Relações filogenéticas, biogeografia histórica e evolução da ...

Erika Sendra TavaresRelações filogenéticas, biogeografia histórica e evolução daorganização de genes mitocondriais dos psitacídeosneotropicais (tribo Arini: Psittacidae: Psittaciformes)São Paulo2005ATUALIDADES ORNITOLÓGICAS N.128 – NOVEMBRO/DEZEMBRO DE 2005 – P. 5

Erika Sendra TavaresRelações filogenéticas, biogeografia histórica e evolução daorganização de genes mitocondriais dos psitacídeosneotropicais (tribo Arini: Psittacidae: Psittaciformes)Tese apresentada ao Instituto de Biociênciasda Universidade de São Paulo, para aobtenção de Título de Doutor em Ciências, naÁrea de Biologia/ Genética.Orientadora: Profa. Dra. Cristina Yumi MiyakiSão Paulo2005

Tavares, Erika SendraRelações filogenéticas, biogeografiahistórica e evolução da organização de genesmitocondriais dos psitacídeos neotropicais (triboArini: Psittacidae: Psittaciformes)86 páginasTese (Doutorado) - Instituto de Biociênciasda Universidade de São Paulo. Departamento deBiologia.1. Psitacídeos neotropicais 2. Filogeniamolecular 3. tribo Arini 4. Organização dos genesmitocondriais I. Universidade de São Paulo.Instituto de Biociências. Departamento deGenética e Biologia Evolutiva.Comissão Julgadora:__________________________Prof. (a) Dr. (a)__________________________Prof. (a) Dr. (a)__________________________Prof. (a) Dr. (a)__________________________Prof. (a) Dr. (a)__________________________Profa. Dra. Cristina Yumi Miyaki

Ao Rafinha, Tião e Ilka, commuito amor

Strange fascination, fascinating me,Changes are taking the pace I am going through,David Bowie (Changes, “Hunk Dory”, 1971)

AgradecimentosÀ Dra. Cristina Yumi Miyaki pela orientação com muita dedicação e carinho, pelo incentivo eencorajamento de sempre e pelo muito que me ensinou.Ao Dr. Allan Baker pela oportunidade de estágio e orientação em seu laboratório no RoyalOntario Museum em Toronto, pela empolgação científica contagiante, por todo carinho, apoio pessoale pelas várias explicações sobre muitos assuntos.Ao Sérgio Luiz Pereira pela orientação técnica e sugestões científicas oferecida sempre comgrande disposição e paciência, pelo companheirismo e dicas de sobrevivência em terras distantes.Ao Renato Gaban-Lima pela ajuda incondicional, discussões e sugestões sobre ospsitacídeos.À Dra. Anita Wajntal e à Dra. Elizabeth Höfling pelo interesse e sugestões.À Camila Ribas pelos conselhos prestimosos durante todo o desenvolvimento da tese,companheirismo e discussões científicas.À Melina Baumgarten pelas conversas confortantes, incentivo e apoio em muitos momentos.Ao Rogério Lourenço por obter as seqüências de Graydidascalus e Triclaria como parte do seuprojeto de iniciação científica, que foram utilizadas no terceiro capítulo dessa tese.Ao Renato Caparroz pelo empréstimo de livros, materiais e por apresentar grandes amigos noCanadá.Aos amigos de laboratório Adriana Oliveira-Marques, Celina Yoshihara, Cibele Biondo, ErwinGrau, Fábio Raposo, Fernando d’Horta, Fernando Nodari, Flávia Presti, Gustavo Cabanne, GustavoYbazeta, Jacqueline Miller, José Patané, Juliana Oliveira, Maryann Burbidge, Mark Pack, Nadia deMoraes-Barros, Nicola Wade, Oliver Haddrath, Polyana Andrioni, Ricardo Yassaka, Rodrigo Pessoa,Sarah Nasser, Tania Matsumoto, Tara Paton, entre outros pela troca de experiências e pelosmomentos agradáveis.Ao Luis Fábio Silveira pela ajuda prestativa no Museu de Zoologia.À Dra. Marie Anne Van Sluys e Mariana Cabral de Oliveira.do departamento de Botânica porpermitir o uso do sequenciador automático.À Elisângela Quedas e Silvia Blanco pela grande ajuda com o seqüênciamento automático.Ao Dr. Carlos Frederico Martins Menck do Instituto de Biociências pelo empréstimo da chavedo programa de computador.Às amigas Helenice Hirata, Lucilene da Silva, Maria Andrade, por toda ajuda prestativa,oferecida sempre com muita disposição.Aos amigos e colegas de instituição no Brasil e no Canadá Adriana (Adri), Andréia Ramirez,Antônia Cerqueira (Toninha), Bill, Carla D’Angelo, Cláudia Fábris, Cléber Costa, Cibele Masotti,Cristiane Iughetti, Fátima, Gisele, Ilana Kohl, Mônica Varela, Patrícia Faria, Roseli Zanelato, SilviaGeurgas entre tantos outros pela convivência e por compartilhar momentos alegres.Aos professores do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências(USP), pela ajuda e sugestões.Aos funcionários do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva e da pós-graduação doInstituto de Biociências (USP) e do Royal Ontario Museum pelo suporte.

Às pessoas e instituições que cederam o material biológico utilizado nessa tese: African SafariZoo, Parque Ecológico do Tietê, UNESP, Zoológico de Sorocaba, Zoológico de Americana, ZoológicoCyro-Gevaerd, Fundação Crax, Museu Paraense Emílio Goeldi, Field Museum of Natural History eaviculturistas.À Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado de São Paulo pelo financiamento da pesquisa,pela concessão da bolsa de doutorado e pelo financiamento do estágio no Royal Ontario Museum.À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, ao Conselho Nacional deDesenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), ao Natural Sciences and Engineering ResearchCouncil of Canada e ao National Science Foundation (AToL) pelo financiamento da pesquisa.À Lynx Edicións pela permissão de uso das figuras do Handbook of the Birds of the Worldvolume 4.Ao Rafinha (Rafael Corrêa) pelo grande apoio, participação e incentivo e por ter tornado todosesses anos extremamente felizes.Aos meus pais Sebastião Tavares e Ilka Tavares e aos meus sogros Valmir Corrêa e LúciaCorrêa por tudo que me ensinaram, pelo amor, dedicação e prontidão em ajudar.À Maria Inês Ribeiro Salsa pelo grande suporte, por todo carinho e amor.Aos meus irmãos Katia Tavares, Leonardo Tavares e Tiago Corrêa pelos períodos alegres,pelo incentivo e por toda ajuda.À todos os demais membros da minha família e aos meus amigos pelo apoio nos períodosdifíceis e por compartilharem os momentos felizes.

ÍndiceResumo 1Abstract 2Capítulo 1: Introdução geral 3Capítulo 2: Relações filogenéticas e biogeografia histórica dos psitacídeosneotropicais (tribo Arini) com base em seqüências de DNA mitocondriale nuclear 28Capítulo 3: Evolução da organzação dos genes mitocondriais ao redor da regiãocontroladora em psitacídeos Neotropicais 61Capítulo 4: Considerações finais 83

ResumoCom a finalidade de entender melhor as relações filogenéticas entre os psitacídeos neotropicais(tribo Arini), foram seqüenciados 6416 pares de bases de genes nuclear (RAG-1) e mitocondriais(citocromo b, NADH2, ATPase 6, ATPase 8, COIII, DNAr 12S e DNAr 16S) de 29 espéciespertencentes a 25 dos 30 gêneros reconhecidos atualmente. As análises filogenéticas utilizando osmétodos de máxima verossimilhança e análise bayesiana evidenciaram que, dentre os psitacídeosneotropicais, o clado formado por Nannopsittaca e Bolborhynchus é grupo irmão de todos os outrosgêneros, que por sua vez são agrupados em dois clados. Esses clados compreendem: um grupo depapagaios, caturritas, curicas e afins e outro grupo que inclui as araras, marianinhas, tiriba e afins. Adatação molecular utilizando uma calibração geológica (separação da Nova Zelândia há 82-85 milhõesde anos, ma) sugere que os psitacídeos neotropicais compartilharam ancestral comum com um grupode psitacídeos Australianos no final do Cretáceo (65 ma), portanto a divergência dessas linhagenspoderia ser atribuída ou intensificada pela separação dos continentes. Os ancestrais dos psitacídeosneotropicais atuais poderiam estar distribuídos na América do Sul e Antártica ou somente no primeirocontinente. Hipóteses da diversificação no grupo foram levantadas relacionando fatores históricos comos padrões de cladogênese encontrados.Seqüências mitocondriais da região controladora e regiões flanqueadoras determinadas paravários táxons de psitacídeos neotropicais evidenciaram a existência de dois arranjos gênicos.Nannopsittaca dachilleae, Bolborhynchus lineola, Myiopsitta monachus, Brotogeris chiriri, Araararauna, Anodorhynchus hyacinthinus, Cyanoliseus patagonus, Cyanopsitta spixii, Diopsittaca nobilis,Enicognathus lepthorhynchus, Guarouba guarouba, Orthopsittaca manilata, Primolius auricollis,Pyrrhura picta e Rhynchopsitta pachyryncha apresentam a ordem dos genes descrita inicialmente emGallus gallus e posteriormente sugerida como o arranjo mais freqüente em aves. Graydidascalusbrachyurus, Pionopsitta pileata, Pionopsitta barrabandi, Triclaria malachitacea, Deroptyus accipitrinus,Pionites leucogaster e Forpus crassirostris revelaram um rearranjo de genes com duplicação da regiãocontroladora, como descrito inicialmente para psitacídeos neotropicais dos gêneros Amazona ePionus. Em Deroptyus e Pionites também foram encontrados pseudogenes exclusivos. Com base nomapeamento dessas duas organizações gênicas na filogenia proposta para o grupo (manuscrito 1,anexo) propusemos dois mecanismos para explicar a distribuição da ordem gênica no grupo. Noprimeiro, poderia ter ocorrido três eventos de duplicação de genes seguido de três eventos de deleçãoque poderiam levar ao arranjo com a duplicação da região controladora. Alternativamente, teriaocorrido um único evento de duplicação de genes seguido de cinco eventos independentes de deleçãode genes, dois reverteriam para a organização original e três dariam origem à ordem alternativa.Ambos os cenários assumem convergência e seis eventos envolvendo duplicação ou deleção degenes.1

AbstractTo clarify the phylogenetic relationships among the genera of Neotropical parrots we analyzed6416 base pairs of nuclear (RAG-1) and mitochondrial DNA sequences (cytochrome b, NADH2,ATPase 6, ATPase 8, COIII, 12S rDNA, and 16S rDNA) from 29 species belonging to 25 out of the 30genera. Phylogenetic analyses using maximum likelihood and Bayesian methods showed that withinNeotropical parrots, Nannopsittaca and Bolborhynchus form the sister clade to all other genera, whichin turn are grouped in two distinctive clades. These two derived clades partition amazons and theirallies from macaws, conures, and related taxa. Molecular dating with a geological calibration for theseparation of New Zealand (82-85 million years, Myr) suggests that the Neotropical parrots shared acommon ancestor with Australian parrots around the end of the Cretaceous (65 Myr), and thus, theirdivergence could be explained by vicariance. The three Neotropical clades may have diverged whilethey were in the Antarctica-South America block, or in South America only. Hypothesis of thediversification in these groups relating historical factors and cladogenesis pattern in were proposed.Sequences of the mitochondrial control region and flanking genes of Ara ararauna,Anodorhynchus hyacinthinus, Bolborhynchus lineola, Brotogeris chiriri, Cyanoliseus patagonus,Cyanopsitta spixii, Diopsittaca nobilis, Enicognathus leptorhynchus, Guarouba guarouba, Myiopsittamonachus, Nanopsittaca dachilleae, Orthopsittaca manilata, Primolius auricollis, Pyrrhura picta, andRhynchopsitta pachiryncha show the same gene arrangement first described in Gallus gallus, (which isthe most common mitochondrial genome arrangement in birds). Sequences of the same region inAmazona xanthops, Deroptyus accipitrinus, Forpus crassirostris, Graydidascalus brachyurus,Pionopsitta pileata, Pionopsitta barrabandi, Pionites melanocephala, and Triclaria malachitacearevealed an arrangement of genes with a duplication of the control region, as previously reported inNeotropical parrots from the genera Amazona and Pionus. Exclusive pseudogenes occur in Deroptyusand Pionites. The mapping of these characters in a phylogenetic proposal for the group suggestsambiguity on the inference of the ancestral states of the clades. Two models were proposed andcompared, considering six events of duplication and deletion of genes.2

Capítulo 1Introdução

1.1. Apresentação GeralCapítulo 1Na presente tese as relações evolutivas entre psitacídeos neotropicais foram estudadas pelaanálise de seqüências de DNA nuclear e mitocondrial. Os resultados foram comparados comclassificações e propostas sistemáticas prévias. Foram realizadas estimativas dos tempos dedivergência entre as linhagens, a partir das quais foram levantadas hipóteses biogeográficas.Adicionalmente, a evolução da ordem dos genes mitocondriais ao redor da região controladora foiestudada.A tese está organizada em capítulos. O presente capítulo 1 é uma introdução geral quedescreve o contexto no qual o trabalho se insere, com ênfase nos organismos estudados e métodos deanálise utilizados. Já nos capítulos 2 e 3 são apresentados os dados obtidos em forma de manuscritosa serem submetidos para publicação. O último capítulo se refere às considerações finais referentesaos manuscritos.1.2. Psitacídeos1.2.1. Informações sistemáticas e filogenéticasA ordem Psittaciformes inclui as araras, papagaios, periquitos, maracanãs e cacatuas. Aprincipal característica compartilhada pelos táxons pertencentes ao grupo é a forma do bico, cujamaxila superior é curva e envolve a maxila inferior (Smith, 1975; Forshaw, 1989; Sibley e Alquist,1990). Propostas filogenéticas recentes com base em evidências moleculares e morfológicas (Sibley eAlquist, 1990; Cooper e Penny, 1997; Cracraft, 2001; Livezey e Zusi, 2001; Mayr e Clarke, 2003;García-Moreno e col., 2003; Harrison e col., 2004) sugerem que o grupo faz parte das Neoaves deNeognathae, porém sua posição filogenética em relação às demais ordens de Neoaves ainda não ébem resolvida (Figura 1.1).Figura 1.1. Relações filogenéticas entre os grandes grupos de aves (modificado de García-Moreno ecol., 2003).4

Capítulo 1Os Psittaciformes são uma das ordens de aves mais abundantes em número de espécies,incluindo cerca de 350 espécies (distribuídas em 84 gêneros). Ocorrem no neotrópico, região africana,sul asiática e australiana (Forshaw, 1989, Collar, 1997; Rowley, 1997) (Figura 1.2).30 gêneros 4 gêneros 50 gênerosFigura 1.2. Distribuição dos gêneros da ordem Psittaciformes (del Hoyo e col., 1997).Atualmente são reconhecidas duas famílias na ordem, Cacatuidae (inclui as subfamíliasCalyptohynchinae, Cacatuinae e Nymphicinae) e Psittacidae (Loriinae e Psittacinae) (Forshaw, 1989,Collar, 1997; Rowley, 1997). No entanto, estudos filogenéticos recentes evidenciaram que a famíliaPsittacidae como é reconhecida atualmente não é monofilética. Análises filogenéticas do gene nuclearRAG-1 e de íntrons localizados nos cromossomos sexuais de um grande número de gêneros da ordemPsittaciformes sugerem que os gêneros Strigops (tribo Strigopini: Psittacinae: Psittacidae) e Nestor(Nestorini: Psittacinae: Psittacidae) exclusivos da Nova Zelândia são grupo irmão de todos os demaisgêneros de psitacídeos atuais (Barrowclough e col., 2004; de Kloet e de Kloet, 2005), Cacatuidae é opróximo clado monofilético e é grupo irmão das demais tribos da família Psittacidae (Barrowclough ecol., 2004).Os psitacídeos neotropicais formam o grupo de espécies mais numeroso da ordem (com cerca150 espécies) e atualmente inclui 30 gêneros (Collar, 1997). Apresentam uma grande variação detamanho, preferência de hábitat, distribuição geográfica e comportamento (Forshaw, 1989). A5

Capítulo 1sistemática dos gêneros neotropicais sofreu diversas modificações ao longo do tempo (ex. Salvadori,1891; Miranda-Ribeiro, 1920; Peters, 1937; Pinto, 1937, 1978; Forshaw, 1989; Sick, 1997; Collar,1997). Alguns sistematas, com base em morfologia externa, anatomia e comportamento (Salvadori,1891; Boetticher, 1943, 1959; Verheyen, 1956; Brereton, 1963) distribuíam os gêneros neotropicais emdois grupos de composição variável, em alguns casos incluindo táxons de outras regiões geográficas(Tabela 1.1).Tabela 1.1. Grupos de gêneros de psitacídeos neotropicais (em alguns casos incluindo gênerosafricanos, sublinhados). Os nomes dos gêneros correspondem à Collar (1997), exceto Propyrrhurapara o qual foi adotado Primolius (Penhallurick, 2001).AutoresSalvadori(1891)Verheyen(1956)Boetticher(1943, 1959)Brereton(1963)Smith (1975)Miyaki e col.(1998)de Kloet e deKloet (2005)Pioninae: Amazona, DeroptyusGraydidascalus, HapalopsittacaPionites, Pionus, Pionopsitta,Triclaria, Touit, PoicephalusAmazoninae: Amazona, DeroptyusGraydidascalus, Pionites, Pionus,Pionopsitta, Triclaria, Touit.Psittacini: Amazona, DeroptyusGraydidascalus, HapalopsittacaPionites, Pionus, Pionopsitta,Triclaria, Touit, Poicephalus,Psittacus, CoracopsisForpidae: Forpus, Bolborhynchus,PsilopsiagonGruposConurinae: Anodorhynchus, Ara, Aratinga,Bolborhynchus, Cyanoliseus, Cyanopsitta,Diopsittaca, Enicognathus, Forpus, Guarouba,Leptosittaca, Myiopsitta, Nandayus,Nannopsittaca, Ognorhynchus, Orthopsittaca,Primolius, Psilopsiagon, Pyrrhura,RhynchopsittaArinae: Anodorhynchus, Ara, Aratinga,Bolborhynchus, Brotogeris, Cyanoliseus,Cyanopsitta, Diopsittaca, Enicognathus,Forpus, Guarouba, Leptosittaca, Myiopsitta,Nandayus, Nannopsittaca, Ognorhynchus,Orthopsittaca, Primolius, Psilopsiagon,Pyrrhura, RhynchopsittaAraini: Anodorhynchus, Ara, Aratinga,Bolborhynchus, Cyanoliseus, Cyanopsitta,Diopsittaca, Enicognathus, Forpus, Guarouba,Leptosittaca, Myiopsitta, Nandayus,Nannopsittaca, Ognorhynchus, Orthopsittaca,Primolius, Psilopsiagon, Pyrrhura,RhynchopsittaAmazonidae: Anodorhynchus, Ara, Aratinga,Pionites, Pyrrhura, Pionopsitta, Deroptyus,Amazona, Brotogeris, PionusArini: Amazona, Anodorhynchus, Ara, Aratinga, Bolborhynchus, Brotogeris,Cyanoliseus, Cyanopsitta, Deroptyus, Diopsittaca, Enicognathus, Forpus,Graydidascalus, Guarouba, Hapalopsittaca, Leptosittaca, Myiopsitta, Nandayus,Nannopsittaca, Ognorhynchus, Orthopsittaca, Pionites, Pionopsitta, Pionus, Primolius,Psilopsiagon, Pyrrhura, Rhynchopsitta, Triclaria, TouitCauda curta: Amazona, PionusAmazona, Forpus,Graydidascalus,Pionus, TriclariaMyiopsitta,BrotogerisCauda longa: Anodorhynchus, Ara, AratingaCyanopsitta, Deroptyus, Diopsittaca,Guarouba, PyrrhuraAnodorhynchus, Ara, Aratinga, Cyanoliseus,Deroptyus, Guarouba, Pionites, Pyrrhura,RhynchopsittaVerheyen (1956) agrupou exclusivamente táxons neotropicais nas famílias Amazoninae eArinae e sugeriu que esses grupos compartilham características morfológicas (presença de quatro6

Capítulo 1vértebras dorsais, uma única carótida dorsal, entre outras) que os distinguem dos psitacídeos dasdemais regiões geográficas, mas não sugeriu uma categoria para agrupá-los. Em uma revisãoabrangente da sistemática da ordem Psittaciformes, Smith (1975) agrupou todos os táxonsneotropicais na tribo Arini (família Psittacidae) com base em dois caracteres exclusivos (eclosão dosfilhotes com canal auditivo imperfurado e postura copulatória em uma perna) e outros caracterescomuns, porém não exclusivos (fórmula carótida do tipo A-2-s, bicos marrons, pretos ou brancos,sistema de coloração das penas com padrão “Dyck-texture” que inclui cor verde, com azul e/ ouvermelho) e considerou artificiais os agrupamentos internos até então propostos na tribo (Tabela 1.1).Na falta de7

