ANP - curs 11

ANP - curs 11
Digestia enzimatica
Endonucleazele de restrictie sunt enzime bacteriene ce recunosc specific anumite
secvente de ADN dublu catenar si taie ambele catene in interiorul sau in apropierea
situsului de recunoastere. Lungimea enzimelor de restrictie este variabilila, osciland intre
150 aminoacizi la PvuII si 1250 aminoacizi la CjeI, sau chiar mai mult. Enzimele de
restrictie protejeaza bacteriile fata de infectiile virale, avand astfel rolul unui sistem
imunitar microbian. In lipsa enzimei de restrictie la E coli, aceasta sufera o infectie virala
rapida. Enzimele de restrictie sunt prezente in combinatie cu una sau doua enzime de
modificare (ADN-metiltransferaze), care protejeaza celula impotriva clivarii propriului
ADN de catre enzima de restrictie cu care acesta se asociaza. Enzimele de modificare
recunosc acelasi situs catalitic asemeni enzimei de restrictie pe care o insotesc, dar in loc
de clivare, acestea metileaza una din bazele azotate la fiecare catena. Gruparile metil
patrund in adancitura majora a ADNului la nivelul situsului de restrictie. Enzima de
restrictie impreuna cu enzimele de modificare formeaza impreuna un sistem de restrictie
si modificare (R-M). In anumite sisteme cele doua enzime actioneaza independent una
fata de cealalta. In alte sisteme, cele doua componente se prezinta sub forma a doua
subunitati separate, ale unei enzime mai mari, ce combina ambele activitati catalitice (de
restrictie si de modificare).
Enzimele de restrictie sunt clasificate in functie de compozitia subunitatii de clivare, a
situsului de restrictie, a specificitatii secventei si a cofactorilor necesari. Enzimele care
fac parte din prima categorie sunt enzimele de tip I, care contin subunitati multiple care
se prezinta sub forma de combinatii R-M si care taie ADNul aleator fata de secventele de
recunoastere. In categoria enzimelor de tip II se gasesc enzime care taie ADNul in
apropierea sau in interiorul secventei de recunoastere. Aceasta genereaza fragmente de
restrictie discrete, fragmente care migreaza diferit in geluri de agaroza (electroforeza
orizontala) fata de cel neclivat. Cele mai cunoscute enzime de tip II sunt HhAI, HindIII,
Not I, care taie in interiorul secventei de
recunoastere. Enzimele de acest tip sunt
cele mai des utilizate. De exemplu,
enzima NotI recunoaste urmatoarea
secventa:
5’-GCGGCCGC-3′
3′-CGCCGGCG-5′
NotI taie ADNul uman in medie la
fiecare 10 Mb.
Majoritatea enzimelor de restrictie de tip
II recunosc secvente de ADN care sunt
simetrice deoarece ele se cupleaza la
ADN sub forma de dimeri, in timp ce
unele se cupleaza sub forma de
heterodimeri deoarece recunosc
secventele de ADN asimetrice (BbvCI).
Unele recunosc secvente continue
(EcoRI-GAATTC), in care cele doua
Scindarea ADNului dublu-catenar cu
ajutorul enzimei de restrictie EcoRI

jumatati de recunoastere sunt adiacente, in timp ce altele recunosc secvente discontinue
(Bgl I- GCCNNNNNGGC) in care cele doua situsuri sunt separate.
Asemeni multor altor endonucleaze de restrictie EcoRI scindeaza ADNul la situsul de
restrictie din secventa palindromica. EcoRI scindeaza legaturile fosfodiesterice din
ambele catene ale ADNului intre G si A (vezi figura). Resulta formarea a doua capete
monocatenare complementare (AATT), care initial erau in contact una cu cealalta.
Acestea pot fi separate la incalzire, dar pot fi realiniate la temperaturi mai mici. Situsurile
scindate pot fi din nou realipide cu ajutorul unei enzime numita ADN ligaza. Prin clivare
se geneaza un capat hidroxil 3’ si unul fosfat 5’. Activitatea enzimelor se face in prezenta
magneziului (enzima de restrictie) si a S-adenozil-metioninei (enzima de modificare
corespunzatoare).
