Bibliotecas Apresentadas em - Biotecnologia

PESQUISABibliotecas Apresentadas emFAGOSMarcelo de Macedo BrígidoProf. Dr., Grupo de Imunologia Molecular – UnBLab. Biologia Molecular / departamento deBiologia Celularbrigido@unb.brFotos e ilustrações cedidas pelos autoresPhage Display LibrariesAndréa Queiroz MaranhãoProfa. Dra., Grupo de Imunologia Molecular – UnBLab. Biologia Molecular / departamento deBiologia Celularandreaqm@unb.brFigura 1 - Organização estruturalde uma partícula viral dobacteriófago M13 (Kischenko etal., 1994, com modificações). Ovírion tem cerca de 9.300 Å de comprimentoe 65 Å de diâmetro. A extremidadedo vírus, que é montadaprimeiro (distal), é recoberta porcinco cópias de p7 (33 resíduos deaminoácidos) e cinco moléculas dep9 (32 resíduos de aminoácidos). Aextremidade proximal, que é montadapor último, possui cinco cópias dep6 (113 resíduos de aminoácidos) ecinco de p3 (406 resíduos deaminoácidos). Entre as duas extremidadeso DNA circular e de fita simples(ssDNA) é recoberto por milharesde cópias de p8 (50 resíduos deaminoácidos)44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002urante os últimos anos, umanova perspectiva da BiologiaMolecular tem atraído diversosgrupos de pesquisadores: o desenvolvimentode novas biomoléculas como objetivo de se obter fármacos, vacinase outras drogas de interesse biotecnológico.A grande maioria dos processosbiológicos envolve contatos entresuperfícies macromoleculares (enzimasubstrato,receptores-efetores, proteínas- ácidos nucléicos, etc.) que sãoresultantes das forças físico-químicascaracterísticas dessas superfícies contactantes.Dessa forma, pode-se afirmarque a evolução molecular se manifestapela busca do aprimoramentode tais interações, seja no intuito defavorecê-las ou não, mas procurandosempre a manutenção do equilíbrio dosistema vivo. Na natureza, esse fenômenoocorre como um processo detentativas e erros, onde subpopulaçõesde variantes da população primordialsão selecionadas, positiva ounegativamente. Assim, a evolução molecularnatural é um processo quedemanda longos períodos de tempo,uma vez que a seleção é exercida sobum pequeno número de variantes (Kenanet al., 1994).Atualmente é possível aplicar, emlaboratório, métodos que visem a dirigirartificialmente a evolução molecularem função de objetivos prédeterminados.Em oposição aos mecanismosnaturais, as metodologias realizadasin vitro abreviam o tempo requerido,selecionando populações molecularescompostas pelo maior númeropossível de variantes. Uma das metodologiasmais empregadas atualmenteé a construção de bibliotecas conformacionais,que são definidas comouma população de ligantes em potencial,composta por (bio)moléculas deformas variantes. Cada membro dabiblioteca apresenta uma forma distinta,que determinará a capacidade deinteração deste com uma moléculaalvo.Quanto maior for o número deformas representadas na biblioteca,mais facilmente será encontrado umligante afim (Posner et al., 1994).Vários tipos de bibliotecas conformacionaisforam descritos, com a utilizaçãode diversas estratégias; entreessas, destacam-se aquelas sintetizadasquimicamente, como as de oligonucleotídeose de peptídeos fixos ouem solução (revisadas por Kenan etal., 1994), e as produzidas em sistemasvivos, como as leveduras, bactériasou bacteriófagos filamentosos (revisadaspor Scott,1993).Bacteriófagos FilamentososOs fagos filamentosos (M13, f1, fd,entre outros) pertencem à família Inoviridaede bacteriófagos e possuemcomo material genético DNA fita simples(ssDNA). A infecção viral ocorrevia pilus sexual de células bacterianasgram negativas que apresentam o genedesta fímbria especial codificado peloplasmídio F. A liberação das partículasvirais, que são produzidas a cada ciclose realiza a partir da extrusão do DNAatravés da membrana. Em nenhumdestes dois processos ocorre lise celular.A partícula viral esquematizada nafigura 1 é composta pelo genoma virale por cinco proteínas estruturais. Nocapsídio do fago estão presentes asproteínas p3, p6, p8, p7 e p9. No fagoselvagem, encontram-se cerca de 2.800

