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QBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO VITRANSAMINAÇÃOOBJETIVO: Verificar a reação de transaminação em homogenato de fígado.INTRODUÇÃOA transaminação consiste na transferência reversível do grupo amino de umaminoácido a um cetoácido sem que o grupo -NH 2 ou -NH+ 3 fique livre no meio aquoso. Oaminoácido perde o grupo amino e se converte no cetoácido correspondente e o cetoácidoque ganha o grupo amino se converte no aminoácido respectivo.As transaminases se econtram na maioria dos tecidos animais. Todos os aminoácidosque fazem parte das proteínas participam em transaminações enzimáticas, com exceção dalisinaNesta experiência se identificarão os produtos de uma reação de transaminação pormeio de cromatografia em papel.MÉTODOUma alíquota de um homogenato de fígado será incubada com um aminoácido e umcetoácido. A identificação dos produtos da reação será feita por cromatografia em papel.PREPARAÇÃO DO HOMOGENATO DE FÍGADO DE RATOO Fígado de um rato é picado e lavado 2 vezes com 20 ml de tampão fosfato 0,05 M,pH 7,4 e em seguida é homogeneizado com 10 ml deste tampão fosfato. Este homogenato écentrifugado a 800 x g por 15 minutos para eliminar células não destruídas e núcleos. Osobrenadante é decantado em um tubo de ensaio mantido em gelo e esta fração consiste napreparação enzimática. Notar que não é necessária a enzima pura para que esta catalise areação.REAÇÃO DE TRANSAMINAÇÃOO sistema completo de reação é composto por um aminoácido, um cetoácido, apreparação enzimática, arsenito de sódio (NaAsO 2 ) e um tampão. O arsenito é empregadocom a finalidade de evitar a oxidação posterior dos cetoácidos pelo sistema enzimáticopresente no hepatócito.MISTURA DE REAÇÃOα-cetoglutarato 0,2 M, pH 7,4 - 0,1 mlAlanina 0,2 M, pH 7,4 - 0,1 mlPrep. enzimática - 0,2 mlTampão fosfato 0,05 M, pH 7,4 - 0,2 mlArsenito de Sódio 0,2 M - 0,2 mlIncubar a 37 o C por 30 minutos. Em seguida colocar em banho-maria fervente por 3minutos. Centrifugar por 10 minutos em centrífuga Eppendorf. Decantar o sobrenadantetransferindo para um segundo tubo Eppendorf e fazer a cromatografia com os padrõesadequados.
CROMATOGRAFIAEm um papel de filtro Whatman n o 1 (10x20 cm) traçar com lápis uma linha a 2,5 cmda origem e marcar pontos com 2,5 cm de distância entre si. Colocar padrões de alanina,glutamato, piruvato e α-cetoglutarato, mistura de reação, branco * e 2,4-dinitrofenilhidrazina.Sobre os pontos onde foram aplicados o α-cetoglutarato, piruvato e mistura de reação,adicionar uma aplicação capilar de 2,4-dinitrofenilhidrazina.O solvente utilizado para a cromatografia será n-Butanol/Etanol/NH 4 OH (0,5N).(70:20:30).Após o solvente chega a 1 cm do final do papel, marcar a frente do solvente, secar opapel, marcar as manchas amarelas dos produtos de reação da 2,4-dinitrofenilhidrazina e osα-cetoácidos, e revelar o cromatograma com ninhidrina.* branco: mistura de apenas alanina e α-cetoglutarato.
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