ALESSANDRE BUENO GUSSO - Unesc

UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESCCURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO ESPECIALIZAÇÃO EM TREINAMENTOESPORTIVOALESSANDRE BUENO GUSSOESTUDO MEIÓTICO A PARTIR DA BIÓPSIA TESTICULAR EMCAMUNDONGOS ADULTOSCRICIÚMA, JUNHO DE 2005

1ALESSANDRE BUENO GUSSOESTUDO MEIÓTICO A PARTIR DA BIÓPSIA TESTICULAR EMCAMUNDONGOS ADULTOSMonografia apresentada a Universidade do ExtremoSul Catarinense, para obtenção do Titulo deEspecialista em Treinamento Esportivo.Orientador Prof Dr.Newton LucchiariCRICIÚMA, JUNHO DE 2005

2Às pessoas que me deram o maior presente: a vida, aosmeus pais Herminio e Lane, a minha namoradaCristiane e aos meus irmãos Rodrigo e Guilherme, peloamor e carinho,ofereço os méritos desta conquista.

3AGRADECIMENTOSAos meus avós Hizilda, Zilda, Adir e Pedro, por me ajudarem a me tornar uma pessoa melhor.Aos amigos e colaboradores Rodrigo e Alexandre, pelo apoio , disponibilidade e companheirismo.Aos colegas de pós - graduação, pelo excelente convívio e valiosas oportunidades de vivencia.Ao Professor Dr. Newton Lucchiari pela inestimável orientação nesta iniciação cientifica, e pela amizade ededicação durante todos os momentos nos quais tive o privilégio de conviver durante estes anos, dedico estatese.Em fim, á todas as pessoas que fazem parte do departamento de Pós Graduação –Treinamento Esportivo-UNESC, e que de algum modo contribuíram para a realização deste trabalho e que por ventura não foramaqui citados , o meu muito obrigado!

4RESUMOEsta pesquisa teve como principal objetivo o estudo da infertilidade correlacionandoas células da meiose I através do coeficiente de determinação. Para realização dapesquisa foram utilizados camundongos Swiss machos de 25g a 30g (n = 12), ondeas células em meiose foram obtidas por excisão testicular; estas células foramtransferidas para uma solução hipotônica, previamente aquecida a 37ºC. A amostraé então centrifugada, conforme segue a modificação da técnica descrita por Sperlinge Kaden (1971). As células foram analisadas em microscópio óptico e contadas emcâmara de New bauer, onde o material final obteve uma diluição de 1,5 ml. Comoresultado obtivemos a média do número de células em meiose I 161,5 células;coeficiente de variação da amostra de 15,2%. A distribuição das células nassubfases da prófase I obteve os seguintes resultados: leptóteno 4,75% e coeficientede variação (CV) 24,7%; zigóteno 23% e CV 15,8%; paquíteno 37,75% e CV 9,9%;diplóteno 20,83% e CV 19,1%; diacinese 3,66% e CV 92,5%. O número de célulaspor µL obteve a seguinte contagem: leptóteno 11,8 células/µL; zigóteno 18,4células/µL, paquíteno 30,2 células/µL; diplóteno 16,66 células/µL e diacinese 2,92células/µL. O coeficiente de determinação (CD) – contagem de células em prófase Icorrelacionando-as com suas subfases obteve como resultados principais: prófase I– leptóteno: CD = 2,62(inexistente); prófase I – zigóteno: CD = 34,1(forte); prófase I– paquíteno: CD = 0,06(inexistente); prófase I – diplóteno: CD = 11,97(fraco) eprófase I – diacinese: CD = 8,12(fraco). Desta forma, através da implantação datécnica modificada de Sperling e Kaden foi possível analisar quantitativamente ascélulas em meiose I, fornecendo subsídios para estudos futuros correlacionando osfatores envolvidos na infertilidade. A partir do coeficiente de determinaçãoconcluímos que o número geral de células em prófase I não está relacionado com onúmero de células nas subfases da prófase I: leptóteno e paquíteno possuemrelação inexistente; diplóteno e diacinese possuem relação fraca, enquanto que ozigóteno possui uma relação forte.Palavras-chave: meiose, infertilidade e coeficiente de determinação.

5LISTA DE ILUSTRAÇÕESQuadro 1 – Esquema do processo da divisão meiótica (Fases da Meiose). ............25Figura 1 – A figura ao alto demonstra o leptóteno, a primeira sub fase da PrófaseI,esta figura foi obtida através da biópsia testicular de camundongo, ondese observa os cromossomos iniciando sua contração obtendo o formato defios granulosos...........................................................................................26Figura 2 – A figura ao alto demonstra o zigóteno , a segunda sub fase da PrófaseI,esta figura foi obtida através da biópsia testicular de camundongo, ondese observa os cromossomos homólogos próximos entre si(1), ocorrendo aformação das sinapses (2).........................................................................27Figura 3 – A figura demonstra o paquíteno, a terceira sub fase da Prófase I,estafigura foi obtida através da biópsia testicular de camundongo.Nesta faseos cromossomos se apresentam mais curtos e grossos conforme indicadona figura (1). Nesta fase, os cromossomos X destacam-se maisnitidamente junto à membrana nuclear (2).................................................28Figura 4 – A figura demonstra o diplóteno, a quarta sub fase da Prófase I,esta figurafoi obtida através da biópsia testicular de camundongo, onde seevidencia-se o afastamento dos cromossomos bivalentes(1), ficando estespresos por um ou mais quiasmas(2)..........................................................29Figura 5 – A figura demonstra a diacinese , a quinta sub fase da Prófase I,estafigura foi obtida através da biópsia testicular de camundongo, onde seobserva os quiasmas nas extremidades dos cromossomos já firmementecondensados(1)..........................................................................................30

