
31<br />
68ME 50 HPV 68<br />
32<br />
39, 45, 52, 56, 68 50 HPV 39, 45, 52, 56; *<br />
33<br />
6 50 HPV 6<br />
34<br />
45 50 HPV 45<br />
35 68 500 NEGATIVE
36<br />
37<br />
38<br />
39<br />
40<br />
41<br />
66 500 HPV 66<br />
11 50 HPV 11<br />
59 500 HPV 59<br />
52 50 HPV 52<br />
35, 59, 66, 68ME 50 HPV 35, 59, 66, 68;*<br />
31 50 HPV 31<br />
42 39 500 HPV 39<br />
43<br />
51 500 HPV 51<br />
A<br />
16 25 NEGATIVE;<br />
B<br />
none 0 NEGATIVE;<br />
C<br />
16 2500 HPV 16 LOW;<br />
* menționăm că toate datele prezentate în acest raport au fost traduse <strong>cu</strong><br />
permisiunea organizatorilor panenului de proficiență (53).<br />
8. Prevalenţa şi distribuţia genotipurilor HPV în rândul femeilor<br />
din zona Moldovei<br />
Obiective: Estimarea prevalenţei şi distribuţiei genotipurilor HPV<br />
în zona de Nord a Moldovei. Corelarea infecţiei HPV <strong>cu</strong> factorii de risc ai<br />
displaziei cervicale.<br />
Material şi metode: în perioada septembrie 2009 – mai 2011 am<br />
genotipat 353 de probe ADN purificat din celule cervicale, recoltate de la<br />
pacientele invitate să participe la studiu. Participantele au semnat<br />
formularul de consimţământ informat aprobat de Comisia de Etică a<br />
Universităţii de Medicină şi Farmacie “<strong>Gr</strong>. T. <strong>Popa</strong>”, Iaşi.<br />
Înainte de recoltarea de celule cervicale, medicii ginecologi au<br />
completat, împreună <strong>cu</strong> pacientele, date personale ale acestora. În acest<br />
formular de solicitare a analizei de genotipare HPV am încercat sa aflăm<br />
care sunt co-factorii displaziei cervicale: numărul de naşteri, utilizarea de<br />
contraceptive orale, fumatul, numărul de parteneri sexuali, alte <strong>infecţii</strong><br />
genitale (Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Candida<br />
albicans, virusul herpes simplex), rezultatul examenului citologic Babeş<br />
Papanicolau. De asemenea, am solicitat în acest formular date despre<br />
utilizarea tratamentului antiinflamator în antecedente, dacă a existat<br />
suspiciune macroscopică sau simptomatologie sugestivă (fig. 46).<br />
25
Datele anamnestice ale pacientelor pre<strong>cu</strong>m şi rezultatul testărilor au<br />
fost prelucrate <strong>cu</strong> ajutorul programului de prelucrare statistică a datelor -<br />
SPSS 16.0.<br />
infectii unice<br />
25%<br />
infectii multiple<br />
11%<br />
Fig. 11: Prevalența infecțiilor HPV<br />
negative<br />
64%<br />
Fig. 12: Formularul de solicitare a analizei de genotipare HPV<br />
26
În tabelul IV este redată prevalența genotipurilor HPV în toate<br />
infecțiile detectate, iar în fig. 15 sunt redate frecvențele genotipurilor HPV<br />
în cazul pacientelor <strong>cu</strong> citologie normală și patologică.<br />
Tabel III: Prevalenta genotipurilor HPV pentru toate tipurile de infecții: unice și<br />
multiple<br />
Tip HPV Frecventa Procent<br />
negativ 226 64,0<br />
16 35 9,91<br />
53 20 5,66<br />
51 18 5,09<br />
18, 31 11 3,11<br />
52 10 2,83<br />
6, 42 8 2,26<br />
58, CP6108 7 1,98<br />
45 6 1,69<br />
33, 66, 70 5 1,41<br />
68, 73, 84 4 1,13<br />
56, 82 2 0,65<br />
40 1 0,28<br />
Fig. 13: Cele mai frecvente genotipuri HPV identificate in rândul femeilor din<br />
Nordul Moldovei, <strong>cu</strong> citologie normală şi patologică<br />
27
Concluzii:<br />
• genotiparea prin testarea ADN /HPV este cea mai indicată metodă<br />
de screening pentru cancerul cervical, datorită sensibilităţii,<br />
criteriilor de validare şi obiectivităţii <strong>cu</strong> care se fac interpretările;<br />
• identificarea tipului de HPV oferă posibilitatea evaluării displaziei<br />
cervicale post conizaţie;<br />
• prevalenţa genotipurilor HPV 16 şi HPV 18 în rândul pacientelor<br />
testate a fost de 9.91 %, respectiv 3.11, ceea ce justifică necesitatea<br />
vaccinării anti – HPV în zona noastră, mai ales pentru HPV16;<br />
• studiul de faţă permite selectarea pacientelor HPV 16 şi HPV 18<br />
pozitive, care vor fi urmărite în dinamică, prin tehnica Real Time<br />
PCR, în vederea stabilirii “valorii prag” a încărcăturii virale, cât<br />
mai precoce, ideal, anterior evoluţiei către neoplazia cervicală, în<br />
vederea instituirii terapiei chirurgicale;<br />
• deoarece genotiparea HPV permite evaluarea fenomenului de<br />
persistenţă a <strong>infecţii</strong>lor <strong>cu</strong> HR HPV, se impune, pe viitor, repetarea<br />
testării la 6, respectiv 12 luni, pentru a departaja obiectiv, <strong>infecţii</strong>le<br />
tranzitorii, de cele permanente;<br />
9. Corelaţii ale încărcăturii virale a HPV16 și HPV 18 <strong>cu</strong> gradul<br />
displaziei cervicale și <strong>cu</strong> factorii de risc ai neoplaziei cervicale<br />
Material şi metodă:<br />
Am <strong>cu</strong>antificat prin Real Time PCR probele ADN HPV detectate<br />
pozitive pentru HPV 16 (34 paciente) şi HPV 18 (8 paciente) prin tehnica<br />
de genotipare Linear Array HPV Genotyping Test.<br />
Determinarea încărcăturii virale a fost realizată <strong>cu</strong> ajutorul kiturilor<br />
Precision 2X qPCR mastermix, Path-HPV16 Real-time PCR detection of<br />
Human Papillomavirus 16 Advanced kit şi Path-HPV18 Real-time PCR<br />
detection of Human Papillomavirus 18 Advanced kit. Amplificarea în timp<br />
real a utilizat termocyclerul MX 3005P, Stratagene.<br />
Determinările prin Real Time PCR au fost realizate în 4 sesiuni de<br />
lucru.<br />
28
A. Setarea godeurilor: standarde in dublu, controale, probe paciente<br />
Sesiunea I Sesiunea II<br />
Sesiunea III Sesiunea IV<br />
Fig. 14: Imaginea plă<strong>cu</strong>țelor RT PCR setate<br />
B. Profilul termic al experimentului a presupus 1 ciclu de 10’ la 95° C şi<br />
50 de cicluri formate din două segmente: primul segment a presupus 15 sec<br />
la 95 ° C şi al doilea 1 min la 60 ° C.<br />
Fig. 15: Profilul termic al experimentului<br />
29
C. “RUN”: odată setate godeurile şi profilul termic, s-a selectat opţiunea<br />
“RUN” a soft-ului Stratagene. Întregul experiment a avut o durată de 72,5<br />
minute.<br />
D. Evaluarea rezultatelor s-a putut realiza şi în timpul amplificării PCR,<br />
“în timp real”, iar în lucrarea de faţă am redat doar rezultatele finale ale<br />
experimentului.<br />
Evaluarea calităţii unei determinări prin Real Time PCR trebuie să urmeze<br />
paşii următori de analiză preliminară:<br />
- examinarea <strong>cu</strong>rbelor de amplificare;<br />
- verificarea / ajustarea liniei de background;<br />
- verificarea / ajustarea “threshold’;<br />
- verificarea controalelor (negative, pozitive);<br />
- verificarea probelor testate;<br />
- analiza specifică a experimentului.<br />
Sesiunea I Sesiunea II<br />
Sesiunea III Sesiunea IV<br />
Fig. 16: Curbele de amplificare<br />
30
Sesiunea I Sesiunea II<br />
Sesiunea III Sesiunea IV<br />
Fig. 17: Verificarea controalelor<br />
Sesiunea I<br />
Sesiunea III<br />
Sesiunea IV<br />
Fig. 18: Curbele standard ale celor 4 sesiuni<br />
31<br />
Sesiunea II<br />
Sesiunea IV<br />
Sesiunea IV<br />
Sesiunea IV
Sesiunea I Sesiunea II<br />
Sesiunea III Sesiunea IV<br />
Fig. 19: Numărul de cópii virale detectate<br />
Analiza spectrofotometrică a acizilor nucleici, proteinelor și a<br />
<strong>cu</strong>lturilor celulare face parte din rutina zilnică a unui laborator modern.<br />
NanoPhotometrulTM universal combină masurătorile probelor, începând de<br />
la 0,7 µl până la volumele standard ale probelor – 3500 µl. Măsurătorile<br />
probelor în volume mai mici de 1 µl sunt realizate fără a fi necesare<br />
prezența <strong>cu</strong>vetelor, <strong>cu</strong> ajutorul celulei integrate LabelGuardTM Microliter.<br />
Etapele de măsurare a ADN-ului purificat <strong>cu</strong> ajutorul nanodropului<br />
NanoPhotometerTM Pearl sunt:<br />
- pipetarea probei de ADN în centrul ferestrei de măsurare;<br />
- atașarea capa<strong>cu</strong>lui;<br />
- <strong>cu</strong>rățarea ferestrei de măsurare <strong>cu</strong> un șervețel fără praf;<br />
- îndepărtarea surplusului de probă din oglinda capa<strong>cu</strong>lui <strong>cu</strong> un<br />
șervețel.<br />
Proba de măsurat este pipetată direct pe fereastra de măsurare.<br />
Închiderea capa<strong>cu</strong>lui favorizează formarea unei picături de lichid la<br />
o grosime a stratului optic exact definită (fig. 24). Tehnologia de compresie<br />
a probei ADN elimină ris<strong>cu</strong>l evaporării probei și de asemenea evită<br />
costurile unor calibrări repetate.<br />
32
Fig. 20: Utilizarea nanodropului în laboratorul de biologie mole<strong>cu</strong>lară<br />
Sesiunea a IV-a de RT PCR a beneficiat de avantajele utilizării<br />
nanodropului NanoPhotometerTM Pearl (achiziționat în cadrul grantului<br />
ID_1642). În tabelul V s-a fa<strong>cu</strong>t corespondența între numărul de cópii<br />
virale detectate prin RT PCR, numărul CT-urilor și valoarea ADN<br />
<strong>cu</strong>antificată prin nanodrop.<br />
Tabel IV: Asociere valoarea ADN <strong>cu</strong>antificată prin nanodrop ,<br />
număr copii virale și valoarea CT-urilor<br />
Nr. Cuantificare Număr cópii Valoarea Ct<br />
Probă testată ADN detectate în corespunzătoare<br />
nanodrop<br />
(µg/ml)<br />
proba inițială fiecărei probe<br />
1 3,493 No Ct No Ct<br />
2 12,5 1,593 x 10 3<br />
29,73<br />
3 3,493 No Ct No Ct<br />
4 24,5 No Ct No Ct<br />
5 18,5 4, 072 x 10 2<br />
31,66<br />
6 31,4 7, 915 x 10 5<br />
20,97<br />
7 18 3, 341 x 10 5<br />
22,19<br />
8 26,9 3, 722 x 10 35,04<br />
9 15,5 1,321 x 10 3<br />
30,00<br />
10 9,481 No Ct No Ct<br />
33
Cu ajutorul programului SPSS versiunea 16.0 am analizat statistic,<br />
descriptiv, prin crostabulare, relațiile dintre încărcăturile virale și<br />
diagnosti<strong>cu</strong>l citologic. Așa <strong>cu</strong>m se poate vedea în figura 22, cele mai mari<br />
încărcături virale (10 5 și 10 6 cópii ADN / HPV 16, respectiv) au fost<br />
detectate în 40% din cazurile de LGSIL și în 60% în cazurile <strong>cu</strong> HGSIL.<br />
Totusi, am detectat o încărcare virală de 10 5 cópii și în cazul unei paciente<br />
<strong>cu</strong> citologie normală, și în cazul uneia <strong>cu</strong> celule atipice, ceea ce sugerează<br />
că încărcătura virală nu poate fi un marker eficient de detecție a femeilor <strong>cu</strong><br />
risc cres<strong>cu</strong>t de evoluție către neoplazia cervicală.<br />
De asemenea, am evaluat relația dintre încărcăturile virale și<br />
factorii de risc (fumat, contraceptive orale, grupul de vârstă, tipul infecției<br />
HPV unică versus multiplă).<br />
Cele mai mari valori ale încărcăturilor virale ale ADN/HPV 16 au<br />
fost detectate la grupurile de vârstă 20 – 30 și 40 – 50 ani. De asemenea,<br />
cópii virale de ordinul a 10 6 au fost identificate și la paciente <strong>cu</strong> vârsta<br />
<strong>cu</strong>prinsă între 50 – 60 ani.<br />
Pentru lotul nostru studiat, fumatul nu a fost un factor de risc care<br />
să fie corelat <strong>cu</strong> valori ridicate ale cópiilor virale de ADN/HPV 16. Cele<br />
mai ridicate valori ale cópiilor virale au fost detectate în lotul nostru pentru<br />
pacientele care au declarat că nu au utilizat contraceptive orale. Cele mai<br />
ridicate valori ale cópiilor virale de HPV 16 au fost detectate în cazul<br />
infecțiilor unice <strong>cu</strong> HPV 16, rezultat comparabil <strong>cu</strong> cele găsite și de alți<br />
autori.<br />
Fig. 21: Corelații între încărcăturile virale ale ADN/HPV 16 și rezultatele<br />
examenului citologic<br />
34
<strong>Gr</strong>upa de vârsta Fumat<br />
Contraceptive<br />
35<br />
Tipul infecției HPV<br />
Fig. 22: Corelații între numărul de cópii virale și factorii de risc ai neoplaziei<br />
cervicale<br />
Concluzii:<br />
• Diversitatea valorilor încărcăturii virale detectate in raport <strong>cu</strong> gradul<br />
displaziei cervicale (am detectat încărcături virale mari, de 10 5 – 10 6<br />
cópii virale, atât in situaţiile în care pacientele aveau HSIL, <strong>cu</strong>m era de<br />
aşteptat, dar şi in cazurile <strong>cu</strong> LSIL, ASCUS si chiar <strong>cu</strong> citologie<br />
normala), a fă<strong>cu</strong>t imposibilă stabilirea unei valori limită, care să indice<br />
intervenţia chirurgicală terapeutică.<br />
• Pentru 7 dintre pacientele testate am realizat monitorizarea lor, la 6, 12<br />
si 18 luni, prin genotipare şi prin <strong>cu</strong>antificarea ADN HPV 16 &18 prin<br />
Real Time PCR.<br />
• Lipsa de aderenţă a pacientelor la monitorizarea la care au fost invitate<br />
să participe, conform formularului de consimţământ informat, se poate<br />
explica prin neînţelegerea necesităţii urmăririi pacientelor în vederea<br />
precizării evoluţiei bolii.<br />
• Se impune informarea populaţiei <strong>cu</strong> privire la relaţia dintre <strong>infecţii</strong>le<br />
determinate de HPV şi cancerul cervical ca şi la <strong>utilitatea</strong> participării la<br />
programele de monitorizare.