Clonarea ADNului
Majoritatea segmentelor de ADN, de exemplu genele, se gasesc in cantitati mici
in celula. Pentru a lucra experimental cu ADNul este nevoie de o cantitate mare de copii
(clone). Procedura clasica de clonare a ADNului se bazeaza pe abilitatea bacteriilor de a
prelua si replica secvente relativ mici de ADN circular cunoscute sub numele de plasmizi.
Segmentul care trebuie copiat trebuie taiat din ADNul amplificat (prin intermediul
tehnicii PCR) cu ajutorul enzimelor de restrictie
O harta de restrictie reprezinta o secventa liniara sau circulara pe care sunt
reprezentate situsurile particulare
pentru enzimele de restrictie. Distanta
dintre aceste situsuri de restrictie este
masurata in numarul perechilor de
baze din ADN sau ARN. In cazul in
care molecula de ADN este taiata cu o
enzima de restrictie corespunzatoare
aceasta este scindata in fragmente
distincte. Aceste fragmente sunt
Obtinerea unui plasmid recombinat cu
ajutorul enzimelor de restrictie
Harta de restrictie a vectorului (plasmidului) pTZ57R/T
separate pe baza marimii cu ajutorul gelurilor de
agaroza sau poliacrilamida. Construirea unei
harti de restrictie necesita folosirea mai multor
enzime de restrictie. In unele tehnici, se
foloseste o grupare fosfat radioactiva la capatul
5’ sau 3’ al secventei scindate.
In situatia simpla in care vectorul
(plasmidul) este deschis (scindat) cu ajutorul
enzimei de restrictie EcoRI si recircularizarea se
face dupa adaugarea fragmentului de ADN
izolat, fragment care poseda capete complementare
cu ale plasmidului. Astfel dupa alipirea
acestui fragment de ADN rezulta un plasmid
recombinat. Prin preincalzirea unui numar de
celule bacteriene cu ADNul circular modificat

unele dintre acestea pot prelua plasmidul recombinat si sa il replice ca pe propriul ADN.
Pentru a fi siguri de faptul ca bacteria gazda contine plasmidul in scopul replicarii acesti
plasmizi confera suplimentar si rezistenta acestei gazde la diverse antibiotice. In cazul in
care bacteriile sunt incubate in prezenta acelor antibiotice, numai celulele care vor
contine plasmidul recombinat se vor replica. Plasmidul este izolat mai tarziu din celule,
scindat cu enzima de restrictie EcoRI si fragmentele sunt separate utilizand electroforeza.
Fragmentele de interes pot fi identificate dupa marime si extrase din gelul de agaroza
pentru experimente ulterioare.
Separarea si detectia acizilor nucleici
In celula acizii nucleici sunt asociati cu proteinele. Odata cu distrugerea celulei
marea parte a acizilor nucleici devin liberi. Acest lucru poate fi obtinut prin agitarea
complexului acid nucleic-proteina cu o solutie de fenol fapt care determina precipitarea
proteinei si posibilitatea indepartarii acesteia prin centrifugare. Alternativ, proteina poate
fi disociata de acizii nucleici de catre detergenti, clorura de guanidina, prin utilizarea unei
concentratii ridicate de sare sau a unor proteaze care degradeaza enzimatic proteinele. In
toate cazurile acizii nucleici (ARN si ADN) pot fi precipitati cu etanol. ARNul poate fi
extras din precipitatul obtinut prin tratarea acestuia cu ADNaze (care scindeaza ADNul)
si vice versa (ADNul poate rezulta prin tratarea precipitatului cu ARNaze).
Cromatografia
Hidroxiapatita (un material pe baza de fosfat de calciu) este utilizata la purificarea
cromatografica si fractionarea ADNului. Duplex-ADNul se leaga puternic de
hidroxiapatita, lucru care permite izolarea rapida a acestuia. Dupa aplicarea extractului
din celula pe coloana, materialul se spala cu o concentratie redusa de fosfat (solutie
tampon) pentru a indeparta ARNul si proteinele, dupa care ADNul este eluat prin
cresterea concentratiei fosfatului.