Capítulo 1Esse conjunto de dados foi ampliado para um total de 3.245 pb com a adição dos genesmitocondriais citocromo oxidase I e região controladora e um total de 13 espécies de psitacídeosneotropicais (Tavares, 2001; Tavares e col. 2004), com a finalidade de entender melhor as relaçõesfilogenéticas entre os gêneros pertencentes a um dos grupos obtidos anteriormente (Miyaki e col.,1998). Entre os resultados obtidos nessas novas análises, Myiopsitta monachus não agrupa com osdemais táxons de cauda longa (Tavares, 2001), algumas espécies de mesmo gênero formam cladosmonofiléticos e um agrupamento nunca mencionado entre os gêneros monoespecíficos Guaroubaguarouba e Diopsittaca nobilis foi recuperado (Figura 1.4). No estudo filogenético de íntrons localizadonos cromossomos sexuais Z e W três grupos de gêneros neotropicais foram recuperados (Tabela 1.1;de Kloet e de Kloet, 2005), sendo que dois dos mesmos apresentaram composição semelhante aosgrupos obtidos nas análises filogenéticas anteriores (Miyaki e col., 1998; Tavares e col. 2004). Noentanto, as relações entre os grupos e entre os gêneros pertencentes a cada um desses grupospermaneceram desconhecidas. Adicionalmente, filogenias dos níveis taxonômicos de gênero e espéciesugeriram a ausência de monofiletismo nos gêneros Aratinga, Amazona e Pionopsitta (Tavares, 2001;Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004; Ribas e col., 2005).a) b)Figura 1.4. Relações filogenéticas entre gêneros de psitacídeos neotropicais com base em seqüênciasde DNA mitocondrial. a) por máxima verossimilhança com base em 2.332 pb, números correspondemao suporte por “quartet puzzle” (Tavares, 2001); b) por máxima verossimilhança com base em 3.246pb, números correspondem ao suporte por “bootstrap”: máxima parcimônia/ máxima verossimilhança(Tavares e col., 2004).8

1.2.2. Importância da tribo Arini para a biologia evolutivaCapítulo 1O estudo das relações evolutivas entre as linhagens de psitacídeos neotropicais é necessáriopara entender vários aspectos evolutivos, já que além de numeroso (inclui cerca de 150 espécies), éum grupo relativamente heterogêneo. Estão distribuídos por toda a região neotropical, ondeapresentam padrões de exploração de hábitats muito variáveis. Algumas espécies são endêmicas aregiões muito particulares, como Cyanopsitta spixii em mata ciliar aberta na região de Curaçá eGuarouba guarouba em floresta de terra firme ao norte do Maranhão e Pará, enquanto outras sedistribuem em amplas áreas, como Ara ararauna que ocorre em buritizais, babaçuais e beira de matada América Central ao sul do Brasil e Aratinga leucophthalmus em orlas de mata das Guianas àArgentina (Collar, 1997; Sick, 1997; Forshaw, 1989). Existe uma grande variação de tamanho,coloração de plumagem e comportamento entre as linhagens. Por exemplo, as menores espécies,pertencentes ao gênero Forpus, pesam 25 gramas, enquanto a arara-azul grande, Anodorhynchushyacinthinus, pesa cerca de 1500 gramas (Sick, 1997; Forshaw, 1989). Quanto à coloração, algumasespécies são predominantemente verdes (ex. espécies dos gêneros Amazona, Pionus, Pyrrhura eEnicognathus), outras são vermelhas (ex. Ara macao e Ara chloroptera), azuis (ex. Anodorhynchus eCyanopsitta) ou amarelas (ex. complexo Aratinga solstitiais e Guarouba guarouba). Nidificam emparedões rochosos (ex. Anodorhynchus leari), ocos (ex. Cyanopsitta, Nandayus), cupinzeiros (ex.Aratinga aurea) ou constróem ninho de gravetos (exclusivamente Myiopsitta monachus) (Collar, 1997).Alguns gêneros como Pionopsitta, Aratinga, Pyrrhura, Pionites, Touit, Forpus, Brotogeris eAmazona incluem espécies e subespécies com distribuições restritas, sendo bons modelos paraestudos de padrões biogeográficos (vide Ribas, 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004;Ribas e col. 2005). No entanto, a falta de conhecimento das relações entre gêneros, dificulta a escolhade bons grupos externos. Além disso, alguns gêneros monotípicos, são representantes únicos dealgumas das linhagens atuais que estão seriamente ameaçados de extinção, por exemplo, Cyanopsittaspixii e Guarouba guarouba, o que torna urgente a necessidade de estudar vários aspectos dessasespécies, inclusive suas posições filogenéticas, afim de se obter mais informação a respeito dosmesmos antes que sejam extintos. Muitas espécies de psitacídeos neotropicais são vulneráveis ouameaçadas de extinção e o conhecimento de suas relações evolutivas pode auxiliar trabalhos maisespecíficos voltados aos planos de conservação e manejo (Collar e col., 1992; Beissinger, 2000;Owens e Bennet, 2000).9

1.2.3. BiogeografiaCapítulo 1Com base na atual distribuição das espécies (Figura 1.2) e no registro fóssil, Glenny (1954)sugeriu que a ordem Psittaciformes se originou no continente antártico após o limite entre o Cretáceo-Terciário, a partir do qual as espécies dispersaram para os continentes sul-americano, Austrália eNova Zelândia e a colonização africana teria ocorrido por migrações transoceânicas. Também combase na distribuição dos gêneros atuais, porém assumindo uma idade mais antiga para a origem dogrupo, Cracraft (1973, 2001) sugeriu que a ordem Psittaciformes, entre outras ordens de aves comdistribuição semelhante, possivelmente se originou no antigo continente da Gondwana e que aseparação dos blocos desse grande continente teve uma função importante na diversificação dasprimeiras linhagens desses grupos.Algumas evidências recentes vêm corroborando a hipótese de origem na Gondwana para ogrupo. Estudos de datação molecular sugerem que a diversificação de Neoaves e Galloanserae(Figura 1.1), ocorreu entre 80-110 milhões de anos (ma; Hedges e col., 1996; Cooper e Peny, 1997;van Tuinen e Hedges, 2001; Paton e col., 2002). Corroborando essa idéia, foi reanalisadorecentemente um fóssil de ave (Vegavis iaai), posicionado filogeneticamente na ordem Anseriformes edatado de 66-68 ma, o que sugere que pelo menos a ordem atual Anseriformes já estaria diferenciadaantes do limite entre o Cretácio-Terciário (Clarke e col., 2005). Adicionalmente, os dados recentes defilogenia molecular de psitacídeos sugerem que os gêneros da Nova Zelândia são grupo irmão dosdemais táxons atuais e o padrão de diversificação dos demais grupos seguindo um padrão coincidentecom a separação dos continentes também reforçam uma possível origem na Gondwana(Barrowclough, 2004; de Kloet e de Kloet, 2005). Um padrão semelhante é descrito em Passeriformes(Ericson e col. 2003).O registro fóssil de Psittaciformes não contribui para elucidar essa e outras questões. O fóssilmais antigo descrito como psitacídeo é uma mandíbula inferior encontrado na região de Wyoming nosEUA e data de mais de 65 ma (Stidham, 1998). Apesar disso, a identificação morfológica dasestruturas do fóssil como sendo uma mandíbula de psitacídeo foi fortemente questionada (Dyke eMayr, 1999). Outros fósseis de Psittaciformes, porém sem posição filogenética conhecida, foramdescritos na França (sítio arqueológico “La Bouffie”), no período Eoceno superior (por volta de 50 ma).Devido a diferenças osteológicas em relação aos demais psitacídeos atuais, foram consideradospertencentes a uma família à parte, Quercypsittidae, atualmente extinta (Chauviré, 1992). Um outrofóssil de psitacídeo, também encontrado na França, é o Archaeopsittacus verreauxi, datado entre oOligoceno Superior e o Mioceno Inferior (Forshaw, 1989). Além destes, existem fósseis de gêneros10

Capítulo 1atuais mais recentes que datam dos períodos Terciário (Boles, 1993; Boles, 1998) e Quaternário(Collar, 1997).Datações moleculares sugerem que a separação entre o periquito australiano (Melopsittacusundulatus) e alguns táxons neotropicais ocorreu por volta de 76 ma (Miyaki e col., 1998) o que tambémestaria de acordo com a hipótese de que a separação dos continentes teve um papel importante nadiversificação desses grupos. A divergência entre os gêneros de psitacídeos neotropicais foi estimadaentre o Eoceno-Oligoceno e durante o Mioceno (16-27 ma) e foi associada a mudanças ambientais emconsequência de mudanças no nível do mar, orogenia dos Andes e expansão de ambientes de florestae de áreas secas (Miyaki e col., 1998; Tavares e col., 2004). Já o intervalo de divergências entreespécies do mesmo gênero de psitacídeos foi estimado entre 0,5 e 1,3 ma (Tavares e col., 2004; Ribase Miyaki, 2004; Ribas e col., 2005).1.3. Inferências filogenéticas baseadas em seqüências de DNA1.3.1.Aspectos geraisFilogenias são baseadas no princípio de que todos os organismos atuais e extintos sãointerligados por relações de ancestralidade comum. A principal meta dos estudos filogenéticos élevantar as hipóteses mais prováveis sobre história evolutiva entre os organismos. Com base noprincípio de ancestralidade comum, a evolução ocorre por processos de ramificação, onde umalinhagem se divide em duas ou mais, portanto, as hipóteses sobre as relações evolutivas entre osorganismos são ilustradas em gráficos chamados de árvores filogenéticas. O padrão de ramificação deuma árvore é chamado de topologia (Graur e Li, 2000). Muitas são as aplicações dos estudosfilogenéticos, entre elas, estabelecer sistemas de classificação biológica que refletem a evolução dosorganismos e permitir interpretações de diversos processos evolutivos morfológicos, moleculares ebiogeográficos. Com o desenvolvimento das técnicas moleculares, surgiu a filogenia molecular, ouseja, o estudo das relações evolutivas entre os organismos pelo uso de marcadores moleculares(Moritz e Hillis, 1996; Graur e Li, 2000).Sibley e Alquist (1990) realizaram um dos primeiros trabalhos de maior impacto na áreamolecular de aves. Esses autores utilizaram a técnica de hibridação DNA-DNA entre pares de táxonsrepresentantes de praticamente todas as ordens de aves a fim de tentar entender as relações entreesses grupos. Apesar dos vários resultados significativos que eles obtiveram, problemasmetodológicos e empíricos permaneceram sem solução e muitas das relações ainda não foramresolvidas (Garcia-Moreno e col., 2003). Recentemente, seqüências de DNA mitocondriais e nucleares11

Capítulo 1têm sido muito empregadas em reconstruções filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos de aves(ex. Miyaki e col., 1998, Haddrath e Baker, 2001; Pereira e col., 2002, Paton e col., 2002; Nahum ecol., 2003; Harrison e col., 2004).1.3.2. Heterogeneidade de taxas de substituição de nucleotídeos e modelagemO princípio básico das inferências filogenéticas com base em seqüências de DNA, é que apartir da divergência entre dois táxons, o número de diferenças nas suas seqüências homólogas deDNA aumentaria proporcionalmente ao longo do tempo. No entanto, a comparação de seqüênciashomólogas entre os táxons revelou que cada sítio evolui sob condições muito particulares. Em algunscasos essas diferenças podem ser associadas a uma pressão seletiva devido à sua função. Porexemplo, em genes codificadores de proteínas, os sítios correspondentes à terceira posição do códonestão mais sujeitos à variação do que os correspondentes à primeira e à segunda posição, porquemutações na terceira posição alteram menos frequentemente o aminoácido correspondente devido ànatureza degenerada do código genético (Graur e Li, 2000; Nei e Kumar, 2000). Essa heterogeneidadefaz com que em alguns conjuntos de dados existam sítios tão conservados que não apresentamsubstituições entre táxons distantemente relacionados, enquanto em outros sítios a variação é muitogrande, a ponto de mascarar o sinal filogenético devido à presença de substituições múltiplas mesmoentre linhagens próximas taxonomicamente. Esse problema é ainda maior nas inferências filogenéticasentre grupos taxonômicos mais distantemente relacionados (Swofford, 1996; Holder e Lewis, 2003;Felsenstein, 2004).Além disso, alguns tipos de substituições entre os sítios ocorrem com maior freqüência do queoutros e as substituições também estão sujeitas à freqüência de bases que ocorre no segmentoestudado. Todos esses fatores mencionados podem interferir nas inferências filogenéticas aumentandoo número de substituições paralelas ou reversões de estado, que não podem ser detectados pelasimples comparação das seqüências dos táxons atuais. No entanto, foram desenvolvidos diversosmodelos evolutivos que descrevem o padrão de substituição de nucleotídeos no DNA em diferentesconjuntos de dados. Existem diferentes testes e critérios para escolher o modelo evolutivo maisadequado para um conjunto de dados, como o teste de razão de verossimilhança (“likelihood ratiotest”, Felsenstein, 1988; Posada, 2003) e o critério de informação Akaike (Posada e Crandall, 1998;Posada, 2003) e, em geral, os valores dos parâmetros são estimados a partir dos dados (Swofford ecol., 1996). Na presente tese, foram empregados os métodos de máxima verossimilhança e análise12

Capítulo 1bayesiana (descritos a seguir) que incorporam modelos evolutivos explícitos (Swofford, 1996; Holder eLewis, 2003; Felsenstein, 2004) .1.3.3. Máxima verossimilhançaO método da máxima verossimilhança busca a hipótese filogenética com maior probabilidadede explicar a distribuição dos estados de caráter nos táxons atuais, com base em um modelo evolutivopreviamente definido e estados de caracteres observados nos terminais da árvore filogenética(Swofford e col., 1996). Dessa forma, para uma dada hipótese, representada na forma de umatopologia, a probabilidade para as combinações considerando cada possível ancestral de cada nóinterno devem ser calculadas com base no modelo evolutivo. Por esse método, diversas hipóteses sãotestadas pela multiplicação das suas probabilidades para cada caráter, que em estudos molecularessão cada sítio de DNA.Por ser um critério de otimização, para se escolher a melhor topologia pela máximaverossimilhança, em princípio todas as topologias possíveis para explicar a história evolutiva dostáxons devem ser testadas. No entanto, dependendo do número de táxons na análise, o cálculo daprobabilidade para todas as possíveis topologias pode ser extremamente demoradocomputacionalmente. Por causa disso, foram desenvolvidas diferentes estratégias de buscasheurísticas, que visam encontrar a melhor topologia, sem necessariamente amostrar todas astopologias possíveis, tornando o método aplicável para grandes conjuntos de dados, apesar deaumentar o risco de a melhor topologia não ser amostrada (Swofford e col., 1996; Holder e Lewis,2003; Felsenstein, 2004).Uma das formas mais utilizadas para avaliar o quanto os dados sustentam cada clado damelhor topologia obtida por máxima verossimilhança é o “bootstrap” não paramétrico. Pelo “bootstrap”a matriz de dados originais é re-amostrada com reposição para gerar várias pseudo-réplicas, a partirdas quais a melhor topologia para cada uma é encontrada. Uma topologia consenso dessas árvores égerada e o número de vezes que cada clado aparece nessas topologias é representadoprobabilisticamente. Dessa forma, esse algoritmo permite availar que partes da topologia são menossuportadas pelo conjunto de dados (Holder e Lewis, 2003).1.3.4. Análise BayesianaA inferência filogenética por análise bayesiana é baseada no conceito de probabilidadeposterior das hipóteses filogenéticas. A probabilidade posterior de uma topologia pode ser interpretada13

Capítulo 1como a sua probabilidade de ser a que representa a verdadeira história evolutiva do grupo deorganismos estudados, portanto por esse método a topologia com a maior probabilidade posterior deveser a melhor estimativa da evolução do grupo. Para calcular a probabilidade posterior é usado oteorema de Bayes que combina a probabilidade a priori da topologia, com sua probabilidade deexplicar a distribuição dos estados de caráter nos táxons atuais com base em um modelo evolutivo(verossimilhança). A probabilidade a priori de uma topologia é definida como sua probabilidade combase em dados independentes dos dados que serão usados na análise, por exemplo, pode ser geradaa partir da taxonomia vigente do grupo (Holder e Lewis, 2003). Diferentemente da verossimilhança,onde os valores de parâmetro do modelo evolutivo são pré definidos, em um contexto bayesiano, aescolha da melhor topologia implica em calcular a probabilidade posterior para todas as hipóteses,assim como sua integração com todas as possíveis combinações de tamanho de ramos e valores dosparâmetros dos modelos de substituição de nucleotídeos (Huelsenbeck e col., 2001; Holder e Lewis,2003; Felsenstein, 2004). Mesmo com a utilização de buscas heurísticas, é impossível realizar todoesse cálculo analiticamente, portanto a aproximação das probabilidades posteriores das topologias érealizada através da cadeia Markov de Monte Carlo (“Markov chain Monte Carlo”- MCMC)(Felsenstein, 2004).O algorítmo MCMC gera uma cadeia conceitual no espaço de parâmetros (que são astopologias possíveis, com todas as combinações de parâmetros do modelo evolutivo) através de umaseqüência de passos. A partir de uma topologia inicial qualquer do espaço, é gerada uma novatopologia pela perturbação de alguns parâmetros do modelo evolutivo. Essa nova topologia é aceita ounão em comparação com a anterior, de acordo com um teste estatístico descrito por Metropolis e col.(1953). Cada comparação entre topologias corresponde a uma geração da cadeia. Na maior parte dasvezes são aceitas as topologias com maior probabilidade, porém esse procedimento é intercalado pelaescolha de topologias com menor probabilidades em algumas gerações, para favorecer a mudança delocalização no espaço de parâmetros. Repetindo esse processo milhões de vezes, uma grande cadeiade localizações no espaço de parâmetros é criada. Ao atingir regiões de alta probabilidade posterior,dificilmente são aceitos movimentos para regiões de probabilidade mais baixa no espaço deparâmetros. A proporção de vezes que uma topologia é visitada, após a cadeia atingir o equilíbrio, éuma aproximação válida da sua probabilidade posterior. O mesmo vale para cada valor de parâmetrodo modelo evolutivo e para as diferentes combinações de tamanho de ramo (Holder e Lewis, 2003;Felsenstein, 2004).14

Capítulo 1Em geral, mais de uma topologia e valores de parâmetros apresentam probabilidades altas emuito próximas, portanto, é obtida uma amostragem de hipóteses mais prováveis ao invés de umaúnica topologia. As porções congruentes das várias topologias podem ser sumarizadas em umatopologia consenso onde a probabilidade posterior aproximada de cada clado pode ser representada eé uma forma de avaliar seu suporte. Utilizando um número muito grande de gerações, é possívelamostrar as regiões com maior probabilidade do espaço de parâmetros, o que torna o algoritmo bemacurado (Holder e Lewis, 2003). No entanto, não é possível saber se a MCMC atuou tempo suficientepara prover estimativas confiáveis das probabilidades posteriores. Uma estratégia recomendada é ageração independente de várias MCMC, com números altos de gerações para verificar seindependentemente as mesmas hipóteses são recuperadas no equilíbrio de cada uma delas(Shoemaker e col., 1999; Huelsenbeck e col., 2001; Felsenstein, 2004).1.4. Mapeamento de caracteres em uma hipótese filogenética1.4.1. Aspectos geraisPara entender vários aspectos dos processos evolutivos, não basta conhecer os estados doscaracteres dos organismos atuais, mas também precisamos saber como eram os estados nos seusancestrais. Embora o registro fóssil forneça informações a respeito de várias características físicas ecomportamentais dos organismos ancestrais, em diversos casos, os fósseis não estão disponíveis ounão estão suficientemente preservados para obter a informação necessária. A fim de preencher essalacuna, uma alternativa que vem sendo empregada amplamente é a inferência do estado dosorganismos ancestrais, a partir do mapeamento dos estados de caracteres presentes nos organismosatuais em uma hipótese filogenética. Vários erros estão associados a esse tipo de análise, entre eles oda hipótese filogenética e o da reconstrução dos estados ancestrais do caráter. Apesar disso, essaferramenta tem se revelado útil nas mais diversas áreas do conhecimento evolutivo, por exemplo, nareconstrução de receptores de estrógeno ancestrais (Thornton e col., 2003), na inferência decomportamentos ancestrais de abelhas (Schwarz, e col., 2003) e na identificação de padrões dedispersão de grupos (Waters e Roy, 2004). As inferências dos estados nos ancestrais podem serrealizadas pelos métodos de máxima parcimônia ou máxima verossimilhança (Maddison e Maddison,2004).15