10. Testarea ADN/HPV post-intervenție chirurgicală excisională<br />
Strategiile terapeutice în cazul bolii bolii confirmate colposcopic<br />
pot fi distructive sau excizionale. Nu există nici un avantaj demonstrat<br />
pentru nici una din tehnicile chirurgicale conservatoare pentru tratarea și<br />
eradicarea neoplaziei cervicale intraepiteliale. Superioritatea chirurgiei<br />
excizionale este dată însă de rata de succes a terapiei. Terapiile excisionale<br />
sunt preferate în majoritatea cir<strong>cu</strong>mstanțelor, deoarece ele sunt în mod clar<br />
superioare metodelor distructive, având avantajul posibilității evaluării<br />
histologice a zonei de transformare. Examinarea histologică a țesutului<br />
excizat permite anatomopatologului să re<strong>cu</strong>noască sau să elimine existența<br />
unui cancer microinvaziv, a unei boli glandulare sau a implicării marginilor<br />
zonei de transformare (90).<br />
Monitorizarea după terapia CIN utilizând examenul citologic a fost<br />
cea mai frecventă procedură de urmărire, dar eficiența ei a fost dis<strong>cu</strong>tată<br />
datorită sensibilității scăzute pentru detecția CIN prin această metodă.<br />
Deoarece infecția HPV este esențială pentru dezvoltarea și menținerea CIN,<br />
detecția ADN/HPV poate detecta leziunile CIN reziduale sau re<strong>cu</strong>rente mai<br />
rapid și <strong>cu</strong> o sensibilitate mai ridicată. Unele studii au identificat că<br />
ADN/HPV este de obicei eliminat dupa terapia eficientă a CIN, iar<br />
persistența ADN/HPV este predictivă pentru re<strong>cu</strong>rență. Studiile întreprinse<br />
până în prezent au analizat câteva metode diferite de terapie, care au fost<br />
identificate a avea rate de succes diferite în clearance-ul ADN/HPV,<br />
sugerând că testarea ADN/HPV este utilă pentru evaluarea diferitelor<br />
tehnici de terapie (92).<br />
Unul din obiectivele tezei de doctorat a fost evaluarea tipului de<br />
infecție HPV, tranzitorie versus infecţie persistentă, la 6 luni de la<br />
intervenția chirurgicală, evaluată <strong>cu</strong> un test sensibil de identificare a<br />
ADN/HPV: Linear Array HPV genotyping test. Pentru atingerea acestui<br />
obiectiv, au fost analizate cazurile selectate din rândul pacientelor<br />
genotipate HPV.<br />
21 paciente (22 – 46 ani) au fost testate post intervenție chirurgicală<br />
excizională. Au fost incluse în acest studiu toate pacientele care împreună<br />
<strong>cu</strong> ginecologul au completat formularul de consimțământ informat pentru<br />
participarea la studiu, pre<strong>cu</strong>m și formularul de solicitare a genotipării HPV<br />
(fig. 46); în acest formular se cere menționarea motivului solicitării<br />
genotipării HPV (screening, testare post intervenție chirurgicală, suspiciune<br />
macroscopică, control după tratament radio-chirurgical, simptomatologie<br />
sugestivă sau investigațiii preoperatorii).<br />
36
Metoda de lucru și kiturile utilizate au fost aceleași ca cele descrise în<br />
capitolul 4.<br />
Rezultatele acestui studiu pot fi sumarizate astfel:<br />
• anterior intervenției chirurgicale:<br />
– 14,2% (3/21) dintre paciente au fost pozitive pentru HPV<br />
16;<br />
– 4,7% au fost pozitive <strong>cu</strong> HPV 31 (1/21) și respectiv HPV<br />
53 (1/21);<br />
– o pacientă a prezentat infecție multiplă <strong>cu</strong> tipurile HPV 31,<br />
51, 54;<br />
• genotiparea post-intervenție terapeutică a identificat trei infecții<br />
persistente:<br />
– două infecții unice (HPV 18 și respectiv HPV 51);<br />
– o infecţie <strong>cu</strong> tipuri HPV multiple (6, 39);<br />
• 3 paciente negative pentru ADN/HPV post – conizație au prezentat<br />
aceleași rezultate citologice patologice pe toată durata<br />
monitorizării, nefiind influiențate de terapia excisională.<br />
Utilizând tehnica Linear Array HPV Genotyping Test am identificat o<br />
persistență a infecției HPV, atât <strong>cu</strong> HR cât și <strong>cu</strong> LR în 14,28% din cazurile<br />
testate.<br />
Din lotul pacientelor testate post – conizatie am selectat 3 cazuri<br />
parti<strong>cu</strong>lare:<br />
Prezentări de caz: 1<br />
• Pacienta N.L, 30 ani – displazie severă<br />
– examene citologice repetate: HGSIL<br />
– examene colposcopice repetate: sugestive pentru infecția<br />
HPV<br />
• 2 intervenții excizionale<br />
– 2 testări ADN/HPV la 6 luni: ambele negative pentru<br />
oricare din cele 37 genotipuri HPV testate<br />
– ultimul examen citologic: normal<br />
Observație: posibilă afectare a celulelor cervicale produsă de tratamentul<br />
hormonal urmat de pacientă. Acesta este un exemplu de caz care a suferit<br />
multiple intervenții chirurgicale, marcante afectiv pentru pacientă, din<br />
cauza subiectivității testelor citologice și colposcopice.<br />
Prezentări de caz: 2<br />
• N. M., 32 ani<br />
– examen citologic periodic: ASCUS, LGSIL, HGSIL<br />
– test ADN/HPV pozitiv pentru HPV 16, persitent la 6 luni<br />
– conizaţie<br />
37
– retestare prin genotipare la 6 luni: HPV negativ<br />
Observaţie: eficienţa conizaţiei, certificată prin testarea ADN/HPV. Infecție<br />
persistentă tratată eficient prin conizație, confirmată prin testul ADN.<br />
Pacienta este menținută în programul de urmărire.<br />
Prezentări de caz: 3<br />
• D.C., 45 ani<br />
– examen citologic: ASCUS<br />
• testare ADN/HPV prin metoda HC II: negativ<br />
– examen citologic: HGSIL<br />
– genotipare HPV LA: HPV 18<br />
– biopsie la 6 luni: HPV 18<br />
– examen citologic: ASCUS<br />
– genotipare la 6 luni dupa biopsie: HPV 18<br />
– se menține hemoragia intermenstruală<br />
– histerectomie totală (mai 2011): CIN 2<br />
Observaţie: lipsa concordanței între examenle citologice și cele de biologie<br />
mole<strong>cu</strong>lară. Examenul citologic nu a fost concordant <strong>cu</strong> persistența ADN<br />
HPV 18.<br />
Concluzii:<br />
Numărul redus de paciente urmărite post-conizaţie impune<br />
revizuirea consimţământului informat, astfel încât pacientele să înţeleagă<br />
avantajele participării la studii similare, ca modalitate de monitorizare a<br />
reactivării infecţiei persistente, ce impune strategii terapeutice diferite<br />
Există evidențe științifice despre faptul că testarea HPV după<br />
terapie poate prezice eșe<strong>cu</strong>l tratamentului <strong>cu</strong> o sensibilitate semnificativ<br />
mai mare și <strong>cu</strong> specificitate similară, în comparație <strong>cu</strong> citologia repetată și<br />
<strong>cu</strong> statusul histologic al marginilor. Dat fiind acest risc al re<strong>cu</strong>renței<br />
infecției HPV, se impune realizarea unor protocoale de urmărire a<br />
pacientelor, în funcție de statusul ADN/HPV și cel al citologiei. În cazul<br />
pacientelor ADN/HPV pozitive dar <strong>cu</strong> citologie normală, se impune<br />
repetarea testării ADN/HPV la 5 ani, dar trebuie avut grija la impactul unui<br />
rezultat HPV pozitiv asupra pacientei.<br />
Sunt încă dis<strong>cu</strong>ții legate de perioada de realizare a unui test HPV<br />
după terapie. Timpul optim de a efectua o testare ADN/HPV a fost analizat<br />
doar în câteva studii: o proporție substanțială de femei a eliminat virusul la<br />
3 luni, dar semnificativă este perioada de 3 – 6 luni post terapie. După 6<br />
luni, eliminarea virusului este rar posibilă (119, 120).<br />
Utilizarea testării HPV post terapie ar trebui explorată pentru<br />
realizarea de noi protocoale pentru monitorizarea după terapia CIN.<br />
Evidențele științifice sugerează de asemenea că urmărirea conse<strong>cu</strong>tivă a<br />
38
femeilor negative atât pentru HPV cât și pentru citologie ar trebui să fie mai<br />
puțin intensă. Se recomandă implementarea și monitorizarea <strong>cu</strong> grijă a<br />
pacientelor, prin diferite protocoale de urmarire. Se impun studii de analiză<br />
a protecției pe termen îndelungat a unui rezultat HPV negativ, pre<strong>cu</strong>m și<br />
realizarea de ghiduri naționale și europene pentru management și urmarire.<br />
În figura 98 este prezentat un posibil algoritm de urmărire a femeilor după<br />
terapia leziunilor CIN:<br />
Colposcopie Colposcopie<br />
Acceptabilă inaceptabilă (CIN 2, 3 re<strong>cu</strong>renta)<br />
Proceduri de urmarire propuse pentru monitorizarea post terapie<br />
Excizie / ablația Procedura<br />
zonei de transformare diagnostică excisională<br />
Citologie Testare ADN/HPV<br />
Citologie și/sau colposcopie<br />
Negativ ≥ ASC HPV pozitiv HPV<br />
negativ<br />
Screening Colpscopie<br />
de rutină<br />
Screening<br />
de rutină<br />
Fig. 23: Algoritm de monitorizare după terapia leziunilor CIN (adaptat după 90)<br />
39
11. Evaluarea ris<strong>cu</strong>lui de evoluție către neoplazia cervicală în cazul<br />
pacientelor HIV pozitive<br />
HPV ca factor de risc pentru HIV<br />
Numeroase studii au detectat o prevalență și o incidență mai mare,<br />
pre<strong>cu</strong>m si o persistență a infecției HPV și a displaziilor anogenitale în cazul<br />
femeilor și bărbaților HIV pozitivi, în comparație <strong>cu</strong> subiecții negativi<br />
pentru HIV.<br />
Studiul HERS (HIV Epidemiology Research Study) a identificat că<br />
aproape toate tipurile HPV se pare că persistă în rândul femeilor HIV<br />
pozitive, în comparație <strong>cu</strong> cele HIV negative (OR = 2,5). Fenomenul de<br />
persistență a fost de 1,9 ori mai mare, <strong>cu</strong> nivele CD4 < 200 celule / µl, în<br />
comparație <strong>cu</strong> femeile <strong>cu</strong> nivele CD4 > 500 celule / µl (123). Prevalența<br />
infecției HPV crește odată <strong>cu</strong> scăderea imunității. Astfel, în cazul<br />
pacientelor HIV negative, prevalența HPV a fost de 29,8% și apoi a cres<strong>cu</strong>t<br />
după <strong>cu</strong>m urmează: 51,7% pentru cazurile <strong>cu</strong> CD4 > 200 și <strong>cu</strong> ARN/HIV <<br />
20.000 copii, 66% pentru cazurile <strong>cu</strong> CD4 > 200 dar <strong>cu</strong> ARN/HIV > 20.000<br />
și a cres<strong>cu</strong>t apoi la 76% în cazul în care CD4 < 200 celule / µl (124).<br />
Există evidențe consistente despre faptul că displazia cervicală este<br />
mult mai prevalentă în rândul femeilor HIV infectate, în comparație <strong>cu</strong><br />
femeile seronegative. 15 – 40% dintre femeile HIV pozitive prezintă<br />
displazie evidentă, acest procentaj fiind de 10 – 11 ori mai mare decât în<br />
cazul femeilor negative (125). Frecvența și severitatea frotiurilor citologice<br />
pre<strong>cu</strong>m și displaziile confirmate histologic crește odată <strong>cu</strong> scăderea CD4. În<br />
aceste cazuri, displazia este asociată <strong>cu</strong> o implicare extensivă la nivelul<br />
cervixului și deseori implică și alte situsuri (vagin, vulvă, regiunea<br />
perianală) (126).<br />
Lot de studiu, metoda, rezultate<br />
În perioada februarie – iunie 2011 am testat ADN/HPV din celule cervicale<br />
recoltate de la paciente <strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>te HIV/AIDS pozitive, monitorizate de o<br />
echipa de medici ginecologi a Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie<br />
„Cuza Voda”, Iași.<br />
Lotul testat a inclus 20 de paciente <strong>cu</strong> media vârstei de 21 de ani<br />
(limite 19 – 30 ani). 10 / 20 (50%) dintre femeile testate au fost detectate<br />
pozitive pentru HPV, dintre care doar 3 au fost infecții unice HPV (52, 68<br />
și respectiv 84). 35% (7/20) paciente au prezentat infecții <strong>cu</strong> multiple tipuri<br />
HPV, fiind detectate între 2 și 7 genotipuri HPV pe strip (fig. 24).<br />
40
infectii multiple<br />
35%<br />
infectii unice<br />
15%<br />
negative infectii unice infectii multiple<br />
41<br />
negative<br />
50%<br />
Fig. 24: Rezultatele genotipării lotului de paciente HIV pozitive<br />
Infecțiile <strong>cu</strong> multiple tipuri HPV detectate au fost:<br />
- pacienta C. A.: HPV 51, 52, 55, 68, CP 6108;<br />
- pacienta D.I.: HPV 6, 16, 51, 52, 66, 73, 83;<br />
- pacienta S. E: HPV 6, 16, 73, 82;<br />
- pacienta A. A.: HPV 39, 42, 51, 73;<br />
- pacienta P. C.: HPV 31, CP 6108;<br />
- pacienta B. C.: HPV 6, 11, 52, 58;<br />
- pacienta T. A-M.: HPV 42, 53, 82, CP 6108.<br />
În fig. 27 am redat imaginea câtorva din aceste stripuri <strong>cu</strong> multiple<br />
benzi albastre care corespund infecțiilor <strong>cu</strong> multiple tipuri HPV.<br />
