apostila de exercícios

PROCEDIMENTO (7)1) Determinação da porcentagem de incorporação.Lipossomos 10mM serão obtidos por vortexação de asolecitina (L-α-fosfatidilcolinade soja tipo IV - S, Sigma Chemical Company, grau comercial) em solução 0.2mM de azulde metileno (AM).Quatro alíquotas de lipossomos com azul de metileno (LAM) de 1.0 ml cada serãosubmetidas a um processo de diálise em tubos de celofane contra água (2 l) sob agitaçãoconstante com barra magnética (0.5h). Como controle, simultaneamente será dialisada umasolução de azul de metileno 0.2mM (AM) (1.0 ml). Após a diálise, uma das quatro tripascontendo lipossomos (LAM) será rompida para determinação da porcentagem daincorporação, que é dada por:A2A2c% incorporação = 100. - , onde,A1A1cA 1 e A 2 são as absorbâncias a 660nm de uma alíquota de 0.2ml de LAM adicionada a 2mlde água e 1 ml de TRITON X-100 (1%) antes e depois da diálise, respectivamente.A 1c e A 2c são as absorbâncias a 660nm de uma alíquota de 0.2ml da solução de azul demetileno 0.2mM (AM) adicionada a 2ml de água e 1ml de TRITON X-100 (1%) antes edepois da diálise, respectivamente.Os dados a serem obtidos estão sumarizados na Tabela I.TABELA IDiálise e determinação da porcentagem de incorporação de AM em lipossomosde asolecitinaAMOSTRAS* ABSORBÂNCIA 660nm % DE INCORPO-RAÇÃOANTES DADIÁLISEAPÓS ADIÁLISELAM A 1 = A 2 =AM A 1c = A 2c =*Note bem que as leituras de absorbâncias a 660nm são feitas em 0.2ml de amostra, 2ml deágua e 1ml de TRITON X-100.Como branco pode-se usar 3ml de água destilada2) Determinação da permeação de AM induzida pela lipoperoxidaçãoPara induzir a lipoperoxidação, utilizaremos o sistema ácido ascórbico/Fe 3+ /EDTA.Em um tubo CONTROLE I (CI) adicionaremos uma das três tripas dialisadas contendolipossomos (LAM) e 9.0ml de água. Em outro tubo CONTROLE II (CII) adicionaremosoutra das três tripas, 7.0ml de água e 2.0ml de ácido ascórbico (AA) 10mM. No terceiro tuboTESTE (T), coloca-se a terceira tripa, 5.0ml de água, 2.0ml de AA 10mM e 2.0ml deFe 3+ /EDTA 1mM. Os três tubos serão então incubados durante 0.5h a 40 o C sob agitação.Após esse período de incubação, será feita a leitura de absorbância a 660nm de alíquotas de3ml de cada uma das soluções externas às tripas em CI, CII e T. As leituras de absorbância a660nm devem preencher a Tabela II. Uma vez feitas as leituras, as alíquotas da soluçãoexterna devem ser devolvidas aos respectivos tubos de origem e as tripas arrebentadas. Oconteúdo interno das tripas é recolhido junto com a solução externa.