PCR na Micologia - Biotecnologia

Análise deVariabilidade GenéticaBaseando-se no princípio da PCR,Williams et al. (1990) e Welsh & Mc-Clelland (1990) descreveram uma classede marcadores moleculares, os RA-PDs, extremamente útil para medir ecaracterizar a variabilidade genética.O RAPD envolve a amplificaçãode regiões anônimas dispersas pelogenoma. Nesta técnica, não se escolhea priori a região a ser amplificada, aocontrário disso, utilizam-se primers deseqüências arbitrárias de bases e analisam-seos produtos amplificados.Além de não ser usados primers específicos,os produtos de amplificaçãosão obtidos a partir deuma única seqüência iniciadora.Esta ocorreráquando coincidir da mesmaseqüência primer reconhecerum sítio de homologiaem uma das fitase também reconhecero mesmo sítio, porémcom orientação invertida,na outra fita damolécula de DNA, dentrodo intervalo limite daPCR.O tamanho do primerde RAPD é menor(normalmente, 10 nucleotídeos)do que aqueleutilizado na PCR específica, justamentepara aumentar a chance de haversítios complementares ao primer dentrodo intervalo limite da PCR. Osprimers são utilizados, um a um, paradetectar diferenças entre os genótipos.Ao final do trabalho, no entanto,os dados obtidos com os diferentesprimers devem ser analisados em conjunto.A condição ótima da reação deRAPD pode variar de organismo paraorganismo, de maneira que a conduçãode experimentos visando a otimizaçãoda técnica é importante. A concentraçãode DNA genômico é a variávelmais importante a ser padronizada.O excesso de DNA pode reduzirou inibir significativamente a atividadede polimerização da enzima Taqpolimerase devido a altas concentraçõesde impurezas, resultando na ausênciade amplificação. Por outro lado,o DNA em concentração muito baixapode dar origem a padrões de amplificaçãonão reprodutíveis, podendoocorrer acréscimo ou diminuição debandas, mesmo entre repetições. Felizmente,ao contrário do que ocorrepara muitas espécies vegetais, para amaioria dos fungos o espectro deconcentração de DNA que permiteobter perfis de RAPD é amplo. Bueno-Gomes (2000) mostrou que para Penicilliumchrysogenum, concentraçõesde DNA variando de 0,03 a 300ngpermitem a obtenção de perfis deRAPD. Amostras contendo entre 0,3 e30ng de DNA dão origem a padrõesidênticos de RAPD. Entretanto, estetrabalho mostrou haver um leve comprometimentona reproducibilidade,quando concentrações extremas deFigura 4. Morfologia das colôniasdos isolados Ma2 e Ma3 deM. anisopliae (gentilmente cedidapor Sosa-Gomez, D.R /Embrapa/soja)DNA, tais como 0,03 e 300ng, sãoutilizadas na reação. A título de exemplo,a Tabela I mostra as condições deamplificação que freqüentemente utilizamosem nosso laboratório.Antes do advento dos marcadoresmoleculares, a caracterização de isoladosfúngicos era restrita, principalmente,a de marcadores morfológicos.A caracterização morfológica,embora útil, é bastante limitada devidoao baixo número de caracterespassíveis de serem analisados. Emfungos em média cada primer gera 10segmentos amplificados, com pesomolecular variando de 300 a 2500 pb.Ao serem totalizadas as bandas obti-das com os diferentes primers, tem-sedesta forma um grande número delocos a serem analisados. A presençade um fragmento amplificado em algunsdos genótipos comparado com aausência desse mesmo fragmento emoutros genótipos, caracteriza o que sedenomina polimorfismo de RAPD. Estespolimorfismos têm sido extremamenteúteis para estudos de variabilidadegenética. Em nosso laboratório,na Universidade Estadual de Londrina,temos utilizado o RAPD para caracterizara variabilidade genética devárias espécies fúngicas, particularmenteaquelas de interesse para ocontrole biológico de pragas da agricultura.O interesse pelo uso demicrorganismos para o controlede pragas da agriculturavem aumentando nos últimosanos, principalmente apartir da década de 70, àmedida que foram sendo evidenciadosos problemas advindosda utilização dos inseticidasquímicos. Entre osexemplos de fungos disponíveisno mercado e daquelesque ainda estão em desenvolvimentono país, paradiferentes culturas encontram-seos gêneros Metarhizium,Beuaveria, Paecilomyces,Nomurae e Entomophthora.Apesar do Brasil ser um país que sedestaca pelo número de pesquisadoresque trabalham com controle microbianode pragas, ainda são poucasas informações existentes sobre a variabilidadegenética de espécies defungos entomopatogênicos isoladosem nosso país. O conhecimento davariabilidade genética dessas espéciesé de grande importância para a realizaçãode estudos genéticos e desenvolvimentode programas de melhoramento.Entre as principais pragas das pastagensno Brasil encontram-se os gênerosDeois, Zulia e Mahanarva. Estascigarrinhas, altamente fitotoxigênicas,reduzem a produção de massaverde em cerca de 15% e, em consequência,danificam uma área foliar quepoderia alimentar milhões de bovinospor ano. O controle dessas cigarrinhas,que pode chegar a 60%, repre-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 15