Fig. 25: Imaginea unor stripuri <strong>cu</strong> multiple benzi detectate corespunzătoare<br />
infecțiilor <strong>cu</strong> multiple tipuri HPV
Pentru pacientele care au fost pozitive și pentru HPV 16, am<br />
<strong>cu</strong>antificat ADN/HPV 16 prin Real Time PCR. Prezentarea principiului RT<br />
PCR și validarea experimentului a fost prezentată în capitolul 3.7. În tabelul<br />
VI am prezentat rezultatele obținute pentru aceste două paciente:<br />
<strong>cu</strong>antificarea ADN <strong>cu</strong> ajutorul nanodropului, valorile Ct-urilor și numărul<br />
de cópii virale detectate prin Real Time PCR.<br />
Tabel V: Rezultatele <strong>cu</strong>antificării ADN/HPV 16 pentru două paciente HIV +<br />
Paciente Rezultat genotipare<br />
LA<br />
Valoare<br />
ADN citită<br />
la<br />
nanodrop<br />
42<br />
Număr<br />
Ct / RTPCR<br />
Număr cópii<br />
ADN/HPV<br />
16<br />
D.I. HPV 6, 16, 51, 52,<br />
66, 73, 83<br />
18,5 31,66 4,072 x 10 2<br />
S.E. HPV 39, 42, 51, 73 26,9 35,04 3,722 x 10<br />
Dis<strong>cu</strong>ții: lotul nostru, deși mic ca dimensiune, prezintă aceleași<br />
caracteristici ca și loturile mari din studiile citate anterior. În primul rând<br />
prevalența ADN/HPV în rândul femeilor HIV pozitive este de 50%, versus<br />
32,1% din lotul nostru prezentat în capitolul 3.4. Dintre infecțiile HPV<br />
detectate în cazul femeilor HIV pozitive, doar 30% au fost infecții unice,<br />
restul fiind infecții <strong>cu</strong> multiple tipuri HPV. HPV 16 a fost detectat doar în<br />
două din infecțiile mutiple, cele mai frecvente HR HPV detectate în aceste<br />
cazuri fiind 51 (3 paciente), 52 (3 paciente), 73 și CP6108 (câte 2<br />
paciente).Ca și în cazul altor infecții <strong>cu</strong> multiple tipuri HPV, încărcatura<br />
virală a ADN/HPV 16 a fost mai mică decât în cazul infecțiilor unice.<br />
Concluzii: se impune monitorizarea atentă a acestor paciente, mai frecvent<br />
decît în cazul femeilor HIV negative, chiar dacă media lor de vârstă este de<br />
doar 21 ani, din cauza ris<strong>cu</strong>lui mai mare de persistență a infecțiilor HPV în<br />
cazul femeilor HIV pozitve. Pentru țara noastră se recomandă de asemenea<br />
protocolul „scren – and – treat” pentru monitorizarea acestor paciente<br />
(135).<br />
12. Infecții <strong>asimptomatice</strong> <strong>cu</strong> <strong>transmitere</strong> <strong>sexuală</strong><br />
În legatură <strong>cu</strong> amploarea şi importanţa <strong>infecţii</strong>lor<br />
<strong>asimptomatice</strong> transmise pe cale <strong>sexuală</strong>, este bine<strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>t faptul că cele<br />
mai multe <strong>infecţii</strong> transmise pe cale <strong>sexuală</strong> (ITS) sunt simptomatice, dar<br />
nu este definit exact conceptul ITS <strong>asimptomatice</strong>, si nu se <strong>cu</strong>noaște<br />
frecvenţa lor sau importanţa <strong>infecţii</strong>lor <strong>asimptomatice</strong> în <strong>transmitere</strong>a ITS.
În acest sens se impune alcătuirea unui cadru conceptual pentru<br />
categorizarea ITS în funcţie de simptomatologie, determinarea proporţiei<br />
indivizilor <strong>cu</strong> infecţie asimptomatică si de asemenea, se impune estimarea<br />
proporţiei transmiterii ITS datorită <strong>infecţii</strong>lor <strong>asimptomatice</strong>.<br />
Conceptul poate fi construit pe baza prezenței simptomelor,<br />
indivizii fiind divizaţi în mai multe categorii: indivizi “simptomatici”<br />
(simptomele sunt prezente); indivizi <strong>cu</strong> infecţie “inaparentă” (individul<br />
prezintă simptome dar nu sunt re<strong>cu</strong>nos<strong>cu</strong>te ca fiind produse de o ITS);<br />
persoane “<strong>asimptomatice</strong>”- această categorie este importantă, deoarece,<br />
numai pacienţii “simptomatici” vor solicita tratament specific. Analizând<br />
studii de <strong>transmitere</strong> care au evaluat pacienţi simptomatici, pacienţi<br />
asimptomatici sau <strong>cu</strong> <strong>infecţii</strong> inaparente, s-a observat că aceştia au un rol<br />
important în <strong>transmitere</strong>a ITS, iar partenerii sexuali ai indivizilor <strong>cu</strong> ITS,<br />
simptomatici sau nu, sunt în mod caracteristic asimptomatici.<br />
Atât publi<strong>cu</strong>l larg cât şi cadrele medicale trebuie să aprecieze<br />
importanţa naturii <strong>asimptomatice</strong> a ITS. Mesaje de sănătate publică<br />
concentrate pe simptomele ITS se vor finaliza <strong>cu</strong> un impact semnificativ<br />
asupra transmiterii acestor <strong>infecţii</strong>. În acelaşi scop, cadrele medicale trebuie<br />
să intensifice evaluarea ris<strong>cu</strong>lui pacienţilor, screening-ul acestora pentru<br />
ITS, pre<strong>cu</strong>m şi acordarea de informaţii corecte.<br />
Este important de dis<strong>cu</strong>tat potențialul impact al unui test HPV<br />
pozitiv asupra unei femei, pre<strong>cu</strong>m și mesajul transmis acestei femei, atât ei<br />
cât și partenerului ei în timpul consilierii. Se impune explicarea<br />
semnificației unui test ADN HPV pozitv și se indică literatura adecvată<br />
acestor paciente. Pacientele vor fi sfătuite ce măsuri să ia în legătură <strong>cu</strong><br />
partenerul lor și de asemenea, partenerul va trebui informat. Se va verifica<br />
necesitatea unei monitorizări ulterioare psihologice și de asemenea<br />
pacientele vor fi consiliate din punct de vedere sexual.<br />
Viitorul prevenției cancerului cervical presupune utilizarea testării<br />
ADN HPV ca test primar de screening, pre<strong>cu</strong>m și prevenția se<strong>cu</strong>ndară întro<br />
populație complet vaccinată. Principiile unui program de screening<br />
populațional presupun testarea unui grup mare al populației aparent<br />
sanatoase, pentru a detecta semnele precoce ale bolii. Screening-ul este<br />
intenționat a ținti / viza în special acele persoane care vor beneficia cel mai<br />
mult din urma acestui screening, iar scopul unui screening este obținerea<br />
unui beneficiu maxim de sănătate pentru populație. Clinicienii au un rol<br />
important în transferul de informație către paciente, pentru a favoriza<br />
scăderea anxietății pacientelor detectate HPV pozitiv. În cazul detectării<br />
unui test HPV pozitiv este necesară concentrarea pe elementele cheie ale<br />
mesajului pentru a scădea anxietatea pacientelor. Mesajul ar trebui să<br />
43
conțină <strong>cu</strong>noștinte despre faptul că tipurile HPV sunt heterogene, având<br />
ris<strong>cu</strong>ri diferite pentru dezvoltarea cancerului cervical; de asemenea, mesajul<br />
ar trebui să conțină informații despre prevalența cres<strong>cu</strong>tă a infecției HPV și<br />
de asemenea, ar trebui avută în vedere componenta motivațională a<br />
prevenției cancerului cervical (136).<br />
Monitorizarea și consilierea femeilor HPV pozitive, <strong>cu</strong> citologie normală<br />
Din lotul pacientelor testate prin genotipare în rândul femeilor care<br />
nu și-au realizat niciodată un test Papanicolau, am detectat 33,3% paciente<br />
ADN/HPV pozitive, iar în cazul femeilor <strong>cu</strong> un test Papanicolau normal am<br />
identificat 19,2% pozitive. În ambele situații, cazurile ADN HPV pozitive<br />
au presupus infecții <strong>cu</strong> tipuri HRHPV, LRHPV, pHRHPV, pre<strong>cu</strong>m și<br />
infectii <strong>cu</strong> multiple genotipuri HPV. Putem afirma că în cazul femeilor fără<br />
testarea citologică am identificat 33,3% infecții HPV <strong>asimptomatice</strong>, iar<br />
cazul pacientelor <strong>cu</strong> Papanicolu normal am identificat 19,2% infecții<br />
<strong>asimptomatice</strong> și inaparente (fig. 26: 1-fără citologie efectuată, 2-citologie<br />
normală).<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
1<br />
2<br />
HR-HPV<br />
LR-HPV<br />
44<br />
NEGATIVE<br />
HR-HPV<br />
pHR-HPV<br />
LR-HPV<br />
MULTIPLE INFECTIONS<br />
NEGATIVE<br />
Fig. 26: Rezultatele testării ADN/HPV în cazul femeilor fără examen<br />
citologic sau <strong>cu</strong> rezultat normal al examenului Papanicolau<br />
În momentul în care am comunicat rezultatul testării ADN/HPV în<br />
cazul acestor două categorii de paciente, am identificat situații delicate, de<br />
neacceptare, în momentul inițial, al rezultatului genotipării HPV.<br />
Neacceptarea se datorează faptului ca pacientele erau în momentul testării,<br />
<strong>asimptomatice</strong>, și nu voiau sa accepte faptul că au fost detectate pozitive<br />
pentru un virus care poate produce cancer.<br />
Având în vedere ritmul rapid al inovaţiei în prevenirea și controlul<br />
cancerului de col uterin, au fost realizate puține eforturi concentrate pentru<br />
diseminarea informației către publi<strong>cu</strong>l larg, într-un mod adecvat și<br />
semnificativ. Cele mai multe femei au aflat de HPV în momentul primirii<br />
unui rezultat anormal pentru frotiul Papanicolau. Puține persoane înteleg<br />
legatura dintre HPV și cancerul cervical. Infecția HPV este o infecție
transmisă pe cale <strong>sexuală</strong> foarte frecventă, care însă rareori evoluează către<br />
cancer.<br />
Se impun eforturi pentru optimizarea programelor educaționale de<br />
sănătate publică, care să presupună informarea pacientelor care urmează să<br />
fie monitorizate, informarea pacientelor pentru înțelegerea relației dintre un<br />
test citologic anormal și un test ADN HPV pozitiv și <strong>cu</strong>m plasează aceste<br />
rezultate o pacientă la risc pentru cancerul cervical. Este importantă<br />
facilitatea luării unei decizii importante de către pacienta <strong>cu</strong> privire la<br />
status-ul infecției HPV (62).<br />
Literatura de specialitate sugerează că detecția unui HR HPV la o<br />
femeie este un indicator important pentru evoluția către CIN 2 sau chiar<br />
grade mai avansate ale displaziei cervicale. În rândul femeilor <strong>cu</strong> vârsta<br />
peste 30 ani, <strong>cu</strong> citologie negativă, CIN 3 a fost identificat pe par<strong>cu</strong>rsul a<br />
10 ani de monitorizare în 21% din cazurile HPV 16 pozitive și în 18% în<br />
cazul pacientelor HPV 18 pozitive. În cazul femeilor pozitive pentru alte<br />
HR HPV, ris<strong>cu</strong>l pentru CIN 3 a fost doar de 1,5% (62).<br />
Probe recoltate de la femei HPV pozitive dar <strong>cu</strong> citologie negativă<br />
trebuie testate prin genotipare HPV, iar femeile detectate pozitive pentru<br />
genotipuri specifice HR HPV, <strong>cu</strong>m ar fi HPV 16 și 18 trebuie evaluate și<br />
colposcopic. Femeile pozitive pentru alte HR HPV trebuie retestate la 12<br />
luni prin citologie și prin testare ADN HPV. Acest algoritm de urmărire va<br />
permite femeilor <strong>cu</strong> risc de a avea un rezultat fals negativ citologic să fie<br />
evaluate colposcopic (63).<br />
Multe femei testate în screening-uri populaționale care au fost<br />
detectate HPV pozitive au avut un rezultat citologic negativ. Într-un studiu<br />
care a înrolat mai mult de 213.000 femei <strong>cu</strong> vârsta de 30 ani, prevalența<br />
HPV a fost de 6,5% și doar 58% dintre femei au avut un rezultat<br />
concordant între rezultatul testării HPV și rezultatul evaluării citologice<br />
(136). Femeile HPV pozitive necesită consilierea <strong>cu</strong> privire la ris<strong>cu</strong>l de<br />
evoluție către CIN 2, <strong>cu</strong> privire la sursa infecției și la gradul lor de<br />
infectivitate. Ris<strong>cu</strong>l de a avea o leziune CIN 2 nedetectată în cazul femeilor<br />
HPV pozitve <strong>cu</strong> citologie negativă a fost detectat a fi între 2,4 – 5,1% (137<br />
– 142). Este important de menționat că în cazul femeilor <strong>cu</strong> vârsta peste 30<br />
ani, majoritatea femeilor HPV pozitive devin HPV negative după<br />
monitorizare. Un studiu din Franța a detectat, după o perioadă de 6 luni de<br />
urmărire, că 60% din pacientele monitorizate au devenit negative (143).<br />
Pe baza acestor considerente, cel mai adecvat management al<br />
acestor paciente este monitorizarea prin citologie și testarea ADN HPV la<br />
12 luni. Pacientele care la testări repetate sunt în mod persistent HPV<br />
45
pozitive, ar trebui evaluate colposcopic, în timp ce femeile care devin<br />
negative la ambele teste ar trebui retestate după 3 ani (algoritm fig. 27)<br />
(62).<br />