Figura 2 - Esquematização do ciclo infectivo de bacteriófagosfilamentosos. Os fagos filamentosos infectam células de bactérias Gramnegativas através da interação de p3 adesinas do pillus sexual. Apóseste contato inicial, o DNA fita simples entra dentro da célula e é convertidoa DNA fita dupla ou RFDNA. Ao assumir essa conformação, a síntesede proteínas virais se dá utilizando-se a maquinaria celular. As novas partículasvirais são montadas a partir da extrusão do DNA fita simples pelamembrana celular, onde estão localizadas as proteínas virais estruturais(Webster, 2000)cópias da proteína 8 (p8), que formamo corpo do capsídio cilíndríco e flexível.Nas extremidades desse capsídioencontram-se de três a cinco cópiasdas demais proteínas estruturais. Aextremidade distal contém as proteínasp7 e p9, enquanto que a proximalé composta pelas proteínas codificadaspelo gene 3 (p3) e pela proteínap6. O diâmetro da partícula viral é decerca de 65 Åeoseucomprimentodepende do tamanho do genoma encapsulado,sendo que cada nucleotídeodo ssDNA confere 1,435 Å decomprimento ao ser envolvido por p8,e as proteínas minoritárias contribuemcom cerca de 175 Å. (Makowisk, 1993).A incorporação de proteínas exógenasna superfície dos fagos filamentososfaz-se fusionando-se esses peptídeoscom proteínas estruturais daspartículas virais. As duas principais proteínasutilizadas para esse fim são aproteína p8 eap3.O ciclo infectivo dos fagos filamentosos(figura 2) é iniciado pela ligaçãoda proteína p3 à extremidade dos pilida célula bacteriana. Em seguida, ocorrea internalização do ssDNA viral (denominadofita +), que atua como moldepara a síntese da fita complementar(denominada -) dentro da hospedeira,originando um DNA de fita dupla,correspondente à forma replicativa(RFDNA). O RFDNA é capaz de dirigira sua replicação, a produção de ssDNA,bem como a síntese de mRNA viral,utilizando-se, para tanto, da maquinariaenzimática da hospedeira.Os vírions formados são montadospela extrusão do ssDNA através doenvelope bacteriano, sem lisar a célulaou impedir sua divisão. Após atravessara membrana, o DNA viral passa aser revestido pelas proteínas estruturais,completando assim a montagemda partícula viral, que é então liberadapara o sobrenadante da cultura (Smith& Scott, 1993).A principal proteína estrutural utilizadapara a apresentação de proteínasé a proteína 3. Responsável pela adesãoda partícula viral ao pilus sexual, oproduto do gene III dos fagos filamentososcorresponde à maior das proteínasestruturais, com uma massa molecularde cerca de 42 kDa na sua formamadura. Essa proteína é sintetitizadasob a forma de um precursor contendopeptídeo sinal, que é clivado durante apassagem através da membrana. Aproteína 3 (p3) associa-se ao capsídioviral através de 23 resíduos de aminoácidoshidrofóbicos próximos à extremidadeC-terminal. O produto do geneIII contém ainda dois arranjos repetitivosdo motivo Ser-Gly-Gly-Gly ou Ser-Glu-Gly-Gly-Gly, localizados a 70 e a215 resíduos de aminoácidos da extremidadeN-terminal. Esses arranjos sãoresponsáveis pela aparente flexibilidadeda molécula (Makowski, 1993)Em 1984, Crissman e Smith estabeleceramo papel funcional dos domíniosamino e carboxi de p3, sendo aporção N-terminal requerida para ainfectividade viral, enquanto que a C-terminal desempenha papel na morfogênesedas partículas. Em 1985, Smithmostrou que era possível inserir umgene inteiro entre os dois domínios dep3 e que esta ainda era capaz demanter ambas as funções. Mais surpreendenteainda era o