1.4.2. Mapeamento de caracteres por máxima parcimôniaCapítulo 1O mapeamento por máxima parcimônia infere os estados ancestrais que minimizam o númerode passos de mudança do caráter na hipótese filogenética a partir da distribuição dos estados nosorganismos atuais. Consideremos um exemplo hipotético, onde um caráter com dois estados, preto (0)e branco (1) apresentam a mesma probabilidade de sofrer mudança entre os dois estados (modificadode Ronquist, 2004). A partir de uma dada hipótese filogenética e distribuição dos estados nos terminais(Figura 1.4), a reconstrução mais parcimoniosa da evolução do caráter sugere dois eventos demudança de estado e também que os ancestrais A e B apresentavam o estado de caráter preto,enquanto os os ancestrais C, D, E e F apresentavam estado ancestral do caráter branco (Figura 1.4a).A análise por máxima parcimônia permite considerar caracteres não-ordenados, ordenados e pesagemdiferencial nas diferentes mudanças de estado (Maddison e Maddison, 2004; Ronquist, 2004).1.4.3. Mapeamento de caracteres por máxima verossimillahançaNo mapeamento por verossimilhança a probabilidade de mudança entre os estados de caráterobservados nos terminais é estimada. A partir dessas probabilidades e dos comprimentos de ramo datopologia, em questão, as probabilidades dos estados nos ancestrais são estimadas. Nesse caso,considerando o mesmo exemplo para explicar o mapeamento por parcimônia e assumindo a mesmaprobabilidade de mudança entre os estados preto e branco (0,5), o estado de caráter dos ancestrais A,B e F não são tidos como certos, mas uma probabilidade é dada para cada estado. Por exemplo, o nóancestral C apresenta maior probabilidade de que o estado tenha sido branco. Uma vantagem domapeamento por verossimilhança em comparação ao mapeamento por pascimônia é que aprobabilidade de estado em um ancestral não depende dos estados estimados em outros ancestrais(Figura 1.4b) (Ronquist, 2004).a) b)Figura 1.4. Mapeamento de caracteres em uma hipótese filogenética. a) por máxima parcimônia; b) pormáxima verossimilhança, tamanhos de ramo proporcionais à régua, p - probabilidade de mudançaentre os estados (modificado de Ronquist, 2004).16

1.5. Datação molecularCapítulo 11.5.1. FundamentosA hipótese do relógio molecular propõe que os genes e seus produtos evoluem sob uma taxaconstante ao longo do tempo e das linhagens (Zuckerkandl e Pauling, 1965). Essa hipótese recebeupopularidade imediata por diversas razões. A principal vantagem que a teoria ofereceu foi apossibilidade de inferir o tempo de divergência entre duas linhagens a partir do número desubstituições entre as suas seqüências de DNA, independentemente de informações fósseis. Issorapidamente se tornou uma aplicação comum, sendo propostos vários relógios moleculares universais,que foram empregados em uma ampla gama de trabalhos buscando entender diversos aspectosevolutivos e biogeográficos (Bermingham e col., 1992; Doolittle e col., 1996; Hedges e col., 1996;Wang e col., 1999). Um dos relógios moleculares gerais mais amplamente utilizados foi a taxa de 2%de substituição de nucleotídeos por milhão de anos para o genoma mitocondrial, proposto inicialmentepara mamíferos (Brown e col., 1979) e estendido para outros grupos de vertebrados, como aves(Shields e Wilson, 1987) e aplicado em diversos estudos (ex., Klicka e Zink, 1997; Ribas e Miyaki,2004).No entanto, apesar do impacto do relógio molecular nos estudos evolutivos, com o acúmulo dedados gerados ficou evidente a existência de uma heterogeneidade muito maior do que se acreditavainicialmente nas taxas de substituição entre diferentes linhagens. Como resultado disso, foi proposta aidéia de relógios moleculares locais. Por essa proposta, se a taxa de substituição for constante entregrupos taxonomicamente próximos, é possível estimar o tempo de divergência dentre os mesmosaplicando um ponto de calibração específico para o grupo (Swofford e col., 1996; Fleischer e col.,1998; Yoder e Yang, 2000).A fim de verificar se um conjunto de táxons está evoluindo sob uma mesma taxa, duasestratégias são amplamente utilizadas: o teste de taxa relativa (“relative rate test”; Takezaki e col.,1995; Margoliash, 1963; Sarich e Wilson, 1967; Graur e Li, 2000) e o teste de razão deverossimilhança (“likelihood ratio test”; Felsenstein, 1988). O teste de taxa relativa comparaestatisticamente o número de substituições entre cada dois táxons com o número de substituições decada uma em relação ao grupo externo mais próximo. Se a diferença no número de substituições emcada linhagem for estatisticamente diferente ao nível de significância de 5% comparado ao grupoexterno, o teste considera que as linhagens não estão evoluindo sob uma taxa constante (Takezaki ecol., 1995). Pelo teste de razão de verossimilhança, são comparadas por c 2 as probabilidades datopologia estimada sem a hipótese do relógio molecular e da mesma topologia forçando os17

Capítulo 1comprimentos dos tamanhos de ramo a apresentarem taxa constante (topologia linearizada). Paraesse teste o número de graus de liberdade é definido pelo número de táxons menos dois. Caso astopologias apresentem probabilidades significantemente diferentes, a hipótese de taxa constante não éaceita (Felsenstein, 1988; Posada e Crandall, 1998).Quando a heterogeneidade de taxas de substituição entre os táxons é identificada, uma dasestratégias utilizadas é a exclusão dos táxons ou dos genes que apresentam desvio significativo emrelação aos demais da análise. A divergência entre os demais pode ser calculada através dostamanhos de ramo da topologia linearizada (Takezaki e col., 1995). No entanto, essa estratégia faz usoineficiente da informação obtida pelas seqüências de DNA porque em alguns casos, muitos táxonsdevem ser excluídos antes de se estimar as datas de divergência (Arbobast e col., 2002). Além disso,em alguns casos, os testes de identificação de variação de taxa podem ser ineficientes, como porexemplo, quando a seqüência é curta ou os genes apresentam baixas taxas de substituição. Falha nadetecção de variação de taxas pode levar a um erro sistemático nas estimativas de tempo dedivergência, já que pode superestimar algumas datas (Bromham e Penny, 2003). A fim de evitar essesproblemas, métodos mais recentes de datação molecular, como o “non-parametric rate smoothing”(nprs; Sanderson, 1997), “penalized likelihood” (PL; Sanderson, 2002) e o método bayesiano (Thorne ecol., 1998, Kishino e col., 2001) acomodam a variação nas taxas de substituição de nucleotídeos entreas linhagens.1.5.2. Métodos NPRS e PLO princípio básico do método NPRS é assumir taxas evolutivas locais para cada nó da topologiae minimizar a variação entre essas taxas ao longo da topologia pela aplicação de uma penalidade nãoparamétrica.Essa penalidade de mudança abrupta (“roughness penality”) é determinada peloquadrado mínimo da diferença entre as taxas dos ramos ancestrais e descendentes e a variância nastaxas entre os ramos descendentes e a raíz (Sanderson, 1997).O método PL utiliza o mesmo principio básico que o NPRS, mas utiliza uma aproximação semiparamétrica para encontrar um valor ótimo de um parâmetro de suavização (“smoothing parameter”),que pode variar entre dois extremos, para a penalidade de mudança abrupta. Em um extremo, existe omodelo do relógio molecular, onde as taxas não variam (para o qual o parâmetro de suavização tendeao infinito), e no outro, existe o modelo saturado, onde cada ramo apresenta uma taxa independente(para o qual o parâmetro de suavização tende a zero). O teste de validação cruzada (“crossvalidation”)é empregado para encontrar o valor ideal do parâmetro de suavização para o conjunto de18

Capítulo 1dados. Por esse método, ramos terminais são independentemente excluídos da topologia. O tamanhode ramo desse terminal é então estimado com base na taxa dos demais ramos e na penalidade demudança abrupta, considerando diversos valores do parâmetro de suavização. Os valores estimadossão então comparados com os valores observados. Esse processo é repetido até que o valor escolhidopara o parâmetro de suavização é aquele que melhor aproxima os valores estimados dos tamanhos deramo aos valores observados.O PL se revelou superior aos métodos que assumem linearização e ao NPRS, porque o teste devalidação cruzada permite avaliar se para um conjunto de dados é melhor assumir um modelo onde astaxas são constantes ao longo das linhagens (relógio molecular), ou mais variáveis, ou ainda qualquercategoria intermediária entre esses dois extremos (Sanderson, 2002).1.5.3. Método bayesianoO método bayesiano de datação usa um modelo probabilístico para descrever a mudança dastaxas de evolução ao longo dos ramos e utiliza uma cadeia Markov de Monte Carlo para aproximar asprobabilidades posteriores das taxas e dos tempos (Thorne e col., 1998; Kishino e col., 2001). Essemétodo, assim como o NPRS e o PL também assume que cada ramo apresenta uma taxaindependente, mas constante ao longo do ramo e existe uma autocorrelação entre as taxas dosdiferentes ramos ao longo do tempo evolutivo. O método parte de uma topologia pré definida e ointervalo de tempo para pelo menos um dos nós, mas ao contrário dos dois outros métodos (NPRS ePL), não assume os valores fixos de tamanho de ramo. Os parâmetros para o modelo evolutivo podemser estimados para cada partição de dados a partir da topologia e das seqüências. Com base nomodelo evolutivo, na topologia e na matriz de dados, são estimados os tamanhos de ramo e seusrespectivos valores de variância e covariância. Como o cálculo analítico das taxas evolutivas para cadaramo leva em conta todos os valores dos parâmetros do modelo evolutivo, a variação dos tamanhos deramo e a própria incerteza dos tempos de divergência levaria muito tempo computacional, essesvalores são aproximados pela MCMC. Para essa MCMC são definidos como parâmetros iniciais a taxade evolução molecular da raiz do grupo interno, a média da data da raiz do grupo interno e seusrespectivos desvios padrões. O resultado final aproxima as estimativas de tempo de divergência daslinhagens e fornece os valores do intervalo de credibilidade de cada nó (Thorne e col., 1998; Kishino ecol., 2001; Thorne e Kishino, 2002).19

1.5.4. Pontos de calibraçãoCapítulo 1Além da heterogeneidade de taxa evolutiva ao longo das linhagens, outra questão amplamentedebatida no emprego da datação molecular envolve a escolha de pontos de calibração adequados.Com a adoção de relógios moleculares locais, devido à evidente variabilidade nas taxas evolutivas emdiferentes linhagens, a utilização de uma taxa geral se revelou inadequada (Lovette, 2004). Portanto,para obter estimativas de tempo de divergência mais confiáveis, pontos de calibração específicosdevem ser adotados para cada linhagem (Bromham e Penny, 2003).Um dos métodos mais confiáveis de calibração é a utilização de evidências fósseis quesustentem limites para a diversificação entre duas ou mais linhagens incluídas na topologia que sepretende utilizar para estimar os tempos de divergência. No entanto, mesmo quando há disponibilidadedo fóssil em questão, três principais fontes de erros devem ser consideradas nesse caso: a) erro nainferência filogenética do grupo em questão; b) erro na identificação e posicionamento filogenético dofóssil em questão; c) erro na identificação da data do fóssil. Em aves, o registro fóssil é muitoincompleto devido em grande parte à própria natureza dos ossos pneumáticos, que dificultam afossilização (Arbobast e col., 2002; Bromham e Penny, 2003; Lovette, 2004).Uma outra maneira de escolher pontos de calibração é a utilização de eventos geológicosassociados à diversificação de um dos grupos em questão. Por exemplo, a origem de ilhas oceânicascujas datas de emergência são conhecidas (Fleischer e col., 1998). Porém, da mesma forma, existemerros que podem estar associados a essa calibração, como por exemplo: a) a precisão do intervalo detempo para a formação da ilha; b) tempo de colonização das populações após a formação de cadailha; c) possibilidade de migração entre as ilhas no caso de aves com grande capacidade de dispersão;d) erro na inferência filogenética do grupo em questão (Bromham e Penny, 2003).Por causa dos erros que podem estar associados a um particular ponto de calibração e oaumento do erro da própria estimativa de tempo a medida em que os nós distanciam-se dessa regiãoda topologia, o ideal é usar uma abordagem múltipla, onde vários pontos de calibração sãoempregados (ex. van Tuinen e Hedges, 2001).20

1.6. ObjetivosCapítulo 1A presente tese tem por objetivos:• Inferir as relações filogenéticas entre os gêneros da tribo Arini por meio de dadosmoleculares a partir de um grande número de seqüências dos genomas mitocondrial enuclear.• Estimar o tempo de divergência entre as linhagens e comparar essas estimativas comeventos históricos paleogeográficos descritos para a região neotropical que possam terinfluenciado a diversificação dos psitacídeos neotropicais.• Determinar a organização dos genes mitocondriais ao redor da região controladora atravésdo sequenciamento de porções entre o final do gene citocromo b e o início do DNAribossomal 12S de representantes das linhagens de psitacídeos neotropicais. A análisedessas seqüências em conjunto com a filogenia e a datação da divergência entre aslinhagens visa compreender melhor a evolução do genoma mitocondrial no grupo.21

1.7. ReferênciasCapítulo 1Arbobast, B.S, Edwards, S.V., Wakeley, J., Beerli, P. ,Slowinski, J.B., 2002. Estimating divergencetimes from molecular data on phylogenetic and population genetic timescales. Annu. Rev. Ecol.Syst. 33, 707–740.Barrowclough, G.F., Groth, J.G., Mertz, L.A., 2004. Phylogenetic relationships among parrots. OneHundred and Twenty-Second Stated Meeting of the American Ornithologist’s Union. 16 – 21August, Laval, Quebec.Beissinger, S.R., 2000. Ecological mechanisms of extinction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11688-11689.Bermingham, E., Rohwer, S., Freeman, S., Wood, C., 1992. Vicariance biogeography in thePleistocene and speciation in North American wood warblers: a test of Mengel’s model. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 6624–28.Boetticher, H.von, 1943. Gedanken “uber die systematic Stellung einiger Papagaien. Zool. Anz. 143,191-200.Boetticher, H.von, 1959. Papagaien. Wittenberg Lutherstadt, A. Ziemsen.Boles, W.E., 1993. A new cockatoo (Psittaciformes: Cacatuidae) from the Tertiary of Rivers Leigh,northwestern Queensland, and an evaluation of rostral characters in the systematics of parrots.Ibis 135, 8-18.Boles, W.E., 1998. A budgerigar Melopsittacus undulatus from the Pliocene of Rivers Leigh, northwesternQueensland. EMU 98, 32-35.Brereton, J.L., 1963. Evolution within the Psittaciformes. Proc. Internatl. Ornitol. Congr. 13, 499-517.Bromham, L., Penny, D., 2003. The modern molecular clock. Nature 4, 216-224.Brown, W.M., George, M.J., Wilson, A.C., 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 361, 119-134.Chauviré, C.M., 1992. Une nouvelle famille de Perroquetes (Aves, Psittaciformes) dans l`Eocenesupérieour des phosphorites du Qherci, France. Geobios 14, 169-177.Clarke, J.A., Tambussi, C.P., Noriega, J.I., Erickson, G.M, Ketcham, R.A., 2005. Definitive fossilevidence for the exant avian radiation in the Cretaceous. Nature 433, 305-308.Collar, N.J., 1997. Family Psittacidae (Parrots). In: del Hoyo, J., Elliot, A.E., Sargatal, J.(Eds.)Handbook of the Birds of the World, vol. 4. Sandgrouse to Coockos. Lynx Edicións, Barcelona.Pp. 679.22

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Capítulo 2Relações filogenéticas e biogeografia histórica dospsitacídeos neotropicais (tribo Arini) com base emseqüências de DNA mitocondrial e nuclear

2.1. IntroduçãoCapítulo 2Os psitacídeos neotropicais formam o grupo de espécies mais numeroso da ordemPsittaciformes (150 das 330 espécies reconhecidas) e inclui 30 gêneros (Collar, 1997, Rowley, 1997).Apresentam uma grande variação de tamanho, preferência de hábitat, distribuição geográfica ecomportamento (Forshaw, 1989). A sistemática do grupo tem sido discutida há muito tempo. Ossistematas mais antigos, com base em morfologia externa e anatomia (Salvadori, 1891; Boetticher,1943, 1959; Verheyen, 1956), e comportamento (Brereton, 1963) distribuíam os gêneros neotropicaisem dois grupos de composição variável, em alguns casos incluindo táxons de outras regiõesgeográficas. Verheyen (1956) agrupou exclusivamente táxons neotropicais nas famílias Amazoninae eArinae e sugeriu que esses grupos compartilham características morfológicas (presença de quatrovértebras dorsais, uma única carótida dorsal, entre outras) que os distinguem dos psitacídeos dasdemais regiões geográficas, mas não sugeriu uma categoria para agrupá-los. Em uma revisãoabrangente da sistemática da ordem Psitaciformes, Smith (1975) agrupou todos os táxons neotropicaisna tribo Arini (família Psittacidae) com base em dois caracteres exclusivos (eclosão dos filhotes comcanal auditivo imperfurado e postura copulatória em uma perna) e considerou artificial osagrupamentos internos até então propostos na tribo. Na falta de estudos mais abrangentes, essaproposta foi aceita em todas as classificações posteriores (por exemplo, Forshaw, 1989; Collar, 1997).Atualmente, o monofiletismo da tribo Arini vem sendo corroborado por estudos de filogenia molecularincluindo diversos gêneros representantes da ordem (Barrowclough e col., 2004; de Kloet e de Kloet,2005).Em uma análise de 1.771 pares de bases (pb) de genes mitocondriais realizados comrepresentantes de nove gêneros da tribo Arini dois grupos monofiléticos foram recuperados e referidospelos autores como psitacídeos de cauda longa e psitacídeos de cauda curta (Miyaki e col. 1998), oque estaria de acordo com uma chave de identificação proposta por Sick (1997). Exceto para omonofiletismo29

Capítulo 22005). Além disso, alguns estudos também apontaram ausência de monofiletismo nos gênerosneotropicais Aratinga, Amazona e Pionopsitta (Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello eAmato, 2004; Ribas e col., 2005).Apesar de ser muito questionado, dados moleculares podem ser usados para estimar datas dedivergência entre os táxons (Arbobast e col., 2002). Tendo tais estimativas, pode-se tentar associá-lasa eventos paleogeoclimáticos registrados no período de diversificação das linhagens. Em relação aospsitacídeos, a data estimada de separação entre o periquito australiano (Melopsittacus undulatus) ealguns táxons neotropicais por volta de 76 milhões de anos atrás (ma; Miyaki e col., 1998) estaria deacordo com a hipótese de que a separação dos continentes teve um papel importante na diversificaçãodesses grupos. Além disso, a divergência entre os gêneros de psitacídeos neotropicais foi estimadaentre o Eoceno-Oligoceno e durante o Mioceno (16-27 ma) e poderia estar associada a mudançasambientais em consequência de mudanças no nível do mar, orogenia dos Andes e expansão deambientes de floresta e de áreas secas (Miyaki e col., 1998; Tavares e col., 2004). Já o intervalo dedivergências entre espécies do mesmo gênero de psitacídeos foi estimado entre 0,5 e 1,3 ma(Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Ribas e col., 2005).No presente trabalho foram estudadas as relações filogenéticas da maioria dos gêneros datribo Arini, incluindo representantes de diferentes linhagens de gêneros não-monofiléticos. Foi utilizadoum grande conjunto de seqüências de DNA nuclear e mitocondrial totalizando 6.461 pb. A informaçãofilogenética de alguns caracteres morfológicos, comportamentais e genético também foi analisada combase na filogenia obtida. Além disso, o tempo de divergência entre as linhagens de psitacídeosneotropicais foi estimado por métodos que levam em conta a taxa de variação nas substituições denucleotídeos entre as linhagens e hipóteses biogeográficas sobre a diversificação do grupo forampropostas com base nesses resultados.2.2. Material e Métodos2.2.1. AmostragemForam obtidas amostras de 29 espécies representantes de 25 dos 30 gêneros da tribo Arini(Tabela 2.1). Como estudos filogenéticos anteriores sugerem a ausência de monofiletismo dos gênerosAratinga, Amazona e Pionopsitta (Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004;Ribas e col., 2005), foram amostrados dois ou três táxons de cada um desses gêneros, representandoas diferentes linhagens apontadas por esses trabalhos.30

Capítulo 2Tabela 2.1. Táxons amostrados. Razão entre comprimento da asa e comprimento da cauda,espécimen analisado e estados da forma da cauda, narinas e anel perioftálmico.Espécies Amostra a asa/cauda bVoucherMZUSP cFormaAnelNarinas fcauda d perioftálmico gAmazona farinosa 3683 1,9 6731 A E NAmazona xanthops 1876 2,6 4330 A E NAnodorhynchus hyacinthinus 5281 0,8 32290 C C NAra ararauna 13 0,8 13992 C E NAratinga aureaAratinga leucophthalmusAratinga solstitialis346209020421,21,21,114893106536490Bolborhynchus lineola 4393 1,9 13080 C E CBrotogeris chiriri 5486 1,3 74601 C E NCacatua goffini 4582 - - - - -Cyanoliseus patagonus 4967 1,0 2272 C E CCyanopsitta spixii 409 0,8 76154 C E NDeroptyus accipitrinus 395 1,4 44059 A E NDiopsittaca nobilis 973 1,2 15897 C E NEnicognathus leptorhynchus 5173 1,2 21754 C C CForpus crassirostris 501 2,1 39569 A E CGraydidascalus brachyurus 1624 2,9 22573 A E CGuarouba guarouba 69 1,4 43982 C E NMelopsittacus undulatus 4999 - - - - -Myiopsitta monachus 2821 1,1 2277 C C CNandayus nenday 143 1,2 13083 C E NNanopsittaca dachilleae 5495 2,3 - A e E e C eOrthopsittaca manilata 1852 1,1 38318 C E NPionites leucogaster 2377 2,1 12226 C E NPionopsitta pileataPionopsitta barrabandi34673896932,12,4694413501Pionus maximiliani 1219 2,2 14015 A E NPrimolius auricollis 1742 1,1 44077 C E NPyrrhura leucotis 3921 1,0 34495 C E NRynchopsitta pachyryncha 5237 1,6 - C e C e N eTriclaria malachitacea 415 1,4 28102 A E NaRegistro na coleção do Laboratório de Genética e Evolução Molecular de Aves (LGEMA),Universidade de São Paulo, exceto 389693 registrado no Field Museum of Natural History; b Razãoobtida a partir de espécimens machos, (Forshaw, 1989); c Museu de Zoologia da Universidade de SãoPaulo; d A- arredondada, C – acuneada; e Dados obtidos de literatura (Salvadori, 1890; Forshaw, 1989;Collar, 1997); f E - expostas, C- cobertas por penas; g N- nu e evidente, C- coberto por penas.CCCAAEEEEENNNNN31