Citologie negativă<br />
HPV (-) HPV (+)<br />
Screening de rutină Repetarea ambelor teste la 12 luni<br />
(nu mai devreme de 3 ani)<br />
Ambele negative Citologie (-), HPV (+) Citologie<br />
anormală, HPV (+)<br />
Screening de rutină Colposcopie Management conform<br />
(3 ani) ghid ASCCP<br />
Fig. 27: Utilizarea testelor ADN HPV în screening-ul cancerului cervical pentru<br />
femeile <strong>cu</strong> vârsta peste 30 ani, <strong>cu</strong> citologie negativă (adaptat după 62)<br />
13. Concluzii generale<br />
România se situează pe primul loc în Europa în ceea ce privește<br />
incidența (23,9/100,000) și mortalitatea (11.6/100,000) prin cancerul de col<br />
uterin. În pofida acestor date, rapoartele OMS menționează că nu sunt date<br />
disponibile pentru țara noastră referitor la prevalența genotipurilor HPV în<br />
rândul femeilor <strong>cu</strong> diferite diagnostice citologice.<br />
Introducerea testării prin RT PCR a <strong>infecţii</strong>lor simptomatice şi<br />
<strong>asimptomatice</strong>, induse de HPV, reprezintă pentru zona noastră o noutate,<br />
deoarece este primul studiu care abordează la nivel mole<strong>cu</strong>lar, relaţia dintre<br />
46
aceste <strong>infecţii</strong> şi cancerul cervical, utilizând infrastructura Laboratorului de<br />
Microbiologie din cadrul Fa<strong>cu</strong>ltăţii de Medicină a UMF „<strong>Gr</strong>. T. <strong>Popa</strong>” Iaşi. Au<br />
fost optimizate metodele de biologie mole<strong>cu</strong>lară ce au fost utilizate în<br />
realizarea obiectivelor știintifice ale tezei (metoda de detecție a 37 genotipuri<br />
HPV prin tehnica Linear Array HPV Genotyping Test si tehnicia Real Time<br />
PCR pentru <strong>cu</strong>antificarea HPV 16 și a HPV 18).<br />
Pe par<strong>cu</strong>sul celor 3 ani destinaţi cercetării ştiinţifice în cadrul<br />
doctoranturii, am realizat genotiparea probelor pentru un lot reprezentativ de<br />
paciente (353), iar rezultatele privind prevalența genotipurilor <strong>cu</strong> risc înalt<br />
oncogen detectate (9,91% pentru HPV 16 și 3,11% HPV 18), susțin<br />
introducerea vaccinării anti HPV în zona noastră. Genotiparea prin tehnica<br />
Linear Array HPV Genotyping test a fost validată prin participarea la un panel<br />
internațional de testare a proficienței, organizat de către OMS.<br />
Pacientele pozitive pentru HPV 16 și 18 au fost testate prin tehnica<br />
Real Time PCR, în vederea stabilirii unei valori prag a încărcăturii virale, utile<br />
pentru identificarea precoce a ris<strong>cu</strong>lui de evoluție către cancerul cervical.<br />
Diversitatea valorilor încărcăturii virale detectate în raport <strong>cu</strong> gradul displaziei<br />
cervicale (mai exact, am detectat încărcături virale mari, de 10 5 – 10 6 cópii<br />
virale, atât în situațiile în care pacientele aveau HSIL, <strong>cu</strong>m era de așteptat, dar<br />
și în cazurile <strong>cu</strong> LSIL, ASCUS și chiar <strong>cu</strong> citologie normală), a fa<strong>cu</strong>t<br />
imposibilă stabilirea unei valori limită, care să indice intervenţia chirurgicală<br />
terapeutică. Cuantificarea prin RT PCR este utilă în cazul în care se poate<br />
realiza testarea în dinamică a încărcăturii virale, pentru a evalua istoria<br />
naturală a infecției <strong>cu</strong> genotipurile înalt oncogene.<br />
Pentru şapte dintre pacientele testate am realizat monitorizarea lor la<br />
6, 12 și18 luni, prin genotipare și prin <strong>cu</strong>antificarea ADN HPV 16 și 18 prin<br />
Real Time PCR. Lipsa de aderență a pacientelor la monitorizarea la care au<br />
fost invitate să participe, conform formularului de consimțământ informat, se<br />
poate explica prin neînțelegerea necesității urmăririi pacientelor în vederea<br />
precizării evoluției bolii. Se impune educarea populației <strong>cu</strong> privire la<br />
conexiunea dintre HPV și cancerul cervical și la <strong>utilitatea</strong> participării la<br />
programele de monitorizare.<br />
Necesitatea monitorizării prin testarea ADN HPV se impune și în<br />
cazul pacientelor tratate excizional, pentru displazii cervicale de grad înalt. Am<br />
evaluat prin testarea ADN HPV, 21 paciente, la 6 luni după intervenția<br />
chirurgicală și am detectat o persisteță a infecţiei HPV, atât <strong>cu</strong> HR cât şi <strong>cu</strong> LR<br />
în 14,28% din cazurile testate (două infecții unice: HPV 18 și respectiv HPV<br />
51, și o infecţie <strong>cu</strong> tipuri HPV multiple - 6, 39). Se impune revizuirea<br />
consimţământului informat, astfel încât pacientele să înţeleagă avantajele<br />
participării la astfel de studii, ca modalitate de monitorizare a reactivării<br />
47
infecţiei persistente, ce impune strategii terapeutice diferite. În unele ţări,<br />
colposcopia, <strong>cu</strong> o sensibilitate ce variază în limite foarte largi (24 – 96 %) este<br />
o tehnică abandonată, în favoarea tehnicilor de biologie mole<strong>cu</strong>lară. Testarea<br />
pentru genotipurile HPV înalt oncogene, după terapia excizională, este cea mai<br />
sensibilă metodă (96%) pentru stabilirea leziunilor CIN reziduale sau<br />
re<strong>cu</strong>rente.<br />
O altă categorie de femei care necesită monitorizare prin testare ADN<br />
HPV o reprezintă femeile <strong>cu</strong> vârsta peste 30 ani, <strong>asimptomatice</strong>, ADN HPV<br />
pozitive dar <strong>cu</strong> citologie negativă. În cazul femeilor <strong>cu</strong> Papanicolu normal am<br />
identificat 19,2% <strong>infecţii</strong> HPV <strong>asimptomatice</strong> (4 paciente pozitive pentru HPV<br />
16 și alte 4 paciente din această categorie, pozitive <strong>cu</strong> HPV 18). Categoria<br />
persoanelor “<strong>asimptomatice</strong>” este importantă, deoarece, numai pacienţii<br />
“simptomatici” vor solicita tratament specific. Ghidurile europene recomandă<br />
monitorizarea atentă a acestor paciente prin testarea ADN HPV.<br />
În contextul transmiterii simultane a mai multor agenţi infecţioşi, o<br />
atenție parti<strong>cu</strong>lară trebuie acordata pacientelor HIV – HR HPV pozitive. Am<br />
testat 20 de paciente HIV pozitive, <strong>cu</strong> media vârstei de 21 de ani: 50% au fost<br />
pozitive pentru HPV, dintre care 70% au prezentat <strong>infecţii</strong> <strong>cu</strong> tipuri HPV<br />
multiple, fiind detectate concomitent între 2 şi 7 genotipuri HPV. Prevalența<br />
ADN/HPV în rândul femeilor HIV pozitive a fost de 50%, versus 32,1%. HPV<br />
16 a fost detectat doar în două dintre infecțiile multiple, cele mai frecvente HR<br />
HPV detectate în aceste cazuri fiind 51 (3 paciente), 52 (3 paciente), 73 și<br />
CP6108 (câte 2 paciente). Ca şi în cazul altor infecții <strong>cu</strong> tipuri HPV multiple,<br />
încărcătura virală a ADN/HPV 16 a fost mai mică decât în cazul infecțiilor<br />
unice. Se impune monitorizarea atentă a acestor paciente, mai frecvent decât în<br />
cazul femeilor HIV negative, chiar dacă media lor de vârstă este de doar 21<br />
ani, deoarece prevalența infecției HPV creşte odată <strong>cu</strong> scăderea imunității, iar<br />
cancerul cervical în rândul femeilor HIV pozitive nu pare să fi scăzut în era<br />
HAART.<br />
Cele mai multe <strong>infecţii</strong> transmise pe cale <strong>sexuală</strong> (ITS) sunt<br />
simptomatice, dar nu se <strong>cu</strong>noaște frecvenţa lor sau importanţa <strong>infecţii</strong>lor<br />
<strong>asimptomatice</strong> în <strong>transmitere</strong>a ITS.<br />
Din lotul pacientelor testate prin genotipare în rândul femeilor care nu<br />
și-au realizat niciodată un test Papanicolau, am detectat 33,3% paciente<br />
ADN/HPV pozitive, iar în cazul femeilor <strong>cu</strong> un test Papanicolau normal am<br />
identificat 19,2% pozitive. În ambele situații, cazurile ADN HPV pozitive au<br />
presupus infecții <strong>cu</strong> tipuri HRHPV, LRHPV, pHRHPV, pre<strong>cu</strong>m și infectii <strong>cu</strong><br />
multiple genotipuri HPV. Putem afirma că în cazul femeilor fără testarea<br />
citologică am identificat 33,3% infecții HPV <strong>asimptomatice</strong>, iar cazul<br />
48
pacientelor <strong>cu</strong> Papanicolu normal am identificat 19,2% infecții <strong>asimptomatice</strong><br />
și inaparente.<br />
Până în prezent țările dezvoltate au ajuns la stadiul în care se<br />
preconizează posibilitatea eradicării cancerului cervical (teoretic sunt<br />
îndeplinite toate condițiile eradicării unei infecții HPV) şi ar fi de dorit ca și în<br />
țara noastră să se realizeze un screening organizat pentru detectarea cancerului<br />
cervical în stadii incipiente, prin introducerea la nivel național a genotipării<br />
HPV. Vaccinarea anti HPV, în asociere <strong>cu</strong> testarea ADN HPV, ar putea<br />
conduce la scăderea incidenței și mortalității cancerului cervical pentru țara<br />
noastră.<br />
Studiul de faţă a fost posibil prin utilizarea fondurilor aferente<br />
proiectului de cercetare câştigat prin competiţie naţională: „Tehnica Real Time<br />
PCR ca instrument practic în diagnosti<strong>cu</strong>l şi monitorizarea <strong>infecţii</strong>lor HPV”,<br />
grant CNCSIS, IDEI_1642.<br />
14. Originalitatea contribuţiilor proprii<br />
Introducerea pentru prima dată a două metode de biologie<br />
mole<strong>cu</strong>lară (PCR clasic urmat de hibridizare și Real Time PCR) în<br />
activitatea de rutină a Laboratorul de Virusologie, din cadrul<br />
Disciplinei de Studiu Microbiologie, a Fa<strong>cu</strong>ltăţii de Medicină, ca<br />
etapă preliminară iniţierii studiului infecţiei HPV şi a relaţiei<br />
acesteia <strong>cu</strong> cancerul de col.<br />
Evaluarea prevalenței genotipurilor HPVcir<strong>cu</strong>lante în zona de<br />
Nord a Moldovei pe un lot reprezentativ, <strong>cu</strong> obținerea unor<br />
rezultate care susțin implementarea vaccinării anti HPV în zona<br />
noastră.<br />
Obținerea proficienței pentru genotiparea HPV din partea experţilor<br />
OMS, prin participarea la un panel, la nivel mondial.<br />
Evaluarea încărcăturii virale pentru ADN HPV 16 si 18, evaluată<br />
prin RT PCR, în raport <strong>cu</strong> gradul displaziei cervicale;<br />
Studiul a fost axat şi pe atingerea altor obiective ale tezei de<br />
doctorat, <strong>cu</strong>m au fost testarea ADN/HPV post intervenție<br />
excizională și evaluarea ris<strong>cu</strong>lui de evoluție către neoplazia<br />
cervicală pentru pacientele HIV – HPV pozitive;<br />
Diagnosti<strong>cu</strong>l infecţiei HPV, inclusiv pentru pacientele încadrate ca<br />
HR HPV, urmat de terapia adecvată stadiului, <strong>cu</strong> scopul reducerii<br />
ris<strong>cu</strong>lui de evoluţie nefavorabilă.<br />
49
15. Perspectivele pe care le deschide teza<br />
realizarea screening-ul cancerului cervical prin determinarea:<br />
• markerilor corelaţi <strong>cu</strong> prezenţa virusului:<br />
ADN /HPV;<br />
HPV E6/E7 mARN / Real Time PCR;<br />
genotiparea HPV.<br />
• markerilor leziunilor cervicale:<br />
p16INK4a CINTEC;<br />
markerii de metilare (CADM1) / Real Time PCR;<br />
tranziţia de la cercetare, la implementarea ca diagnostic de rutină a<br />
genotipării HPV;<br />
diagnosti<strong>cu</strong>l infecțiilor asiptomatice <strong>cu</strong> ajutorul tehnicii Real Time<br />
PCR, pentru a surprinde boala cervicală în stadii incipiente, în<br />
vederea unei intervenţii terapeutice eficiente.<br />
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA:<br />
1. Pagliusi S, Aguado MT. Efficacy and other milestones for human papillomavirus vaccine introduction, Vaccine<br />
2004 23(5):569-578.<br />
2. WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV Information Centre). Human Papillomavirus<br />
and Related Cancers in World. Summary Report 2009.<br />
3. F. Xavier Bosch, Global Burden & Epidemiology of HPV & associated diseases, HPV Today, July 2010.<br />
4. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM.<br />
GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10<br />
Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Available from: http://globocan.iarc.fr<br />
5. Doorbar J., The natural history of papillomavirus disease; from silent and productive infections to neoplasia and<br />
latency, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops.<br />
6. Harald zur Hausen et al, Classification of papillomaviruses, Virology 324 (2004) 17– 27<br />