6LISTA DE TABELASTabela 1 – Contagem das células e coeficiente de variação, em prófase I obtidasatravés de biópsia testicular em camundondos......................................22Tabela 2 – Distribuição das células nas sub-fases da prófase I, obtidas através dabiópsia testicular em camundongos........................................................23Tabela 3 – Coeficiente de determinação contagem de células em prófase Icorrelacionando-as com suas sub-fases obtidas através de biópsiatesticular em camundongos....................................................................24

7SUMÁRIO1 INTRODUÇÃO..................................................................................................91.1 Conceitos gerais.............................................................................................91.2 Espermatogênese.........................................................................................121.3 Objetivo...........................................................................................................152 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................162.1 Materiais........................................................................................................162.1.1 Animais..........................................................................................................162.1.2 Reagentes......................................................................................................162.1.3 Material de experimento...............................................................................172.2 Metodologia...................................................................................................172.2.1 Obtenção da amostra...................................................................................172.2.2 Técnica para obtenção de cromossomo meiótico....................................182.2.3 Descoloração................................................................................................192.2.4 Contagem do número de células em prófase I e suas sub-fases............193 RESULTADOS...............................................................................................213.1 Resultados gerais.........................................................................................213.2 Visualização das células em prófase I........................................................243.2.1 Prófase I.........................................................................................................253.2.1.1 Leptóteno......................................................................................................263.2.1.2 Zigóteno........................................................................................................273.2.1.3 Paquíteno......................................................................................................283.2.1.4 Diplóteno.......................................................................................................293.2.1.5 Diacinese.......................................................................................................303.2.2 Metáfase.........................................................................................................313.2.3 Anáfase..........................................................................................................313.2.4 Telófase.........................................................................................................313.3 Meiose II.........................................................................................................313.3.1 Prófase II........................................................................................................313.3.2 Metáfase.........................................................................................................31

83.3.3 Anáfase..........................................................................................................323.3.4 Telófase.........................................................................................................324 DISCUSSÃO...................................................................................................335 CONCLUSÃO.................................................................................................37REFERÊNCIAS..........................................................................................................39

91 INTRODUÇÃO1.1 Conceitos geraisDe acordo com dados estatísticos, cerca de 10 a 20 % dos conceptos sãoeliminados intra-uterinamente, que caracteriza o aborto.No Brasil, os abortos são classificados como perdas fetais com idadegestacional de até 20 semanas e peso igual ou inferior a 500g. A organizaçãoMundial da Saúde distingue o aborto em 3 grupos: grupo I, morte fecal precoce,onde o feto é eliminado antes de 5 meses de gestação; grupo II, morte fetalintermediária, que ocorre entre 5º e 7º mês de gestação; e, grupo III, morte fetaltardia, onde o feto eliminado tem mais de 7 meses de gestação.O aborto pode ser definido como a interrupção da gravidez antes de 20semanas de gestação, e pode ser classificado em: aborto induzido (interrupçãoterapêutica); aborto espontâneo (interrupção da gestação antes de 20 semanas degravidez); aborto espontâneo de recorrência (ocorre de 3 ou mais consecutivos);aborto não detectado (quando o produto está retido mais de 8 semanas, após amorte fetal).Em 1971, Penrouse e Delthanty documentaram a primeira anormalidadecromossômica em um embrião humano malformado – a triploidia.Subseqüente, foi observado que esta anormalidade era comum em fetosde abortos espontâneos. Boué e Boué, na França, em 1973, mostram que aincidência total de anormalidade cromossômicas é de 62% nos fetos abortados. Para

10Chandley ,1976 40 a 50% dos abortos espontâneos são cromossomicamenteanormais.A literatura mostra que a preocupação em cariotipar casais com abortosespontâneos é grande, e muitas vezes permite estabelecer a causa dos abortos. Osestudos somáticos são de grande importância porque permitem detectar portadoresequilibrados de anomalias estruturais, os quais apresentam fenótipo normal .Nesse tipo de casal, é pouco comum trabalho que estudem a meiosemasculina, depois de afastadas causas ginecológicas que justifiquem os abortosespontâneos. A maioria dos estudos meióticos é realizada em homens comproblemas de infertilidade, com a finalidade de se detectar anomalias meióticas quepossam ser a causa da mesma. O interesse pelo estudo da meiose masculina émaior do que para a feminina, pela dificuldade em obter-se o material (ovócito) namulher. (OPTIZ, 1989).Em 30 a 50% dos casos estudados por infertilidade, a causa está nohomem (OPTIZ,1989). Segundo Chandley (1976), a participação paterna e maternaé igual.Outros estudos demonstram que fatores imunológicos podem estar portrás da infertilidade masculina. Através da inoculação intra peritoneal deespermatozóides em camundongos, esta, poderá induzir a formação de anticorpos.Estes anticorpos anti-espermatozóides podem ser detectados tanto no sanguequanto no líquido linfático (IgG) inibindo quantitativamente e qualitativamente aprodução e o desenvolvimento dos espermatozóides.Na avaliação do homem num casal com abortos espontâneos, o aspectoclínico ajuda a determinar que direção deve ser tomada e fatores genéticos,