fato de que aseqüência exógena era incorporada àpartícula viral e apresentada de formaacessível ao reconhecimento molecular.Isso demonstrava que determinantesantigênicos, presentes na proteínaexógena fusionada à p3 eram apresentadosna superfície da partícula viral.Esses trabalhos levaram à proposiçãode que bibliotecas conformacionais depeptídeos ou mesmo de proteínaspoderiam ser construídas por meio damanipulação do gene III, assim comodo gene VIII de bacteriófagos filamentosos(Smith, 1993).Outra possibilidade de apresentaçãoé utilizar-se do principal constituintedo capsídio de fagos filamentosos, aproteína p8. Essa proteína tem umaforma cilíndridica e é composta por 50resíduos de aminoácidos. Também ésintetizada como uma pré-proteína apartir da expressão do gene VIII. Quandoancorada à membrana celular pelopeptídeo sinal, expõe o seu domínioC-terminal para o periplasma. À medidaque ocorre a extrusão do DNA viral,p8 vai sendo incorporada no vírionemergente. No vírus, a porção C-terminalaparece próxima ao ssDNA, enquantoa N-terminal, dotada de grandeBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 45

misturas com proteínas selvagens. Polipeptídeosde maior massa molecularpodem ser apresentados ao longo docapsídio do bacteriófago, fusionados ap8, desde que p8 selvagem (em tornode 80%) seja fornecida ao sistema.Esse tipo de construção pode ser alcançadoquando fagomídios são utilizados(a proteína selvagem é sintetizadaa partir do genoma do fago auxiliar),ou quando os vetores virais apresentamduas cópias do gene viii, umaselvagem e uma de fusão (Webster,2000).Apresentando Peptídeos naSuperfície dos FagosFigura 3 - Seleção de ligantes de uma biblioteca utilizando-se oantígeno adsorvido em placa de microtitulação. Bibliotecas de formasvariantes do gene de interesse são obtidas e clonadas em fagomídiospara incorporação do peptídeo ao capsídio viral. As partículas virais defusão apresentando a biblioteca são produzidas e colocadas em contatocom ao antígeno fixado a um suporte. Sucessivas lavagens são realizadase os fagos remanescentes são eluídos da placa e amplificados por meiode infecção de células bacterianasflexibilidade, fica exposta ao solvente,sendo essa última aquela que é manipuladapara apresentar peptídeos exógenos(Smith & Scott, 1993).Inicialmente acreditava-se que apenasbibliotecas de peptídeos (de, nomáximo, 6a8resíduos de aminoácidos)podiam ser apresentadas pelaproteína VIII. Isso é válido nos sistemasde apresentação onde todas as proteínas8 são de fusão, não existindoA possibilidade de expressão deuma proteína de fusão no capsídio defagos, de maneira acessível ao reconhecimentopor um ligante, abriu ocaminho para a construção de bibliotecasconformacionais apresentadas nasuperfície dessas partículas virais. Osvírus, cujos genomas são manipuladosde forma a apresentarem em seuscapsídios o polipeptídeo exógeno fusionadocom uma de suas proteínasestruturais, são denominados fagos defusão.Nas bibliotecas construídas em fagosfilamentosos, a seleção de formas,com maior ou menor afinidade, por umligante alvo é feita misturando-se fagosde fusão, produzidos e liberados para osobrenadante de cultura de célulasinfectadas, com a molécula reconhecidapelo peptídeo recombinante fixaem um suporte. A figura 3 mostra umesquema onde uma placa de microtitulaçãofoi recoberta com um ligante;em seguida, incubaram-se fagos defusão apresentando uma biblioteca deformas de peptídeo exógeno fusionadasà proteína 3. Durante os procedimentosde lavagem, os fagos capazesde reconhecer o ligante com o qual aplaca foi sensibilizada, são retidos. Osfagos selecionados podem ser obtidosatravés de condições de eluição quedesfavoreçam a ligação desses com amolécula presa ao suporte, e após asua amplificação por meio de infecçãode células de