Capítulo 2Para compor o grupo externo mais próximo foram selecionados os psitacídeos australianosMelopsittacus undulatus (tribo Platycercini) e Cacatua goffini (família Cacatuidae) e o psitacídeo daNova Zelândia Strigos habroptilus (tribo Strigopini, família Psittacidae, NC_005931; Harrison e col.,2004). Falco peregrinus (NC_000878; Mindell e col., 1998; AY461399, Griffiths e col., 2004), Aburriaaburri (AF165466, AY143680, AY140740, AY140768, AY165454, AF165442; Pereira e col., 2002) eGallus gallus (X52392, Desjardins e Morais, 1990; AF143730, Groth e Barrowclough, 1999) foramselecionados como grupos externos mais distantes para enraizar a topologia. A classificação dospsitacídeos adotada nesse trabalho segue Collar (1997), exceto por Propyrrhura, para o qual adotamosPrimolius de acordo com Penhallurick (2001).2.2.2. Extração de DNA e sequenciamentoO DNA foi extraído a partir de tecido sangüíneo em solução contendo 0,1% de SDS, Tris-HCl100mM (pH 8.0), EDTA 10 mM e 10 mg/mL de proteinase K mantido a 55 o C por aproximadamente 4horas. O DNA foi purificado por procedimento padrão com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (Bruforde col., 1992). A amplificação dos segmentos de DNA foi realizada por “Polymerase Chain Reaction”(PCR) em 25 µL de reação com solução tampão 1x (Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl 22,5mM, gelatina a 0,01%, 160 µg/ mL de BSA), 2 µM de cada dNTP, 1µM de cada “primer”, 1 U de Taqpolimerase (Pharmacia) e 25-50 ng de DNA. As condições da reação de PCR foram: desnaturaçãoinicial a 95ºC por 5 minutos (min.), seguido de 30 ciclos de 95 o C por 60 segundos (seg.), 50 o C por 25seg., 72 o C por 80 seg., e uma extensão final de 72 o C por 7 min. Os segmentos amplificados forampurificados por corte de banda do gel de agarose e centrifugação através de uma ponteira com filtro.As seqüências foram obtidas nos seqüenciadores automáticos Li-Cor 4200 bi-direcional e ABI3100 deacordo com protocolo sugerido pelos fabricantes. Foram obtidas as seqüências de DNA do genenuclear RAG-1, e dos genes mitocondriais citocromo b, NADH2, ATPase 6, ATPase 8, COIII, DNAr12S e DNAr 16S. Os “primers” usados foram R1 (5’- GACAAACATCATCTCAGGAAGAAGAT -3’), R11(5’- GGACCAGTAGATGATGAAACTCCT -3’), R13 (5’- TCTGAATGGAAATTCAAGATGTT -3’), R14(5’- TTCCTGTGGATACTCCAGCA -3’), R17 (5’- CCCTCCTGCTGGTATCCTTGCTT -3’), R18 (5’-GATGCTGCCTCGGTCGGCCACCTTT -3’), R19 (5’- GTCACTGGGAGGCAGATCTTCCA -3’), R21 (5’-GGATCTTTGAGGAAGTAAAGCCCAA -3’), R20 (5’- CCATCTATAATTCCCACTTCTGT -3’), R22 (5’-GAATGTTCTCAGGATGCCTCCCAT -3’), R24 (5’- GCCTCTACTGTCTCTTTGGACAT -3’) e R2B (5’-GAGGTATATAGCCAGTGATGCTT -3’) para o RAG-1 (Groth e Barrowclough, 1999); b1 (5’- CCATCCACCATCTCAGGATGATGAAA - 3’), b52 (5’- GNAAATCYCACCCNCTWCTHAAAAT -3’) e b6 (5’- GTC32

Capítulo 2TTCAGTTTTGGTTTACAAGAC -3’) para o citocromo b (Kocher e col., 1989); MetL (5’- AAGCTATCGGGCCCATACCCG –3’), ND2H (5’- CCTTGAAGCACTTCTGGGAATCAGA -3’), ND2-54H (5’- GGGGTGGTGAGATTTTGCGA- 3’) e ASNH (5’- GATCRAGGCCCATCTGTCTAG -3’) para o NADH2; LysL(5’- CAGCACTAGCCTTTTAAGCT -3’), COIIIRH (5’- ATTATTCCGTATCGNAGNCCYTTTTG -3’), A5(5’- TAGGAGTGTGCTTGGTGTGCCATT- 3’) e ATP6L (5’- AAAYATYTAATGGCACACCAAGC- 3’)para os genes ATPase 6, ATPase 8 e COIII; L1537 (5’- AATCTTGTGCCAGCCACCGCGG -3’) e12Send (5’- GTGCACCTTCCGGTACACTTACC -3’) para o DNAr 12S; 16Sa (5’- AAGCCWANCGAGCYGGGTGATAGCTGG -3’), 16Sb (5’- CATAGATAGAAACCGACCTGG -3’), 16Sc (5’- TTCTTCAAGGTCGCCCCAACC -3’) e 16Se (5’- GCACGGTTAGGATACCGCGGCCG -3’) para o RNAr 16S (OliverHaddrath, comunicação pessoal). As seqüências de DNA foram depositadas no GenBank com osnúmeros de acesso: DQ143281-DQ143297 para citocromo b; DQ143298-DQ143324 para NADH2;DQ143250-DQ143280 para os genes ATPase 6, ATPase 8 e COIII; DQ143208-DQ143228 para 12SrDNA; e DQ143229-DQ143249 para o 16S rDNA. Foram obtidas do GenBank as seqüências decitocromo b para Diopsittaca nobilis (AF370769, Tavares e col., 2004), Pionopsitta barrabandi,Pionopsitta pileata e Triclaria malachitacea (AY669424, AY669437 e AY669439; Ribas e col., 2005) ede NADH2 para Amazona farinosa (AY194461; Eberhard e Bermingham, 2004), Pionopsittabarrabandi, Pionopsitta pileata e Triclaria malachitacea (AY669468, AY669481 e AY669486; Ribas ecol., 2005).2.2.3. Análise das seqüências de DNAAs ambigüidades nas fitas complementares de DNA foram verificadas com o Sequencher 4.1.2(GeneCodes Corp., Ann Arbor, Michigan). O alinhamento dos genes foi verificado visualmente noMacClade 4.0 (Maddison e Maddison, 2000). As lacunas de alinhamento, as regiões com alinhamentoambíguo e as regiões de sobreposição entre as ATPases 8 e 6, e a ATPase 6 e o COIII foramexcluídas da matriz de dados. A composição de bases, as taxas de transição e transversão e adistância genética entre seqüências de nucleotídeos foram calculadas no PAUP* 4.0b10 (Swofford,2002). O grau de saturação das seqüências foi avaliado para cada gene pela relação entre o númerode transições e o número de transversões pelas distâncias par a par corrigidas entre os táxons.Diferenças de composição de base entre táxons não são corrigidos pela maior parte dosmétodos de reconstrução filogenética e topologias inadequadas podem ser escolhidas quando asdiferenças de composição são expressivas (Penny e col., 1990; Lockhart e col., 1994; Foster e Hickey,1999; Chang e Champbell, 2000; Haddrath e Baker, 2001; Paton e col., 2002). Por isso, os sítios33

Capítulo 2variáveis de cada gene foram avaliados quanto ao desvio de composição de bases usando oTreepuzzle 5.0 (Schmidt e col., 2002). Nessa análise, os sítios invariáveis foram excluídos já quepodem mascarar a detecção de desvio composicional entre os táxons (Foster e Hickey, 1990). Apressão de mutação simétrica direcional atuando nos genes que codificam para proteínas foi estimadacom o programa DMP 2.0 (Jermin e col., 1996).2.2.4. Análises filogenéticasO modelo mais adequado para cada partição de dados foi selecionado pelo teste de razão deverossimilhança (“hierarchical likelihood ratio tests”- LRT) implementado no Modeltest 3.6 (Posada eCrandall, 1998). As análises bayesianas foram realizadas no MrBayes 3.0 (Ronquist e Huelsenbeck,2003), utilizando a amostragem pela “Markov Chain Monte Carlo” (MCMC), inicialmente para cadagene em separado, para a partição nuclear, para a partição mitocondrial e para a matriz totalconcatenada, para verificar se as diferentes partições suportam resultados incongruentes e paraverificar se a adoção de modelos independentes para cada partição é mais adequada. A análisebayesiana final foi realizada para a matriz combinada dos genes, assumindo diferentes modelos erespectivos parâmetros para cada gene considerado. Foram executadas quatro buscas independentes,cada uma com 2 milhões de gerações, uma cadeia fria e quatro quentes, uma topologia amostrada acada 1000 gerações e o descarte (“burnin”) determinado pela convergência nos valores deverossimilhança das topologias. As probabilidades posteriores dos ramos foram computadas paratodas as análises bayesianas descartando-se as topologias amostradas antes da convergência dosvalores de verossimilhança na cadeia de Marcov. O modelo evolutivo e seus respectivos parâmetrosestimados por LRT no Modeltest 3.6 (Posada e Crandall, 1998) foram usados como estimativas iniciaisna busca por máxima verossimilhança (MV) realizada no PAUP* 4.0 b10 (Swofford, 2002), por buscaheurística a partir de 5 árvores iniciais geradas por adição aleatória de táxons (“stepwise addition”) ealgoritmo “tree bisection and reconnection” (TBR) para gerar diferentes topologias. O suporte dos nósda busca por MV foi estimado por “bootstrap” não paramétrico (Effron, 1979; Felsenstein, 1985) com100 réplicas, cada uma iniciada por uma topologia gerada por adição aleatória de táxons no programaPAUP* 4.0b10 (Swofford, 2002), usando o mesmo modelo e valores de parâmetros assumidos nabusca por MV.Adicionalmente, foi realizada uma busca por MV utilizando um modelo não-homogêneo desubstituição de nucleotídeos no programa NHML 3.0 (Galtier e Gouy, 1998), utilizando a correção parataxa de substituição entre os sítios HKY+G (Hasegawa e col., 1985). Devido ao grande número de34

Capítulo 2terminais (n=32), o tempo computacional para realização de uma busca mais abrangente seria muitogrande, portanto os nós que apresentaram valores de “bootstrap” superiores a 90% na busca por MVforam fixados.2.2.5. Comparação das diferentes topologiasPara comparar as topologias obtidas pelos diferentes métodos foi utilizado o testeaproximadamente não enviesado (AU, “approximately unbiased”; Shimodaira, 2002) implementado noprograma CONSEL (Shimodaira e Hasegawa, 2001). O teste AU utiliza uma técnica de “bootstrap”multi-escalonado, na qual vários conjuntos de réplicas da matriz de dados inicial são gerados, podendoter alteração no tamanho da matriz. O número de vezes que a hipótese é suportada pelas réplicas écalculado para cada conjunto de dados para obter valores de “bootstrap” a partir das matrizes detamanho variável (Shimodaira, 2002).2.2.6. Mapeamento de caracteres morfológicos, comportamentais e genético na filogeniamolecularOito caracteres que foram utilizados para agrupar ou diagnosticar gêneros de psitacídeosneotropicais em classificações (Salvadori, 1891; Brereton e Immelmann, 1961; Forshaw, 1989), queforam considerados em estudos sistemáticos (Smith, 1975), ou que foram apontados como exclusivosde um grupo (Miyaki e col., 1997) foram mapeados na topologia consenso da análise bayesiana noprograma Mesquite 1.05 (Maddison e Maddison, 2004), para avaliar a informação filogenética dosmesmos. O mapeamento foi realizado por verossimilhança assumindo a mesma probabilidade demudança entre os estados. Os caracteres e seus respectivos estados são: 1) o tamanho da cauda(Salvadori, 1891); como a definição original desse estado não é clara e envolvia a forma da caudatambém, separamos o tamanho e a forma da cauda e redefinimos os estados do tamanho da seguinteforma: longa (razão entre comprimento da asa e comprimento da cauda menor que 1,7) ou curta(razão entre comprimento da asa e comprimento da cauda maior do que 1,8); 2) forma da cauda(Salvadori, 1891, redefinido como caracter independente do tamanho da cauda no presente trabalho):acuneada (penas gradualmente maiores das bordas em direção ao centro), ou arredondada (todas aspenas com aproximadamente o mesmo tamanho) (Salvadori, 1891); 3) dimorfismo sexual aparente:presente ou ausente (Smith, 1975); 4) íris bi-colorida: presente ou ausente (Smith, 1975); 5) coçar acabeça com o pé: colocando a perna diretamente para frente por baixo da asa, ou passando o péindiretamente sobre a asa (Brereton e Immelmann, 1961); 6) narinas: expostas ou não expostas35

Capítulo 2(Salvadori, 1891); 7) anel perioftálmico: nu e evidente, ou coberto por penas (Forshaw, 1989); 8)minissatélites ligados ao cromossomo W: presente ou ausente (Miyaki e col., 1997). A inferência dosestados ancestrais não foi realizada para o caráter 8, já que o mesmo não foi estudado para algunsdos táxons considerados na presente hipótese filogenética. Os comprimentos da cauda e da asa foramobtidos de Forshaw (1989). Os estados para forma da cauda, narinas e anel perioftálmico foramobtidos da literatura (Salvadori, 1891; Forshaw, 1989) e confirmados em peles de museu (Tabela 2.1).2.2.7. Tempos de divergênciaA hipótese de existência de relógio molecular entre as linhagens de psitacídeos neotropicaisfoi testada através do teste de razão de verossimilhança (LRT, “likelihood ratio test”; Posada eCrandall, 1998) comparando os valores de verossimilhança, da topologia assumindo e não assumindoo relógio molecular (valores obtidos no PAUP* 4.0b10; Swofford, 2002). Para verificar se as diferençasnos valores de MV nas diferentes situações é significativa, foi utilizado o teste c 2 , onde o número degrau de liberdade foi definido como o número de táxons menos 2. As estimativas dos tempos dedivergência foram obtidas pelos métodos “penalized likelihood” (PL; Sanderson, 2002) e bayesiano(Thorne e col., 1998; Kishino e col., 2001), que não pressupõem a existência de taxa de evoluçãoconstante ao longo das linhagens. O PL está implementado no programa r8s 1.5 (Sanderson, 2003) eassume um modelo paramétrico que permite a existência de diferentes taxas de substituição em cadaramo e uma penalidade não paramétrica (“roughness penality”) que aumenta o custo da taxa demudança se as taxas variarem de forma abrupta entre os ramos (Sanderson, 2002). Antes de estimaros tempos de divergência, uma análise de validação cruzada (Sanderson, 2002) foi realizada no r8s1.5 (Sanderson, 2003) para determinar o melhor valor do parâmetro de suavização (“smoothing”) paraa penalidade. Os tamanhos de ramo usados foram da topologia obtida pela análise bayesiana,computada apenas com os genes mitocondriais, pois a seqüência de RAG-1 para Strigops não estádisponível. A estimativa de tempo de divergência por inferência bayesiana foi realizada no multidivtime(pacote multidistribute, http:// statgen.ncsu.edu/thorne/multidivtime.html), que usa um modeloprobabilístico para descrever as mudanças de taxa de evolução ao longo do tempo e usa aaproximação MCMC para obter as distribuições posteriores das taxas e tempos (Thorne e col., 1998;Kishino e col., 2001). Esse método permite que cada gene seja analisado com um modelo evolutivoindependente (Thorne e Kishino, 2002). Inicialmente o programa baseml no pacote PAML 2.0 (Yang,1997) foi usado para obter as taxas de transição/ transversão, valores dos parâmetros de substituiçãopelo modelo evolutivo HKY85g (Hasegawa e col., 1985), e valores do parâmetro a para distribuição36

Capítulo 2gama de cada gene. Esses dados foram convertidos pelo paml2modelinf do pacote multidistribute paraum formato reconhecido pelo estbranches do pacote multidistribute, que estima os tamanhos de ramoe seus respectivos valores de variância-covariância. Análises de MCMC foram realizadas nomultidivtime para aproximar os valores de distribuição posterior das taxas de substituição e tempos dedivergência. Os parâmetros iniciais da distribuição a priori foram 9,0 e 0,2 para rttm (média a priori dadata da raiz do grupo interno) e rttmsd (desvio padrão da rttm), respectivamente e 0,094 para rtrate(média a priori da distribuição da taxa de evolução molecular na raiz do grupo interno, aqui estimadapelo valor da mediana dos tamanhos de ramo de cada terminal até a raiz sobre o valor da rttm) ertratesd (desvio padrão da rtrate). Um grande valor de desvio padrão (rttmsd e rtrates) foi escolhidopara permitir que os genes apresentem uma grande variação nas taxas ao longo do tempo, já que ainformação das taxas a priori é desconhecida (Thorne e Kishino, 2002). Várias simulações foramrealizadas para verificar a convergência do algoritmo MCMC comparando os valores de distribuiçãoposterior dos tempos de divergência, tamanho de ramo e proporção de mudanças das diferentescorridas. Esse método aceita amostragem incompleta dos táxons para os diferentes genes, por issoRAG-1 foi incluído na análise mesmo sem a seqüência de Strigops habroptilus.Diversos estudos independentes de datação molecular em linhagens de aves apontam aorigem de várias ordens de Neoaves37

Capítulo 22.3. Resultados2.3.1. Análise das seqüênciasAs amplificações para cada gene resultaram em segmentos de bandas únicas em gel deagarose, de tamanhos entre 800 a 1.300 pares de bases (pb), que são maiores que a maioria daspossíveis cópias de genes mitocondriais incorporados no núcleo encontrados no genoma de Gallusgallus (Pereira e Baker, 2004). Além disso, a análise das seqüências codificadoras de proteínas nãoindicou códons de parada de leitura dentro dos genes, ou mutações que alterassem o código de leiturados aminoácidos. Dada a baixa ocorrência de NUMTs em aves, é improvável que pseudogenes foramamplificados nesse estudo.As seqüências concatenadas totalizaram 6.416 pb de comprimento, sendo 2.703 pb de DNAnuclear e 3.713 pb de DNA mitocondrial (DNAmt). Substituições acumularam de modo proporcional àsdistâncias corrigidas nas matrizes dos genes RAG-1, DNAr 12S e DNAr 16S. Ocorre saturação emgenes mitocondriais nas comparações entre psitacídeos e grupos externos de outras ordens de aves enas transições dos genes codificadores mitocondriais entre os psitacídeos.A média entre as distâncias par a par não corrigidas (distância-p) calculadas separadamentepara cada região, sugere que RAG-1 apresenta a taxa de evolução mais lenta (distância-p entrepsitacídeos neotropicais entre 0,04-4%), o que é esperado para um éxon de um gene nuclearcodificador de proteína. Entre os genes mitocondriais, os genes que apresentaram taxa de evoluçãomais lenta foram os DNAr 12S (457 pb) e DNAr 16S (518 pb), nos quais a variação foi em torno de 1,1a 9,2%; seguido dos genes codificadores de proteínas citocromo oxidase III (191 pb) e citocromo b(888 pb), os quais variaram entre 3,1 a 16,3%; e NADH 2 (892 pb), com variação entre 5 a 20%. Osgenes cujas taxas de substituição foram mais rápidas dentre os estudados são a ATPase 6 (673 pb) ea ATPase 8 (92 pb), cuja variação foi de 4,3 a 26,1%. As taxas de transição e transversão para ostáxons do grupo interno foram 3,15, 4,33 e 4,26 para o RAG-1, os genes mitocondriais e ambosconcatenados, respectivamente.A composição de bases de RAG-1 de psitacídeos neotropicais foi: A=31,6-31,9; C=19,7-20,2;T=24,4-24,9 e G=23,5-23,8. Para a matriz de genes mitocondriais combinados a composição de basesfoi: A=29,8-32,5; C=31,2-34,6; T=21,2-24,5 e G=12,3-14,2. Esses valores estão de acordo com asporcentagens encontradas para genes nucleares e mitocondriais de outras aves.Dentre os genes mitocondriais codificadores de proteínas foi detectado um desvio significativo(p < 0,05) na composição de bases da terceira posição do códon em 14 táxons incluídos na análise38

Capítulo 2(Tabela 2.2), enquanto as seqüências de RAG-1 não apresentam desvio na composição de bases paranenhum táxon. A pressão de mutação simétrica39