11endócrinos e os que influenciam no desenvolvimento da espermatogênese devemser pesquisados. Neste ponto, o estudo meiótico se mostra de extrema utilidade.O estudo meiótico compreende a análise da formação do complexosinaptinêmico e das fases da meiose a partir de biópsia testicular.Estudos meióticos realizados em indivíduos inférteis com fenótipo ecariótipo somático normal tem revelado a existência de determinados de tipos deanomalias limitadas à linha germinativa. As anomalias citogenéticas restritas àmeiose, em estudos realizados em indivíduos inférteis, varia de 2 a 19%(KOULISCHER e SCHOYSMAN, 1983; HENDRY, 1988; FERGUSON-SMITH, 1986e BRAEKELLER, 1991).As principais alterações encontradas são: poliploidia, aneuploidia,presença de multivalentes, alterações da formação do complexo sinaptinêmico(desinapses) e a dissociação do cromossomo X e Y. essas anomalias são vistas nopaquíteno e/ou ma metáfase I e algumas vezes em metáfase II, e podem apresentarseem todas ou em parte das células.Das anomalias descritas, as mais importantes são as de pareamento doscromossomos homólogos – as desinapses, as quais podem afetar todos osbivalentes ou somente alguns a estes dois tipos de anomalias, Templado (1980),denominou de desinapse completa e individual respectivamente.A desinapse completa se observa na metáfase I por uma baixa freqüênciade quiasmas, de modo que a maior parte dos bivalentes de tamanho médico oupequeno, aparecem dissociadas em univalentes e somente os bivalentes maioresapresentam 1 ou no máximo 2 quiasmas. O número de quiasmas nunca é maior que20 a 25% por célula, quando o número médio de quiasma é de 48,6. (TEMPLADO,1980).

12A desinapse individual apresenta bivalentes de tamanho médio com umúnico quiasma terminal ou não, ou, dissociado em univalentes e parescromossômicos normais. Este tipo de desinapse, ao contrário da completa, não secaracteriza por apresentar um número baixo de quiasmas. A freqüência de quiasmasdepende do número de bivalentes desinápticos presentes em cada célula, sendoinferior ao valor normal naquelas células que apresentam um número alto debivalentes dissociados. (TEMPLADO et al, 1981).As desinapses podem ser a causa da esterilidade, quando produzem umbloqueio da meiose, e da infertilidade quando a meiose se completa, porque ocorrea formação de gametas desequilibrados devido a uma segmentação anormal dosbivalentes desinápticos e/ou univalentes durante a anáfase I.Em casais com história de abortos espontâneos, concluímos sernecessário conhecer a constituição cromossômica de cada conjugue, depois deafastadas as causas ginecológicas. Em casos de cariótipos somáticos normal,devemos realizar a análise do sêmem e o estudo da meiose masculina. juntamentecom fatores externos associados, onde podemos destacar a pratica de esportes,alterações dos hábitos de vida e doenças predisponentes.1.2 EspermatogêneseA espermatogênese é um processo em que as células germinativas poucodiferenciadas, as espermatogônias, dão lugar a células altamente especializadas,móveis e haplóides, os espermatozóides. O processo cuja finalidade é a produçãode espermatozóides, é complexo, contínuo e dinâmico, e inclui processos dediferenciação e divisão celular. Inicia-se na puberdade quando por influencias

13hormonais as células contidas nos tubos seminíferos localizados nos testículosiniciam sua diferenciação.Clermont (1977), divide a espermatogênese em três fases: uma primeiraetapa na qual as espermatogônias proliferam e dão lugar, mediante divisõesmeióticas, a um novo tipo de células mais diferenciadas, chamadas espermatócitos;uma segunda fase na qual estes espermatócitos sofrem a meiose, dando lugar acélulas haplóides, as espermátides, e uma terceira fase em que as espermátides,por sua vez, sofrem transformações citológicas complexas se convertendo emespermatozóides. Esta última etapa, que inclui a divisão celular, é conhecida comoespermiogênese .Dentro dos tubos seminíferos encontramos, portanto, os seguintes tipos decélulas germinativas: espermatogônia, espermatócitos I, espermatócitos II,espermátides e espermatozóides. Estes cinco tipos celulares se encontram situadosnesta mesma ordem, entre a periferia e a luz dos túbulos, de forma que asespermatogônias são as células mais próximas da membrana basal enquanto queos espermatozóides estão próximos a luz do túbulo.As espermatogônias iniciam a espertatogênese, em intervalos fixos, acada 16 dias (CLERMONT e GLEELER 1963). Uma vez que um grupo de células deespermatogônias, de maneira sincrônica, é passado para o estado deespermatócito, as células see movem em direção da luz do túbulo formando umanova camada de células, que por sua vez estão em um mesmo estágio.Quando a primeira geração de espermatozóides se libera da luz do túbulo,uma nova geração de células toma seu lugar na periferia. Antes que se completeuma série de espermatogêneses, se inicia outra no mesmo lugar do túbulo, restandoas células germinativas ordenadas em várias camadas celulares. Cada uma dessas