E. coli, os fagos selecionadospodem ser utilizados em novosciclos de seleção. A cada procedimentode seleção, formas mais afins dopeptídeo exógeno são obtidas, ocorrendoo processo de maturação daafinidade (Lowman & Wells, 1993).Devido às diferenças nas quantidadesde p3 e p8 presentes nas partículasvirais de fusão, as bibliotecas apresentadasno contexto da proteína 8 sãoditas multi ou polivalentes, uma vezque várias cópias da proteína de interessesão incorporadas ao capsídio dosfagos, e aquelas que se utilizam de p3são denominadas monovalentes, emvirtude da presença de, no máximo,46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Figura 4 - Representaçãoesquemática de umfagomídeo hipotético paraa construção de bibliotecasconformacionais nasuperfície de partículasviraistrês cópias das proteínas de fusão.Essas diferenças nas quantidades podemser exploradas em momentosdistintos da seleção de bibliotecas:pode-se assegurar seleção de formasde menor afinidade, utilizando-se bibliotecasmultivalentes e, em seguida,submetê-las a um refinamento da afinidadeem sistemas monovalentes (Wells,1996).VetoresTanto o gene VIII quanto o gene IIIvêm sendo utilizados para a expressãode bibliotecas conformacionais embacteriófagos filamentosos. Diversasestratégias têm sido descritas para amanipulação desses genes com vistasà obtenção de sistemas eficientes paraa expressão das bibliotecas (Smith,1993). Uma das formas encontradaspara se superar os problemas de manipulaçãodo DNA viral foi a utilização defagomídios, que são plasmídios quepossuem, além da origem de replicaçãoativa em E. coli, a origem dereplicação fagos filamentosos, que contémtodos os elementos para a sínteseda fita complementar e replicação viral,bem como o sinal de empacotamentodo DNA fita simples. Nessessistemas, células transformadas com ofagomídio são infectadas por um fagoauxiliar (helper), que contêm todos osgenes do bacteriófago filamentoso,permitindo o resgate do fagomídio soba forma de partícula viral. Durante ainfecção viral, o ssDNA provenientedos fagomídios é revestido por proteínasestruturais preferencialmente aossDNA originado pelo helper. Isso ocorreporque os fagos helper apresentammutações na seqüência que forma ogrampo, as quais dificultam o empacotamentode seu próprio material genético(Webster, 2000).O fagomídio construído para apresentaçãode bibliotecas conformacionaisna superfície de fagos filamentososé manipulado de forma a expressaros diversos peptídeos quiméricos, fusionadosa um dos genes III ou VIII.Quando ocorre a infecção com o fagoauxiliar, os capsídios são montadoscontendo misturas de p3 ou p8 selvagem(codificadas pelo auxiliar), e proteínasquiméricas (expressas a partirde um dos genes III ou VIII fusionados,contidos no fagomídio), gerando umaprogênie de fagos de fusão. Nas célulasreinfectadas por esses fagos defusão, os fagomídios podem ser obtidossob a forma de plasmídios bacterianos(fita dupla - RFDNA) podendoassim ser amplificados, purificados enovamente manipulados (Breitling etal., 1991).A utilização de fagomídios, comovetores para a construção de bibliotecastem sido bastante difundida (Dübelet al., 1993). A maior vantagem dessesistema é a possibilidade do gene daproteína de fusão se propagar na formade um plasmídio. Dependendo dopromotor utlilizado, esse gene podeser amplificado de forma regulada atéo momento da infecção com o fagoauxiliar, reduzindo o número de mutantesselecionados negativamente. Osfagomídios transformam E. coli de formamais eficiente que o RFDNA e apartícula viral formada a partir de seussDNA, de menor tamanho que a originadapelos vetores do tipo fago, é maisestável, dissociando-se menos facilmentedos ligantes imobilizados (Breitlinget al., 1991).O esquema geral de um fagomídioutilizado para a produção de bibliotecasna superfície de bacteriófagos filamentososestá representado na figura4. Dentre os elementos constituintesmais importantes, destacam-se: as origensde replicação de E. coli e defagos, o gene que confere resistência aantibiótico, o promotor que dirige atranscrição do gene de fusão easeqüêncialíder responsável pela citolo-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 47