Capítulo 2Tabela 2.2. Pressão de mutação direcional simétrica (m D ) para os genes mitocondriais codificadores deproteínas. m D < 0,5 e m D > 0,5 representam maior quantidade de A+T e maior quantidade de G+C,respectivamente. Os valores representam as % de GC observada na seqüência total (Pobs), nos sítiosnão sinônimos (Pnon), nos sinônimos (Psin) e na terceira posição do códon (P 3 ). Táxons queapresentam variação na composição de bases estão representados em negrito.Táxon m D Pobs Pnon Psin P 3Ara a 0,519 0,460 0,412 0,534 0,474Primolius 0,523 0,460 0,410 0,537 0,479Orthopsittaca 0,540 0,472 0,418 0,554 0,489Cyanopsitta 0,539 0,466 0,409 0,553 0,491Nandayus 0,508 0,452 0,406 0,524 0,463Aratinga solstitialis b 0,502 0,447 0,402 0,517 0,459Aratinga leucophthalmus 0,533 0,467 0,414 0,548 0,493Aratinga aurea 0,525 0,460 0,408 0,540 0,475Guarouba 0,519 0,454 0,400 0,535 0,467Diopsittaca 0,522 0, 458 0,406 0,537 0,470Cyanoliseus b 0,502 0,448 0,403 0,517 0,462Anodorhynchus c 0,529 0,462 0,408 0,543 0,479Enicognathus 0,541 0,468 0,410 0,559 0,489Rhynchopsitta a, b 0,485 0,444 0,406 0,500 0,435Pyrrhura a 0,572** 0,481 0,413 0,585 0,523Deroptyus 0,556** 0,473 0,410 0,570 0,501Pionites 0,563*** 0,475 0,409 0,577 0,513Forpus d 0,514 0,455 0,406 0,529 0,458Graydidascalus a 0,540 0,465 0,407 0,555 0,487Amazona xanthops 0,535 0,467 0,412 0,549 0,480Amazona b 0,563*** 0,474 0,406 0,576 0,512Pionus 0,551** 0,473 0,413 0,565 0,491Pionopsitta barrabandi 0,519 0,457 0,407 0,534 0,478Triclaria b 0,520 0,460 0,412 0,535 0,466Pionopsitta pileata 0,528 0,463 0,411 0,543 0,479Myiopsitta a 0,470** 0,434 0,402 0,483 0,417Brotogeris b 0,565*** 0,475 0,408 0,578 0,513Bolborhynchus 0,541 0,469 0,412 0,555 0,486Nannopsittaca 0,537 0,466 0,411 0,551 0,477Cacatua e 0,540 0,470 0,414 0,555 0,486Melopsittacus d 0,511 0,455 0,409 0,526 0,457Falco 0,500 0,454 0,415 0,515 0,455a ATP 6, b citocromo b, c ATP 8, d NADH2, e COIII, * p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001.40

Capítulo 2A análise bayesiana das regiões nuclear e mitocondrial concatenadas, assumindo cada genecomo uma partição independente, resultou em uma topologia consenso muito parecida com a obtidaapenas com os genes mitocondriais. Em ambas as topologias três grandes clados foram recuperadosdentre os psitacídeos da região neotropical (Figura 2.2): clado A – periquitos pequenos (Bolborhynchuse Nannopsittaca), clado B- papagaios, caturritas, curicas e afins (Amazona, Pionus, Graydidascalus,Pionopsitta, Triclaria, Myiopsitta e Brotogeris) e clado C – araras, marianinhas, tiribas e afins (Ara,Primolius, Orthopsittaca, Cyanopsitta, Diopsittaca, Guarouba, Nandayus, Aratinga, Anodorhynchus,Cyanoliseus, Enicognathus, Rhynchopsitta, Pyrrhura, Deroptyus, Pionites e Forpus). A única diferençafoi observada nas relações entre Ara, Primolius e Orthopsittaca. Os primeiros dois gêneros parecemser mais proximamente relacionados na matriz combinada, enquanto considerando apenas a partiçãode DNAmt, Ara e Orthopsittaca aparecem como grupos irmãos e Primolius agrupa com esse clado. Noentanto, como esperado, o suporte dos nós aumenta significantemente com a inclusão de RAG-1.A busca por MV recuperou uma topologia muito semelhante à topologia consenso obtida apartir da análise bayesiana (Figura 2.2), diferindo somente na posição de Pyrrhura que ficou comogrupo irmão de um clado que inclui Rhynchopsitta, Enicognathus, Cyanolyseus, Anodorhynchus,Guarouba, Diopsittaca, Aratinga, Nandayus, Cyanopsitta, Orthopsittaca, Primolius e Ara e as relaçõesentre Enicognathus, Rhynchopsitta, Cyanoliseus e Pyrrhura. Ambos “bootstrap” e probabilidadesposteriores apresentaram suporte alto para a maioria dos clados.No entanto, alguns nós com baixos valores de suporte por “bootstrap” nas análises de MVapresentam altos valores de probabilidade posterior na análise bayesiana. Por exemplo, o clado queune Forpus às demais linhagens do grupos das araras, marianinhas e afins apresenta suporte por“bootstrap” de 61% e probabilidade posterior de 100%. Análises de MV homogênea e não-homogênearecuperaram a mesma árvore, apenas diferindo nas relações entre Primolius, Ara e Orthopsittaca. Noentanto, as diferenças nas topologias obtidas pelos três métodos não são significativas ao nível 5% deacordo com o teste AU.41

Capítulo 2a) b)Figura 2.1. Reconstrução filogenética por análise bayesiana de psitacídeos neotropicais com base em: a) 2703 pb do gene nuclear RAG-1; b) 3713 pb dosgenes mitocondriais; táxons com desvio significativo na composição de bases dos genes codificadores mitocondriais estão sublinhados. As probabilidadesposteriores estão indicadas nos nós.42

Capítulo 2Figura 2.2. Reconstrução filogenética por análise bayesiana de psitacídeos neotropicais com base em6416 pares de bases de seqüências de DNA nuclear e mitocondrial. Os números nos nós correspondemaos valores de porcentagem de “bootstrap” de MV acima de 50 % e aos valores de probabilidade posteriordos nós na análise bayesiana, respectivamente. Clados: A- pequenos periquitos; B- papagaios, caturritascuricas e afins; C- araras, marianinhas, tiribas e afins. Ilustrações dos psitacídeos de del Hoyo ecolaboradores (1997).43

Capítulo 22.3.3. Mapeamento de caracteres morfológicos, comportamentais e genético na filogenia molecularOs caracteres morfológicos e comportamentais selecionados apresentam homoplasia quandomapeados na hipótese filogenética apresentada no presente trabalho (Tabela 2.1; Figura 2.3). A caudacurta presente nos táxons do clado A, em muitos do clado B e em Forpus e Pionites do clado C, e a caudalonga presente em Myiopsitta, Brotogeris e Triclaria (clado B) e em muitos táxons do clado C, sãoconvergentes quando mapeadas na filogenia molecular (Figura 2.3a). A forma arredondada da cauda(presente em Deroptyus e Pionites) e o dimorfismo sexual (presente em Pionopsitta, Triclaria e Forpus)provavelmente surgiram independentemente por paralelismo em mais de uma linhagem (Figuras 2.3b e2.3c). A inferência para o estado ancestral da íris bi-colorida é ambígua e ambos estados ocorrem emdiferentes grupos ao longo da topologia, de forma que esse caráter por si só apresenta pouco valorsistemático (Figura 2.3d). O estado comportamental de coçar a cabeça passando o pé indiretamente sobrea asa parece ter surgido em paralelo em Bolborhynchus, Pionopsitta pileata e Forpus (Figura 2.3e). Oestado aparentemente derivado das narinas cobertas por penas surgiu convergentemente, uma vez noclado B e várias vezes independentemente no clado C (Figura 2.3f). O mapeamento sugere que o anelperioftálmico nu parece ser o estado ancestral do caráter nos clados, mas o estado coberto por penasparece ter surgido em paralelo nos três principais clados (Figura 2.3g).Os minissatélites ligados ao cromossomo W estão presentes nos táxons do grupo das araras,marianinhas e afins com exceção dos táxons mais basais Pionites, Deroptyus e Pyrrhura e estão ausentesnos táxons estudados no grupo dos papagaios e afins (Figura 2.3h). No entanto, o estado desse caracternão é conhecido no grupo mais basal (clado A), em dois táxons do grupo de papagaios e afins (clado B) equatro táxons do grupo das araras, marianinhas e afins (clado C).44

Capítulo 2a) b)b) d)Figura 2.3. Mapeamento dos caracteres morfológicos, comportamentais e genéticos na hipótesefilogenética obtida no presente trabalho: a) comprimento da cauda; b) forma da cauda; c) dimorfismosexual aparente; d) íris bi-colorida; e) posição da perna ao coçar a cabeça; f) narinas; g) anel perioftálmico;e h) minissatélites ligados ao cromossomo W. Os círculos coloridos nos nós representam a probabilidadedo estado ancestral (Figuras a-g). Os círculos coloridos nos terminais representam os estados do caráternos táxons atuais.45

Capítulo 2e) f)g) h)Figura 2.3. continuação.46

Capítulo 22.3.4. Tempos de divergênciaA hipótese de existência de relógio molecular entre os psitacídeos neotropicais foi rejeitada peloteste LRT das topologias assumindo e não assumindo taxa constante entre as linhagens, incluindo osgrupos externos Falco, Aburria e Gallus (log da verossimilhança da topologia com relógio= -39016,92; logda verossimilhança da topologia sem relógio molecular= -38962,05; 2∆= 109,73, gl=33; p < 0,001) eexcluindo os grupos externos (log da verossimilhança da topologia com relógio= -33714,15; log daverossimilhança da topologia sem relógio molecular= 33664,22; 2∆= 99,88; gl= 30; p < 0,001). O teste devalidação cruzada resultou em um valor ótimo de penalidade 3,16 para estimar o tempo de divergênciapelo método PL. Os tempos de divergência estimados pelo método PL e método bayesiano foramcongruentes (Tabela 2.3) e a comparação com os eventos paleogeoclimáticos foi realizada com base nométodo bayesiano, já que esse método leva em conta a incerteza nos tamanhos de ramo e nos tempos de47

Capítulo 2Tabela 2.3. Tempos de divergência estimado entre as linhagens de psitacídeos neotropicais (em milhõesde anos, ma). Dados obtidos com o método PL (com nó 1 fixado em 82 e 85 ma) e os respectivosintervalos de confiança (IC); e com o método bayesiano e os respectivos intervalos de credibilidade (ICr).Os nós estão indicados na figura 2.4.PL PL bayesianoNó Data IC 95% Data IC 95% Data ICr 95%1 82 fixado 85 fixado 82,9 (82,0; 84,6)2 69,8 (66,9; 72,3) 72,3 (69,3; 75,0) 67,6 (60,4; 74,8)3 62,1 (59,0; 65,1) 64,3 (60,8; 68,5) 59,0 (51,5; 66,8)4 52,6 (49,3; 59,0) 54,5 (51,0; 57,8) 49,7 (42,5; 57,3)5 20,3 (17,7; 23,2) 21,0 (18,1; 24,0) 18,4 (13,4; 24,2)6 50,9 (47,7; 54,1) 52,7 (49,3; 56,0) 48,3 (41,2; 55,9)7 49,4 (16,2; 52,7) 51,2 (47,7; 54,6) 46,1 (39,0; 53,8)8 36,7 (33,3; 40,0) 37,9 (34,5; 41,4) 32,5 (25,5; 40,2)9 40,1 (36,7; 43,6) 41,5 (36,8; 45,1) 39,2 (32,2; 46,6)10 37,4 (34,0; 40,9) 38,7 (35,2; 42,3) 36,2 (29,7; 43,4)11 35,7 (32,4; 39,2) 37,0 (33,4; 40,6) 33,2 (26,8; 40,2)12 28,9 (25,4; 32,4) 29,9 (26,3; 33,6) 24,9 (19,4; 31,1)13 24,9 (21,6; 28,4) 25,8 (22,4; 29,4) 22,4 (17,0; 28,7)14 19,7 (16,8; 22,9) 20,4 (17,4; 24,2) 16,6 (11,7; 22,1)15 48,3 (45,1; 51,6) 50,0 (46,6; 53,4) 46,2 (39,0; 53,8)16 30,4 (27,6; 33,3) 31,4 (28,6; 34,5) 28,2 (22,5; 34,8)17 23,1 (20,1; 26,1) 23,9 (20,0; 27,0) 22,3 (16,6; 28,7)18 25,4 (22,7; 28,3) 26,3 (23,5; 29,3) 25,2 (20,0; 31,2)19 25,1 (22,4; 28,1) 26,0 (23,1; 29,1) 23,4 (18,1; 29,6)20 23,3 (20,9; 26,7) 24,1 (21,7; 26,9) 23,4 (19,0; 29,2)21 22,1 (19,8; 24,6) 22,8 (21,0; 25,6) 22,1 (17,3; 27,5)22 20,2 (17,9; 22,6) 20,9 (18,7; 23,3) 20,6 (16,1; 25,7)23 9,4 (7,7; 11,3) 9,7 (7,9; 11,8) 8,9 (6,1; 12,3)24 18,7 (16,7; 21,1) 19,4 (17,3; 21,8) 19,9 (15,5; 24,9)25 16,2 (14,3; 18,4) 16,7 (14,7; 19,0) 18,3 (13,9; 23,2)26 17,8 (15,9; 20,1) 18,4 (16,3; 20,7) 19,0 (14,8; 24,0)27 4,9 (4,2; 5,8) 5,1 (4,3; 6,0) 5,5 (3,6; 7,7)28 16,3 (14,4; 18,4) 16,7 (14,9; 19,0) 17,2 (13,0; 22,0)29 13,9 (12,1; 15,9) 14,4 (12,5; 18,6) 15,0 (11,2; 19,5)30 12,8 (11,1; 14,8) 13,3 (11,4; 15,3) 13,6 (9,9; 18,0)48

Capítulo 2Figura 2.4. Cronograma mostrando os tempos de divergência entre linhagens de psitacídeos estimadospelo método bayesiano. As letras correspondem aos nós indicados na tabela 2.3 e seus respectivosintervalos de credibilidade estão indicados pelas barras horizontais. As barras verticais indicam eventospaleogeoclimáticos registrados nos respectivos períodos. A- pequenos periquitos; B- papagaios, caturritas,curicas e afins; C- araras, marianinhas, tiribas e afins.49

Capítulo 2Os resultados sugerem que essa estratégia melhorou a resolução da topologia e aumentou osuporte dos ramos, como foi sugerido em outros trabalhos (Poe e Swofford, 1999; Haddrath e Baker, 2001;Slowinski, 2001; Paton e col., 2002). Além disso, a combinação de partições nuclear e mitocondrial, queoferecem resolução em diferentes partes da topologia, resultou em uma topologia mais robusta, comosugerido em uma filogenia de gêneros de cracídeos (Pereira e col., 2002).A presente análise apontou três grandes clados dentre os psitacídeos neotropicais: pequenosperiquitos dos gêneros Nannopsittaca e Bolborhynchus (clado A); papagaios, caturritas, curicas e afins dosgêneros Amazona, Pionus, Graydidascalus, Pionopsitta, Triclaria, Myiopsitta e Brotogeris (clado B) eararas, marianinhas, tiricas e afins dos gêneros Ara, Primolius, Orthopsittaca, Cyanopsitta, Diopsittaca,Guarouba, Nandayus, Aratinga, Anodorhynchus, Cyanoliseus, Enicognathus, Rhynchopsitta, Pyrrhura,Deroptyus, Pionites e Forpus (clado C). Apenas cinco gêneros não puderam ser incluídos, pois o DNAextraído de pele dos gêneros Touit e Ognorhynchus não resultaram em amplificações de boa qualidade eas amostras dos gêneros Hapalopsittaca, Leptosittaca e Psilopsiagon não estavam disponíveis.Embora os clados B e C são semelhantes aos obtidos em estudos filogenéticos anterioresempregando amostragem de táxons mais incompleta (Miyaki e col., 1998, Tavares e col., 2004, de Kloet ede Kloet, 2005), os resultados apresentados no presente trabalho sugerem que os pequenos periquitos sãogrupo irmão de todos os demais táxons. Adicionalmente, a ausência de monofiletismo de Aratinga,Amazona e Pionopsitta, apontada em estudos anteriores, foi corroborada no presente estudo (Tavares ecol., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004; Ottens-Wainright e col., 2004; Ribas e col.,2005).Em comparação com propostas de classificação mais antigas, que assumiam agrupamentos entregêneros de psitacídeos neotropicais, incluindo ou não táxons de outras regiões geográficas, nossosresultados não sustentam a proposta de classificação de Brereton (1963) que agrupa na família ForpidaeBolborhynchus, Nannopsittaca, Forpus e Psilopsiagon, porque na presente reconstrução, Forpus agrupacom táxons do clado C, que por sua vez agrupam com o clado B. Os clados B e C apresentam algumassimilaridades e diferenças com os grupos Pioninae/ Conurinae (Salvadori, 1891) e Amazoninae/ Arinae(Verheyen, 1956). Os grupos Pioninae (Salvadori, 1891) e Amazoninae (Verheyen, 1956) possuemcomposição semelhante e ambos incluem os táxons do clado dos papagaios e afins (clado B) com exceçãode Myiopsitta e Brotogeris. Além disso, tais grupos incluem os táxons Pionites, Deroptyus (incluídos noclado C), Touit e Hapalopsittaca (não amostrados no presente trabalho). Pioninae (Salvadori, 1891)também inclui o gênero africano Poicephalus. Conurinae (Salvadori, 1891) e Arinae (Verheyen, 1956)também são grupos de composição semelhante e ambos incluem os táxons do clado C, exceto Deroptyus50

Capítulo 2e Pionites. Além disso, Conurinae (Salvadori, 1891) e Arinae (Verheyen, 1956) incluem Nannopsittaca,Bolborhynchus (pertencentes ao clado A no presente trabalho), Psilopsiagon, Leptossitaca eOgnorhynchus (não amostrados no presente trabalho). Smith (1975) considerou que as sugestões degrupos de gêneros neotropicais propostos nas classificações anteriores (Salvadori 1890; Verheyeyen,1956; Brereton, 1963) não refletiam a evolução do grupo, e por falta de evidências, preferiu não aceitaragrupamentos dentre os gêneros da tribo Arini. Um dos argumentos citados pelo autor (Smith, 1975) foi ofato de Deroptyus e Pionites (família Pioninae e Amazoninae) apresentarem similaridades emcomportamento com Pyrrhura e Aratinga (família Conurinae e Arinae). Apesar de tais similaridadescomportamentais não terem sido detalhadamente descritas e comparadas com os demais táxons, napresente reconstrução filogenética, Deroptyus e Piontes pertencem ao clado C, o qual inclui Pyrrhura eAratinga. O clado fomado por Deroptyus e Pionites, proposto no presente trabalho, está de acordo comobservações de campo que sugerem que ambos os gêneros apresentam o canto “keeya” e compartilhamaspectos no comportamento reprodutivo (McLoughlin e Burton, 1976), porém, esses caracteres ainda nãoforam estudados por uma abordagem cladística.2.4.2. Mapeamento de caracteres morfológicos, comportamentais e genéticos na hipótesefilogenéticaNenhum dos caracteres morfológicos mapeados na hipótese filogenética proposta no presentetrabalho apresentou estados exclusivos para um único grupo. O tamanho e a forma da cauda foram osprincipais caracteres adotados para definir grupos de gêneros dentre os psitacídeos neotropicais emclassificações mais antigas (Salvadori, 1890; Verheyen, 1990). Propostas mais recentes (Smith, 1975;Forshaw, 1989; Collar, 1997) não consideram os agrupamentos com base nesses caracteres. No entanto,a importância do tamanho e forma da cauda foram levantados novamente em um estudo molecular, onde avariação dos estados de caráter da cauda concordaram com as relações filogenéticas inferidas com baseem táxons de nove gêneros amostrados (Miyaki e col., 1998). Quando esses caracteres foram mapeadosna presente hipótese filogenética, que possui uma amostragem mais completa de táxons, elesapresentaram convergência (Figura 2.3a e 2.3b). Dessa forma, o uso desses caracteres na diagnose degrupos monofiléticos dentre os psitacídeos neotropicais deve ser descontinuado.Os minissatélites ligados ao cromossomo W podem ser informativos, uma vez que podem estarpresentes em um sub-clado do clado C, excluindo os táxons mais basais Forpus, Deroptyus, Pionites ePyrrhura (Figura 2.3h). No entanto, como o caracter não foi estudado para alguns dos táxons pertencentesà tribo Arini, qualquer conclusão pode ser prematura.51

Capítulo 22.4.3. Tempos de divergência e biogeografia históricaA maneira mais adequada de estimar os tempos de divergência por dados moleculares é utilizando52