Cromatografia de afinitate este folosita pentru izolarea acizilor nucleici. Un
exemplu il constituie ARNm din eucariote care are la capatul 3’ o secventa de tip poli(A).
Acestia pot fi separati pe un material (agaroza sau celuloza) pe care este grefata (atasata
prin legaturi covalente) o secventa complementara de tip poli(U). ARNm se leaga de
material la o concentratie mare de sare si la temperatura joasa si poate fi eluat prin
schimbarea unuia din parametrii mentionati.
Absorbtia in UV a acizilor nucleici
In cazul tehnicii PCR este necesara determinarea exacta a concentratiei ADNului.
Una din cele mai simple metode de estimare a concentratiei acizilor nucleici se bazeaza
pe proprietatea acestora de a absorbi lumina din domeniul ultraviolet la o lungime de
unda maxima de 260 nm, absorbtie care este atribuita nucleelor aromatice prezente in
bazele purina si pirimidina. In general pentru o concentratie de 50 µg/ml ADN dublu
catenar valoarea absorbantei la 260 nm este egala cu unitatea, iar in cazul ADNului si
ARNului monocatenar aceeasi valoare a absorbantei este echivalenta cu o concentratie de
40 µg/ml.

Determinarea concentratiei acizilor nucleici prin fluorescenta
Complexul ADN-bisbenzimidazol emite mai puternic (intensitate de 5 ori mai la
458 nm) decat bisbenzimidazolul in stare libera. Technica poate fi cu doua ordine de
magnitudine mai sensibila (in domeniul 0,01 – 5 µg/ml) comparativ cu detectia in UV.
O alta modalitate de detectie a ADNulu sau ARNului se bazeaza pe interactiunea
dintre acesti polimeri si bromura de etidiu. In urma formarii complexului acid nucleicbromura
de etidiu intensitatea emisiei (la 590 nm) creste de aproximativ 25 de ori.
Probele de acid nucleic sunt pipetate pe petriuri cu agaroza ce contin 1% bromura de
etidiu. Aceasta metoda are sensibilitate mai mare (1-10 ng/ml) comparativ cu prima
metoda mentionata.
Acridin orange este un agent fluorescent folosit in microscopie. Acest compus
interactioneaza cu ADN sau ARN prin intercalare intre lanturi sau prin interactiuni
electrostatice. Complexul acridin orange-ADN se distinge printr-un maxim de absorbtie
la 502 nm si un maxim de emisie la 525 nm (verde). Prin asocierea agentului fluorescent
cu ARNul maximul de absorbtie se deplaseaza la 460 nm, iar maximul de emisie este
deplasa la 650 nm (rosu).
DAPI (4,6’-diamino-2-phenilindol) este un compus fluorescent care se leaga in
adancitura mare a ADNului. Acest reactiv este des folosit in microscopia de fluorescenta.
Dat fiind faptul ca DAPI poate trece prin membrana celulara acest compus poate fi folosit
pentru etichetarea celulelor. In cazul in care este utilizat pentru microscopia de
fluorescenta DAPI poate fi excitat in domeniul UV. Complexul DAPI-ADN dublu
catenar este caracterizat print-un maxim de absorbtie la 358 nm si un maxim de emisie la
461 nm (banda larga). In cazul ARNului complexul emite la 400 nm. Datorita
fluorescentei albastre a DAPI acest agent poate fi folosit in analize complexe, caz in care
pot fi depistati si alti compusi cu fluorescenta verde sau rosie. Alaturi de etichetarea
nucleelor celulelor, DAPI poate fi utilizat pentru detectia ADNului viral din culturile de
celule.
SYBR Green este un compus fluorescent
mai nou utilizat la detectia acizilor nucleici in
solutie, in aplicatii pe biocipuri sau in citometria
in flux. SYBR Green este de 25 de ori mai
sensibil decat bromura de etidiu (utilizata mai rar
datorita riscului apararitiei unor mutatii genetice).
SYBR Green se leaga preferential de ADNul
duplex (in adancitura mica a duplexului),
complexul absoarbe lumina albastra la 488 nm si
emite lumina verde la 522 nm, dar poate lega si
ADNul monocatenar proces in urma caruia
cresterea fluorescentei este mai putin pronuntata.