Tabela 1 - Exemplos de Utilização de Bibliotecas Apresentadas em FagosBibliotecaFinalidade / Espécie MolecularPequenos Peptídeos Mapeamento de sítios enzimáticosRandômicosMapeamento de Epitopos(até 20 resíduos de aminoácidos, Agonistas e antagonistas de biomoléculassendo de6a8randômicos) Identificação de mimotoposPeptídeos ligantes a ácidos nucléicosPeptídeos com potencial para vacinaçãoEndereçamento endotelialReferênciaCheadle et al., 1994Hoess et al., 1995; Wang et al., 1995Smith et al., 1993; South et al., 1995Folgori et al.,1994Wu et al., 1995Stoute et al., 1995Pasqualini & Rouslahti, 1996Grandes PolipeptídeosReceptores celularesEnzimas: β-lactamasetripsinaInibidores de ProteasesInibidores da coagulação sangüíneaDomínio de ligação ao HIV do CD4 humanoHormôniosAnticorpos: FabscFvHumanização de AnticorposProteínas obtidas a partir debibliotecas de cDNAConstrução de fatores transcricionaisEstabilização de ProteínasScarseli et al., 1993; Robertson, 1993Soumillion et al., 1994Corey et al., 1993Roberts et al., 1992Pannekoek et al., 1993Abrol et al., 1994Lowan & Wells, 1993Zebedee et al., 1992;Maranhão & Brígido, 2000; Ward,1993Wang et al., 2000Barth et al., 2000Beerli et al.,2000Chakravarty et al., 2000calização do produto de fusão.As origens de replicação são seqüênciasgênicas que são reconhecidaspela maquinaria celular ou viralpara produzir cópias do fagomídio. Aorigem de E. coli mais usada nos vetoresjá construídos é a col E1, derivadados plasmídios tipo pUC, responsávelpelo alto número de cópias do fagomídiona célula, em sua forma plasmidial(dupla fita). A origem de fago correspondeà região intergênica encontradano genoma dos vírus. Essa seqüência écapaz de, com o auxílio das enzimascelulares, transformar o fagomídio dessDNA (forma infectante, empacotadano capsídio viral) em forma replicativae vice-e-versa (Allen Jr. et al.,1993).Assim, quando a célula contendo ofagomídio é infectada pelo fago auxiliarpara a produção de partículas virais,ocorre a replicação do DNA plasmidialpelo mecanismo de círculo rolante,dando origem ao DNA fita simples,que migra para a membrana celularpara ser revestido por proteínas docapsídio.As seqüências promotoras utilizadaspara dirigir a síntese do produto defusão nos vetores têm sido as maisdiversas. Acredita-se que a estequiometriaentre proteínas de fusão e proteínasselvagens seja um importantefator na estabilidade da partícula viralapresentadora de proteínas exógenas(Posner et al., 1994). Dessa forma, autilização de promotores muito fortes,como os virais, deve ser evitada amenos que esses possam ser mantidossob repressão até o momento da produçãoda partícula viral recombinante.As seqüências codificadoras para opeptídeo sinal são responsáveis peloencaminhamento da proteína de fusãopara a membrana celular. Deve-se ressaltarque a translocação total atravésda membrana celular não ocorre, umavez que o domínio C-terminal de p3permanece inserido nesse compartimentocelular até que o produto defusão seja incorporado ao capsídio dovírion emergente (Breitling et al.1991). Entre as seqüências líderes descritas,a mais usada é a pel B (Hoogenboomet al., 1991).Vantagens sobre outrossistemas de seleção.Quando comparadas às bibliotecasde expressão construídas em sistemascomo λgt11, os sistemas utilizandofagos filamentosos apresentam váriasvantagens. A primeira delas é quefagos filamentosos não lisam as célulasinfectadas, o