16 Biotecnologia Ciência & DesenvolvimentoFigura 5. RAPD de 13 isoladosde M. anisopliae obtido com oprimer OPX11. Acima de cadalinha encontra-se a denominaçãodo isolado. O isolado E9 foiamplificado duas vezes para seter um controle derepetibilidade. Na linha M, apresenta-seo marcador de pesomolecular (λDNA Hind III).(Fungaro et al. 1996)senta um bom exemploda utilização prática dofungo Metarhizium anisopliae(Figura 3 e 4).Uma ilustração da análisede variação genéticade M. anisopliae isoladosde solo e de cadáveres dacigarrinha Deois flavopicta,utilizando-se deRAPD, é apresentada naFigura 5. Entre os 13 isoladosanalisados, 6 foramcoletados em diferentesregiões do Brasil e estavamcolonizando o inseto;os demais isoladosprovieram do solo de umaúnica região do Estadodo Paraná, Mauá. Os resultadosmostraram quea diversidade entre isoladosobtidos de D. flavopictaé muito menor queaquela encontrada entreisolados do solo. Este éum exemplo da importânciado emprego do método deRAPD no entendimento da relaçãopatógeno-hospedeiro (Fungaro et al.1996)Estudos realizados pelo Cenargen/Embrapa demonstraram que o fungoMetarhizium flavoviride apresentagrande potencial para o controle degafanhotos. Estes insetos se alimentamde gramíneas nativas e de váriasculturas economicamente importantes,tais como, arroz, cana-de-açúcar emilho. Uma nuvem de gafanhoto podeconter 40 milhões de indivíduos porquilômetro quadrado, o que representaum consumo diário de 80 miltoneladas de alimentos (Cosenza et al.1994). Esse fato demonstra a importânciade se investir esforços paramelhor conhecimento da espécie M.flavoviride. Estudos realizados em nossolaboratório (Martins, 1998) e tambémpor pesquisadores do Cenargen(Magalhães et al. 1997) permitiramconcluir que esta espécie apresentabaixa variabilidade genética quandocomparada a M. anisopliae.Além de aspectos relacionados coma variabilidade genética, o nosso grupotambém tem usado o RAPD para aidentificação taxonômica de algunsisolados de fungos entomopatogênicos(Azevedo, 1999) e para o monitoramentode cruzamentos entre isoladosde M. flavoviride (Martins et al.,1999).BibliografiaAzevedo, A. C. S. (1999). Caracterizaçãomolecular de Paecilomyces fumosoroseuse P. tenuipes. Londrina: UEL. 99p.Dissertação, Mestrado.Martins, M. K. (1998) RNA de duplafita em Metarhizium flavoviride. Londrina:UEL.101p. Dissertação de Mestrado.Bueno-Gomes R. (2000). Análise genéticae molecular da parassexualidadeem Penicillium chrysogenum. UNESP140p. Tese, Doutorado.Cosenza,G. W.; Ribeiro, J. G. B., deCarvalho, J.S.. (1994). Programa Nacionalde controle de gafanhotos. Manual Téc-nico. Ministério da Agricultura,do Abastecimento e daReforma Agrária. Embrapa-SPI, Brasília, DF 34p.Fungaro, M. H. P.; Vieira,M. L. C.; Pizzirazni-Kleiner,A. A. & Azevedo, J. L. (1996).Diversity among soil and insectisolates of Metarhiziumanisopliae var. anisopliae detectedby RAPD. Letters inApplied Microbiology 22: 389-392.Geisen, R. (1998). PCRMethods for the detection ofmycotoxin-producing fungi.In: Bridge P.D., Arora, D.K.,Reddy, C.A., Elander, R.P. ed.Applications of PCR in Mycology,CAB International, NewYork, p.243-266.Magalhães, B P, Faria, M;Tigano, M S, Sobral, B W S(1997). Characterization andvirulence of a Brazilian isolateof Metarhizium flavovirideGams and Rozsypal(Hyphomycetes). Memoirs of the EntomologicalSociety of Canadá 171: 313-312.Martins, M. K.; Furlaneto, M.C.; Sosa-Gomez, D.R.; Faria, M. R. & Fungaro, M.H. P. (1999). Double-stranded RNA inthe entomopathogenic fungus Metarhiziumflavoviride. Current Genetics 36:94-97.Mullis, K. & Faloona, F. (1987). Specificsynthesis of DNA in vitro via apolymerase catalysed chain reaction. Methodsin Enzymology. 55: 335-350.Sreenivasaprasad, K., Sharada, K., Brown,A.E, Mills, P.R. (1996). PCR-baseddetection of Colletotrichum acutatumon strawberry. Plant Pathology 45: 650-655Shapira, R.; Paster, N.; Eyal, O.; Menasherov,M.; Mett, A. & Salomon, R. (1996).Detection of aflatoxigenic molds in grainsby PCR. Applied and EnvironmentalMicrobiology. 62: 3270-3273.Welsh, J. &McClelland, M. (1990).Fingerprinting genomes using PCR withprimers arbitrary. Nucleic Acids Research.18: 7213-7218.Williams, J. K. G.; Kubelik, A. R.;Livak, K. J.; Rafalski, J. A. & Tingey, S. V.(1990). DNA polymorphism amplified byarbitrary primers are useful as geneticmarkers. Nucleic Acids Research. 18:6531-6535.