apostila de exercÃcios
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Em seguida aplicar num ponto da origem uma pequena quantida<strong>de</strong> <strong>de</strong> mistura <strong>de</strong>citocromo c e albumina bovina. Sobre um outro ponto da origem, aplicar a amostra <strong>de</strong> sorohumano. CUIDADO: as amostras <strong>de</strong> soro humano não estão testadas em relação a presença<strong>de</strong> microorganismos patogênicos. USAR LUVA DE POLIETILENO PARA APLICAR ASAMOSTRAS.Montar as fitas no suporte da cuba <strong>de</strong> eletroforese com todos os polos positivos domesmo lado. Fechar a cuba <strong>de</strong> correr a eletroforese com 5mA/fita durante 60 minutos.Desligar a corrente, mergulhar as fitas no corante Ponceau por 10 minutos e <strong>de</strong>scorarcom ácido acético 5%.Cuidados especiais- Não tocar as fitas com a fonte da corrente contínua ligada.- Prestar atenção para o fato <strong>de</strong> que uma das faces da fita <strong>de</strong> acetato <strong>de</strong> celuloseapresenta-se mais brilhante. Esta face, correspon<strong>de</strong>nte as costas da fita, contém uma película<strong>de</strong> plástico não absorvente sobre o qual assenta-se a verda<strong>de</strong>ira matriz que suporta o tampãoe as amostras, o acetato <strong>de</strong> celulose. As amostras <strong>de</strong>vem ser aplicadas na parte opaca (face <strong>de</strong>acetato <strong>de</strong> celulose).- Antes <strong>de</strong> levar a fita com as aplicações à cuba, fazer uma pequena marca que ai<strong>de</strong>ntifique como pertencente a um <strong>de</strong>terminado grupo.A mistura <strong>de</strong> proteínas contém:pIP.M.Albumina <strong>de</strong> soro bovino 4,7 66.500Citocromo c 10,7 13.000Com base a estes dados prever a posição <strong>de</strong> cada uma <strong>de</strong>ssas proteínas na fita ao finalda operação. Justificar.Examinar o eletroforetograma das proteínas do soro humano. Compará-lo com oresultado final da eletroforese <strong>de</strong> soro apresentado na literatura (p. ex. “Biochemistry: Acase-oriented approach”, The C.V.Mosby Company, 5 a ed., autores: Montgomery, Conway, eSpector, pág. 67).3. DOSAGEM DE PROTEÍNA PELO MÉTODO DO BIURETOElaborar um protocolo para construir uma curva padrão, para a qual se utilizará umasolução estoque <strong>de</strong> Albumina <strong>de</strong> concentração conhecida (8mg/ml) e 2,5 ml <strong>de</strong> Reagente <strong>de</strong>Biureto, num volume final <strong>de</strong> 4,0ml por tubo.Após a adição do reagente, agitar e incubar os tubos por 15 minutos a 37 o C. Ler asabsorbâncias a 550 nm.Construir um tubo a partir <strong>de</strong> 1,0ml <strong>de</strong> Albumina <strong>de</strong> concentração <strong>de</strong>sconhecida,adicionar Biureto, completar o volume final a 4,0ml, medir a Absorbância e <strong>de</strong>terminar aconcentração <strong>de</strong>sconhecida.Agra<strong>de</strong>cimento: As amostras <strong>de</strong> soro humano foram cedidas pelo Laboratório <strong>de</strong>Análises Clínicas da FCFUSP. Agra<strong>de</strong>cemos aos responsáveis por este Laboratório e emespecial à Profa.Dra. Ana Campa.BIBLIOGRAFIA