que possibilita a separaçãode partículas virais do conteúdointracelular, eliminando-se assim muitoda reatividade cruzada com proteínascelulares. Assim, enquanto a varredurade clones em sistemas tradicionais(que lisam as células) requer oligante puro (Rapoport et al., 1995),tal não é exigido quando são utilizadasbibliotecas apresentadas na superfíciede partículas virais. Bibliotecas construídasna superfície de fagos já foramcapazes de ser selecionadas até pelainteração do fago de fusão com superfíciesde células em cultura, e mesmodiante da complexidade de formaspresentes nesse tipo de superfíciealvo,as partículas foram capazes deinteragir com o ligante específico (Meulemanset al. 1994; Edwards, et al.,2000).Outra característica importante éque essa nova metodologia utiliza osmais rápidos protocolos de seleção jádescritos, e possibilita a varredura deaté 10 8 clones por ciclo de seleção.Esse método é mais rápido porque osobrenadante das culturas infectadas,contendo de 10 10 a10 13 clones por mL,pode ser utilizado diretamente para aseleção. Essa utilização prescinde datransferência para membranas, que,além de limitar o número de clones(limitação de área) do filtro, é umprocesso extremamente trabalhoso.O alto número de variantes geradosnas bibliotecas apresentadas na super-48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

fície do capsídio de fagos permite amutação randômica simultânea de até 6códons de aminoácidos, possibilitandoque as (~2x10 6 ) formas possam sersubmetidas a ciclos de seleção de umasó vez (Lowman & Wells, 1993). Vale apena ressaltar que, ao se isolar o fagoatravés do fenótipo (capacidade de ligaçãoa uma molécula-alvo) apresentadoem seu capsídio, isola-se também ogenótipo codificador dessa característica.Isso ocorre uma vez que o ssDNA dofagomídio ou fago de fusão é empacotadono capsídio da partícula que apresentao peptídeo exógeno.Apesar das vantagens aqui apresentadas,existem alguns relatos que apontamproblemas na utilização desses sistemasde expressão/seleção. O primeiroproblema diz respeito à instabilidadeobservada em bibliotecas que apresentamalguns tipos de anticorpos, e, alémdisso, há autores que consideram que opasso de amplificação, que envolve umatransfecção viral, possa ser um empecilho(Rapoport et al., 1995). Outrosrelatam também problemas de crescimentocelular nas culturas que expressama proteína de fusão, o que poderiaocasionar uma relativa tendenciosidadeda biblioteca, que passaria a expressar,preferencialmente, as formas mais toleradaspela bactéria (Kenan et al., 1994).A despeito desses problemas as bibliotecasapresentadas em fagos (phagedisplay libraries), em conjunto com oprocedimento de seleção (biopanning),são uma metodologia consagrada naliteratura. Diversos exemplos delas eseus principais resultados estão listadosna Tabela I.Outros fagos também já foram utilizadospara apresentação de proteínasexógenas em seus capsídios: baculovírus(Lindley etal., 2000), bacteriófago λ(Zhang et al., 2000) e vírus da hepatiteB (Kratz et al., 1999). Alguns ajustestambém foram propostos. Entre esses,destaca-se a utilização de bibliotecasfusionadas à porção infectiva da proteínaIII, acoplando-se assim a seleção deligantes com capacidade infectante dapartícula selecionada (Krebber et al.,1997), a regulação da expressão com autilização de diferentes promotores(Huang et al., 2000), a obtenção demutantes de pVIII para melhorar a expressãode grandes polipeptídeos (acimade 100 kdA) de forma multivalente(Sidhu et al., 2000) além da otimizaçãode métodos de seleção utilizando-se asuperfície de células em cultura comoalvo da seleção (Watters et al., 1997;Edwards, et al., 2000).Entre os trabalhos que se utilizamdessa técnica com aplicabilidade e potencialterapêutico, destaca-se o estudode