7. Margaret Stanley, Mechanisms of HPV infection and immunity - A state of the Art ,<br />
HPV Immunity online WEBMINAR, Elselvier, 16 / 06 / 2010.<br />
8. Mark Schiffman, HPV: Natural History of the infection from the epidemiologic and clinical perspective, The<br />
26th International Papillomavirus Conference and Workshops.<br />
9. Mark Schiffman et al. Classification of weakly carcinogenic human papillomavirus types: addressing the limits<br />
of epidemiology at the borderline, Infectious Agents and Cancer 2009 4:8 doi:10.1186/1750-9378-4-8<br />
10. Anna Barbara Moscicki, Natural history of infection in younger women: implication for screening, follow-up<br />
and treatment, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops.<br />
11. Margaret Stanley, How do HPV vaccines protect? , The 26th International Papillomavirus Conference and<br />
Workshops.<br />
12. Anthony B. Miller, Cervical cancer screening: the principles and evaluation parameters of the programme, The<br />
26th International Papillomavirus Conference and Workshops.<br />
13. Chris J.L.M. Meijer, Biological markers in cervical cancer screening, The 26th International Papillomavirus<br />
Conference and Workshops.<br />
14. Jack Cuyick, Rational transition from research studies to implementation in programmes, The 26th International<br />
Papillomavirus Conference and Workshops.<br />
15. Jack Cuyick et al., Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical<br />
cancer screening Int. J. Cancer: 119, 1095–1101 (2006).<br />
16. *** Linear Array HPV Genotyping Test, Roche Diagnostic handbook.<br />
17. *** High Pure PCR Template Preparation Kit for genomic DNA (ROCHE Diagnostics) handbook<br />
18. S Brismar-Wendel, M Froberg, A Hjerpe, S Andersson, B Johansson, Age-specific prevalence of HPV<br />
genotypes in cervical cytology samples with equivocal or low-grade lesions, British Journal of Cancer (2009), 1<br />
–7.<br />
50
19. J. Jamison, R. T. Wilson and J. Carson , The evaluation of human papillomavirus genotyping in cervical liquidbased<br />
cytology specimens; using the Roche Linear Array HPV genotyping assay, Cytopathology 2009, 20, 242–<br />
248.<br />
20. Christoph Koidl, MD; Michael Bozic; Ita Hadzisejdic, Comparison of mole<strong>cu</strong>lar assays for detection and<br />
typing of human papillomavirus, Am J Obstet Gynecol, 2008;199:144.e1-144.e6.<br />
21. Philip E. Castle, Carolina Porras, Wim G. Quint , Comparison of Two PCR-Based Human Papillomavirus<br />
Genotyping Methods, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 2008, p. 3437–3445.<br />
22. J. Jeronimo, N. Wentzensen, R. Long, M. Schiffman, Evaluation of Linear Array Human Papillomavirus<br />
Genotyping Using Automatic Optical Imaging Software, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug.<br />
2008, p. 2759–2765.<br />
23. Matthew P. Stevens, Suzanne M. Garland, Jeffrey H. Tan, HPV Genotype Prevalence in Women With<br />
Abnormal Pap Smears in Melbourne, Australia, J. Med.Virol.81:1283–1291,2009.<br />
24. Marinko Dobec, Fridolin Bannwart, Franz Kaeppeli, Pascal Cassinotti, Automation of the linear array HPV<br />
genotyping test and its application for routine typing of human papillomaviruses in cervical specimens of<br />
women without cytological abnormalities in Switzerland, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 23–27.<br />
25. Muñoz N, Bosch FX, de Sanjosé S, Herrero R, Epidemiologic classification of human papillomavirus types<br />
associated with cervical cancer, N. Engl. J Med., 2003, Feb 6; 348 (6); 518 – 27.<br />
26. *** Introduction to Quantitative PCR, Stratagene, Methods and Application Guide;<br />
27. Tevfik Dorak M., (editor) Real – Time PCR, BIOS Advanced Methods;<br />
28. *** qPCR course - Freising, Germany, TATAA BIOEPS COURSE;<br />
29. *** Precision TM 2X qPCR Mastermix handbook, Primer Design LTD, handbook.<br />
30. *** Quantification of Human Papilloma Virus 16 (HPV 16) genomes, Primer Design handbook;<br />
31. *** Quantification of Human Papilloma Virus 18 (HPV 16) genomes, Primer Design handbook;<br />
32. *** Mx300XP_Demo_mature, Azra Dedic Biomedica Medizinprodukte GmbH.<br />
33. WHO & IARC, IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenetic Risks to Humans, Human<br />
Papillomaviruses, volume 90, Lyon, France, 2007.<br />
34. van Duin, Snijders PJ, Meijer CJ, Human Papillomavirus 16 load in normal and abnormal cervical scrapes; an<br />
indicator of CIN II/III and viral celearance, Int J Cancer, 2002, Apr 1; 98 (4); 590 – 5.<br />
35. Peter J.F. Snijders, Albertus T. Hesselink, Chris J.L.M. Meijer, Determination of viral load thresholds in<br />
cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with normal cytology, Int. J.<br />
Cancer: 119, 1102–1107 (2006).<br />
36. Albertus T. Hesselink, Chris J.L.M. Meijer, Peter J.F. Snijders1, High-risk human papillomavirus DNA load in<br />
a population-based cervical screening cohort in relation to the detection of high-grade cervical intraepithelial<br />
neoplasia and cervical cancer, Int. J. Cancer: 124, 381–386 (2009).<br />
37. Inger Gustavssona, Ivana Juko-Pecirepa, Ingrid Backlund, Comparison between the Hybrid Capture 2 and the<br />
hpVIR real-time PCR for detection of human papillomavirus in women with ASCUS or low grade dysplasia,<br />
Journal of Clinical Virology 45 (2009) 85–89.<br />
38. Karin Biedermann, Nadia Dandachi, Maria Trattner, Comparison of Real-Time PCR Signal-Amplified In Situ<br />
Hybridization and Conventional PCR for Detection and Quantification of Human Papillomavirus in Archival<br />
Cervical Cancer Tissue, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2004, p. 3758–3765.<br />
39. Ming Guo, Nour Sneige, Elvio G Silva, Distribution and viral load of eight oncogenic types of human<br />
papillomavirus (HPV) and HPV 16 integration status in cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma,<br />
Modern Pathology (2007) 20, 256–266.<br />
40. Long Fu Xi, Nancy B. Kiviat, Denise A. Galloway, Effect of Cervical Cytologic Status on the Association<br />
between Human Papillomavirus Type 16 DNA Load and the Risk of Cervical Intraepithelial Neoplasia <strong>Gr</strong>ade 3,<br />
The Journal of Infectious Diseases 2008; 198:324 –31.<br />
41. Nelba Tábora, Annabelle Ferrera, Judith M. J. E. Bakkers, High HPV 16 Viral Load is Associated with<br />
Increased Cervical Dysplasia in Honduran Women, Am. J. Trop. Med. Hyg., 78(5), 2008, pp. 843–846.<br />
42. Jean-Luc Prétet, Véronique Dalstein, Sylvain Monnier-Benoit, High risk HPV load estimated by Hybrid<br />
Capture II® correlates with HPV16 load measured by real-time PCR in cervical smears of HPV16-infected<br />
women, Journal of Clinical Virology 31 (2004) 140–147.<br />
43. Elisa Leo, Simona Venturoli , Monica Cricca, High-throughput two-step LNA real time PCR assay for the<br />
quantitative detection and genotyping of HPV prognostic-risk groups, Journal of Clinical Virology 45 (2009)<br />
304–310.<br />
44. Tibor Takacs, Csaba Jeney, Laura Kovacs, Mole<strong>cu</strong>lar beacon-based real-time PCR method for detection of 15<br />
high-risk and 5 low-risk HPV types, Journal of Virological Methods 149 (2008) 153–162.<br />
45. Roger A. Hubbard, Human Papillomavirus Testing Methods, Arch Pathol Lab Med—Vol 127, August 2003.<br />
46. Francois Coutlée,, Helen Trottier, Simon Gagnon, Low-risk human papillomavirus type 6 DNA load and<br />
integration in cervical samples from women with squamous intraepithelial lesions, Journal of Clinical Virology<br />
45 (2009) 96–99.<br />
47. Roberto Flores-Munguia, Erin Siegel, Walter T. Klimecki, and Anna R. Giuliano, Performance Assessment of<br />
Eight High-Throughput PCR Assays for Viral Load Quantitation of Oncogenic HPV Types, Journal of<br />
Mole<strong>cu</strong>lar Diagnostics, Vol. 6, No. 2, May 2004.<br />
51
48. Francesco Broccolo, Stefania Chiari, Andrea Piana, Prevalence and Viral Load of Oncogenic Human<br />
Papillomavirus Types Associated With Cervical Carcinoma in a Population of North Italy, Journal of Medical<br />
Virology 81:278–287 (2009).<br />
49. Martina Schmitza, Cornelia Scheungraber, Jörg Herrmann, Quantitative multiplex PCR assay for the detection<br />
of the seven clinically most relevant high-risk HPV types, Journal of Clinical Virology 44 (2009) 302–307.<br />
50. Merja P. Ruutu, Satu-Maria Kulmala, Panu Peitsaro, The performance of the HPV16 real-time PCR integration<br />
assay, Clinical Biochemistry 41 (2008) 423–428<br />
51. Christopher Payan, Alexandra Ducancelle, Mohamed H. Aboubaker, Human Papillomavirus Quantification in<br />
Urine and Cervical Samples by Using the Mx4000 and LightCycler General Real-Time PCR Systems,<br />
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Mar. 2007, p. 897–901.<br />
52. Ramona Gabriela Ursu, Luminiţa Smaranda Ian<strong>cu</strong>, HR-HPV viral load, p16INK4a: predictive of persistence<br />
infection, 25th International Papillomavirus Conference. Malmo, May, 2009.<br />
53. Carina Eklund, Keng-Ling Wallin, Ola Forslund, Joakim Dillner, WHO HPV LabNet Report on HPV DNA<br />
Proficiency Panel, 2010<br />
54. De Sanjose et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in<br />
women with normal cytology: a meta-analysis. Lancet Infect Dis 2001 7(7): 453 – 459.<br />
55. K S Cuschieri et al., Multiple high risk HPV infections are common in cervical neoplasia and young women in<br />
a cervical screening population, J Clin Pathol 2004;57:68–72<br />
56. Silvia Franceschi, Oral contraceptives and cervical cancer, HPVToday, 17.<br />
57. Stuart Collinsa et al., Cigarette smoking is an independent risk factor for cervical intraepithelial neoplasia in<br />
young women: A longitudinal study, Eur J Cancer. 2010 January ; 46(2): 405–411.<br />
58. Ann Nielsen Acquisition of high-risk human papillomavirus infection in a population-based cohort of Danish<br />
women, Sex Transm Dis. 2009 October ; 36(10): 609–615<br />
59. Giancarlo Ripabelli et al., Prevalence and genotype identification of human papillomavirus in women<br />
undergoing voluntary cervical cancer screening in Molise, Central Italy, Cancer Epidemiology 34 (2010) 162–<br />
167<br />
60. Ameli Trope et al., Performance of Human Papillomavirus DNA and mRNA Testing Strategies for Women<br />
with and without Cervical Neoplasia, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2009, p. 2458–2464<br />
61. *** NanoPhotometer TM Pearl hand book<br />
62. Carcopino X, Henry M, Benmoura D, Fallabregues AS, Richet H, Boubli L, Tamalet C., Determination of HPV<br />
type 16 and 18 viral load in cervical smears of women referred to colposcopy., J Med Virol. 2006<br />
Aug;78(8):1131-40.<br />
63. Snijders PJ, Hogewoning CJ, Hesselink AT, Berkhof J, Voorhorst FJ, Bleeker MC, Meijer CJ., Determination<br />
of viral load thresholds in cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with<br />
normal cytology., Int J Cancer. 2006 Sep 1;119(5):1102-7<br />
64. Yoshida T, Sano T, Kanuma T, Owada N, Sakurai S, Fukuda T, Nakajima T., Quantitative real-time polymerase<br />
chain reaction analysis of the type distribution, viral load, and physical status of human papillomavirus in<br />
liquid-based cytology samples from cervical lesions., Int J Gynecol Cancer. 2008 Jan-Feb;18(1):121-7.<br />
65. Syrjänen K, Kulmala SM, Shabalova I, Petrovichev N, Kozachenko V, Zakharova T, Pajanidi J, Podistov<br />
J, Chemeris G, Sozaeva L, Lipova E, Tsidaeva I, Ivanchenko O,Pshepurko A, Zakharenko S, Nerovjna<br />
R, Kljukina L, Erokhina O, Branovskaja M, Nikitina M, <strong>Gr</strong>unjberga V, <strong>Gr</strong>unjberg A, Juschenko A, Santopietro<br />
R, Cintorino M, Tosi P, Syrjänen S., Epidemiological, clinical and viral determinants of the increased<br />
prevalence of high-risk human papillomavirus (HPV) infections in elderly women., Eur J Gynaecol<br />
Oncol. 2008;29(2):114-22.<br />
66. Hesselink AT, Berkhof J, Heideman DA, Bulkmans NW, van Tellingen JE, Meijer CJ, Snijders PJ., High-risk<br />
human papillomavirus DNA load in a population-based cervical screening cohort in relation to the detection of<br />
high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer., Int J Cancer. 2009 Jan 15;124(2):381-6.<br />
67. Broccolo F, Chiari S, Piana A, Castiglia P, Dell'Anna T, Garcia-Parra R, Maneo A, Villa A, Leone EB, Perego<br />
P, Maida A, Mangioni C, Co<strong>cu</strong>zza CE., Prevalence and viral load of oncogenic human papillomavirus types<br />
