Metode de analiză a genelor

Metode de
analiză a genelor
Expresia genelor
ADN mut ARNm mut Proteină an Caracter an
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ mutaţie G 4 →A
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
Transcripţie
5’-AUUACAAGAUUACCAUGU-3’ ARNm mut
Translaţie
Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptidan
Caracter fenotipic anormal
Utilizarea tehnicilor de analiză a
acizilor nucleici în medicină
Analiza ADN:
• depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al
bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce);
• identificarea polimorfismului individual →
dactiloscopie genomică (analiza filiaţiei);
• depistarea ADN străin (bacterian, viral) →
diagnosticul bolilor infecţioase şi gradului de infectare.
Analiza ARNm:
• analiza expresiei genice ţesut-specifică;
• evaluarea gradului de expresie a genei normale /
patologice.
Expresia genelor
ADN ARNm Proteină Caracter
5’-ATTGCAAGATTACCATGT-3’ Catena codogenă (netranscrisă)
3’-TAACGTTCTAATGGTACA-5’ Catena anticodogenă (transcrisă)
Transcripţie
5’-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3’ ARNm
Translaţie
Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid
Maturizare
Caracter fenotipic normal
Secvenţiere
PCR
Southern-blot
Hibridare in situ
Analiza genelor
ADN ARN
Proteine
Northern-blot
RT–PCR
Hibridare in situ
Western-blot
Secvenţiere
Analiza funcţiei
Analiza
histochimică
Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin
acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)
27.03.2011
1

RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z
Componentele necesare pentru
clonarea in vitro (PCR):
• ADN de cercetat
• Primeri specifici secvenţei de clonat –
• Complimentari secvenţelor flancante
• Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă
• Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP)
• Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:
• - tº de denaturare ADN
• - tº de renaturare (ADN+primer)
• - tº de polimerizare (elongarea catenelor noi
de ADN)
2,5 kb
10 kb
6 kb
5 kb
10 kb
6 kb
5 kb
-
2,5 kb
+
M
12 kb
10 kb
8 kb
6 kb
4 kb
2 kb
PCR – reacția de polimerizare în lanț
Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare
• Replicare semiconservativă, repetată
• Specificitatea primerilor sintetici pentru gena–ţintă
• Hibridizarea ADN-ţintă – primer ← complementar:
• Denaturare termică a ADN - de cercetat
Modificarea ciclică a temperaturii:
• Denaturare
• Renaturare
• Sinteză
Etapele tehnicii PCR
A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante
B. Repetarea automată a procedurilor de denaturarerenaturare-elongare
de 30-35 ori
•Denaturarea ADN la 96oC •Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
•Elongarea catenelor ADN la 72oC C. Analiza produşilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor
27.03.2011
2

Extragerea ADN Pregătirea
componentelor pentru
PCR
Electroforeza
produşilor PCR
Colorarea şi
vizualizarea produşilor
PCR
Avantajele PCR
Amplificarea
ADN-ţintă
Interpretarea
rezultatelor
• Metodă rapidă
• Metodă ieftină
• Utilizarea cantităţilor mici de material analizat
• Nu necesită izotopi radioactivi
• Interpretarea uşoară a rezultatelor
Dezavantajele PCR
• Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice
amplificate
• Necesitatea primerilor sintetici, specifici secvenţei
analizate
Identificarea inserţiilor / deleţiilor
Utilizarea PCR
• Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice
• Identificarea mutaţiilor punctiforme
(substituţiile nucleotidice)
• Identificarea expresiei genice (RT-PCR)
• Dactiloscopia genomică (filiaţie)
• Identificarea agenţilor infecţioşi
• Identificarea gradului de infecţie (quantitative
PCR)
• Identificarea produselor PCR în timp real
(Real-Time PCR)
Identificarea mutaţiilor punctiforme
27.03.2011
3

Identificarea agenţilor infecţioşi
Stabilirea paternităţii (filiaţiei)
Optimizarea condiţiilor de
desfăşurare a PCR
Caracteristica primerilor utilizaţi în PCR
Gena Secvenţa Lungimea, baze % G+C Tm, o C
ACE
AT1 R
NOS
5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ 24 54 59
5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’ 25 48 58
5’-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3’ 20 65 58
5’-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3’ 23 48 55
5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57
5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59
Dependenţa cantităţii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor.
În condiţiile PCR s-a utilizat: 1 – t o C optimală -5 o C; 2 – t o C optimală; 3 – t o C optimală +5 o C.
Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR
Concentraţiile critice ale substanţelor pentru inhibarea activităţii Taq-polimerazei
Substanţa Concentraţia critică
SDS >0.005% (m/v)
Fenol >0.2% (v/v)
Etanol >1% (v/v)
Isopropanol >1% (v/v)
CH 3 COONa >5 mM
NaCl >25 mM
EDTA >0.5 mM
Dependenţa cantităţii de produse amplificate de concentraţia ADN genomic utilizată în PCR.
S-a utilizat ADN în cantitate de: 1 – 0,5 μg, 2 – 0,25 μg, 3 – 0,1 μg, 4 – 0,02 μg
Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR
Dependenţa cantităţii produselor PCR de concentraţia ionilor Mg 2+ .
Concentraţia utilizată de MgCl 2: 1 – 2,5mM; 2 – 5mM.
Dependenţa cantităţii de ADN amplificat de numărul de cicluri PCR.
1 – 30 cicluri; 2 – 35 cicluri; 3 – 40 cicluri.
27.03.2011
4

Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE
Analiza electroforetică în gel de agaroză de 2% a produselor PCR rezultate
din amplificarea ADN uman cu primeri corespunzători genei ACE.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip I/D; 2 – genotip D/D; 3 – genotip I/I.
Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R
Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători
genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip A/A; 2 – genotip A/C
ARMS-PCR
I
D
A
C
Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS
M 1 2 3
Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători genei NOS.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip G/G; 2 – genotip T/T; 3 – genotip G/T.
Tehnica Real-time-PCR
Utilizarea tehnicii microarray
• Izolarea ARN din diferite ţesuturi
• Izolarea ARNm
• Amplificarea prin intermediul RT-PCR
• Marcarea cu agenţi fluorescenţi
• Hibridarea cu ADN fixat în micocipuri
• Analiza rezultatelor
G
T
27.03.2011
5

Tehnica Southern-blot
• Bazată pe RFLPs
• Hibridizare cu sonde marcate
• Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un
suport solid (pe membrane de nitroceluloză)
Tehnica Southern-blot
Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN
Denaturarea şi
transferul ADN
pe membrane
Hibridare cu sonda
Autoradiografia
Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
RFLPs şi analiza genotipului
Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2
Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C
C (mm)
B (Nm)
A (NN)
Hibridarea acizilor nucleici
• Unirea complementară a fragmentelor
(moleculelor) de acizi nucleici:
• ADN de cercetat cu
• sonda oligonucleotidică
• În reacţie participă molecule monocatenare
• Moleculele ADN-ţintă sunt fixate
• Moleculele-sonde sunt marcate radioactiv
sau fluorescent
• Identificarea complexelor hibride se
realizează prin intermediul autoradiografiei
Utilizarea tehnicii Southern-blot
• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari
• Identificarea mutaţiilor punctiforme ce
afectează SR
• Dactiloscopia genomică RFLPs
27.03.2011
6

Avantajele Southern-blot
• Este metodă foarte precisă
• Nu necesită cunoaşterea secvenţei nucleotidice
analizate
• Nu necesită primeri sintetici
Dezavantajele Southern-blot
• Necesită cunoaşterea hărţii de restricţie a genei ţintă
• Necesită cantităţi mari de material biologic
• Metodă îndelungată, cu multe etape
• Necesită izotopi radioactivi
• Necesită materiale costisitoare
Tehnica Northern-blot
Extragerea ARN Electroforeza ARN
Transferul ARN
pe membrane
Identificarea nivelului
de expresie şi a variantei
de splicing
Hibridare cu sonda
Autoradiografia
Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
Tehnica Northernblot
• Extragerea ARN din
ţesutul ţintă
• Electroforeza ARN în
condiţii de denaturare
• Transfer pe membrană de
nailon
• Hibridarea cu sonda
marcată
• Autoradiografia
Utilizarea tehnicii
Northern-blot
• Identificarea expresiei genice în
anumite ţesuturi, anumite condiţii
• Identificarea variantei de splicing a
proARNm
• Identificarea nivelului de expresie
• Identificarea agenţilor infecţioşi
(ribovirusuri)
27.03.2011
7

Secvenţierea ADN
Stabilirea secvenţei de nucleotide
• Metoda chimică (tehnica Maxam-Gilbert,
1973)
• Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975)
• Metoda automată (cu utilizarea agenţilor
fluorescenţi)
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ catena codogenă
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ catena anticodogenă (matriţă)
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTAC-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACA-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAA-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAG-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGA-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGAT-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGATT-3’
Tehnica dideoxi
Extragerea ADN
Denaturarea ADN
Sinteza catenelor complementare
utilizând primeri marcaţi cu 32 P în
prezenţa dNTP şi ddNTP
Electroforeza în condiţii de denaturare
Vizualizarea fragmentelor marcate prin
autoradiografie
5’-ATTA -- primer marcat P 32
pentru ADN-polimerază
A, T, C, T – dNTP (2’-dNTP)
pentru sinteza noilor catene
A, T, C, T – ddNTP (2’,3’-ddNTP)
pentru stoparea sintezei
Tehnica
dideoxi
• Sinteza enzimatică a
ADN
• Utilizarea în paralel
a nucleotidelor ce
conţin deoxiriboză
şi dideoxiriboză
• Stoparea sintezei în
cazul incorporării
ddNTP
A
T
G
C
5’-ATTACA-3’
5’-ATTACAA-3’
5’-ATTACAAGA-3’
5’-ATTACAAGATTA-3’
5’-ATTACAAGATTACCA-3’
5’-ATTACAAGAT-3’
5’-ATTACAAGATT-3’
5’-ATTACAAGATTACCAT-3’
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’
5’-ATTACAAG-3’
5’-ATTACAAGATTACCATG-3’
5’-ATTAC-3’
5’-ATTACAAGATTAC-3’
5’-ATTACAAGATTACC-3’
-
+
A T C G
(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’
-
+
27.03.2011
8

Metoda automată
Hibridarea in situ pentru
depistarea secvenţelor ADN
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
cu nuclei interfazici
Hibridarea
in situ
• Pregătirea
preparatelor de
cromozomi
• Denaturarea ADN
• Hibridarea cu sonda
marcată
• Vizualizarea la
microscopul optic
Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenţelor ARN
Hibridarea in situ cu
utilizarea probei sens (stânga)
şi antisens (dreapta)
Analiza
histochimică –
identificarea
proteinelor în ţesut
27.03.2011
9

Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor nucleici:
Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul
expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinţelor
mutaţiilor.
Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice - prenatal sau
postnatal, cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu anomalii genetice
sau manifestării unor patologii severe.
Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea vectorilor de gene etc.).
Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în diagnosticul bolilor
infecţioase.
Identificarea polimorfismelor individuale în analiza filiaţiei, în
criminalistică.
27.03.2011
10