Capítulo 2florestas tropicais na América do Sul (Burnham e Johnson, 2004; Rull, 1999; Jaramillo e Dilcher, 2000; Wilfe col., 2003). Além disso, muitas das linhagens atuais desse clado estão associadas com ambientesflorestais. Portanto, os papagaios e afins podem ter evoluído exclusivamente na América do Sul,associados a esses ambientes.No início do Oligoceno, uma expansão de áreas abertas e savanas pode ter acontecido naAmérica dos Sul. As evidências dessa aridificação são o registro de diversificação de plantas de ambientessecos nesse período (Pennington e col., 2004) e o registro fóssil animal com uma fauna de mamíferosdominada por herbívoros hipsodontes, que em geral são associados a ambientes de savana (Flynn eWyss, 1997). A aridificação da América do Sul foi atribuída ao soerguimento da porção central dos Andes,que impediu a passagem das correntes úmidas do Pacífico para o interior do continente (Hooghiemstra evan der Hammer, 1998). Possivelmente, a grande diversificação (entre 22-34 ma) do grupo das araras,maracanãs e afins (clado C), ocorreu em resposta a essa diversificação de ambientes secos, uma vez quemuitas linhagens atuais desse grupo ocupam ambientes com características semelhantes.Apesar de não haver evidências a partir dos dados apresentados aqui, ou a partir de outras fontes,membros dos clados dos pequenos periquitos (clado A) e do clado das araras, maracanãs e afins (clado C)poderiam estar ocupando o sul da América do Sul e não dispersaram para a porção norte do continente atéo Oligoceno, devido à presença de um mar transcontinental formado no sul da Argentina e do Chile(Romero, 1986; Smith e col., 1994), que poderia ter atuado como uma barreira para a sua dispersão.Alternativamente, os ancestrais desses dois grupos poderiam ser remanescentes de linhagens queinicialmente ocorriam na Antártica e que teriam sido impulsionados para a América do Sul, à medida que aAntártica migrou mais para o sul e se tornou um continente incrustrado por gelo (Shevenall e col., 2004;Dingle e Lavelle, 1998). Uma redução drástica do nível do mar aconteceu em conseqüência da formaçãoda calota polar Antártica, o que poderia ter facilitado a invasão da América do Sul, como foi sugerido paraalguns grupos de mamíferos (Flynn e Wyss, 1997). Um padrão muito semelhante de cladogênesediferenciada entre dois grupos também foi descrito para Passeriformes neotropicais suboscines (Ericson ecol., 2003). A família Furnariidae apresenta uma filogenia bem resolvida, enquanto os internós emTyrannidae são muito curtos, indicando indicando uma rápida radiação (Ericson e col., 2003).Apesar de não ter sido possível incluir amostras de psitacídeos africanos no presente estudo, asua posição filogenética não afeta a interpretação biogeográfica da evolução dos psitacídeos neotropicais.Estudos anteriores sugeriram que os psitacídeos africanos não são monofiléticos e podem ter invadido aÁfrica duas vezes, uma via sudoeste da Ásia e outra, via América do Sul (de Kloet, de Kloet, 2005). Ogrupo que teria dispersado para a África a partir da América do Sul seria grupo irmão dos psitacídeos53

Capítulo 2neotropicais (Barrowclough e col., 2004; de Kloet, de Kloet, 2005). Como estimamos a separação de umgênero do clado australasiático (Melopsittacus undulatus) dos neotropicais entre 51-66 ma e primeiracladogênese dentre os neotropicais entre 42-57 ma (Tabela 2.3), a invasão da África pelas linhagens daAmérica do Sul pode ter ocorrido entre 42-66 ma, período no qual a África já se encontrava isolada dosupercontinente formado pela Antártica-Austrália-América do Sul. Além disso, reforçaria a hipótese de quelinhagens dos psitacídeos encontravam-se distribuídos ao longo do supercontinente, antes da primeiradiversificação do grupo neotropical.As estimativas de tempo de divergência entre psitacídeos neotropicais realizadas anteriormenteempregavam métodos que não levam em conta a taxa de variação entre as linhagens. Por exemplo, Miyakie colaboradores (1998) e Tavares e colaboradores (2004) utilizaram o método de linearização de árvore(Takezaki e col., 1995), que avalia a presença de táxons que evoluem sob uma taxa significantementediferente da média da amostra sendo estudada e exclui esses táxons da análise. A calibração utilizadapara o relógio molecular nesses estudos foi a separação entre Galliformes e Anseriformes dos demaisneognatos, estimada em 100 ma. Tavares e colaboradores (2004) também empregaram a taxa padrãoestimada para o genoma mitocondrial de aves, de 2% de substituição de nucleotídeos/ ma. O mesmoprocesso foi utilizado para estimar tempos de divergência entre espécies de psitacídeos, porém aplicandotaxas de 1,6-2,0% de substituição de nucleotídeos/ ma (Ribas e Miyaki, 2004; Ribas e col., 2005). Emgeral, essas estimativas resultaram em tempos de divergência mais recentes do que os tempos estimadosno presente estudo. Acreditamos que a aproximação realizada no presente trabalho é mais adequada doque as realizadas anteriormente (Miyaki e col., 1998; Tavares e col., 2004) porque não assume a hipótesede existência de um relógio molecular estrito, permitindo haver variação de taxa ao longo das linhagens.Além disso, incorpora na análise a incerteza nos tamanhos de ramo e tempos estimados e foi realizadacom base em uma hipótese filogenética cujos nós são melhor resolvidos. A utilização de um ponto decalibração geológico independente (a separação da Nova Zelândia dos demais continentes da Gondwana)permite que as taxas sejam estimadas a partir dos dados, ao invés de assumir taxas estimadas a partir deoutras linhagens de aves (Lovette, 2004).54

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Capítulo 3Evolução da organização dos genes mitocondriais aoredor da região controladora em psitacídeosneotropicais (tribo Arini)

Capítulo 33.1. IntroduçãoA maioria dos genomas mitocondriais de vertebrados inclui 22 genes para RNA transportadores(RNAt), 13 genes codificadores de proteínas, dois genes para RNA ribossomal (RNAr) e uma região nãocodificadora (região controladora, RC) e inicialmente se acreditava que a organização desses genes(Figura 3.1a) era extremamente conservada (Quinn, 1997; Boore, 1999). No entanto, o aumento donúmero de genomas sequenciados revelou variações dessa organização em várias linhagens devertebrados, principalmente envolvendo RNAt, como por exemplo, em marsupiais, cobras cegas, rãs elagartos (Pääbo e col., 1991; Kumazawa e Nishida, 1995; Macey e col., 1997; Saccone e col, 1999; Booree col., 1995; Boore, 1999). O primeiro genoma mitocondrial de uma ave a ser completamente sequenciado(Gallus gallus; Desjardins e Morais, 1990) revelou um arranjo único dentre os vertebrados (Figura 3.1b).Com o aumento no número de seqüências determinadas, esse arranjo de genes (aqui denominado“comum”) foi evidenciado ser muito freqüente em aves (Marshall e Baker, 1997; Mindell e col. 1998; Härlide col., 1998; Haddrath e Baker 2001; Paton e col., 2002; Slake e col., 2003). No entanto, um outro arranjogênico (aqui denominado “alternativo”; Figura 3.1c) foi descrito em alguns táxons (Mindell e col., 1998;Bensch e Härlid, 2000).Mecanismos distintos podem explicar diferentes processos de rearranjo gênico. Por exemplo, eminsetos Hymenoptera alguns rearranjos de genes são melhor explicados por recombinação (Dowton e col.,2003), para vários rearranjos em vertebrados foi proposto um mecanismo de duplicação e deleçãoaleatória de genes (Moritz e col., 1986, 1987; Macey e col. 1997; Holt e col., 1997). Posteriormente, paradois gêneros de Diplopoda foi proposto um mecanismo de duplicação e deleção não aleatória de genes(Lavrov e col., 2002).O mecanismo pelo qual a organização dos genes comum em aves sugiu a partir da ordem típicaem vertebrados não foi eluciado, mas dois modelos foram propostos. O arranjo comum em aves (Figura3.1b), poderia ter surgido a partir do arranjo de genes comum em vertebrados (Figura 3.1a) pelomecanismo de RNAt atuando como primer ilícito na recombinação, onde o RNAt Glu ou o RNAt Pro ligaria-sena origem da replicação da molécula e não seria isolado na nova fita de DNA sintetizada no processo,junto com os genes adjacentes. O segmento NADH6/ RNAt Glu ou o citocromo b/ RNAt Thr / RNAt Pro , seriaincorporado no próximo ciclo de replicação em uma posição diferente (Desjardins e Morais, 1990).62

Capítulo 3Figura 3.1. Ordem dos genes ao redor da região controladora (fora de escala). a) ordem comum emvertebrados (Boore, 1999) ; b) ordem comum em aves (Desjardins e Morais, 1990); c) ordem alternativa emaves (Mindell e col. 1998); d) ordem nos gêneros de psitacídeos Amazona e Pionus (Eberhard e col.,2001); e e) possível ordem nos gêneros de psitacídeos Deroptyus e Pionites. Os “primers” usados paraamplificação estão indicados nos mapas da ordem gênica correspondente. Os segmentos numeradoscorrespondem a regiões amplificadas nos táxons indicados na Tabela 2.1. NADH5- nicotinamida adeninadinucleotídeo desidrogenase subunidade 5; NADH6- nicotinamida adenina dinucleotídeo desidrogenasesubunidade 6; GLU- RNAt Glu ; cit. b – citocromo b, THR- RNAt Thr , PRO- RNAt Pro , RC – região controladora;nc – região não codificadora, PHE - RNAt Phe , nc- região não-codificadora; ψ ND6- pseudo NADH6, ψ GLUpseudoRNAt Glu ; ψ PRO- pseudo RNAt Pro .Alternativamente, pelo modelo de duplicação e perda subseqüente de genes, o segmento NADH6/RNAt Glu / citocromo b/ RNAt Thr / RNAt Proda ordem típica em vertebrados seria duplicado durante areplicação, por formação de estrutura secundária na nova fita sintetizada durante o processo, ou por errode pareamento no início ou final da replicação. Essa duplicação seria então incorporada na molécula porum novo ciclo de replicação. A deleção de um segmento NADH6/ RNAt Gluentre os genes NADH5 e63

Capítulo 3citocromo b e um segmento de citocromo b/ RNAt Thr / RNAt Pro antes da RC geraria a ordem comum emaves (Figura 3.1b; Desjardins e Morais, 1990; Quinn, 1997).A organização alternativa em aves (Figura 3.1c) poderia ter se originado a partir da organizaçãomais comum de aves pela duplicação em tandem do segmento RNAt Pro / NADH6/ tRNA Glu / RC, seguido deperdas subsequentes de uma das cópias dos genes tRNA Pro / NADH6/ e RNAt Glu e, na maioria dos casos,da RC ou parte da mesma (Mindell e col., 1998; Boore e col., 1999; Bensch e Härlid, 2000). A presença deuma região não codificadora que apresenta grande similaridade com a RC (Figura 3.1c), sugere que esseevento deve ser relativamente recente, reforçando a hipótese de que essa organização de genes em avesteria origem a partir de eventos de duplicação e subsequente perda de segmentos duplicados (Mindell ecol., 1998; Bensch e Härlid, 2000). Essa idéia foi ainda mais reforçada com a caracterização dessa mesmaregião em psitacídeos neotropicais dos gêneros Amazona e Pionus (Eberhard e col., 2001). Esses táxonstambém apresentam a ordem alternativa em aves, mas nesse caso, ambas as RC sequenciadasapresentam as regiões conservadas como os blocos F, D, C e CBS-1, e antes da primeira RC, apresentampseudogenes que são similares às seqüências de RNAt Glu e NADH6 (Figura 3.1d).Assumir que organização alternativa se originou a partir de um único evento de rearranjo de genesimplicaria em aceitar a existência de um grupo monofilético de aves formado por Falconiformes, Cuculidae(Cuculiformes), Picidae (Piciformes) e Suboscines (Passeriformes), excluindo desse grupo outras famíliasdessas mesmas ordens como Musophagidae (Cuculiformes), Bucerotidae (Piciformes) e Oscines(Passeriformes), o que estaria em desacordo com reconstruções filogenéticas bem sustentadas obtidascom dados morfológicos e moleculares diversos (Mindell e col., 1998). Assim, foi proposto que o arranjogênico alternativo (Figuras 3.1c e 3.1d) se originou por vários eventos em linhagens independentes(Mindell e col., 1998). A princípio, acreditou-se que a ordem gênica poderia ser um caráter diagnóstico emníveis taxonômicos como subordens ou famílias, por exemplo, para as subordens Oscines (ordem comum)e Suboscines de Passeriformes (Mindell e col., 1998). No entanto, dados mais recentes evidenciaram aexistência do arranjo alternativo em várias espécies gênero Phylloscopus (Oscines), sugerindo que esseseventos também acontecem em níveis taxonômicos mais baixos e portanto, a validade do carácter parainferência filogenética é questionável (Bensch e Härlid, 2000). Em Phylloscopus a similaridade entre a RCe a região não-codificadora de cada espécie é menor que a similaridade das RC entre espécies próximas,o que corrobora a hipótese de ter ocorrido um único evento de rearranjo gênico em um ancestral comumdo grupo (Bensch e Härlid, 2000). A similaridade entre ambas as RC do mesmo táxon em espécies esubespécies do gênero Amazona e no táxon Pionus chalcopterus, em geral, foi maior do que entre asregiões homólogas de táxons diferentes, com exceção de três subespécies de Amazona ochrocephala.64

Capítulo 3Nesse caso, também foi sugerido que houve um único evento de rearranjo gênico no ancestral dessesgrupos, porém, as RCs de cada táxon estariam evoluindo em concerto (Eberhard e col., 2001).No presente trabalho, determinamos a ordem dos genes mitocondriais em diversos gêneros depsitacídeos neotropicais e evidenciamos a convergência desse caráter no grupo. Propomos modelos paraexplicar a origem dos eventos independentes e testamos essas hipóteses através de elementos exclusivosidentificados nas seqüências de cada linhagem. Com base em uma estimativa de tempo de divergênciaentre as linhagens, estimamos períodos de tempo nos quais teriam acontecido eventos de duplicação eperda de genes ao longo das linhagens estudadas.3.2. Material e métodos3.2.1. Amostragem e sequenciamentoForam estudados 34 indivíduos de 25 dos 30 gêneros de psitacídeos neotropicais (Tabela 3.1).Amostras de DNA foram extraídas a partir de sangue por digestão padrão com proteinase K e purificadascom fenol: clorofórmio: álcool isoamílico na proporção 25:24:1 (Bruford e col., 1992).Os “primers” utilizados nas amplificações e sequenciamento foram: CBL15637 (5’-AACCTCCTAGGAGACCCAGAAAACTTC-3’; Miyaki e col., 1998), LThr (5’-TGGTCTTGTAAACCAAAAGA-3’; Eberhard ecol., 2001), H16065 (5’-AACTGCAGTCATCTCCGGTTTACAAGAC-3’; Kornegay e col. 1993), Tpro16150(5’-ATCACCAACTCCCAAAGCTGG -3’, presente trabalho), ND6H16252 (5’-TTRTGAYTGTTTGTTGT -3’,presente trabalho), ND6L16384 (5’-CACCYCACCCYCAAACAA -3’, presente trabalho), ND6L 852 (5’- CCATAAAGAGTACTAGCGACA C-3’, presente trabalho), ND6H16522 (5’-GGGATGTTGGTGGTTTTTGT-3’,presente trabalho), LGlu (5’-GCCCTGAAAARCCATCGTTG-3’; Eberhard e col., 2001), HgluRev (5’-GCGTTCTTATAGTTGAGATACC-3’; Eberhard e col., 2001), CRL380 (5’-GCCCATAAYTGGCCCGGGAACTT-3’; Tavares e col. 2004), CRL456 (5’- CACGAGAGATCAYCAACCCGGTGT-3’, Tavares e col., 2004),CR522Rb (5’-TGGCCCTGACYTAGGAACCAG-3’; Eberhard e col., 2001), CRL827 (5’-TCATTTTMRCACTGATGCACTTG-3’; Tavares e col. 2004), CRH1028 (5’- AGGTGTAAAACAAAGTGCATCAGGGT-3’;Tavares e col. 2004), Hphe1248 (5’-TCTTGGCAKCTTCAGTACCATGCTTT-3’, Eberhard, com. pess.),12SH1357 (5’-GCGGATACTTGCATGTATATG-3’, presente trabalho).65

Capítulo 3Tabela 3.1. Táxons analisados, número de registro, segmentos amplificados de acordo com a numeraçãocorrespondente indicada na Figura 3.1.Espécie LGEMA a Segmentos amplificadosAmazona xanthops 1876 7Anodorhynchus hyacinthinus 114 1, 3, 4, 5, 6Anodorhynchus hyacinthinus 117 1, 3, 4, 5, 6Ara ararauna 13 1, 3, 4, 5, 6Aratinga aurea 346 3Aratinga leucophthalmus 2090 3Aratinga solstitialis 2042 3Bolborhynchus lineola 4393 3Brotogeris chiriri 5486 3Cyanolyseus patagonus 1837 3Cyanopsitta spixii 409 3, 4, 5Cyanopsitta spixii 498 2, 3, 4, 5Deroptyus accipitrinus 395 14, 15Deroptyus accipitrinus 396 14, 15Diopsittaca nobilis 973 2, 3, 4, 5Diopsittaca nobilis 1126 2, 3, 4, 5Enicognathus leptorhynchus 5173 3Forpus crassirostris 501 7, 13Guarouba guarouba 4 2, 3, 4, 5Guarouba guarouba 69 2, 3, 4, 5Graydidascalus brachyurus 1623 7, 9, 10, 11, 12Graydidascalus brachyurus 1624 7, 9, 10, 11, 12Myiopsitta monachus 1737 1, 3, 4Nandayus nenday 143 1, 3, 4Nannopsittaca dachileae 5495 3Orthopsittaca manilata 2383 3Pionites leucogaster 2377 15, 16Pionopsitta barrabandi 5006 7, 8, 13Pionopsitta pileata 3467 7, 13Primolius auricollis 2345 3Pyrrhura picta 397 3Rhynchopsitta pachyryncha 5237 3Triclaria malachitacea 415 7, 8, 12, 13Triclaria malachitacea 416 7, 8, 12, 13aRegistro na coleção do Laboratório de Genética e Evolução Molecular de Aves (LGEMA), Universidade deSão Paulo.66

Capítulo 3A primeira amplificação realizada para cada táxon foi entre os “primers” LThr e CR522Rb(segmentos 3, 7 e 15 da Figura 3.1; Tabela 3.1). A seqüência obtida a partir do segmento amplificado poresse conjunto de “primers” é diagnóstica da organização gênica em psitacídeos (Figura 3.1). Foramamplificados segmentos adicionais para vários táxons, em geral com sobreposição, sempre levando emconta a sua organização gênica (Figura 3.1; Tabela 3.1).As amplificações foram realizadas em 10 µL, com tampão 1x (Pharmacia ou Biotools), 2 µM de decada dNTP, 1µM de cada “primer”, 0,5 U de Taq polimerase (Pharmacia) e 20-50 ng de DNA, oualternativamente, em 25 µL, com tampão 1x (Biotools), 2 µM de cada dNTP, 1µM de cada “primer”, 1 U deTaq polimerase (Pharmacia) e 25-50 ng de DNA. As condições da reação de PCR foram: desnaturaçãoinicial a 95ºC por 5 minutos (min.), seguido de 30 ciclos de 95 o C por 60 segundos (seg.), 50-54 o C por 25seg. e 65 o C por 40 – 80 seg., e uma extensão final de 65 o C por 5 min. Uma alíquota (2 µL) dos produtos foiaplicada em gel de agarose para verificar a qualidade e tamanho dos produtos.Os produtos de PCR foram purificados com exonuclease I (5 U, USB) e fosfatase alcalina decamarão (0,5 U, USB). Alternativamente, a banda foi recuperada de gel de agarose e o produto foi isoladopor centrifugação do fragmento de gel em ponteira com filtro. A reação de sequenciamento foi preparadacom Big Dye Terminator (Perkin Elmer) de acordo com protocolo sugerido pelo fabricante. As seqüênciasforam obtidas em sequenciadores automáticos (ABI 377 ou ABI 3100, Applied Biosystems).3.2.2. Alinhamento e análise das seqüênciasAmbiguidades entre fitas complementares e regiões de sobreposição foram verificadas e corrigidasusando os programas Sequence Navigator (Applied Biosystems) e Sequencher 4.1.2 (GeneCodes Corp.).Os arranjos e seqüências foram comparados com as seqüências homólogas dos genomas mitocondriaiscompletos de galinha (Gallus gallus; GenBank NC_001323; Desjardins e Morais, 1990) e de um psitacídeoda Nova Zelândia (Strigops habropptilus; NC_005931; Harrison e col., 2004), com a seqüência de 4709 pbentre o final do citocromo b e início do RNAr 12S do psitacídeo neotropical Amazona farinosa (GenBankAF338821; Eberhard e col., 2001) e duas seqüências de tamanhos 735 e 574 pb correspondentesrespectivamente aos segmentos 7 e 13 (Figura 3.1) do psitacídeo neotropical Pionus chalcopterus(AF338317 e AF338318; Eberhard e col., 2001).As seqüências obtidas das extremidades 3’ do citocromo b foram comparadas com as seqüênciaspraticamente completas do gene descritas em trabalhos anteriores e obtidas a partir da amplificação desegmentos diferentes (Figura 3.2; U70761, U70763, U70764, U70766, AY286205, AY286206, AY286209,AF370769 e AF370778; Miyaki e col. 1998; Tavares e col., 2004; Tavares e col. in prep.). As seqüências67