14constitui uma geração de células, que estará formada por um grupo de células quese encontram na mesma fase do processo, que são produzidas ao mesmo tempo, eque sofrem a espermatogênese de forma sincrônica.Este fenômeno de sincronia tem sido observado em muitas espécies. Naespécie humana é muito pouco pronunciado, sendo relativamente pequeno onúmero de células germinativas que se encontram na mesma fase daespermatogênese. (CLERMONT, 1977).Ao microscópio eletrônico se observam grupos de espermatócitos eespermátides (NICANDER, 1967) assim com de espermatogônias (DYM eFAWEETT, 1971) conectados por pontes citoplasmáticas. Faweett et all ,1971incicam que estas pontes facilitam a passagem de substâncias entre as célulasinterconectadas, podendo, desde modo, controlar e contribuir com a suasincronização.As distintas gerações de células germinativas não estão associadasaleatoriamente, a não ser que formem associações celulares cuja composição ésempre a mesma. Fisiologicamente as diferenciações são seqüenciais em umadeterminada região do túbulo e se repetem indefinidamente. Uma série completadessas diferenciações são conhecidas como ciclo do epitélio germinativo e asdiferenciações são os estágios do ciclo. Representam subdivisões artificiais de umprocesso contínuo e com dificuldade para precisar o final de um estágio e o início doseguinte.O ciclo epitélio germinativo tem sido observado nos mamíferos. Cadaespécie tem um número determinado de estágios.Em estudos de cortes seriados de biópsia testicular, tem revelado emhomens que seus ciclos são formados por seis estágios diferentes (CLERMONT,

151977) e sua duração, tal como havíamos comentado anteriormente, era dedezesseis dias. Não obstante, a duração exata de todo o processo deespermatogênese é difícil de se saber com exatidão, devido a dificuldade dedeterminar o momento exato em que as espermatogônias começam a se dividir eem que momento os espermatozóides são liberados do epitélio germinativo. Umcálculo bastante aproximado da duração real, pode ser obtido somando a duraçãode cada um dos estágios da espermatogônia (24-26 dias), espermatócito (27-28dias) e espermátide (22-23 dias), o que da uma duração total de setenta e cinco diasaproximadamente para todo o processo de espermatogênese.Apesar dos avanços técnicos introduzidos no estudo da espermatogênesenos últimos anos, tais como a utilização de marcadores radioativos, microscopiaeletrônica, estes tem permitido grandes progressos no conhecimento morfológico eestrutural da espermatogênese, entretanto algumas partes dos processos daespermatogênese a nível molecular ainda não estão bem esclarecidas. Por exemplo:os mecanismos que controlam a diferenciação das células na espermatogônia, oprocesso molecular que permite a sinapse de cromossomos homólogos e o seucruzamento durante a meiose. Enquanto que os fatores extracelulares, a açãohormonal tem sido muito discutida nos últimos anos. (CLERMONT, 1977).1.3 ObjetivoO presente trabalho teve por finalidade implantar no laboratório deimunologia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, as técnicas para obtençãodo cromossomo meiótico, a fim de permitir uma análise quantitativa e qualitativa dascélulas meióticas em suas referidas fases.

162 MATERIAS E MÉTODOS2.1 Materiais2.1.1 Animais:Foram utilizados camundongos Swiss machos de 25 g a 30 g(aproximadamente 12 camundongos).Os animais foram fornecidos pelo biotério do Bloco da Saúde daUniversidade do extremo Sul Catarinense e mantidos sob condições controladas detemperatura e iluminação, com livre acesso a água e ração.2.1.2 ReagentesCromossomo Meiótico:a. KCL Merck art.4936b. Ácido acético glacial Merck art.63c. Metanol Merck art.21566d. Etanol Merck art.983e. Xilolf. Giensa 10%g. Reativos:- Solução hipotônica: KCL Merck. Preparar esta solução a 0,075 M.- Acido acético glacial:

17- Metanol- Solução fixadora: 1parte de ácido acético glacial: três partes de metanol.- EtanolObs: os reagentes foram adquiridos pelo Dep.de compras da UNESC, através dorepresentante Merck do Brasil.2.1.3 Material de experimentoa.Placa de petrib.Pipeta de Pasteurc.Centrífuga Famend.Laminas para microscópioe.Lamínulas 24x60 mmf.Microscópio Nikong.Bisturih.Vórtexi.Geladeiraj.Luvas descartáveisk.Estufa Famen2.2 Metodologia2.2.1 Obtenção da amostraBiópsia testicular:

18A biopsia testicular é obtida por excisão testicular, após anestesiageral.Após a separação dos testículos, este é transferido imediatamente para umasolução hipotônica(5ml), previamente aquecida a 37C°.2.2.2 Técnica para obtenção de cromossomo meióticoReceber a biópsia em uma placa de Petri que contenha uma soluçãohipotônica pré-aquecida a 37C°.Os tubos seminíferos não devem estarcontaminados com sangue.Triturar os tubos seminíferos até obter pedaços extremamente pequenos.Recolher esta mistura (tubos seminíferos finamente cortados e soluçãohipotônica) em tubos de ensaio e homogeneizar bem, com a ajuda de uma pipeta dePasteur, com a finalidade de libertar mais células dos tubos. Deixar sedimentar osrestos de tubos seminíferos e passar o sobrenadante para outro tubo de ensaio.Obs: este procedimento não devera passar de 30 minutos.Centrifugar a 600 G durante sete min. E desprezar o sobrenadante.Homogeneizar o sedimento em vortex a baixa velocidade. Acrescentar de1,5 a 2,0 ml de solução fixadora.Esta adição deve ser feita com agitação constante egota a gota. Após a adição e perfeita homogeneização, deixar 30 min. em geladeira.Centrifugar a 600 G durante 7 minutos.Desprezar o sobrenadante,adicionar o fixador gota a gota utilizando o vortex.Centrifugar a 600 G durante 7minutos. Fazer esta operação quatro vezes.Adicionar ao sedimento uma quantidade de fixador que permita umasuspensão celular ótima (não devendo ser muito concentrado e nem muito diluído).

19Extensão:Utilizar laminas novas, absolutamente limpas e secas.Colocar desta suspensão duas gotas em cada lamina.As laminas ficam nochão e as gotejamos estando em pé.Deixar secar ao ar e corar Giensa a 10 %, durante 10 minutos.2.2.3 DescoloraçãoO óleo de imersão é retirado colocando-se a lamina em xilol.Processo de descoloração:Etanol a 30% por 1 minuto.Etanol a 70 % por 1 minuto.Etanol a 100% por 1 minuto.Etanol a 70% por 1 minuto.Etanol a 30% por 1 minuto.Água destilada.2.2.4 Contagem do número de células em prófase I e suas sub-fasesApós a obtenção da amostra e início da técnica para obtenção decromossomo meiótico, descritos nos sub-itens 3.2.1 e 3.2.2, deve ser adicionado aosedimento total de células , 1,5ml de solução fixadora, o que permite uma suspensãocelular ótima.

20Após ressuspender as células, com o auxilio de uma micro pipeta (2µl) ascélulas deverão ser colocadas em uma câmara de New Bauer para a contagem dascélulas em prófase I.Utilizando esta mesma solução retorna-se a técnica original para oprocesso de extensão e descoloração. Com as laminas coradas deve-se contar 100células aleatórias em prófase I distribuindo-as em suas respectivas sub-fases(leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese).

213 RESULTADOS3.1 Resultados geraisNo estudo do cromossomo meiótico, foi observado fundamentalmente ametáfase I, onde os cromossomos bivalentes eram melhor identificados.Através do estudo realizado, foi possível observar a atividade meióticanormal, juntamente com as fases da meiose em ambas as divisões, porém emdistintas proporções (tabela 2). O paquíteno foi em geral a divisão mais numerosa,entretanto os cromossomos não apareciam bem estendidos. A metáfase I emetáfase II foram as etapas que se apresentaram em maior número. Leptóteno ediplóteno apareceram em menor freqüência, tanto na metáfase I quanto na metáfaseII, a anáfase e telófase foram observadas em raras ocasiões.O número de divisões meióticas e qualidade das figuras dependiam davariação da técnica, sendo que os animais utilizados no experimento possuíam umnúmero pouco variável dessas células, coeficiente de variação da amostra 15,2%(ver tabela 1 na página seguinte).Foram avaliados 12 animais obtendo a especificação relatada no itemmateriais e métodos.

22Tabela 1 – Contagem das células e coeficiente de variação, em prófase Iobtidas através de biópsia testicular em camundondos.CASONúmero de células em prófase I1 1232 1623 1444 1775 1986 1347 1908 1839 18010 14011 14212 165Total do número de células 1938Média 161,5Mediana 163,51º quartil 140,53º quartil 182,3Coeficiente de variação da amostra 15,2%

23Tabela 2 – Distribuição das células nas sub-fases da prófase I, obtidas atravésda biópsia testicular em camundongos.CASO Leptóteno Zigóteno Paquíteno Diplóteno Diacinese1 18 25 37 24 062 13 20 41 21 053 17 24 38 21 004 17 23 39 20 015 12 23 37 22 066 13 30 44 12 017 15 18 39 18 108 21 20 36 23 009 09 23 40 25 0310 11 29 29 27 0411 19 20 41 20 0012 12 21 42 17 08TOTAL 177 células 276 células 453 células 250 células 44 célulasPorcentagemdo número decélulasCoeficientede variaçãoda amostraNúmero decélulas por µl14,75%leptóteno23%zigóteno37,75%paquíteno20,83%diplóteno3,66%diacinese24,7% 15,8% 9,9% 19,1% 92,5%11,8células/µl18,4células/µl30,2células/µl16,66células/µl2,92células/µl