associated with cervical carcinoma in a population of North Italy., J Med Virol. 2009 Feb;81(2):278-87.<br />
68. Winer RL, Harris TG, Xi LF, Jansen KU, Hughes JP, Feng Q, Welebob C, Ho J, Lee SK, Carter JJ, Galloway<br />
DA, Kiviat NB, Koutsky LA., Quantitative human papillomavirus 16 and 18 levels in incident infections and<br />
cervical lesion development., J Med Virol. 2009 Apr;81(4):713-21.<br />
69. Xi LF, Edelstein ZR, Meyers C, Ho J, Cherne SL, Schiffman M., Human papillomavirus types 16 and 18 DNA<br />
load in relation to coexistence of other types, parti<strong>cu</strong>larly those in the same species., Cancer Epidemiol<br />
Biomarkers Prev. 2009 Sep;18(9):2507-12.<br />
70. Damay A, Didelot-Rousseau MN, Costes V, Konate I, Ouedraogo A, Nagot N, Foulongne V, Van de Perre<br />
P, Mayaud P, Segondy M., Viral load and physical status of human papillomavirus (HPV) 18 in cervical<br />
samples from female sex workers infected with HPV 18 in Burkina Faso., J Med Virol. 2009 Oct;81(10):1786-<br />
91.<br />
71. Yoshida T, Sano T, Oyama T, Kanuma T, Fukuda T., Prevalence, viral load, and physical status of HPV<br />
16 and 18 in cervical adenosquamous carcinoma., Virchows Arch. 2009 Sep;455(3):253-9.<br />
52
72. Singh A, Datta P, Jain SK, Bhatla N, Dutta Gupta S, Dey B, Singh N., Human papilloma virus genotyping,<br />
variants and viral load in tumors, squamous intraepithelial lesions, and controls in a north Indian population<br />
subset., Int J Gynecol Cancer. 2009 Dec;19(9):1642-8.<br />
73. Xi LF, Koutsky LA, Castle PE, Edelstein ZR, Meyers C, Ho J, Schiffman M., Relationship between cigarette<br />
smoking and human papilloma virus types 16 and 18 DNA load., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009<br />
Dec;18(12):3490-6.<br />
74. Dinc B, Rota S, Onan A, Bozdayi G, Taskiran C, Biri A, Güner H., Prevalence of human papillomavirus (HPV)<br />
and HPV-16 genotyping by real-time PCR in patients with several cervical pathologies., Braz J Infect Dis. 2010<br />
Jan-Feb;14(1):19-23.<br />
75. Ramanakumar AV, Goncalves O, Richardson H, Tellier P, Ferenczy A, Coutlée F, Franco EL., Human<br />
papillomavirus (HPV) types 16, 18, 31, 45 DNA loads and HPV-16 integration in persistent and transient<br />
infections in young women., BMC Infect Dis. 2010 Nov 11;10:326.<br />
76. Carcopino X, Bolger N, Henry M, Mancini J, Boubli L, Olive D, Cleary S, Prendiville W, Tamalet C.,<br />
Evaluation of type-specific HPV persistence and high-risk HPV viral load quantitation in HPV positive women<br />
under 30 with normal cervical cytology., J Med Virol. 2011 Apr;83(4):637-43. doi: 10.1002/jmv.22022.<br />
77. Marks M, <strong>Gr</strong>avitt PE, Utaipat U, Gupta SB, Liaw K, Kim E, Tadesse A, Phongnarisorn C, Wootipoom<br />
V, Yuenyao P, Vipupinyo C, Rugpao S, Sriplienchan S, Celentano DD., Kinetics of DNA load predict HPV<br />
16 viral clearance., J Clin Virol. 2011 May;51(1):44-9.<br />
78. Li Y, Xiang Y, Zhang RF, Cai YP, Yang Y, Cheng XM, Zhu BL. , Viral load, genomic integration frequency of<br />
human papillomavirus 16 in cervical cancer and precancerous lesions, Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2011 Apr<br />
5;91(13):906-10.<br />
79. Nielsen A, Kjaer SK, Munk C, Osler M, Iftner T., Persistence of high-risk human papillomavirus infection in a<br />
population-based cohort of Danish women., J Med Virol. 2010 Apr;82(4):616-23.<br />
80. Gunnell AS, Tran TN, Torrång A, Dickman PW, Sparén P, Palmgren J, Ylitalo N., Synergy between<br />
cigarette smoking and human papillomavirus type 16 in cervical cancer in situ development., Cancer Epidemiol<br />
Biomarkers Prev. 2006 Nov;15(11):2141-7. Epub 2006 Oct 20.<br />
81. Muñoz N, Castellsagué X, de González AB, Gissmann L., Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer.,<br />
Vaccine. 2006 Aug 31;24 Suppl 3:S3/1-10. Epub 2006 Jun 23.<br />
82. Rajeevan MS, Swan DC, Nisenbaum R, Lee DR, Vernon SD, Ruffin MT, Horowitz IR, Flowers LC, Kmak<br />
D, Tadros T, Birdsong G, Husain M, Srivastava S, Unger ER., Epidemiologic and viral factors associated with<br />
cervical neoplasia in HPV-16-positive women., Int J Cancer. 2005 May 20;115(1):114-20.<br />
83. Wang SS, Schiffman M, Herrero R, Carreon J, Hildesheim A, Rodriguez AC, Bratti MC, Sherman ME, Morales<br />
J, Guillen D, Alfaro M, Clayman B, Burk RD, Viscidi RP., Determinants of human papillomavirus<br />
16 serological conversion and persistence in a population-based cohort of 10 000 women in Costa Rica., Br J<br />
Cancer. 2004 Oct 4;91(7):1269-74.<br />
84. Reesink-Peters N, Burger MP, Kleter B, Quint WG, Bossuyt PM, Adriaanse AH., Using a new HPV detection<br />
system in epidemiological research: change of views on cervical dyskaryosis?, Eur J Obstet Gynecol Reprod<br />
Biol. 2001 Oct;98(2):199-204.<br />
85. Ho GY, Kadish AS, Burk RD, Basu J, Palan PR, Mikhail M, Romney SL., HPV 16 and cigarette smoking as<br />
risk factors for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia., Int J Cancer. 1998 Oct 29;78(3):281-5.<br />
86. del Amo J, González C, Belda J, Fernández E, Martínez R, Gómez I, Torres M, Saiz AG, Ortiz M., Prevalence<br />
and risk factors of high-risk human papillomavirus in female sex workers in Spain: differences by geographical<br />
origin., J Womens Health (Larchmt). 2009 Dec;18(12):2057-64.<br />
87. Flores R, Papenfuss M, Klimecki WT, Giuliano AR., Cross-sectional analysis of oncogenic HPV viral load and<br />
cervical intraepithelial neoplasia., Int J Cancer. 2006 Mar 1;118(5):1187-93.<br />
88. Ylitalo N, Sørensen P, Josefsson A, Frisch M, Sparén P, Pontén J, Gyllensten U, Melbye M, Adami HO.,<br />
Smoking and oral contraceptives as risk factors for cervical carcinoma in situ., Int J Cancer. 1999 May<br />
5;81(3):357-65.<br />
89. Daling JR, Madeleine MM, McKnight B, Carter JJ, Wipf GC, Ashley R, Schwartz SM, Beckmann AM,<br />
Hagensee ME, Mandelson MT, Galloway DA., The relationship of human papillomavirus-related cervical<br />
tumors to cigarette smoking, oral contraceptive use, and prior herpes simplex virus type 2 infection., Cancer<br />
Epidemiol Biomarkers Prev. 1996 Jul;5(7):541-8<br />
90. Arbyn M., Anttila A., Jordan J., Ronco G., Schenck U., Segnan N., Wiener H. G., Herbert A., Daniel J., von<br />
Karsa L., European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening, Second Edition, IARC.<br />
91. Wright TC Jr, Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, Solomon D; 2006 American Society for<br />
Colposcopy and Cervical Pathology-sponsored Consensus Conference., 2006 consensus guidelines for the<br />
management of women with abnormal cervical cancer screening tests., Am J Obstet Gynecol. 2007<br />
Oct;197(4):346-55. Review.<br />
92. Jordan J, Martin-Hirsch P, Arbyn M, Schenck U, Baldauf JJ, Da Silva D, Anttila A, Nieminen P, Prendiville<br />
W., European guidelines for clinical management of abnormal cervical cytology, part 2., Cytopathology. 2009<br />
Feb;20(1):5-16.<br />
93. Strander B, Ryd W, Wallin KL, Wärleby B, Zheng B, Milsom I, Gharizadeh B, Pourmand N, Andersson-<br />
Ellström A., Does HPV-status 6-12 months after treatment of high grade dysplasia in the uterine cervix predict<br />
long term re<strong>cu</strong>rrence?, Eur J Cancer. 2007 Aug;43(12):1849-55.<br />
53
94. Distéfano AL, Picconi MA, Alonio LV, Dalbert D, Mural J, Bartt O, Bazán G, Cervantes G, Lizano<br />
M, Carrancá AG, Teyssié A., Persistence of human papillomavirus DNA in cervical lesions after treatment with<br />
diathermic large loop excision., Infect Dis Obstet Gynecol. 1998;6(5):214-9<br />
95. Arbyn M, Paraskevaidis E, Martin-Hirsch P, Prendiville W, Dillner J., Clinical utility of HPV-DNA detection:<br />
triage of minor cervical lesions, follow-up of women treated for high-grade CIN: an update of pooled evidence.,<br />
Gynecol Oncol. 2005 Dec;99(3 Suppl 1):S7-11.<br />
96. Paraskevaidis E, Arbyn M, Sotiriadis A, Diakomanolis E, Martin-Hirsch P, Koliopoulos G, Makrydimas G,<br />
Tofoski J, Roukos DH., The role of HPV DNA testing in the follow-up period after treatment for CIN: a<br />
systematic review of the literature., Cancer Treat Rev. 2004 Apr;30(2):205-11. Review.<br />
97. Zielinski GD, Bais AG, Helmerhorst TJ, Verheijen RH, de Schipper FA, Snijders PJ, Voorhorst FJ, van<br />
Kemenade FJ, Rozendaal L, Meijer CJ., HPV testing and monitoring of women after treatment of CIN 3:<br />
review of the literature and meta-analysis., Obstet Gynecol Surv. 2004 Jul;59(7):543-53.<br />
98. Nobbenhuis MA, Meijer CJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Risse EK, Verheijen<br />
RH, Helmerhorst TJ., Addition of high-risk HPV testing improves the <strong>cu</strong>rrent guidelines on follow-up after<br />
treatment for cervical intraepithelial neoplasia., Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):796-801.<br />
99. Bar-Am A, Gamzu R, Levin I, Fainaru O, Niv J, Almog B., Follow-up by combined cytology and human<br />
papillomavirus testing for patients post-cone biopsy: results of a long-term follow-up., Gynecol Oncol. 2003<br />
Oct;91(1):149-53.<br />
100. Almog B, Gamzu R, Kuperminc MJ, Levin I, Fainaru O, Niv J, Bar-Am A., Human papilloma virus testing in<br />
patient follow-up post cone biopsy due to high-grade cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2003<br />
Mar;88(3):345-50.<br />
101. Negri G, Gampenrieder J, Vigl EE, Haitel A, Menia E, Mian C., Human papilloma virus typing at large loop<br />
excision of the transformation zone of the cervix uteri., Anticancer Res. 2003 Sep-Oct;23(5b):4289-92.<br />
102. Hernádi Z, Szoke K, Sápy T, Krasznai ZT, Soós G, Veress G, Gergely L, Kónya J., Role of human<br />
papillomavirus (HPV) testing in the follow-up of patients after treatment for cervical precancerous lesions., Eur<br />
J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005 Feb 1;118(2):229-34.<br />
103. Denny LA, Wright TC Jr., Human papillomavirus testing and screening., Best Pract Res Clin Obstet<br />
Gynaecol. 2005 Aug;19(4):501-15<br />
104. Coupé VM, Berkhof J, Verheijen RH, Meijer CJ., Cost-effectiveness of human papillomavirus testing after<br />
treatment for cervical intraepithelial neoplasia., BJOG. 2007 Apr;114(4):416-24.<br />
105. Leguevaque P, Motton S, Decharme A, Soulé-Tholy M, Escourrou G, Hoff J., Predictors of re<strong>cu</strong>rrence in highgrade<br />
cervical lesions and a plan of management., Eur J Surg Oncol. 2010 Nov;36(11):1073-9.<br />
106. Heymans J, Benoy IH, Poppe W, Depuydt CE., Type-specific HPV geno-typing improves detection of re<strong>cu</strong>rrent<br />
high-grade cervical neoplasia after conisation., Int J Cancer. 2010 Nov 9.<br />
107. Liu Y, Li C, Wang J, Zhang W., Repeat low-grade squamous intraepithelial cytology with unsatisfactory<br />
colposcopy treated by the loop electrosurgical excision procedure: a retrospective study., Eur J Gynaecol<br />
Oncol. 2010;31(6):632-5.<br />
108. Fambrini M, Penna C, Pieralli A, Bussani C, Fallani MG, Andersson KL, Scarselli G, Marchionni M., PCR<br />
detection rates of high risk human papillomavirus DNA in paired self-collected urine and cervical scrapes after<br />
laser CO2 conization for high-grade cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2008 Apr;109(1):59-64.<br />
109. Jeong NH, Lee NW, Kim HJ, Kim T, Lee KW., High-risk human papillomavirus testing for monitoring patients<br />
treated for high-grade cervical intraepithelial neoplasia., J Obstet Gynaecol Res. 2009 Aug;35(4):706-11.<br />
110. Ribaldone R, Boldorini R, Capuano A, Arrigoni S, Di Oto A, Surico N., Role of HPV testing in the follow-up<br />
of women treated for cervical dysplasia., Arch Gynecol Obstet. 2010 Aug;282(2):193-7.<br />
111. Ostojić DV, Vrdoljak-Mozetic D, Stemberger-Papić S, Finderle A, Eminović S., Cervical cytology and HPV<br />
test in follow-up after conisation or LLETZ., Coll Antropol. 2010 Mar;34(1):219-24.<br />
112. Ding Z, Jiang C, Shore T, Pather S, Dalrymple C, Atkinson K, Murali R, Yousef Al-Rayyan ES, Luo K, Carter<br />
J., Outcome of cervical intraepithelial neoplasia 2 diagnosed by punch biopsy in 131 women., J Obstet<br />
Gynaecol Res. 2011 Mar 13. doi: 10.1111/j.1447-0756.2010.01427.x.<br />
113. Kucera E, Sliutz G, Czerwenka K, Breitenecker G, Leodolter S, Reinthaller A., Is high-risk human<br />
