Identificação de Atividade Ácida Prostática em Manchas ... - NewsLab

ArtigoIdentificação de Atividade Ácida Prostáticaem Manchas Contendo Materiais Biológicos eAlimentos Simuladas para a Análise ForenseResumoJosé Ricardo dos Santos Vieira 1 , Alaine Albuquerque da Silva 2 , Bianca Tatiana Fonte Rodrigues 2 ,Crícia da Silva Alvarez 2 , Elissandra da Silva Rodrigues Alves 2 , Georgete Maria Moura Vieira 31 - Professor do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará – UFPA2 - Concluintes do Curso de Farmácia do Centro Universitário do Pará – CESUPA3 - Professora do Curso de Farmácia do Centro Universitário do Pará – CESUPASummaryA determinação qualitativa de atividade de fosfataseácida prostática (FAP) tem sido utilizada há vários anosna identificação de esperma em material biológico oumanchas provenientes do local do crime de vítimas deprovável agressão sexual. Para avaliar a sensibilidadedo método de Roy modificado na determinação deatividade de FAP em análise forense, foram analisadasmanchas feitas em papel de filtro a partir de materialbiológico e alimentos (esperma, sangue total, soro, saliva,secreção vaginal, fezes, urina, feijão, leite e café)para simular material proveniente de local de crime.Todas as manchas contendo material biológico mostraramresultados positivos com as manchas de espermacom os mais altos valores (~20.000x em relação àsmanchas com saliva com 0,92 ± 0,78UI/mL). Manchasde alimentos apresentaram resultados positivos (0,31 ±0,13UI/mL), o que indica que a atividade de FAP não éexclusiva de material biológico. A metodologia utilizadapara simular manchas provenientes de local de crimeem casos de estupro, utilizando o método modificadode Roy para determinar a atividade de FAP, mostrou-seadequada para análises forenses. Entretanto, resultadospositivos não podem ser considerados definitivos, massugestivos da presença de esperma quando os resultadosapresentarem-se milhares de vezes acima de umvalor de corte de 1,7UI/mL.Palavras-chaves: Fosfatase ácida prostática, análiseforenseDetection of phosphatase prostate acid instains in with human biological material andfood products to simulate forensic materialQualitative detection of phosphatase prostate acid(PPA) activity has been used for many years to identifyseminal fluid in biological material or stains from clothesof alleged victims of sexual assaults. In order to investigatethe sensibility of the modified Roy test for PPA activitydetermining, stains on filter paper made from humanbiological material and food products were used tosimulate forensic material from crime scene investigation(sperm, whole blood, serum, saliva, vaginal secretion,feces, urine, food products beans, milk, and coffee).All biological material stains have shown PPA activityand stains of sperm have shown the highest PPA activity(~20,000 fold to stains with saliva which have shown0.92 ± 0.78UI/mL PPA activity). Food stains have shownpositive results (0.31 ± 0.13UI/mL) that indicate thePPA activity is not exclusive of biological material. Themethodology used to simulate stains from crime scene investigationin rape cases, using the Roy adapted methodto detect PPA activity, was adequate to forensic analysisof sperm detection in stains. However, positive resultscannot be judged as conclusive but only suggestive ofseminal fluid presence when there are results thousandstimes higher than a cut off of 1.7UI/mL.Key words: Phosphatase prostate acid, forensicinvestigation138NewsLab - edição 85 - 2007