Capítulo 3obtidas da porção 5’ da região controladora foram comparadas, ou complementadas com seqüênciasobtidas em trabalhos anteriores (Figuras 3.2 e 3.3; AF430809, AF430810, AF430811, AF430813,AF430814, AF430816, AF430817, AF430818, AF430822, AF430825, AF430826, AF430828, AF430830,AF430833, AF430836, AF430837 e AY208250; Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004). Alinhamentosautomáticos foram gerados no Clustal X 1.81 (Thompson, 1997) e corrigidos manualmente no MacClade4.0 (Maddison e Maddison, 2000). O alinhamento das seqüências de DNA de genes codificadores deproteínas foi confirmado com a seqüência de aminoácidos correspondente, simulada no MacClade 4.0(Maddison e Maddison, 2000). Composição de bases, valores de distância e demais dados estatísticosforam obtidos nos programas PAUP* 4.0 (Swofford e col., 2002) e MEGA 2.1 (Kumar e col., 2001). Asimulação da estrutura secundária dos RNAt foi realizada no tRNAscan-SE (Lowe e Eddy, 1997). Acaracterização da região controladora (RC), foi realizada por comparação com outras seqüências de RC deaves (Desjardins e Morais, 1989; Mindell e col., 1998; Marshall e Baker, 1999; Eberhard e col., 2001;Delport e col., 2002). O início dos domínios foi definido pela posição dos blocos conservados (Sbisà e col.,1997; Marshaw e Baker, 1999) como definido por Pereira e col. (2004).3.2.3. Mapeamento de hipótesesOs diferentes estados de organização gênica em aves (comum ou alternativa) foram mapeados emuma proposta filogenética das relações entre os gêneros de psitacídeos neotropicais (topologia comtamanho de ramos, Tavares e col., in prep.) no programa Mesquite 1.05 (Maddison e Maddison, 2004)utilizando o método de Máxima Verossimilhança. A partir da organização alternativa com duplicação da RC(Figura 3.1d) é possível recuperar a organização comum dos genes em aves (Figura 3.1b), caso ospseudogenes e a RC 1 sejam deletados, e a partir da ordem comum é possível resultar na ordemalternativa por duplicação e deleção posterior de genes, portanto, consideramos que a mudança entreesses dois estados (ordem comum e ordem alternativa) possui a mesma probabilidade.3.3. ResultadosApesar de o DNA ter sido extraído a partir de sangue, tecido relativamente pobre em mitocôndrias,acreditamos que as seqüências são de origem mitocondrial com base nos seguintes resultados: (1) algunsdos segmentos amplificados são maiores que o tamanho da maioria das possíveis cópias de genesmitocondriais incorporados no genoma nuclear de Gallus gallus e na maioria dos genomas de vertebradossequenciados até o momento (Pereira e Baker, 2004); (2) os segmentos com sobreposição parcialamplificados com diferentes combinações de “primers” são congruentes; (3) as seqüências dos genes68

Capítulo 3codificadores não apresentam códons de parada inesperados ou alteração no quadro de leitura ealinharam com as correspondentes dos mesmos indivíduos amplificadas previamente com diferentecombinação de primers (Miyaki e col. 1998, Tavares e col., 2004, Tavares e col., in prep.); e (4) asimulação da estrutura secundária dos DNAt sugere que os mesmos devem ser funcionais.As seqüências obtidas no presente trabalho (números de acesso em processo de submissão aoGenBank), assim como o conjunto analisado incluindo seqüências de trabalhos anteriores estãorepresentados nas figuras 3.2 e 3.3. A amplificação com o par de primers CBL15637 e ND6H16522resultou em mais de uma banda (de aproximadamente 600 e 900 pb) para os táxons Diopsittaca nobilis,Guarouba guarouba e Cyanopsitta spixii. Portanto, para esses táxons, os “primers” CBL15637 e CR522Rbforam usados para obter cerca de 2 kb de produto. As amplificações com os “primers” Lthr16064 eCR522Rb em amostras de Amazona xanthops e Graydidascalus brachyurus, sempre resultou emseqüências ambíguas e ilegíveis, portanto, não foi possível comparar essa região com as homólogas nosdemais grupos. No entanto, em ambos os táxons o segmento amplificado de 700 pb entre esses “primers”possui tamanho incompatível com a ordem comum, cujo tamanho esperado seria em torno de 1300 pb, jáque inclui todo o gene NADH6 e uma porção de 500 pb da RC, sugerindo que esses táxons apresentam aordem alternativa (Figura 3.1d). Além disso, outras seqüências de Graydidascalus brachyurus foramobtidas (Figuras 3.1 e 3.3), confimando a existência da ordem de genes alternativa nesse táxon.Em casos onde mais de um indivíduo da mesma espécie foi seqüenciado, a variação encontradaentre os indivíduos da mesma espécie foi menor do que aquela encontrada na comparação entre gêneros.Portanto, nas análises subseqüentes, foi utilizada a seqüência consenso para cada gênero, exceto paraAratinga, cujas espécies amostradas são representantes de linhagens independentes (Tavares e col.,2004; Ribas e Miyaki, 2004).Os resultados obtidos sugerem que os táxons que apresentam a organização comum dos genes aoredor da região controladora são: Anodorhynchus hyacinthinus, Ara ararauna, Aratinga aurea, Aratingaleucophthalmus, Aratinga solstitialis, Bolborhynchus lineola, Brotogeris chiriri, Cyanoliseus patagonus,Cyanopsitta spixii, Diopsittaca nobilis, Enicognathus leptorhynchus, Guarouba guarouba, Myiopsittamonachus, Nandayus nenday, Nannopsittaca dachileae, Orthopsittaca manilata, Primolius auricollis,Pyrrhura picta e Rhynchopsitta pachyryncha (Figuras 3.1b e 3.2). Os táxons que apresentam aorganização alternativa dos genes ao redor da região controladora são: Amazona xanthops, Deroptyusaccipitrinus, Forpus crassirostris, Graydidascalus brachyurus, Pionites leucogaster, Pionopsitta barrabandi,Pionopsitta pileata e Triclaria malachitacea (Figuras 3.1d, 3.1e e 3.3).69

Capítulo 3Figura 3.2. Seqüências obtidas (representadas por linhas e seus tamanhos) para cada táxon de psitacídeoneotropical com a ordem comum em aves e seqüências de trabalhos anteriores (em cinza; número deacesso no GenBank e tamanho abaixo dos segmentos; Miyaki e col., 1998; Tavares e col. 2004; Ribas eMiyaki, 2004). As posições dos “primers” usados nas reações de sequenciamento estão representadas nomapa.Figura 3.3. Seqüências obtidas (representadas por linhas e seus tamanhos) para cada táxon de psitacídeoneotropical com a ordem alternativa em aves, seqüências obtidas de outro trabalho (em cinza; número deacesso no GenBank e tamanho abaixo do segmento; Tavares e col. 2004). a) mapa da ordem alternativade Amazona e Pionus (Eberhard e col. 2001); b) mapa da ordem alternativa de Deroptyus e Pionites. Aposição dos “primers” usados nas reações de sequenciamento estão representadas nos mapas.70

Capítulo 3Não foram identificados pseudogenes nas seqüências dos táxons que apresentam a organizaçãocomum dos genes. Para esses táxons, em geral a seqüência obtida inclui parte do RNAt Thr , o RNAt Pro , ogene NADH6, o RNAt Glu e parte da RC. Para nove indivíduos foi obtida a seqüência entre o final docitocromo b e o início do RNAr 12S (Figura 3.2). Para a maioria dos táxons estudados que apresentam aorganização alternativa foram obtidas as seqüências do início da RC 1 e da RC 2, além do RNAt e depsedogenes anteriores à porção 5’ da RC 1. Deroptyus accipitrinus e Pionites leucogaster apresentam umpseudogene com cerca de 65 pb cuja seqüência se assemelha muito a do tRNA Pro e uma outra porção com230 e 264 pb, respectivamente, que apresenta alguma similaridade com NADH6 (Figuras 3.3b e 3.4),sugerindo que podem apresentar a organização dos genes semelhante à ordem alternativa (Figura 3.1e).Pionopsitta pileata, Pionopsitta barrabandi e Triclaria malachitacea apresentam um pseudogene que variade 40 a 92 pb cuja seqüência se assemelha a parte do NADH6 e uma outra porção entre 59 a 64 pb quese assemelha ao RNAt Glu (Figuras 3.3a e 3.5) e ambos são correspondentes aos pseudogenes descritosem espécies de Amazona e Pionus (Eberhard e col. 2001). Forpus crassirostris apresenta pseudogenesdesses mesmos genes com 68 e 43 pb, respectivamente (Figura 3.3a e 3.5).Pseudo RNAt ProDeroptyusPionitesA.farinosaTCAGAAAAAGAGGACTAAACCTCTATCACCAACTCCCAAAGCTGGCATTTTACATTAAACTATTCTCTCCAGAAAAAGAGGACCAAACCTC---CACCAACCCCCCAAAC-AACACCCCACATTAACCCCCCCCCCTCAGAAAAAGAGGACTAAACCTCCATCACCAGCTCCCAAAGCTGGCGTTTTAAATTAAACTATTTCCTPseudo NADH6Deroptyus ------------------------GCC-CACAAACAACCCCAACAAGACCCCCGTCTCCCACAGCCCCAGCACAACAGACAAAGCCAACPionites CCAACAGCAAACAACCYTTAAAATGCACCTCACAATGCACCAACCTTCTCCCRTTCAATAAGTAGAGGAATAAAGGCTATAGAGAGGAADeroptyus AACAGCCCCTACTCAGCATAACAGTAA-AAAGGGG-GGGAGGGGG-GAAGGGGAAAAAGAAAACACCCCACCAACTG---CACTAAGACPionites GATGTGTCGGGGGGAGGAGGTAGGGGG-AAAGGAA--GGTGGGGAAGGGGGGAAGAAAAAACAAACCCTACCAACAGTAACACTAAAGTDeroptyus CAACCCAAATAAACCGCCACAAAACCAACCT-CAAACCTCCACCCTACC-AATCCCGATTCAACTCCCTAATAAGCCACCACTCA----Pionites TAACCCTTAAAAAC-ACCACACAACCAACCT-TAGACCCTTACTCAACT-AATCATAAACCCACGGCCTAAAACCTCTATCCTCCCCTAFigura 3.4. Seqüência do pseudo RNAt pro , comparada com a seqüência funcional de RNAtPro em Amazonafarinosa (Eberhard e col. 2001), e do pseudo NADH6 antes da RC 1 de Deroptyus accipitrinus e Pionitesleucogaster. Regiões de maior homologia entre os táxons estão indicadas em negrito.71

Capítulo 3Pseudo NADH6Amazona ---CCCACCCAAAAACCCTCACCCTACAACCAATGAAGCCCCCAACACAACAACACCA-------------AGGCGCAAAForpus -AAC----CCAAAATTTCCCCAATAAACAACAGTAAACCCTAATTAC-AAATAAAACAC----------------CCAAAP.barrabandi TACCACCAACCCCCAAAA-CCACCCCAACCACCCC-ATTAAACCCACAAAGCACCCCA----------CAACACCAAAACP.pileata CACC------AGAAAGCT-AACCCCCAACAACACCCCATCAGCCCACCTAAAGCAAT------------------ACAAAPionus TCTCACCCCAAACTCCCCACCACAATAAGCAAGCCTAAACACAACAACACCACCAAATATTAACCCACCCCAAAAGCAAAtriclaria TCCC----GCTAAAAACACCACCC------------------------------------------------GACACAAAAmazona ATAGGCCATAAGForpus --AGGCCATAGAP.barrabandi AAAGGCCATAAGP.pileata ACAGGCCATAAGPionus ATAGGCCATAAGtriclaria ACAGGCCATAAGPseudo RNAt GluAmazona TTTCTCAGATCAAA--CCATCCAAAGCTTATGGCCTATTAACCGCCTC--AGCACATCAACCA-TAAForpus GTCC-CACCCAGA-C---CCCCTCACTCTATGGCCTAAAAGTCCACTC-------------------P.barrabandi CCTC-TACCCAAAAA-TCATCAAAGGCTTATGGCCAAAAAAGC-CAACCCAGCATTTAAACCA-C--P.pileata TCCC-CACTCAAAAA-TGACTGGGGACTTATGGCCTACAAACCACCACTATGTACTTCAACCA-TACPionus CTTT-CAGAGTCGCGTCTGTCCAAAGCTTATGGCCTAAACCATACCTA-GTGTACCTACCATAATAATriclaria CTTC-TACCC--AAA-CTATCTAAAGCTTATGGCCTA-AAACTTCC-CTTAGTACTCTTAACA-TGGFigura 3.5. Seqüência de pseudogenes dos táxons Amazona farinosa (Eberhard e col. 2001), Forpuscrassirostris, Pionopsitta barrabandi, Pionopsitta pileata, Pionus chalcopteris (Eberhard e col. 2001) eTriclaria malachitacea. Regiões de maior homologia entre os táxons estão indicadas em negrito.3.3.1. Mapeamento de hipótesesO mapeamento das ordens gênicas de psitacídeos neotropicais em uma hipótese filogenética(Tavares e col., in prep.) sugere que há ambiguidade quanto ao estado ancestral de alguns grupos (Figura3.6a). A partir desse resultado e dos pseudogenes presentes nos grupos, dois modelos de evolução foramlevantados:a) Duplicações independentes do segmento dos genes RNAt Pro / NADH6/ RNAt Glu / RC teriam ocorridonas linhagens ancestrais dos clados B, D e F. Essas duplicações seriam seguidas de deleções dosgenes RNAt Pro / parte do NADH6 e do RNAt Glu nos clados B e D. No clado F teria ocorrido adeleção parcial dos genes RNAt Pro / NADH6 e total do gene RNAt Glu . Esse modelo presupõe aexistência de pelo menos seis eventos, sendo três de duplicação de genes e três de deleções degenes (Figura 3.6b).b) Um único evento de duplicação gênica teria ocorrido no ancestral dos clados B, C, D, E e F e cincoeventos de deleção de genes, sendo dois eventos convergentes. Nos clados C e E, a deleçãolevaria à organização comum em aves e nos clados C e D, a deleção resultaria em pseudogenesde RNAtGlu e NADH6. Um evento distinto de deleção de genes resultaria no padrão descrito emPionites e Deroptyus (Figura 3.6c).72

Capítulo 3a)b) c)Figura 3.6. a) Mapeamento dos estados da ordem gênica na inferência filogenética de Tavares e col. (inprep.); b) modelo considerando três eventos independentes de duplicação; c) modelo considerando umevento de duplicação. O período estimado para os eventos estão representados em milhões de anos, ma.73

Capítulo 33.3.2. Caracterização dos genesForam obtidas seqüências completas de NADH6 de Anodorhynchus, Ara, Aratingaleucophthalmus, Aratinga solstitialis, Bolborhynchus, Brotogeris, Cyanolyseus, Cyanopsitta, Diopsittaca,Enicognathus, Graydidascalus, Guarouba, Nannopsittaca, Orthopsittaca, Primolius e Rhynchopsitta.Seqüências parciais do mesmo gene (incompletas na porção 3’) foram obtidas de Aratinga aurea,Myiopsitta, Nandayus e Pyrrhura. Quando comparadas com as as seqüências homólogas de Amazonafarinosa, Pionus chalcopteris (Eberhard e col., 2001), Strigops habroptilus (Harrison e col., 2004) e Gallusgallus (Desjardins e Morais, 1990), verificamos uma variação no códon de parada, sendo esse TAA emGallus e Orthopsittaca, AGG em Bolborhynchus, Brotogeris e Nannopsittaca, e TAG nos demaispsitacídeos comparados. As lacunas de alinhamento ocorrem em trincas, de forma que não foi identificadaalteração no quadro de leitura em nenhum táxon. O alinhamento dessas seqüências sugere que emrelação à Gallus gallus, o número a menos de trincas é de: uma em Amazona farinosa, duas nos gênerosStrigops, Bolborhynchus, Nannopsittaca e Graydidascalus, três nos gêneros Anodorhynchus, Ara, Aratinga,Cyanopsitta, Cyanoliseus, Diopsittaca, Enicognathus, Guarouba, Nandayus, Orthopsittaca, Primolius,Pyrrhura e Rhynchopsitta, e seis nos gêneros Brotogeris e Myiopsitta.Foram obtidas as seqüências completas da RC para Anodorhynchus, Ara, Cyanopsitta,Diopsittaca, Graydidascalus (RC2) e Guarouba, e as seqüências parciais da RC, RC1 e RC2 para osdemais táxons (Figuras 3.2 e 3.3). Essas seqüências foram alinhadas com a RC1 e RC2 de Amazonafarinosa e Pionus chalcopterus (Eberhard e col., 2001). Em alguns trechos do primeiro domínio ocorregrande variabilidade entre gêneros menos relacionados taxonomicamente, o que torna o alinhamentobastante incerto, principalmente nas comparações com os táxons Bolborhynchus, Nannopsittaca,Myiopsitta, Brotogeris e Forpus em relação aos demais e entre si. Apesar disso, para a maioria dasseqüências comparadas foi identificado o “goose hairpin”, uma região repetitiva de composição C 7 TAC 7 ,exceto em Amazona farinosa e Deroptyus accipitrinus cuja composição é C 8 TAC 7 (Eberhard e col., 2001) eATC 3 TAC 7 , respectivamente. O “goose hairpin” só não é presente no RC2 do táxon Graydidascalusbrachyurus (seqüência dessa porção na RC1 não disponível). Comparações de distância-p sugerem que,em geral, nos táxons onde ocorrem duas cópias da RC (RC1 e RC2), elas são mais semelhantes entre sido que as cópias homólogas de táxons distintos, com exceção de Pionopsitta barrabandi. Como esperado,o segundo domínio é mais conservado, sendo possível identificar os blocos F, E, D e C para a maioria dostáxons compadados e também o “bird box” e o CSB-1 para os táxons que apresentavam a RC completa(Figura 3.7).74

Capítulo 3Bloco FBloco ENannopsittaca GGGCTACTCACGAGAAATCATCTACCCG Nannopsittaca CACGACTAGCTTCAGGATCATP.pileata rc1 GGGCTACTCACGTGAAACCATCTACCCG P.pileata rc2 CGTTCCTAGCTTCAGGTCCTTP.pileata rc2 GGGCTACTCACGTGAAACCATCTACCCG P.pileata rc2 CGTTCCTAGCTTCAGGTCCTTTriclaria rc1 GGGCTACTCACGTGAAACCATCTACCCG Triclaria rc1 CGTTCCTAGCTTCAAGTCCTTTriclaria rc2 GGGCTACTCACGTGAAACCATCTACCCG Triclaria rc2 CGTTCCTAGCTTCAAGTCCTTP.barrabandi rc1 GGGCYACTCACGTGAAACCATCTACCCG P.barrabandi rc1 CATGACTAGGTTCAGGCCCTTP.barrabandi rc2 GGACTTCTCACGAGAAATCAGCAACCTG Graydidascalus rc2 CGTTACTAGTTTCAGGCCCATGraydidascalus rc2 TTACATCTCACGAGAAATCACCAACCCG A.farinosa rc2 CGTTCCTAGCTTCAGGTCCATA.farinosa rc2 GGTCATCTCACGTGAAATCATCTACCCG Pionus rc1 CACGCCCAGCGTCAGGTCCATPionus rc1 GGGCTACTCACGTGAAATCATCAACCCG Pionus rc2 CACGCCCAGCGTCAGGTCCATPionus rc2 GGGCTACTCACGTGAAATCATCAACCCG Myiopsitta CGTTACTAGCTTCAGGATCATMyiopsitta GAACCACTCACGAGAAACCATCAACCCG Brotogeris TGCTACTAGCGTCAGGAGCATBrotogeris GGGCAACTCACGAGAAATCACCTACCCC Forpus rc1 CATTCCTAGCTTCAGGTCCATForpus rc1 GGGCAACTCACGTGAAACCATCTACCCG Anodorhynchus CCTTCCCAGCGTCAGGTCCATEnicognathus TGGCTACTC------------------- Guarouba CCTTCCCAGCGTCAGGTCCATCyanolyseus TGGTTACTCGCGAGAGATCA-------- Diopsittaca CCTTCCCAGCGTCAGGTCCATAnodorhynchus TGACTACTCACGAGAGATCACCAACCCG A.aurea CCCTCCCAGCGTCAGGTCCATGuarouba TGACAACTCACGAGAGATCATCAACCCG Cyanopsitta CCTTCCCAGCGTCAGGTCCATDiopsittaca TGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCG Orthopsittaca TCTTCCCAGCGTCAGGTCCATA.solstitialis TGGCTACTCACGAGAGATCACCAATCCG Ara CGTTCCCAGCGTCAGGTCCATA.aurea TGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCG Primolius TATTCCCAGCGTCAGGTCCATCyanopsitta TGACTACTCACGAGAGATCACCAACCCG Nandayus CGTTCCCAGCGTCAGGTCCATOrthopsittaca TGGCTACTCACGAGAGATCATCAACCCG Pyrrhura CGTTCCTAGCGTCAGGTCCTTAra TGGCTACTCACGAGAGATCATCAACCCG Pionites rc2 CGTTCCTAGCGTCAAGTCCATPrimoliusTGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCGNandayusTGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCGRhynchopsitta TGGCAACTCT------------------PyrrhuraTGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCGDeroptyusTGGCTTCTCACGAGAAATCAGCAACCCAPionites rc1 TGGCTATTCGCGAGAAATCAGCA-CC--Pionites rc2 TGTCTATTCGCGAGAAATCAGCAACCGGBloco DBloco CNannopsittaca CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Nannopsittaca CCTTCACAGAGCCATCTCTGCTAGTCTGP.pileata rc1 CCTCTGGTTC--------------- P.pileata rc2 TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTAATATP.pileata rc2 CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Triclaria rc1 TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTGTriclaria rc1 CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Triclaria rc2 TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTGTriclaria rc2 CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Graydidascalus rc2 TCACA-GAGACA--TTTCTCGTGGTTTGP.barrabandi rc1 CCTCTAG------------------ A.farinosa rc2 TCACT-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTGGraydidascalus rc2 CATTTGGTTAGTAGGTCAGGGACAT Anodorhynchus CTATC-GGGTCATCTGGTTCGCTATCCTA.farinosa rc2 CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Guarouba CCATC-TGGCCATCTGGTTCGCTATTTGMyiopsitta CCTCTGGTTCCTAGATTA------- Diopsittaca CCATC-TGGCCATCTGGTTCGCTATTTGBrotogeris CCTCTGGTTCCTAGG---------- A.aurea CTATC-AAGCCATCTGGTTCGCTATATGForpus rc1 CCTCTGGT----------------- Cyanopsitta CTATC-TGGCCATCTGGTTCGCTATTTGAnodorhynchus CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Ara CCATC-TGGTCATATGGTTCGCTATTATGuarouba CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Primolius CCATC-TGGCCATATGGTTCGCTATTTGDiopsittaca CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Nandayus CCATC-TGGCCATCTGGTTCGCTATTTGA.aurea CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Pyrrhura TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTACyanopsitta CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Pionites rc2 TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTGOrthopsittaca CCTCTGGTTCCTAGGTCAGGG----Ara CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAC Bloco de AvesPrimoliusCCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACATNandayus CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Graydidascalus rc2 CACTAATGTACTCCAPyrrhura CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT A.farinosa rc2 CACTGATGCACTTTGPionites rc2 CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT Anodorhynchus CCCTGATGCACTTTGGuaroubaCCCTGATGCACTTTGDiopsittaca CCCTGATGCACTTTGCyanopsitta CCCTGATGCACTTTGAraCCCTGATGCACTTTGFigura 3.7. Blocos conservados no segundo domínio da região controladora. A ordem dos táxonscorresponde à ordem dos clados da Figura 3.6. Como não foi possível obter seqüências completas paratodos os blocos de todos os táxons, o sinal “-“ representa o final da seqüência.75