papillomavirus infection associated with cervical intraepithelial neoplasia eliminated after conization by largeloop<br />
excision of the transformation zone?, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001 Dec 10;100(1):72-6.<br />
114. Kreimer AR, Guido RS, Solomon D, Schiffman M, Wacholder S, Jeronimo J, Wheeler CM, Castle PE., Human<br />
papillomavirus testing following loop electrosurgical excision procedure identifies women at risk for<br />
posttreatment cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 disease., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006<br />
May;15(5):908-14.<br />
115. Gök M, Coupé VM, Berkhof J, Verheijen RH, Helmerhorst TJ, Hogewoning CJ, Snijders PJ, Meijer CJ.,<br />
HPV16 and increased risk of re<strong>cu</strong>rrence after treatment for CIN., Gynecol Oncol. 2007 Feb;104(2):273-5.<br />
116. Fallani MG, Penna C, Marchionni M, Bussani C, Pieralli A, Andersson KL, Fambrini M., Prognostic<br />
significance of high-risk HPV persistence after laser CO2 conization for high-grade CIN: a prospective clinical<br />
study., Eur J Gynaecol Oncol. 2008;29(4):378-82.<br />
117. Dyson S, Pitts M, Lyons A, Mullins R., Providing high quality information about human papillomavirus for<br />
women after treatment for high-grade cervical dysplasia., Sex Health. 2010 Mar;7(1):49-54.<br />
54
118. Valasoulis G, Koliopoulos G, Founta C, Kyrgiou M, Tsoumpou I, Valari O, Martin-Hirsch P, Daponte<br />
A, Karakitsos P, Paraskevaidis E., Alterations in human papillomavirus-related biomarkers after treatment of<br />
cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2011 Apr;121(1):43-8.<br />
119. Nobbenhuis MA, Meijer CJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Risse EK, Verheijen<br />
RH, Helmerhorst TJ., Addition of high-risk HPV testing improves the <strong>cu</strong>rrent guidelines on follow-up after<br />
treatment for cervical intraepithelial neoplasia., Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):796-801.<br />
120. Elfgren K, Jacobs M, Walboomers JM, Meijer CJ, Dillner J., Rate of human papillomavirus clearance after<br />
treatment of cervical intraepithelial neoplasia., Obstet Gynecol. 2002 Nov;100(5 Pt 1):965-71.<br />
121. Soutter WP, Sasieni P, Panoskaltsis T., Long-term risk of invasive cervical cancer after treatment of squamous<br />
cervical intraepithelial neoplasia., Int J Cancer. 2006 Apr 15;118(8):2048-55.<br />
122. Kalliala I, Dyba T, Nieminen P, Hakulinen T, Anttila A., Mortality in a long-term follow-up after treatment of<br />
CIN., Int J Cancer. 2010 Jan 1;126(1):224-31.<br />
123. Schuman P, Ohmit SE, Klein RS, Duerr A, Cu-Uvin S, Jamieson DJ, Anderson J, Shah KV; HIV Epidemiology<br />
Research Study (HERS) <strong>Gr</strong>oup., Longitudinal study of cervical squamous intraepithelial lesions in human<br />
immunodeficiency virus (HIV)-seropositive and at-risk HIV-seronegative women., J Infect Dis. 2003 Jul<br />
1;188(1):128-36.<br />
124. Silverberg MJ, Ahdieh L, Munoz A, Anastos K, Burk RD, Cu-Uvin S, Duerr A, <strong>Gr</strong>eenblatt RM, Klein RS,<br />
Massad S, Minkoff H, Muderspach L, Palefsky J, Piessens E, Schuman P, Watts H, Shah KV., The impact<br />
of HIV infection and immunodeficiency on human papillomavirus type 6 or 11 infection and on genital warts.,<br />
Sex Transm Dis. 2002 Aug;29(8):427-35.<br />
125. Strickler HD, Palefsky JM, Shah KV, Anastos K, Klein RS, Minkoff H, Duerr A, Massad LS, Celentano DD,<br />
Hall C, Fazzari M, Cu-Uvin S, Bacon M, Schuman P, Levine AM, Durante AJ, Gange S, Melnick S, Burk RD.,<br />
Human papillomavirus type 16 and immune status in human immunodeficiency virus-seropositive women., J<br />
Natl Cancer Inst. 2003 Jul 16;95(14):1062-71.<br />
126. Harris TG, Burk RD, Palefsky JM, Massad LS, Bang JY, Anastos K, Minkoff H, Hall CB, Bacon MC, Levine<br />
AM, Watts DH, Silverberg MJ, Xue X, Melnick SL, Strickler HD., Incidence of cervical squamous<br />
intraepithelial lesions associated with HIV serostatus, CD4 cell counts, and human papillomavirus test results.,<br />
JAMA. 2005 Mar 23;293(12):1471-6.<br />
127. Auvert B, Lissouba P, Cutler E, Zarca K, Puren A, Taljaard D., Association of oncogenic and nononcogenic<br />
human papillomavirus with HIV incidence., J Acquir Immune Defic Syndr. 2010 Jan 1;53(1):111-6.<br />
128. Clarke B, Chetty R., Postmodern cancer: the role of human immunodeficiency virus in uterine cervical cancer.,<br />
Mol Pathol. 2002 Feb;55(1):19-24.99. Gage JR, Sandhu AK, Nihira M, Bonecini-Almeida M da G, Cristoforoni<br />
P, Kishimoto T, Montz FJ, Martínez-Maza O., Effects of human papillomavirus-associated cells on human<br />
immunodeficiency virus gene expression., Obstet Gynecol. 2000 Dec;96(6):879-85.<br />
129. <strong>Gr</strong>ay RH, Serwadda D, Kong X, Makumbi F, Kigozi G, <strong>Gr</strong>avitt PE, Watya S, Nalugoda F, Ssempijja V, Tobian<br />
AA, Kiwanuka N, Moulton LH, Sewankambo NK, Reynolds SJ, Quinn TC, Iga B, Laeyendecker O, Oliver AE,<br />
Wawer MJ., Male cir<strong>cu</strong>mcision decreases acquisition and increases clearance of high-risk human<br />
papillomavirus in HIV-negative men: a randomized trial in Rakai, Uganda., J Infect Dis. 2010 May<br />
15;201(10):1455-62.<br />
130. Cu-Uvin S., HPV as a risk factor for HIV, the 26 th International Papillomavirus Conference, Montreal, Canada,<br />
2010<br />
131. Clifford GM, Gonçalves MA, Franceschi S; HPV and HIV Study <strong>Gr</strong>oup., Human papillomavirus types among<br />
women infected with HIV: a meta-analysis., AIDS. 2006 Nov 28;20(18):2337-44<br />
132. De Vuyst H, Lillo F, Broutet N, Smith JS., HIV, human papillomavirus, and cervical neoplasia and cancer in<br />
the era of highly active antiretroviral therapy., Eur J Cancer Prev. 2008 Nov;17(6):545-54.<br />
133. Gervaz P, Hahnloser D, Wolff BG, Anderson SA, Cunningham J, Beart RW Jr, Klipfel A, Burgart L,<br />
Thibodeau SN., Mole<strong>cu</strong>lar biology of squamous cell carcinoma of the anus: a comparison of HIV-positive<br />
and HIV-negative patients., J Gastrointest Surg. 2004 Dec;8(8):1024-30; dis<strong>cu</strong>ssion 1031.<br />
134. Kitchener H, Nelson L, Adams J, Mesher D, Sasieni P, Cubie H, Moore C, Heard I, Agarossi A, Casolati E,<br />
Denny L, Bradbeer C, Lyons F, Beattie G, Niemiec T., Colposcopy is not necessary to assess the risk to the<br />
cervix in HIV-positive women: an international cohort study of cervical pathology in HIV-1 positive women.,<br />
Int J Cancer. 2007 Dec 1;121(11):2484-91.<br />
135. Franceschi S., Epidemiology of HPV infection in HIV infected people, the 26 th International Papillomavirus<br />
Conference, Montreal, Canada, 2010<br />
136. Ogilvie G., Follow-up and counseling for HPV positive women with normal smears, the 26 th International<br />
Papillomavirus Conference, Montreal, Canada, 2010<br />
137. Kjaer S, Høgdall E, Frederiksen K, Munk C, van den Brule A, Svare E, Meijer C, Lorincz A, Iftner T., The<br />
absolute risk of cervical abnormalities in high-risk human papillomavirus-positive, cytologically normal women<br />
over a 10-year period., Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10630-6.<br />
138. Khan MJ, Castle PE, Lorincz AT, Wacholder S, Sherman M, Scott DR, Rush BB, Glass AG, Schiffman M.,<br />
The elevated 10-year risk of cervical<br />
precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the<br />
possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice., J Natl Cancer Inst. 2005 Jul 20;97(14):1072-9.<br />
55
139. Goldie SJ, Kim JJ, Wright TC., Cost effectiveness of human papillomavirus DNA testing for cervical<br />
cancer screening in women aged 30 years or more., Obstet Gynecol. 2004 Apr;103(4):619-31.<br />
140. Ronco G, Segnan N, Giorgi-Rossi P, Zappa M, Casadei GP, Carozzi F, Dalla Palma P, Del Mistro A, Folicaldi<br />
S, Gillio-Tos A, Nardo G, Naldoni C, Schincaglia P, Zorzi M, Confortini M, Cuzick J; New Technologies for<br />
Cervical Cancer Working <strong>Gr</strong>oup., Human papillomavirus testing and liquid-based cytology: results at<br />
recruitment from the new technologies for cervical cancer randomized controlled trial., J Natl Cancer Inst. 2006<br />
Jun 7;98(11):765-74.<br />
141. Bigras G, de Marval F., The probability for a Pap test to be abnormal is directly proportional to HPV viral<br />
load: results from a Swiss study comparingHPV testing and liquid-based cytology to detect cervical<br />
cancer pre<strong>cu</strong>rsors in 13,842 women., Br J Cancer. 2005 Sep 5;93(5):575-81.<br />
142. Cuzick J, Szarewski A, Cubie H, Hulman G, Kitchener H, Luesley D, McGoogan E, Menon U, Terry<br />
G, Edwards R, Brooks C, Desai M, Gie C, Ho L, Jacobs I, Pickles C, Sasieni P.,<br />
Management of women who test positive for high risk types of human papillomavirus: the HART study.,<br />
Lancet. 2003 Dec 6;362(9399):1871-6.<br />
143. Clavel C, Masure M, Bory JP, Putaud I, Mangeonjean C, Lorenzato M, Nazeyrollas P, Gabriel R, Quereux<br />
C, Birembaut P., Papillomavirus testing in primary screening for the detection of high-grade cervical lesions:<br />
a study of 7932 women., Br J Cancer. 2001 Jun 15;84(12):1616-23.<br />
LISTA ARTICOLE PUBLICATE<br />
I. Ursu RG, Onofries<strong>cu</strong> M, Nemes<strong>cu</strong> D, Ian<strong>cu</strong> LS., Enhanced<br />
mole<strong>cu</strong>lar techniques for the diagnosis of human papillomavirus<br />
infections., Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2009 Oct-Dec;<br />
113(4):1205-10.<br />
II. Ramona Gabriela Ursu, Mircea Onofries<strong>cu</strong>, Dragoş Nemes<strong>cu</strong>,<br />
Roxana Nemes<strong>cu</strong>, Luminiţa Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Detection of HPV 16<br />
and HPV 18 viral loads by Real Time PCR in women with cervical<br />
dysplasia, Analele Ştiinţifice Ale Universităţii „Alexandru Ioan<br />
Cuza”, Secţiunea Genetică Şi Biologie Mole<strong>cu</strong>lară, Tom XII, fasc. I,<br />
2011, pag 25 – 29.<br />
III. Luminiţa-Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Ramona Gabriela Ursu, Ecaterina Mariana<br />
Enache, Mircea Onofries<strong>cu</strong>, Parti<strong>cu</strong>laritatile consimtamântului<br />
informat pentru pacientele HPV pozitive, Revista Romana de<br />
Bioetica, ISSN: 1583-5170<br />
IV. RAMONA GABRIELA URSU, MIRCEA ONOFRIESCU,<br />
DRAGOS NEMESCU, LUMINITA SMARANDA IANCU, HPV<br />
prevalence and type distribution in women with or without cervical<br />
lesions in the North - East region of Romania, Virology Journal<br />
(trimis spre publicare).<br />
56
Nume: Ramona Gabriela Ursu<br />
Data naşterii: 9 noiembrie 1977<br />
Tel.: 0744269946<br />
E-mail: ursuramona@yahoo.com<br />
CURRICULUM VITAE<br />
Educatie:<br />
o 2007 - prezent: doctorand în specialitatea Microbiologie, <strong>cu</strong> teza ”Infecţii <strong>cu</strong><br />
<strong>transmitere</strong> <strong>sexuală</strong> <strong>asimptomatice</strong>. Utilitatea clinică a determinării<br />
cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor HPV <strong>cu</strong> risc înalt<br />
oncogen”;<br />
o 2007 – 2008: Şcoala doctorală;<br />
o 2006 – 2007: Masterat de Epidemiologie clinică. Metodologia de studiu<br />
în bolile multicauzale – Disciplina de Asistenţă Primară a Stării de<br />
Sănătate şi Epidemiologie; lucrare de dizertaţie: ”Determinarea<br />
cantitativă a genotipurilor Human Papilloma Virus <strong>cu</strong> risc înalt<br />
oncogen şi caracterizarea statusului integrării genomului HPV”;<br />
o 1997 – 2003: Universitatea de Medicină şi Farmacie Iaşi, Fa<strong>cu</strong>ltatea de<br />
Medicină;<br />
o 1993 – 1997: Liceul Teoretic "Ştefan cel Mare”, Suceava.<br />
Calificãri:<br />
o 2009: Responsabil Management Calitate Transmed Expert<br />
o 2008: Medic Specialist Medicină de Laborator;<br />
o 2003 – 2008: Rezident Medicina de Laborator;<br />
o 2003: Diploma de Medic.<br />
Experienta profesionalã:<br />
o 2008 – prezent : asistent, Disciplina de Microbiologie, UMF “<strong>Gr</strong>igore T.<br />
<strong>Popa</strong>” Iaşi;<br />
o 2004 – 2008: preparator, Disciplina de Microbiologie, UMF “<strong>Gr</strong>igore T.<br />
<strong>Popa</strong>” Iaşi.<br />
Cursuri postuniversitare / burse:<br />
o 2010: Antimicrobial Stewardship: Measuring, Auditing and<br />
Improving, ESCMID Postgraduate Education Course, 8 - 10 April 2010,<br />
Vienna, Austria<br />
o 2009: Curs “Asigurarea calitatii in laboratoarele conform<br />
standardului ISO 15189”;<br />
