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Em seguida aplicar num ponto da origem uma pequena quantidade de mistura decitocromo c e albumina bovina. Sobre um outro ponto da origem, aplicar a amostra de sorohumano. CUIDADO: as amostras de soro humano não estão testadas em relação a presençade microorganismos patogênicos. USAR LUVA DE POLIETILENO PARA APLICAR ASAMOSTRAS.Montar as fitas no suporte da cuba de eletroforese com todos os polos positivos domesmo lado. Fechar a cuba de correr a eletroforese com 5mA/fita durante 60 minutos.Desligar a corrente, mergulhar as fitas no corante Ponceau por 10 minutos e descorarcom ácido acético 5%.Cuidados especiais- Não tocar as fitas com a fonte da corrente contínua ligada.- Prestar atenção para o fato de que uma das faces da fita de acetato de celuloseapresenta-se mais brilhante. Esta face, correspondente as costas da fita, contém uma películade plástico não absorvente sobre o qual assenta-se a verdadeira matriz que suporta o tampãoe as amostras, o acetato de celulose. As amostras devem ser aplicadas na parte opaca (face deacetato de celulose).- Antes de levar a fita com as aplicações à cuba, fazer uma pequena marca que aidentifique como pertencente a um determinado grupo.A mistura de proteínas contém:pIP.M.Albumina de soro bovino 4,7 66.500Citocromo c 10,7 13.000Com base a estes dados prever a posição de cada uma dessas proteínas na fita ao finalda operação. Justificar.Examinar o eletroforetograma das proteínas do soro humano. Compará-lo com oresultado final da eletroforese de soro apresentado na literatura (p. ex. “Biochemistry: Acase-oriented approach”, The C.V.Mosby Company, 5 a ed., autores: Montgomery, Conway, eSpector, pág. 67).3. DOSAGEM DE PROTEÍNA PELO MÉTODO DO BIURETOElaborar um protocolo para construir uma curva padrão, para a qual se utilizará umasolução estoque de Albumina de concentração conhecida (8mg/ml) e 2,5 ml de Reagente deBiureto, num volume final de 4,0ml por tubo.Após a adição do reagente, agitar e incubar os tubos por 15 minutos a 37 o C. Ler asabsorbâncias a 550 nm.Construir um tubo a partir de 1,0ml de Albumina de concentração desconhecida,adicionar Biureto, completar o volume final a 4,0ml, medir a Absorbância e determinar aconcentração desconhecida.Agradecimento: As amostras de soro humano foram cedidas pelo Laboratório deAnálises Clínicas da FCFUSP. Agradecemos aos responsáveis por este Laboratório e emespecial à Profa.Dra. Ana Campa.BIBLIOGRAFIA
01. Biochemistry: A Case-Oriented Approach, Montgomery, Conway e Spector, 5 a ed., 1990.The C.V. Mosby Company (Ver pág. 65).02. Biochemistry for Medical Sciences, Danishlfsky, 1980. Little, Brown and Company (Verpágs. 34, 40 e 469).03. Experimental Biochemistry, Clark e Switzer, 2 a ed., 1977. W.H. Freeman and Company.04. Outlines of Biochemistry, Conn e Stumpf, 4 a ed., 1976. John Wiley & Sons, Inc. (Verúltimas págs. do livro, págs. 587 a 609 - Apêndice 2).
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