IntroduçãoAfosfatase ácida designa umgrupo heterogêneo não específicode fosfatases que exibempH ótimo entre 4,5 e 7,0 e catalizama hidrólise de monoéster ortofosfóricoproduzindo um álcool e umgrupo fosfato, e é amplamente distribuídanos tecidos humanos, alémde animais, vegetais e alimentosem geral (1). No homem adulto, apróstata contribui com quase cercade 50% da fosfatase ácida total,sendo o restante proveniente dosdemais tecidos (ossos, fígado, baço,rins, eritrócitos e plaquetas) (2).A fosfatase ácida prostática(FAP) (EC 3.1.3.2), por ser substânciaespecífica do homem e presenteno sêmen, tem sido utilizadacom muita freqüência em análisesforenses, pois com o crescenteaumento da violência sexual é imprescindíveladotar recursos científicossensíveis, específicos e poucodispendiosos para caracterizaçãode violência sexual, tornando-serotina sua pesquisa na secreçãovaginal e anal, já que, havendoejaculação, mesmo em indivíduosazoospérmicos (patológicos ouvasectomizados) certamente haveráFAP, o que caracterizará, semdúvida, a conjunção carnal ou o atolibidinoso (3). Entretanto, a especificidadee sensibilidade da FAP sãoquestionáveis pela possibilidade deresultados falsos-positivos devido ainterferentes presentes em outrosmateriais biológicos e, até mesmo,em alimentos e outros componentesorgânicos (4, 5).O método de Roy tem sido utilizadocom sucesso para a quantificaçãode FAP sérica e na análise qualitativaem casos de violência sexual comoalternativa do clássico teste de Bergdesenvolvido na década de 1950 (1).Entretanto, seu uso ainda carece depadronização para a quantificaçãoem análise forense, uma vez que oesperma possui mais de 1.000 vezesa concentração de FAP sérica e suaquantificação pode contribuir nacaracterização de casos de violênciasexual (4, 6, 7, 8).Desta forma, este trabalho visatestar uma técnica de dosagemda FAP, por meio do método colorimétricode Roy, em manchassimuladas com fluidos orgânicos ealimentos avaliando a possibilidadede resultados falsos-positivos oufalsos-negativos na dosagem deFAP em análises forenses.MetodologiaForam utilizadas manchas dediversos materiais biológicos (esperma,sangue total, soro, saliva,fezes, urina e secreção vaginal) ealimentos (café, leite e feijão) parasimular possíveis manchas encontradasno local de crimes relacionadoscom suposto atentado sexual.As manchas foram obtidas pelaadição de 50µL de cada material empapel de filtro qualitativo número 1.Uma amostra de 1cm 2 de papel defiltro contendo a amostra foi cortadaapós 15 minutos de secagem aoar e colocado para eluir em 1,0mLde água destilada estabilizada com10µL de ácido acético 10% (v/v)durante 15 minutos em temperaturaambiente.Amostras sólidas (p.ex.: fezes,alimentos) foram previamente diluídas(± 1g em 1mL de água) antesde serem adicionadas ao papel defiltro. As amostras de secreção vaginalforam coletadas com swab dealgodão esterilizado e distendidasdiretamente sobre o papel de filtro,mas também foram diluídas em1,0mL de solução salina fisiológica(NaCl 0,85%) e depois adicionadasao papel de filtro. A Figura 1 sumarizao processo metodológico paraa simulação das manchas.Os materiais biológicos foramprovenientes do Laboratório deAnálises Clínicas do Centro de EnsinoSuperior do Pará (CESUPA) eos alimentos foram provenientes depreparo caseiro.Para evitar a contaminação entreas amostras, foi realizada rigorosalimpeza do material envolvido naobtenção dos fragmentos de papelde filtro (pinça e tesoura) paraevitar resultados falsamente positivosdecorrentes da contaminaçãodo material, principalmente poresperma.A FAP foi dosada na soluçãoeluída através do Método de Roy(9), conforme sugerido pelo fabricantedo kit de dosagem (Labtest140NewsLab - edição 85 - 2007

dosagem do padrão, uma vez quea reação é linear segundo a Lei deLambert-Beer.Uma análise estatística dos valoresfoi realizada utilizando o programaBioestat versão 4.0 (10). O cálculodas médias e desvios padrõesdos valores de FAP nas amostras foiexecutado e um teste T paramétricode aderência foi aplicado para avaliara significância entre os valoresobservados e as médias esperadas.Um valor de p

A metodologia utilizada no presentetrabalho para obter materialpara análise após eluição de manchaem água destilada mostrou-seeficaz na detecção de atividade deFAP em todas as amostras analisadas(Tabela 2).Os valores de atividade de FAPobtidos em manchas de espermaintegral, diluído 1:10 e 1:100 ultrapassarama linearidade de leituraespectrofotométrica sugeridapelo fabricante do kit de dosagem(>0,800). Desta forma, somente asamostras cuja eluição foi diluída a1:100 forneceram leitura dentro doslimites de linearidade de 19,34 ±13,25 x103 UI/mL. Esses resultadoscorroboram o trabalho de Mendeset al(6), que demonstraram que adosagem de FAP no esperma deveser precedida de diluição na ordemmínima de 1:1000 para situar asabsorbâncias dentro da faixa delinearidade do método.Como a presença de espermaé a prova final de que houve ataquesexual, os resultados obtidosdemonstram que a necessidadede diluição do eluído na ordem de1.000 vezes para se obter absorbância

que somente este material biológicoapresentou tal nível de atividade deFAP no presente estudo.Levando-se em consideraçãoque as manchas encontradas emlocal de crime não possuem umpadrão específico de formação,resultados positivos na pesquisade atividade de FAP não podemser conclusivos da presença deesperma. Contudo, a detecção deatividade de FAP aumentada emmilhares vezes em relação a umvalor de corte teórico de 1,7UI/mL (correspondente à atividademáxima detectada em manchas desaliva) pode ser considerada como“sugestiva da presença de espermana mancha investigada” em análiseforense. Em contrapartida, oachado de resultados negativos éconclusivo da ausência de espermana mancha investigada.A detecção de atividade de FAPnas amostras de alimentos (média0,31 ± 0,13UI/mL) que, teoricamente,não deveriam demonstraressa atividade, indica que o métodopossui limitação na presençade interferentes que possam gerarresultado falso positivos, uma vez asmédias de FAP nessas amostras variousignificativamente (p