o 2009: Curs perfectionare tehnica Real Time PCR (PCR cantitativ), prin<br />
participarea la <strong>cu</strong>rsul orgnizat de TATAA Biocenter, Freising, Germania;<br />
o 2009: <strong>cu</strong>rs postuniversitar ”Efectuarea şi interpretarea testelor de<br />
sensibilitate in vitro<br />
pentru principalele specii de interes medical în raport <strong>cu</strong> noile fenotipuri<br />
de rezistenţă”, UMF “<strong>Gr</strong>igore T. <strong>Popa</strong>” Iasi, februarie - martie 2009;<br />
57
o 2008: vizită de o săptămâna la Organizaţia Mondială a Sănătăţii,<br />
Departamentul HIV / AIDS, unde, sub indrumarea Dr. George Schmid am<br />
selectat bibliografia necesară analizei temei “Infecţii <strong>asimptomatice</strong><br />
transmise pe cale <strong>sexuală</strong>”;<br />
o MD (Mobilitate Doctorală) realizată la Institutul de Virusologie “Ştefan<br />
S. Nicolau”, Bu<strong>cu</strong>reşti, pentru deprinderea şi aprofundarea tehnicii Real<br />
Time PCR (2008) – grant PNCDI – PNII : Proiecte de mobilitate a<br />
doctoranzilor (2/2008).<br />
o 2008: participare la ”Beating Cervical Cancer Webminar”, Global<br />
Videoconference World Cancer Congress, Geneva, International Union<br />
Against Cancer, August 28, 2008;<br />
o 2008: grant participare la “47th ESCMID Postgraduate Technical<br />
Workshop, Gene Expression during Infection”, March, 2008, Siena, Italia;<br />
o BD (Bursa Doctorală), Infecţii <strong>cu</strong> <strong>transmitere</strong> <strong>sexuală</strong> <strong>asimptomatice</strong>.<br />
Utilitatea clinică a determinării cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor<br />
HPV <strong>cu</strong> risc înalt oncogen, competiţie CNCSIS (51/2007);<br />
o 2007: grant participare la “A modern approach to the management of<br />
sexually transmitted diseases”, 45th ESCMID Postgraduate Education<br />
Course”, September, 2007, St. Petersburg, Rusia;<br />
o 2007: stagiu de perfecţionare în laboratorul de Virusologie din cadrul<br />
I.N.C.D.M.I. CANTACUZINO, Bu<strong>cu</strong>reşti - introducere în tehnicile:<br />
purificare ADN, PCR standard şi genotipare HPV prin metoda INNO LiPA,<br />
februarie 2007;<br />
o 2006: participare la SUMMER SCHOOL OF PUBLIC HEALTH,<br />
Institute of Public Health, Iunie, Iaşi, România;<br />
o 2005 - 2006: mobilitate ERASMUS SOCRATES la University of<br />
Southern Denmark, Institute of Public Health, Esbjerg;<br />
o 2005: participare la “4th ESCMID Summer School” Szeged, Hungary,<br />
June, 2005;<br />
o 2004: Curs Perfectionare <strong>Gr</strong>ecia – “Bioetica şi legislaţia sanitară în<br />
România”.<br />
Activitate didacticã :<br />
o Stud. Silvia Salceanu; coordonatori: Ramona Ursu, Luminiţa<br />
Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Genotyping HPV in precancerous cervical lesions:<br />
AGC, ASC-US, ASC-H, LGSIL and HGSIL, CONGRESSIS 2011, Al<br />
8-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi<br />
o Stud. Silvia Salceanu, coordonatori Ramona Ursu, Luminiţa<br />
Smaranda Ian<strong>cu</strong>., Human Papillomavirus genotype prevalence in<br />
Paşcani, Romania, 64th International Students' and Young Scientists'<br />
Conference "Actual Problems of Modern Medicine", Kyiv, Ukraine ,<br />
March 3-4th, 2011<br />
o Stud: Ioana Sacară, Silvia Sălceanu; coordonatori: Ramona Gabriela<br />
Ursu, Luminiţa Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Optimization of Real Time PCR<br />
technique for HPV 16 viral load absolute quantification,<br />
58
CONGRESSIS 2010, Al 7-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi<br />
Tineri Medici, Iasi<br />
o Stud. Oana Murariu, Olivia Jigăreanu; coordonatori: Ramona<br />
Gabriela Ursu, Luminiţa Smaranda, Breaking boundaries in Human<br />
Papilloma Viruses (HPV) infections diagnosis: from classical<br />
Papanicolau test to HPV DNA /mRNA tests, CONGRESSIS 2010, Al<br />
8-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi<br />
o 2009: Challenges Related to Acceptability of Human Papilloma<br />
Virus Vaccines, Autor: Andreea-Georgiana Aiacoboae, Co-autori:<br />
Alexandru Lacatus, Victor Constantines<strong>cu</strong>, Coordonator ştiinţific:<br />
Assistant Ramona Ursu M.D., CONGRESSIS 2009, Al 6-lea Congres<br />
Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi<br />
o 2009: Genotyping Human Papillomavirus: Which Assay?,<br />
Autori: Salceanu Silvia Olivia, Coordonator ştiinţific: Assistant Ramona<br />
Ursu M.D., CONGRESSIS 2009, Al 6-lea Congres Internaţional pentru<br />
Studenţi şi Tineri Medici, Iasi<br />
o 2009: participare la conferinţa studenţilor <strong>cu</strong> prezentarea<br />
”Implementarea vaccinării anti HPV”, în cadrul Săptămânii Europene<br />
de Prevenire a Cancerului de Col Uterin (18-24 ianuarie 2009)<br />
o 2008 : pregătirea practică a whorksop-urilor ”Real Time PCR &<br />
ELISA, as laboratory tool in the diagnosis of infectious diseases”, The<br />
5th International Congress for Medical Students and Young Doctors, Iaşi,<br />
Romania<br />
o 2007: “Advantages of HPV genotyping by INNO – LiPA<br />
method”, studenţi: Ioana Sacară, Andrei Hristov, coordonator ştiinţific<br />
Ramona Ursu, CONGRESSIS 2007, the 4TH International Congress for<br />
Medical Students and Young Doctors, Iaşi<br />
o 2006: “Cauzal relation between HBV – HCC”, studenţi: Ioana<br />
Sacară, Andrei Hristov, coordonator ştiinţific Ramona Ursu, International<br />
Congres of Young Doctor and Students, Bucharest<br />
Membru în proiecte de cercetare :<br />
o Tehnica Real Time PCR ca instrument practic în prognosti<strong>cu</strong>l şi<br />
monitorizarea <strong>infecţii</strong>lor <strong>cu</strong> virusuri papilloma umane <strong>cu</strong> risc oncogen<br />
înalt – grant PNCD2 - IDEI (1642/2008), director de proiect prof. dr.<br />
Ian<strong>cu</strong> Luminţa Smaranda;<br />
o Diagnostic prenatal neinvaziv prin analiza mole<strong>cu</strong>lară a ADN fetal<br />
din plasma maternă - grant PNCD2 - IDEI (1155/2007), director de<br />
proiect prof. dr. Onofries<strong>cu</strong> Mircea;<br />
o Cercetări privind sinteza şi activitatea antibacteriană a unor derivate<br />
de acid-4-chinolon-3- carboxilic. Relaţii structură chimică-activitate<br />
biologică, grant CEEX, Faza III, director de proiect prof. dr. Mihai<br />
Nechifor (2007-2008).<br />
Prezentări:<br />
o R. Ursu, M. Onofries<strong>cu</strong>, D. Nemes<strong>cu</strong>, R. Nemes<strong>cu</strong>, L.S. Ian<strong>cu</strong>, HPV<br />
16&18 viral load and risk factors for cervical cancer, The 27the<br />
59
International Papillomavirus Conference 17-22 September 2011, Berlin,<br />
Germany<br />
o A C Anton, C Cojocaru, G Anton, R Ursu, D Socolov, M <strong>Gr</strong>igore, S<br />
Chelemen, Multiple Electrosurgical Excisions – Treatment For<br />
Precancerous Cervical Lession, The 27the International Papillomavirus<br />
Conference 17-22 September 2011, Berlin, Germany<br />
o Ramona Gabriela Ursu, Cristina Ana Anton, Lavinia Dimitriu, Maria<br />
Carlan, <strong>Gr</strong>igore Alexandru Dimitriu, Luminița Smaranda Ian<strong>cu</strong>,<br />
Importanța testării ADN/HPV prin Linear Array Genotyping Test<br />
post intervenție excisională în neoplaziile intraepiteliale cervicale, 18lea<br />
Congres al Societăţii Române de Medicină de Laborator, 25 - 28 mai<br />
2011 la Sibiu<br />
o Ramona Ursu, M. Onofries<strong>cu</strong>, D. Nemes<strong>cu</strong>, Silvia Sălceanu, Roxana<br />
Nemes<strong>cu</strong>,Mioara Matei, Luminiţa Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Screeningul<br />
cancerului cervical: tranziţia de la evaluarea citologică, la testarea<br />
ADN/HPV, prin tehnici de biologie mole<strong>cu</strong>lară, Conferinta Nationala de<br />
Oncologie, Iasi, noiembrie 2010.<br />
o Ursu Ramona, Onofries<strong>cu</strong> Mircea, Nemes<strong>cu</strong> Dragoş, Sălceanu Sivia,<br />
Nemes<strong>cu</strong> Roxana, Matei Mioara, Ian<strong>cu</strong> Luminiţa Smaranda, Prevalenţa<br />
şi distribuţia genotipurilor HPV în zona Moldovei; corelaţii între<br />
încărcătura virală de HPV 16 şi gradul displaziei cervicale, Conferinta,<br />
A II-a Conferinta Nationala de Microbiologie, 2010, Sinaia<br />
o Ramona Ursu, Luminiţa Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Prevalence of human<br />
papilloma virus types and viral load – Pap test correlation in Romania,<br />
26th International Papillomavirus Conference and Workshops, Montreal,<br />
iulie 2010, poster P – 179.<br />
o Ramona Gabriela Ursu , Luminita Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Optimizarea<br />
tehnicii Real time PCR pentru <strong>cu</strong>antificarea genotipurilor înalt<br />
oncogene de HPV 16 şi 18, Conferinta Nationala de Microbiologie si<br />
Epidemiologie, octombrie 2009, Brasov<br />
O 2009: prezentarea posterului "HR-HPV viral load, p16INK4a -<br />
predictive of persistence infection" la conferinţa "25th International<br />
Papillomavirus Conference" , Malmo, Suedia, mai 2009 (facilitarea<br />
participării la conferinţă s-a datorat grantului oferit de International<br />
Papillomavirus Society, grant obţinut prin competiţie).<br />
o 2007: “HPV: viral load and physical status - clinical utility” în<br />
cadrul <strong>cu</strong>rsului “ A modern approach to the management of sexually<br />
transmitted diseases, 45th ESCMID Postgraduate Education Course”, St<br />
Petersburg, Rusia;<br />
o 2005: “Coinfection HBV – HCV” în cadrul şcolii de vară ESCMID,<br />
Szeghed, Ungaria.<br />
Articole :<br />
o RAMONA GABRIELA URSU, MIRCEA ONOFRIESCU, DRAGOS<br />
NEMESCU, LUMINITA SMARANDA IANCU, trimis spre evluare si<br />
publicare la Virology Journal<br />
60
o Ursu RG, Onofries<strong>cu</strong> M, Nemes<strong>cu</strong> D, Ian<strong>cu</strong> LS., Enhanced mole<strong>cu</strong>lar<br />
techniques f, HPV prevalence and type distribution in women with or<br />
without cervical lesions in the North - East region of Romania or the<br />
diagnosis of human papillomavirus infections., Rev Med Chir Soc Med<br />
Nat Iasi. 2009 Oct-Dec; 113(4):1205-10.<br />
o Luminiţa-Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Ramona Gabriela Ursu, Ecaterina Mariana<br />
Enache, Mircea Onofries<strong>cu</strong>, Parti<strong>cu</strong>laritatile consimtamnatului<br />
informat pentru pacientele HPV pozitive, Revista Romana de Bioetica,<br />
ISSN: 1583-5170<br />
o Ramona Gabriela Ursu, M. Onofries<strong>cu</strong>, D. Nemes<strong>cu</strong>, Luminiţa<br />
Smaranda Ian<strong>cu</strong> Optimizarea unor tehnici de biologie mole<strong>cu</strong>lară<br />
pentru diagnosti<strong>cu</strong>l <strong>infecţii</strong>lor <strong>cu</strong> virusuri papilloma umane, Rev Med<br />
Chir Soc Med Nat Iasi, nr. 4, 113/09.<br />
o Lucia Pintilie, Catalina Negut, C. Onis<strong>cu</strong>, M.T. Caproiu, M.Nechifor,<br />
Luminita Ian<strong>cu</strong>, Cristina Ghiciuc, Ramona Ursu, Synthesis and<br />
Antibacterial Actyvity of some Novel Quinolones, Romanian<br />
Biotechnology Letters, Vol. 14, No. 5, 2009, pp. 4756 – 4767,<br />
http://ebooks.unibuc.ro/biologie/RBL/rbl5vol14/19.pdf<br />
o Luminita Smaranda Ian<strong>cu</strong>, Medea Berea, Ramona Ursu, M.<br />
Onofries<strong>cu</strong>, The prevalence of MRSA among the lying – in women<br />
and their new – born infants in two maternities from Iaşi,, Journal of<br />
Preventive Medicine, volume 14, 2006.<br />
Activitate stiintificã:<br />
o membru societăţi ştiinţifice<br />
European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases<br />
International PapillomaVirus Society HPV Global Community<br />
o membru în comitete de organizare<br />
2008: Cursul Epidemiologie şi Sănătate Publică, creditat CMR, <strong>cu</strong><br />
participare internaţională - invitat Prof. Gabriel Gulis, University of<br />
Southern Denmark, Institute of Public Health, Esbjerg.<br />
Experientã educationalã:<br />
o participare <strong>cu</strong>rs de PSIHOPEDAGOGIE organizat de UMF “<strong>Gr</strong>. T.<br />
<strong>Popa</strong>” Iaşi; lucrarea de Dizertaţie “Comunicarea didactică”, coordonator<br />
Conf. Dr. Şerban Turliuc.<br />
Activitatea profesionalã:<br />
o 8 ani practică (laborator de bacteriologie - UMF “<strong>Gr</strong>. T. <strong>Popa</strong>”, Iaşi,<br />
laborator de virusologie - ISP Iaşi, laborator privat analize medicale).<br />
Limbi strãine: engleza, franceza.<br />
61