endereçameto de tumores. Esseestudo vem sendo explorado por experimentosde seleção in vivo, utilizando-sebibliotecas de peptídeos expressasna superfície de bacteriófagosfilamentosos (Pasqualini & Ruoslahti,1996; Johns et al., 2000). As bibliotecassão injetadas por via intravenosa nacauda de camundongos e, após a suacirculação na corrente sangüínea, oanimal é sacrificado e os seus órgãossão retirados. Os fagos que conseguiramromper a barreira endotelial sãoobtidos desses órgãos e caracterizados.A partir desses estudos, várias aplicaçõesenvolvendo químio e radioterapiaespecíficas têm sido propostas.Além disso, busca-se a associação entreos peptídeos expressos em fagos eaqueles presentes na superfície decélulas tumorais metastásicas visandoao desenho de drogas capazes deimpedir a migração e, conseqüentemente,a metástase.Outro campo importante que seabriu nos últimos anos foi a possibilidadede se desenharem fatores transcricionaistotalmente in vitro a partir debibliotecas de zinc fingers e de seleçãocom diferentes oligonucleotídeos.Esses experimentos resultaram no isolamentode domínios protéicos capazesde reconhecer seqüências específicasde DNA. Utilizando-se essas proteínasartificiais, selecionadas por PhageDisplay, já foi possível ligar e desligargenes in vivo de plantas (Beerli etal., 2000).Resumidamente, pode-se dizer queas bibliotecas conformacionais - apresentadasno capsídio de fagos filamentosos- têm emergido como poderosoinstrumento em diversas áreas de pesquisa,desde as mais básicas, como oestudo de estruturas biomoléculas, atéà obtenção e o desenho de novosfármacos e vacinas contra diferentesdoenças (Medynski, 1994).Bibliotecas combinatóriasde anticorposUma das moléculas mais utilizadaspara a construção de bibliotecas emfagos filamentosos são as imunoglobulinas.Os anticorpos são proteínas envolvidasna resposta imune a agentesinfecciosos e são investigados sistematicamentepor seu envolvimento nahomeostase do organismo vertebradoe por seu potencial biotecnológico. Autilização de anticorpos na medicinaterapêutica e na propedêutica vemcrescendo nos últimos anos e certamenteterão um grande impacto namedicina deste novo século.Os anticorpos são obtidos in vivopor um processo de seleção naturalinduzida pela presença do imunógenoacompanhado por linfócitos, gerandoanticorpos de alta afinidade a um dadoantígeno. É exatamente esse mecanismode seleção in vitro que chamou aatenção dos pesquisadores no sentidode adaptar anticorpos às bibliotecascombinatórias em fago. Assim como osanticorpos, que são selecionados invivo por um imunógeno externo, osfagos são selecionados in vitro por umligante. Essa analogia entre os doisprocessos foi inicialmente comentadapor Winter e seus colegas, em 1992(Hoogenboom & Winter, 1992) e,desde lá, a obtenção de anticorposrecombinantes nos sistemas apresentadosem fagos tem sido cada fez maisfreqüente. Neste sentido admite-se queos anticorpos recombinantes obtidospor apresentação em fago seriam representativosda resposta imune. Esseconceito é, no entanto, falho, pois nãoconsidera que o processo de seleçãoem fago seja influenciado por outrosparâmetros muito distintos daquelesencontrados no organismo. Por outrolado, com um sentido pragmático, aobtenção de anticorpos com especificidadee afinidade compatíveis àquelesobtidos in vivo é possível.O desempenho do reagente obtidoquanto a sua capacidade de reconhecimentodo antígeno depende de doisfatores fundamentais: o tamanho dabiblioteca inicial, isto é, a capacidadede representar o repertório do animalimunizado; e o procedimento de seleçãoutilizado. Várias estratégias têmsido utilizadas para se alcançar esseêxito e elas se baseiam em obter umabiblioteca inicial de tamanho igual ousuperior ao repertório imune (em tornode 10 7 ), buscando melhor eficiênciade transformação e de amplificaçãoBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 49

