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QBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO IIICINÉTICA ENZIMÁTICAOBJETIVOEstudar as influências das concentrações de enzima e de substrato na velocidade deuma reação enzimática, examinar as curvas obtidas, obter alguns parâmetros cinéticos (K m eV max ) e discutir seus valores e importância.INFORMAÇÕES GERAISA enzima escolhida para este estudo é a invertase de levedura que catalisa a hidróliseda sacarose para produzir glicose e frutose.C 12 H 22 O 11 + H 2 O → C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6sacarose glicose frutoseA determinação da velocidade da reação (ou da atividade enzimática) pode ser feitaatravés da dosagem dos açúcares redutores formados (glicose e frutose). A dosagem baseiasena reação entre o ácido 3,5 dinitro-salicílico (DNS) e os açúcares redutores. Estesmonossacarídeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor característica, cujaformação pode ser acompanhada a 540 nm.Nestas experiências as velocidades da reação serão expressas em µmoles de sacarosehidrolisada por minuto.Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µmoles) de açúcares redutoresformada, por um cálculo estequiométrico simples, pode-se determinar a quantidadecorrespondente (µmoles) de sacarose hidrolisada.Para estudos de velocidade, o tempo de reação deve ser medido com a maior exatidãopossível. Para isso, o grupo deverá organizar-se de maneira a não permitir que a reação seinicie em tempos diferentes nos vários tubos. Para tal, é importante manter os tubos em gelodurante a adição dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nosprotocolos, com a enzima sendo adicionada por último. Leva-se então os tubos, todos juntos,ao banho a 37 o C para reagir. Transcorrido o tempo determinado , os tubos devem voltartodos juntos, simultaneamente, para o gelo. Aí a reação pára.PROCEDIMENTO1) Curva PadrãoAtenção: A curva padrão será fornecida na forma de um xerox do gráfico A 540 versusµmoles de sacarose hidrolisada.A finalidade da curva padrão é relacionar valores de absorbância a 540 nm comµmoles de sacarose hidrolisada.Para construir a curva padrão utiliza-se seis tubos (180 x 20 mm), conforme indicadoabaixo, contendo volumes crescentes de solução padrão redutora (glicose 5,5 mM maisfrutose 5,5 mM), completando o volume em cada tubo para 2,0 ml com tampão. Como nãoocorrerá hidrólise de sacarose nos tubos de 1 a 5, pode-se acrescentar logo em seguida aotampão, o reagente DNS.
TubosSol. padrãoredutora(ml)Sol. tampãopH 4,77(ml)ReagenteDNS (ml)A 540B - 2,0 2,0 0,000 0,001 0,2 1,8 2,02 0,4 1,6 2,03 0,6 1,4 2,04 0,8 1,2 2,05 1,0 1,0 2,0Sacarose hidrolisada(µmoles)Após a adição do DNS, colocar os tubos em banho-maria fervente por dez minutos.Findo este tempo, esfriar em água corrente e adicionar 16 ml de água destilada.HOMOGENEIZAR e ler as absorbâncias a 540 nm (A 540 ) contra o branco (tubo B).Construir um gráfico A 540 versus µmoles de sacarose hidrolisada (curva padrão).2) Efeito da CONCENTRAÇÃO DA ENZIMANumerar sete tubos de ensaio (180 x 20 mm) e adicionar os reagentes segundo oprotocolo abaixo:TubosSacarose5% emtampãoTampãopH 4,77(ml)TUBOS NO GELOSol.Enzima(ml)Conc. deEnzimaMicromolarA 540Sacarosehidrolisada pormin(µmoles/min)B 1,0 1,0 - 0,00 0,000 0,001 1,0 0,9 0,12 1,0 0,7 0,33 1,0 0,5 0,54 1,0 0,3 0,75 1,0 0,1 0,96 1,0 - 1,0Após a adição da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos de uma temperatura de0 o C e colocá-los simultaneamente em banho-maria a 37 o C. MARCAR o tempo inicial.Incubar a 37 o C por 5 minutos. Transcorrido este tempo, os tubos devem voltarimediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reação pára. Ainda no gelo,adicionar a cada tubo 2 ml de DNS. Na presença de DNS, devido à alcalinidade do reagente,a enzima em pH muito alto, pára de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria ferventee esperar 10 minutos. Findo este tempo, esfriar em água corrente e adicionar 16 ml de águadestilada em cada tubo. AGITAR com inversão da posição na vertical (3 vezes). Ler asabsorbâncias a 540 nm.Fazer um gráfico colocando a concentração da enzima microM nas abcissas e nasordenadas a velocidade de hidrólise expressa em µmoles de sacarose hidrolisada por minuto.Durante a aula de laboratório será fornecido valor da concentração da enzima(microM) na solução estoque.3) Efeito da CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATONumerar sete tubos de ensaio (180 x 20 mm) e adicionar os reagentes segundo oprotocolo a seguir:
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