Capítulo 3A alta variabilidade apresentada no terceiro domínio dos táxons com a RC completa, inviabilizou oalinhamento dessa região entre grupos menos relacionados taxonomicamente, como entre representantesdo clado B e do clado E (Figura 3.6). Nessa região os táxons Amazona e Triclaria do clado B compartilhamum bloco formado por TA 2 CA 3 CA 4 CA 3 CA 3 CCACA 3 CA 3 que não é presente em Graydidascalus brachyurus.Os táxons Anodorhynchus hyacinthinus, Ara ararauna, Cyanopsitta spixii, Diopsittaca nobilis e Guaroubaguarouba compartilham similaridades nessa região, apesar de não apresentarem regiões repetitivas.3.4. DiscussãoAs organizações gênicas ao redor da região controladora descritas para os gêneros de psitacídeosneotropicais sugere que durante a evolução do grupo, ocorreram convergências ao longo das linhagens, jáque táxons de clados diferentes apresentam a mesma organização (Figura 3.6). Apesar de eventos derearranjo dos genes serem considerados pouco freqüentes e únicos em algumas linhagens animais (Booree Brown, 1998; Morrison e col., 2001), a convergência múltipla na organização dos genes mitocondriais aoredor da região controladora foi evidenciada anteriormente em aves (Mindell e col., 1998; Bensch e Härlid,2000).O mecanismo de duplicação e posterior deleção de genes duplicados (Moritz e col., 1986, 1987;Macey e col., 1997; Holt e col., 1997) é o que melhor explica a mudança da ordem comum para a ordemgênica descrita dentre os grupos de aves, porque a mudança de ordem aconteceu entre genes fisicamentepróximos, além disso foram encontradas regiões duplicadas e pseudogenes em Falco peregrinus (Mindelle col. 1998), Phylloscopus (Bensch e Härlid, 2000), Amazona e Pionus (Eberhard e col., 2001) queapresentam a organização alternativa. Assumindo esse mecanismo, duas possíveis maneiras para explicaras diferentes organizações gênicas nos psitacídeos neotropicais foram testadas. Em ambas, consideramosque o ancestral dos psitacídeos neotropicais apresentava a organização comum dos genes em aves,porque não existe nenhuma evidência que sugere o contrário.Se a ordem alternativa fosse o estado ancestral, isso implicaria na necessidade de haver maiseventos de mudança de ordem gênica no grupo, já que os representantes da linhagem de psitacídeosneotropicais que se separou inicialmente das demais linhagens (Bolborhynchus e Nannopsittaca)apresentam a organização comum. Além disso, Strigops habroptilus, representante atual do primeiro cladoda ordem Psittaciformes a se separar dos demais (Barrowclough e col. 2004; de Kloet e de Kloet, 2005)também apresenta a organização comum em aves. Finalmente, a inferência dos estados ancestrais por76

Capítulo 3máxima verossimilhança sugere maior probabilidade do ancestral dos neotropicais de apresentar aorganização comum (Figura 3.4a).A princípio, as duas hipóteses consideradas são igualmente prováveis para explicar a evolução docaráter no grupo, no entanto, o modelo que assume três eventos independentes de duplicação de genes edeleção posterior de cópias duplicadas (Figura 3.4b) parece mais provável, já que nenhuma das linhagensde psitacídeos neotropicais que apresentam a organização comum dos genes em aves apresenta vestígiode genes duplicados, como acontece nas três linhagens que apresentam a organização alternativa. Comoos eventos de perda de genes em todas as linhagens teriam acontecido em períodos próximosconsiderando o modelo apresentado na Figura 3.6c, seria esperado encontrar resquícios de genesduplicados nas linhagens C e E. Hipoteticamente, é possível imaginar a reversão para a ordem comum deaves a partir de uma duplicação de genes, ou mesmo a partir de uma ordem alternativa onde as duascópias da RC são potencialmente funcionais, como ocorre em Amazona e Pionus (Eberhard e col. 2001).No entanto, até o momento não foi descrito em nenhum dos grupos de aves que apresentam a ordem degenes comum (ex. Desjardins e Morais, 1990; Boore, 1999) vestígios de genes duplicados, como aconteceem alguns táxons que apresentam a ordem alternativa, portanto, não existe nenhuma evidência maisconcreta em psitacídeos ou mesmo em aves sugerindo que a ordem comum pode ser revertida a partir deum processo de duplicação, ou mesmo a partir da ordem alternativa. De qualquer forma, o modelo nãopode ser desconsiderado.Forpus e táxons da linhagem de papagaios, curicas e afins (clado C), apresentam pseudogenescom alguma similaridade com as regiões de NADH6 e RNAt Glu . O interessante é que os pseudogenesencontrados em ambos os clados apresentam alguma similaridade, o que tornou possível seu alinhamento.No entanto, em ambos os modelos considerados, a deleção de genes nos dois grupos teria ocorridoindependentemente, ou seja por convergência. Alternativamente, poderiamos considerar um cenário ondeesses táxons compartilhassem um único evento de deleção. Isso sugeriria que a posição filogenéticadesses grupos seria um pouco diferente da proposta filogenética que estamos considerando (Tavares ecol., in prep.). O suporte de “bootstrap” das análises de máxima verossimilhança dos ramos que definem aposição filogenética de Forpus no clado que inclui as araras, marianinhas e afins não é muito alto, apesarde a probabilidade posterior da análise bayesiana ser relativamente elevada (Tavares e col., in prep.). Noentanto, um cenário alternativo onde Forpus seria grupo irmão dos táxons da linhagem B (Figura 3.6) nãofoi recuperado por nenhum dos métodos de inferência filogenética testados (Tavares e col, in prep.),sustentando a possibilidade de convergência nos eventos de deleção de genes. Isso poderia indicar que77

Capítulo 3um mecanismo de deleção não aleatória dos genes duplicados poderia atuar em aves, como propostoinicialmente para artrópodes dos gêneros Narceus e Thyropygus (Lavrov e col., 2002). Apesar de talmecanismo não ter sido testado em aves, a deleção não aleatória dos genes duplicados poderia explicar aconvergência para a ordem alternativa em várias linhagens independentes de aves (Mindell e col., 1998,Bensch e Härlid, 2000, Eberhard e col., 2001) a partir de uma duplicação hipotética que poderia levar aoutros arranjos gênicos nunca descritos, como por exemplo o posicionamento do gene NADH6 entre oRNAt Thr e RNAt Pro .Seria esperado supor que, se o rearranjo gênico ocorreu em uma linhagem ancestral comum entrealguns táxons, cada uma de suas regiões controladoras deveria apresentar mais similaridade com asregiões controladoras homólogas das demais linhagens (cópias ortólogas) do que com a segunda RCpresente no mesmo táxon (cópias parálogas). Nesse sentido, se assumirmos um único evento deduplicação e deleção na linhagem ancestral comum aos táxons do clado B, as RC 1 desses gênerosdeveriam ser mais próximas entre si, do que as RC 1 e RC 2 de cada um desses grupos. No entanto, issonão acontece, as RC parálogas são mais próximas entre si. O mesmo acontece no clado F. Apesar de nãoter sido obtida seqüência da segunda RC para Deroptyus, a distância entre RC 1 desse táxon e de Pionitesé maior do que a distância entre RCs de Pionites. A princípio, isso sugere que em cada táxon dessalinhagem aconteceu um único evento de duplicação de genes, seguido de um único evento de deleção degenes. Entretando, isso não acontece apenas ao nível genérico. Entre espécies do gênero Amazona issotambém foi descrito (Eberhard e col., 2001). Portando, a existência de eventos independentes para cadaum desses casos, seria pouco provável. RCs duplicadas e que apresentam baixa taxa de divergência entreas cópias também foram descritas em pepinos do mar (Arndt e Smith, 1998), cobras (Kumazawa e col.,1998) e outros grupos (Black e Roehrdanz, 1998; Campbell e Barker, 1999; Kumazawa e col., 1995).Eberhard e col. (2001) levantaram três hipóteses pelas quais um ou mais mecanismos de conversãogênica poderiam estar atuando nas RCs parálogas, de forma a mantê-las semelhantes: 1) um mecanismode conversão gênica envolvendo apenas as porções convergentes; 2) um mecanismo de conversão gênicaenvolvendo a região controladora inteira com evolução extremamente rápida das porções não- funcionais;e 3) seleção paralela para manter a funcionalidade de ambas as regiões. Nenhuma das hipóteses por si sóexplica os dados obtidos e os elementos para descartar qualquer uma delas são insuficientes. Portanto,seria interessante comparar a seqüência completa das regiões parálogas de cada táxon a fim de melhorentender o mecanismo que melhor explicaria os eventos de convergência de RC nos psitacídeosneotropicais. As regiões comuns presentes no terceiro domínio da RC de Amazona e Triclaria poderiam78

Capítulo 3estar presentes no ancestral do clado que une esses grupos e ter sido perdido em Graydidascalus, já queesse clado estaria mais relacionado taxonomicamente a Amazona do que a Triclaria.Os dados apresentados aqui contribuem para o melhor entendimento da evolução do genomamitocondrial em aves. Os resultados obtidos são compatíveis com o modelo de mudança da ordemcomum em aves para a ordem alternativa por duplicação seguida de deleção de genes. Além disso, osdados sugerem que vários eventos de rearranjo gênico podem ter ocorrido entre táxons filogeneticamentepróximos e que de algum modo pode haver convergência na maneira como os genes duplicados sãoperdidos em aves, o que torna ainda mais discutível o conteúdo filogenético desse caráter para estudar aevolução de aves. Algum mecanismo de evolução em concerto também parece operar entre as regiõescontroladoras, como foi sugerido inicialmente para Amazona e Pionus (Eberhard e col., 2001).3.5. ReferênciasArndt, A., Smith, M.J., 1998.Mitochondrial gene rearrangement in sea cucumber genus Cucumalia. Mol.Biol. Evol. 15, 1009-1016.Barrowclough, G.F., Groth, J.G., Mertz, L.A., 2004. Phylogenetic relationships among parrots. One Hundredand Twenty-Second Stated Meeting of the American Ornithologists’ Union. 16 – 21 August, Laval,Quebec.Bensch, S., Härlid, A., 2000. Mitochondrial genomic rearrangements in songbirds. Mol. Biol. Evol. 17, 107-113.Black, W.C.I., Roehrdanz, R.L. 1998. Mitochondrial gene order is not conserved in arthropods: prostriateand metastriate tick mitochondrial genomes. Mol. Biol. Evol. 15, 1772-1785.Boore, J.L., 1999. Animal mitochondrial genomes. Nucl. Acids Res. 27, 1767-1780.Boore, J.L., Brown, W.M., 1998. Big trees from little genomes: mitochondrial gene order as a phylogenetictool. Curr. Opin. Genet. Dev. 8, 668-674.Boore, J.L., Collins, T.M., Stanton, D., Daehler, L.L., Brown, W.M., 1995. Deducing the pattern of arthropodphylogeny from mitochondrial DNA rearrangements. Nature 376, 163-165.Bruford, M.W., Hanotte, O., Brookfield, J.F.Y., Burke,T., 1992. Single-locus and multilocus DNAfingerprinting. Pages 255-269 in Molecular Genetic Analyses of Populations - a Practical Approach (A.R. Hoelzel, Ed.). Oxford University Press, New York.Campbell, N.J.H., Barker, S.C. 1999. The novel mitochondrial gene arrangements of the cattle tick,Boophilus microplus: fivefold tandem repetition of a coding region. Mol. Biol. Evol. 16, 732-740.79

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Capítulo 4Considerações finais

Capítulo 4A presente tese se insere no contexto da biologia evolutiva que busca inferir a história da evoluçãoe elucidar seus mecanismos. A filogenia tem por objetivo entender as relações de parentesco entre osorganismos pelo princípio da ancestralidade comum. O estudo dessas relações fornece subsídios geraispara interpretar vários outros aspectos das da evolução, por exemplo, como ocorrem as modificaçõesfisiológicas, ecológicas, etológicas, morfológias, moleculares, dentre outras. Além disso, com base nasfilogenias, pode-se inferir o tempo de divergência entre as linhagens e levantar ou testar hipótesesbiogeográficas. Na presente tese, vários aspectos da biologia evolutiva dos psitacídeos neotropicais foramestudados. Inicialmente foi realizada uma filogenia abrangente dos gêneros do grupo com base em 6.461pb de seqüências de DNA nuclear e mitocondrial. Essa análise recuperou:• Um clado de pequenos periquitos (Bolborhynchus e Nannopsittaca) como grupo irmão dos demaispsitacídeos neotropicais, que por sua vez se dividem em dois grupos, um formado por papagaios,caturritas, curicas e afins (Amazona, Pionus, Graydidascalus, Pionopsitta, Triclaria, Myiopsitta eBrotogeris) e outro formado por araras, marianinhas, tiribas e afins (Ara, Primolius, Orthopsittaca,Cyanopsitta, Diopsittaca, Guarouba, Nandayus, Aratinga, Anodorhynchus, Cyanoliseus,Enicognathus, Rhynchopsitta, Pyrrhura, Deroptyus, Pionites e Forpus).• No clado que inclui papagaios, caturritas, curicas e afins as relações internas são bem resolvidas,enquanto no clado formado por araras, marianinhas tiribas e afins, a maior parte das relaçõesforam bem resolvidas, mas algumas relações permanecem pouco suportadas ou não resolvidas,padrão possivelmente decorrente de uma rápida radiação que se reflete nos curtos tamanhos deramo entre essas linhagens nas topologias obtidas.• Os resultados descritos na presente tese aumentou muito o conhecimento das relaçõessistemáticas e filogenéticas ao nível de gêneros dentre os psitacídeos da tribo AriniA história da evolução de alguns caracteres morfológicos, comportamental e genético foi estudadapelo mapeamento dos estados atuais na inferência filogenética proposta. O resultado dessas análises,sugere que:• Os caracteres morfológicos, (comprimento da cauda, forma da cauda, dimorfismo sexual aparente,íris bi-colorida, narinas expostas e anel perioftalmico nu) e comportamental (posição da perna aocoçar a cabeça) apresentaram convergência e portanto, não podem isoladamente ser usados paraa diagnose dos clados obtidos na presente inferência filogenética.• O caráter genético (minissatélites ligados ao cromossomo sexual W) pode apresentar sinalfilogenético, mas ainda não foi estudado para todos os táxons incluídos na inferência filogenéticaproposta nessa tese, portanto essa conclusão seria prematura.84

Capítulo 4Foram realizadas estimativas dos tempos de divergência dos clados obtidos na inferênciafilogenética. As divergências foram comparadas com fatores históricos que poderiam ter influenciado nadiversificação dos grupos:• O ancestral dos psitacídeos neotropicais se separou do ancestral australasiático entre 51-67milhões de anos (ma), portanto a separação da Austrália e Antártica possivelmente teve um papelimportante na separação ou isolamento desses grupos.• As linhagens mais antigas de psitacídeos neotropicais se diversificaram no início do Eoceno (entre42-57 ma), período no qual a América do Sul e a Antártica eram conectadas.• Padrões de cladogênese bem distintos foram observados em dois grandes clados de psitacídeosneotropicais. Os gêneros de papagaios e afins diversificaram de forma contínua de 12-54 ma, coma maioria dos eventos acontecendo entre 20-46 ma. No entanto, no clado das araras e afins, umalinhagem que deu origem ao atual gênero Forpus divergiu das demais entre 39-54 ma, isso foiseguido de um período de cerca de 20 ma onde não é registrada diversificação no clado dasararas e afins, até que entre 4-34 ma ocorreu cladogênese de forma expressiva em uma daslinhagens.• Os papagaios e afins podem ter evoluído associados a ambientes florestais na América do Sul, jáque a cladogênese do grupo coincide com a reposição de flora e o aumento da distribuição dasflorestas tropicais dessa região. Além disso, muitas das linhagens atuais desse clado ocorremnesses ambientes.• A grande diversificação (entre 22-34 ma) do grupo das araras, maracanãs e afins, pode terocorrido em resposta a uma grande diversificação de ambientes secos ocorrida no Mioceno, umavez que muitas linhagens atuais desse grupo ocupam ambientes com características semelhantes.A falta de registro de diversificação antes desse período poderia ser explicada por uma extinçãodas linhagens que teriam se diversificado.• Outras possibilidades envolvem a existência de uma barreira isolando membros dos clados dospequenos periquitos e do clado das araras, maracanãs e afins e após a barreira ter desaparecido,houve uma dispersão do grupo para ambientes antes pouco explorados. Duas possíveis barreirasseriam: um mar transcontinental formado no sul da Argentina e do Chile durante o Oligoceno; oualgumas linhagens poderiam estar evoluindo na Antártica e teriam sido impulsionados para aAmérica do Sul, à medida que a Antártica migrou mais para o sul e se tornou um continenteincrustrado por gelo.85

Capítulo 4A organização dos genes mitocondriais ao redor da região controladora foi determinada para amaioria dos gêneros de psitacídeos neotropicais. Esses resultados associados a outros obtidos emtrabalhos anteriores foram mapeados na inferência filogenética e alguns aspectos da evolução dessecaráter no grupo estudados estão apresentados a seguir:• Apresentam a ordem de genes comum de aves táxons do clado de pequenos periquitos(Bolborhynchus e Nannopsittaca), as primeiras linhagens a se diferenciar no grupo dos papagaiose afins (Myiopsitta e Brotogeris) e espécies do clado das araras e afins (Ara, Primolius,Orthopsittaca, Cyanopsitta, Diopsittaca, Guarouba, Nandayus, Aratinga, Anodorhynchus,Cyanoliseus, Enicognathus, Rhynchopsitta e Pyrrhura).• A ordem de genes alternativa está presente na maior parte dos representantes do clado dospapagaios e afins (Pionopsitta, Graydidascalus,Triclaria, Amazona e Pionus) e em três gêneros doclado das araras e afins (Deroptyus, Pionites e Forpus).• O mapeamento sugere convergência na mudança de ordem dos genes e a inferência dos estadosdesse caráter em alguns ancestrais foi ambígua, sugerindo mais de uma possibilidade paraexplicar a origem desses eventos. Duas hipóteses foram levantadas:1. A primeira hipótese assume seis eventos independentes, sendo três de duplicação, seguido de trêsde deleção de genes, que teriam ocorrido após 54 ma, entre 32-54 ma e após 29 ma,respectivamente, levando três linhagens a apresentar a ordem alternativa.2. A segunda hipótese, assume um único evento de duplicação (entre 41-56 ma) seguido de cincoeventos independentes de deleção posterior de genes, sendo que dois reverteriam para a ordemcomum em aves (entre 26-54 ma e 20-35 ma) e três dariam origem à ordem alternativa (após 54ma, entre 32-54 ma e após 29 ma).• Como não dispomos de elementos para identificar se duplicações ou deleções de genes são maisprováveis de acontecer, não pudemos concluir qual o mecanismo mais provável para explicar osdiferentes arranjos nessa linhagem.• A presença de pseudogenes que representam resquícios dos eventos de duplicação somente nostáxons que apresentam o arranjo alternativo, não favorece nenhuma das hipóteses, mas evidenciaelementos exclusivos de alguns clados e outros convergentes.• Sugerimos que a mudança de ordem gênica em Aves poderia envolver um mecanismo deduplicação e deleção não aleatória dos genes duplicados, modelo que foi proposto para explicaralteração de ordem gênica em Diplopoda.ATUALIDADES ORNITOLÓGICAS N.128 – NOVEMBRO/DEZEMBRO DE 2005 – P. 586