dos genes variáveis dos anticorpos.Os anticorpos maduros são o resultadoda combinação de genes variáveisque são associados em umprocesso,do qual resulta uma alta variabilidade.Essa combinação de genesassociada à maturação de afinidadepermite aos anticorpos uma capacidadede ligação a um número ilimitadode formas. Sendo assim, uma bibliotecade anticorpos representativa contémformas ligantes a um númerovirtualmente ilimitado de antígenos.Em nosso grupo de trabalho, adaptamosbibliotecas de anticorpos emfago para explorar questões básicas(Maranhão & Brígido, 2000) e paraobtenção de reagentes com aplicaçãobiotecnológica. Com um viés acadêmico,utilizamos essa técnica para comparara seleção de famílias de genesvariáveis por determinado antígeno,com a resposta imune in vivo. Tentamos,com isso, observar se, fora docontexto in vivo, conseguiríamos observaruma tendência na associação decertos antígenos com anticorpos derivadosde determinadas famílias degenes variáveis. Caso haja alguma associação,teremos uma forte evidênciade como o antígeno seleciona o repertórioobservado in vivo. Por outro lado,bibliotecas combinatórias estão sendoutilizadas para selecionar anticorposde alta afinidade específicos para detectarantígenos de tumor ósseo. Apartir do repertório natural de pacientescom osteosarcoma, procuramos encontraranticorpos que auxiliem o diagnósticodessa doença e que possam sereventualmente utilizados na terapêuticacomo agentes anti-tumorais. Estamostambém atuando na área de biotecnologiaagronômica, onde procuramosdesenvolver anticorpos eficientesna neutralização de enzimas de nematóidesenvolvidas na infestação dedeterminados tipos de cultivos. A idéiaé introduzir genes sintéticos, codificadoresdesses anticorpos, no genomade hortaliças no intuito de se obteremplantas transgênicas, que, produzindoo anticorpo neutralizante, tornem-seresistentes aos parasitas.PerspectivasO estudo da tecnologia de apresentaçãode bibliotecas combinatórias nasuperfície de bacteriófagos, que datade 17 anos, já mostrou o seu potencialna produção de novas formas comcapacidade ligante a um grande númerode moléculas. Espera-se que nospróximos anos essa técnica venha arepresentar uma técnica corriqueira deampla divulgação entre os pesquisadores.Nesse contexto, torna-se importanteressaltar que essa técnica complementaa atual onda de projetosgenômicos, onde se gera um grandevolume de informação, mas com poucainterpretação em nível fenotípico.Com a técnica de apresentação emfago, podemos agora testar genes deinteresse em grande escala, na buscade um conjunto de proteínas que interagem,e que vem sendo chamado deinteratoma. A busca desses interatomaspromete expandir os limites criadoscom os projetos genômicos e permitemagora inferir acerca de comoesses genes se relacionam, explicandoo indivíduo fenotipicamente. Nessecontexto, a técnica de apresentaçãoem fago poderá ser amplamente utilizada.Portanto, espera-se, que nos próximosanos, venhamos a considerarum papel corriqueiro a técnica deapresentação em fago.Referências BibliográficasAbrol, S., Sampath, A., Arora, K. &Chaudhary, V. K. (1994). Constructionand characterization of M13bacteriophages displaying gp 120binding domains of human CD4.Indian J. Biochem. & Biophys., 31:302-309Allen Jr., G. C., Dixon, N. E. & Kornberg,A. (1993). Strand switching ofreplicative DNA helicase promotedby the E. coli primossome. Cell,74: 713-722.Barth, S., Weidenmüller, M.K., Schimidt,M.F.G. & Engert, A. (2000).Combining phage display and screeningof cDNA expression libraries:a new approach for identifying thetarget antigen of an scFv preselectedby phage display. J. Nol. 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