SYBR Green I (N',N'-dimetil-N-[4-[(E)-(3-metil-1,3benzotiazol-2-iliden)metil]-1-fenilquinolin-1-iu-2-il]-
N-propilpropan-1,3-diamina)
Separarea ADNului prin electroforeza
Electroforeza in geluri de agaroza reprezinta metoda standard de analiza a acizilor
nucleici. Deplasarea moleculelor se face in prezenta unui curent electric (acizii nucleici

sunt incarcati negativ datorita prezentei gruparilor fosfat si migreaza spre electrodul
incarcat pozitiv). Mobilitatea electroforetica este influentata de urmatorii factori:
concentratia de agaroza, conformatia moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau
superrasucit), prezenta compusului fluorescent in gel, tamponul utilizat, tipul de agaroza
si voltajul aplicat.
Tehnica de separare a acizilor nucleici prin
electroforeza orizontala (de tip submarin)
Tehnica se foloseste pentru determinarea puritatii ADNului sau ARNului, la
verificarea existentei produsilor rezultati in urma PCRului (reactie de polimerizare a
nucleotidelor) sau la analiza fragmentelor rezultate dupa clivarea enzimatica (cu ajutorul
enzimelor de restrictie) a ADNului. Fragmentele analizate pot avea marimi intre 1000 si
23000 pb (pb-perechi de baze). Unul dintre avantajele acestei tehnici este acela ca ADNul
nu este denaturat, pastrandu-si intacte elementele structurale. Pentru a evita fragmentarea
ulterioara a ADNului manipularea trebuie facuta in asa fel incat sa se evite contaminarea
cu amprente, picaturi, saliva sau microorganisme. Din acest motiv se prefera utilizarea de
materiale sterile (varfuri, etc).
Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru electroforeza in geluri de agaroza
sunt: TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM), TBE (Tris- borat 45 mM, 1 mM EDTA),
TPE (Tris-fosfat 90 mM, EDTA 2 mM). Solutiile tampon pentru electroforeza se
pastreaza sub forma unor stocuri concentrate (10X-50X) si pastrate la temperatura
camerei.
Tamponul de incarcare are in componenta un colorant (albastru de bromfenol sau
rosu de crezol 0,25%) care permite vizualizarea frontului de migrare si zaharoza (40%)
sau glicerina (30%) pentru a asigura o vascozitatea corespunzatoare la aplicarea probei.
Benzile sunt vizualizate cu compusi fluorescenti (bromura de etidiu sau SYBR Green)
prin iradiere cu lumina UV. Sensibilitatea variaza intre 100 pg si 1 ng/banda. Datorita
faptului ca acesti coloranti se intercaleaza intre bazele ADNului dublu catenar,
sensibilitatea detectiei depinde de lungimea lantului acizilor nucleici.
Tehnica Southern Blotting identifica ADNul prin legarea cu o secventa specifica
Tehnica a fost dezvoltata de E. Southern. Duplex-ADNul este mai intai supus
electroforezei dupa care gelul este incubat in NaOH 0,5 M cu scopul obtinerii de lanturi
de ADN monocatenare. Dupa incubare ADNul este transferat cu ajutorul unui sistem de
electro-transfer pe o membrana de nitroceluloza. Dupa uscarea nitrocelulozei (la 80 °C
pentru fixarea ADNului) aceasta este imersata intr-o solutie care contine un singur lant de

ADN sau ARN marcat cu 32 P complementar cu secventa ADNului de analizat. Dupa
hibridizare, si spalare (pentru indepartarea materialului radioactiv care s-a legat
nespecific) membrana de nitroceluloza se usuca si se aseaza pe un film de raze X. Pozitia
moleculelor care sunt complementare cu proba radioactiva este indicata prin aparitia unui
spot alb pe film.
Analog secventele ARNului pot fi detectate prin intermediul tehnicii Northern blot in
care ARNul este imobilizat pe nitroceluloza si proba este hibridizata cu ARNul sau
ADNul complementar radioactiv.
Principiul tehnicii Southern Blot