24Tabela 3 – Coeficiente de determinação contagem de células em prófase Icorrelacionando-as com suas sub-fases obtidas através debiópsia testicular em camundongos.Fases dadivisãomeióticaLeptóteno(CD)Zigóteno(CD)Paquíteno(CD)Diplóteno(CD)Diacinese(CD)Prófase I 2,62 24,1 0,06 11,97 8,12Leptóteno X 10,75 0,02 1,20 17,47Zigóteno 10,75 X 6,65 4,01 7,78Paquíteno 0,02 6,55 X 60,99 0,06Diplóteno 0,16 0,003 60,99 X 14,06Diacinese 43,56 60,68 65,28 41,73 X3.2 Visualização das células em prófase IApós a produção e coloração das laminas, as células em prófase I e suassub-fases foram observadas em microscópio óptico,utilizando aumento de 1000 xs,onde pudemos visualizar suas principais características celulares durante o processode divisão meiótica. Assim sendo, aqui serão mostradas as fases da meiose, asquais conseguimos observar, e que por sua vez são de interesse para o estudo docromossomo meiótico. As figuras das sub-divisões celulares seguem o esquemademonstrado no quadro 1.

25LEPTÓTENOZIGÓTENOPRÓFASE IPAQUÍTENO1ª DIVISÃO(REDUCIONAL)MEIOSE IDIPLÓTENODIACINESEMETÁFASE IANÁFASE ITELÓFASEINTERCINESEPRÓFASE II2ª DIVISÃO(EQUACIONAL)MEIOSE IIMETÁFASE IIANÁFASE IITELÓFASE IIQuadro 1 – Esquema do processo da divisão meiótica (Fases daMeiose).3.2.1 Prófase IÉ a fase mais longa da meiose e de maior interesse, tendo em vista queas células nesta fase se encontram em maior número e sua visualização se dá deforma mais objetiva .Durante o seu desenvolvimento é possível a distinção de 5estágios na linhagem germinativa masculina (leptóteno, zigóteno, paquíteno,diplóteno e diacinese).

263.2.1.1 LeptótenoOs cromossomos neste estágio começam a se espessar. Adquirindo oaspecto de fios granulosos (figura 1), mas ainda formando um denso emaranhado.Os unifilamentos observados são constituídos por duas cromátides irmãs unidas.Esta união é determinada por uma estrutura de 500 µm de largura, denominadacomponente lateral, basicamente protéico, que só é notado ao microscópioeletrônico.Figura 1 – A figura ao alto demonstra oleptóteno, a primeira sub fase da PrófaseI,esta figura foi obtida através da biópsiatesticular de camundongo, onde se observa oscromossomos iniciando sua contração obtendoo formato de fios granulosos.

273.2.1.2 ZigótenoComo principal característica desta fase, os cromossomos homólogosestão mais próximos entre si, ocorrendo a formação das sinapses, com a uniãolongitudinal dos cromossomos. Ocorre a formação do cromossomo bivalente. Aunião destes cromossomos vai além de uma simples justaposição; o que ocorre éum emparelhamento das partes homólogas (figura 2).A sinapse inicia-se pela formação de pontes quando as extremidades doscromossomos homólogos se aproximam e ficam a uma distância crítica entre2000µm e 3000µm. As pontes formadas a partir dos componentes laterais doscromossomos homólogos conduzem à elaboração do complexo sinaptinêmico. Coma formação do complexo sinaptinêmico, a fase de zigóteno está completa.12Figura 2 – A figura ao alto demonstra ozigóteno , a segunda sub fase da PrófaseI,esta figura foi obtida através da biópsiatesticular de camundongo, onde se observa oscromossomos homólogos próximos entre si(1),ocorrendo a formação das sinapses (2).

283.2.1.3 PaquítenoEsta fase se inicia quando todos os cromossomos estão em sinapse. Oscromossomos tornam-se mais curtos e grossos do que no zigóteno, ocorrendo oaparecimento de áreas com grande afinidade por corantes básicos (os cromômeros).Nesta fase, os cromossomos X destacam-se mais nitidamente junto àmembrana nuclear do que no zigóteno (figura 3).2Figura 3 – A figura demonstra o paquíteno, aterceira sub fase da Prófase I,esta figura foiobtida através da biópsia testicular decamundongo.Nesta fase os cromossomos seapresentam mais curtos e grossos conformeindicado na figura(1). Nesta fase, oscromossomos X destacam-se maisnitidamente junto à membrana nuclear (2).

293.2.1.4 DiplótenoNesta fase, observa-se o afastamento dos cromossomos homólogos(bivalentes). Esta separação se inicia na região do centrômero. Porém, o movimentode repulsão não provoca o completo afastamento do cromossomo, ficando ele presopor um ou mais quiasmas. Os quiasmas são indicadores dos lugares onde ocorremas permutas genéticas, ocorrendo ruptura das cromátides em determinados pontos ea soldadura a pontos de ruptura de cromátides homólogas (figura 4).21Figura 4 – A figura demonstra o diplóteno , a quartasub fase da Prófase I,esta figura foi obtida através dabiópsia testicular de camundongo, onde seevidencia-se o afastamento dos cromossomosbivalentes(1), ficando estes presos por um ou maisquiasmas(2).

303.2.1.5 DiacineseNa diacinese, os cromossomos bivalentes estão mais contraídos. Nesteestágio da prófase I, ocorre o desaparecimento do nucléolo, e os bivalentesmostram-se mais espaçadamente distribuídos dentro do núcleo. Os quiasmas nestafase estão localizados nas extremidades, sendo chamados quiasmas terminados(figura 5).111Figura 5 – A figura demonstra a diacinese , a quintasub fase da Prófase I,esta figura foi obtida atravésda biópsia testicular de camundongo, onde seobserva os quiasmas nas extremidades doscromossomos já firmemente condensados(1).

313.2.2 Metáfase IOs cromossomos se encontram no plano equatorial.3.2.3 Anáfase IOcorre separação dos cromossomos homólogos (divisão reducional).3.2.4 TelófaseCitocinese, ocorre a formação de duas células haplóides.3.3 Meiose IIAtravés das células resultantes da telófase I, inicia-se a meiose II.Não existe a síntese de DNA (intercinese) até iniciar a prófase II.3.3.1 Prófase IIOcorre a espirilação das cromátides.3.3.2 Metáfase IIOs cromossomos se encontram no plano equatorial.

323.3.3 Anáfase IIcromossomos.Nesta fase, ocorre a separação das cromátides e divisão dos3.3.4 Telófase IICitocinese, ocorre a formação de quatro células haplóides.

334 DISCUSSÃODefinida como a incapacidade de conceber após 1 ano de relaçõessexuais regulares sem uso de nenhum método anticoncepcional, a infertilidade tempermanecido prevalentemente constante ,com o decorrer dos anos, no entanto, ascausas etiológicas e suas freqüências ainda não estão totalmente elucidadas.Atualmente em um estudo no Brasil Passos e cols (1997) demostrou que:66,6% são devido a causas femininas, 18,3% de causas masculinas, 11,6% decausas desconhecidas e 3,3% de causas masculinas e femininas.Na avaliação do homem em um casal com abortos espontâneos, oaspecto clínico determina que direção deve ser tomada e quais os fatores queinfluenciam no desenvolvimento da espermatogênese. Neste ponto o estudomeiótico se mostra de extrema utilidade. Por este motivo, iniciaram-se inúmerosestudos com o intuito de determinar corretamente a relação entre alterações emcélulas meióticas na infertilidade do casal.Neste trabalho, nossa proposta inicial foi dar continuidade ao estudo dainfertilidade, correlacionando as células da meiose I entre si, analisando-asquantitativamente, qualitativamente através de sua obtenção pela técnica da biópsiatesticular.Desta forma numa primeira etapa de nossos estudos demonstramos onúmero de células em prófase I obtidas através de biópsia testicular emcamundongos (tabela 1), juntamente com a distribuição das células nas subfases:leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese (tabela 2). A seguir segue umadescrição das subfases da prófase I e as correlações apresentadas.

34A primeira divisão meiótica (reducional) dividida em prófase I, metáfase I,anáfase I e telófase I,foi analisada; vale destacar que a ênfase maior foi dada aprófase I e suas subdivisões (leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese)tendo em vista que essas células estavam em maior número e sua visualização sedá de forma mais objetiva. Segundo Braekeleer, M1991 alterações na prófase Ipodem inibir as seguintes fases da divisão reducional e ou criar espermatozóidesimóveis, muitas vezes sem alterações morfológicas.Na prófase I, o leptóteno e o zigóteno foram observados emconcentrações relativamente baixas, 14,75% e 23% respectivamente. Essacontagem se dá, devido a não liberação destas células dos tubos seminíferos.Osresultados apresentados neste estudo estão de acordo com os resultadosapresentados por Fisch (1992), onde muitas vezes estas células se encontram, senão abaixo, extremamente fixadas ao epitélio da luz dos tubos seminíferos, o quecaracteriza uma contagem celular baixa. Os cromossomos nesses estágiosobtiveram uma variável qualidade em suas formas, entretanto foi possível observar aunião das cromátides irmãs e a formação do cromossomo bivalente.Outra fase observada foi o paquíteno, que ao contrário das fases que oantecederam, estas células obtiveram uma maior porcentagem de células,aproximadamente 37,75%. Este número se deve, pois geralmente as células na fasede paquíteno se encontram liberadas na luz dos tubos seminíferos.A qualidade dascélulas ao que diz respeito a sua visualização foi variável, entretanto foi possívelobservar células ótimas observando o condensamento dos cromossomos, estes emsinapse e destacando os cromossomos X junto à membrana nuclear.Dando seqüência à divisão meiótica, o próximo grupo observado foi odiplóteno (20,83%), com uma contagem de células relativamente menor do que o

35paquíteno. O diplóteno foi observado com células condensadas e bem visualizadas,onde foi possível analisar o afastamento dos cromossomos homólogos juntamentecom um ou mais quiasmas.Como ultima fase da divisão celular da prófase I, foi observada adiacinese, que das 5 subfases foi a que obteve a menor contagem, 3,66%; estesdados foram de acordo com estudos realizados por Braekeleer (1991), onde o baixonúmero de células se dá devido ao menor tempo em que as estas ficam nesta fasee à proximidade da metáfase I . Entretanto, as células obtidas na diacinese foram deboa qualidade, proporcionando a visualização dos cromossomos bivalentescontraídos, juntamente com os quiasmas localizados nas extremidades.Com este embasamento, conseguimos ter uma contagem geral dascélulas em meiose I, obtendo como média do número de células 161,5, mediana163,5, primeiro quartil 140,5, terceiro quartil 182,3 e coeficiente de variação daamostra 15,2%.Entretanto, a nossa proposta de trabalho envolvia também a análise docoeficiente de determinação, a qual nos forneça dados estatísticos da correlação donúmero de células nas subfases da meiose I, que são influenciadas pelo númerototal de células da meiose I – porcentagem de Y que é influenciada por X (tabela 3).Conforme mostra a literatura o coeficiente de terminação pode serexpresso em porcentagem, correlacionando as células da subfase da meiose I asquais são influenciadas pelo número total de células da meiose I. Os valoresrestantes são atribuídos a outros fatores (tabela 3).Este projeto utilizou a classificação fornecida por Costa (1998), onde oscoeficientes de determinação e correlação recebem nomes especiais conformeestejam próximos ou distantes do zero: correlação linear inexistente 0 - 6,24%, fraca

366,26 - 25%, forte 23,1 – 52,6% e perfeita 56,3 – 100%.Desta forma,analisando osresultados da tabela 3, a prófase I possui uma correlação: forte com o zigóteno, poispossui um coeficiente de determinação de24,1, fraca com o diplóteno e diacineseonde o coeficiente de determinação foi respectivamente de 11,97 e 8,12 einexistente com o leptóteno e o paquíteno onde o coeficiente de determinação foi de2,62 e 0,06 respectivamente.O leptóteno possui uma correlação: fraca com o zigóteno e diacinese einexistente com o paquíteno e diplóteno.O zigóteno possui uma correlação: fraca com o leptóteno, paquíteno ediacinese e inexistente com o diplóteno.O paquíteno possui uma correlação: perfeita com o diplóteno, fraca com ozigóteno e inexistente com o leptóteno e a diacinese.O diplóteno possui uma correlação: perfeita com o paquíteno, fraca com adiacinese e inexistente com o leptóteno e o zigóteno.Por último, a diacinese possui uma correlação: perfeita com o zigóteno e opaquíteno ,forte com o leptóteno e o diplóteno.Segundo Fisch (1992), acredita-se que a correlação prófase I comzigóteno (média), diplóteno, diacinese (fraca) e leptóteno, paquíteno (inexistente)ocorra devido a não liberação das células iniciais - leptóteno, zigóteno- dos tubosseminíferos .Estudos realizados por Braekeleer (1991), também confirmam osresultados apresentados onde, apesar das células em diacienese estarem em menornúmero, estas foram as que tiveram uma correlação mais favorável com as demaissubfases: zigóteno e paquíteno (forte), leptóteno e diplóteno (média).

375 CONCLUSÃOA modificação da técnica descrita por Sperling e Kaden 1971, foiimplantada no Laboratório de Imunologia –UNESC- mostrando-se eficiente para avisualização das células em meiose I.Essas técnicas vão permitir aos alunos de pós-graduação e graduação avisualização prática da meiose, hoje estudada apenas em aulas teóricas.Propiciando aos alunos correlacionar a aplicação do estudo meiótico em casais comhistória de abortos de recorrência ou infertilidade.O estudo das células em meiose, nos fornece dados para futuros estudosem seres humanos e em homens inférteis.As sub fases da meiose I :leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno ediacinese, foram analisadas quantitativamente e qualitativamente, determinandosuas principais características.A diluição da suspensão celular caracterizada como ótima, teve seuvolume final 1,5 ml, onde as células visualizadas não se apresentaram concentradasou dispersas.A contagem das células em prófase I, teve como média 161,5 células ecoeficiente de variação de 15,2%, obtendo deste modo um bom numero de célulaspara estudo.A distribuição das células nas sub fases da prófase I, obteve as seguintesporcentagens, com seus respectivos coeficientes de variação: leptóteno 14,75%,CV-24,7%; zigóteno 23%, CV-15,8%; paquíteno 37,75%, CV-9,9%; diplóteno 20,83,CV-19,1% e diacinese 3,66%, CV-92,5.

38O coeficiente de determinação da prófase I obteve a seguinteclassificação, segundo a classificação usada por Francisco Costa: leptóteno –inexistente –, zigóteno – fraca –, paquíteno – inexistente –, diplóteno – fraca –,diacinese – fraca –.

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