Botulismo: diagnóstico laboratorial

INSTITUTO ADOLFO LUTZBOTULISMO:DIAGNÓSTICO LABORATORIALMiyoko JakabiINSTITUTO ADOLFO LUTZMICROBIOLOGIAALIMENTAR

BOTULISMO Microrganismo descritopela primeira vez em1879, por Ermengen, naBélgica - surto com 33casos; Botulismo - surto deorigem caseira naAlemanha relacionadacom ingestão desalsicha; “botulus”: latim=salsicha.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

características Bacilos GRAM +, retos ouligeiramente curvos; 0,5-2,0 µm de largura e 1,6-22,0µm de comprimento; Esporos ovais e subterminais.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

distribuiçãoNo ambiente Largamente distribuído noambiente; Trato intestinal de animais,pássaros e peixes; Cadáveres de animaissilvestres e pássaros contém> quantidade; Tipos A, B e F: terrestres; Tipo E: ambientes aquáticos; Tipo A: oeste dos EUA; Tipo B leste dos EUA e Europa; Tipo G: restrito a Argentina.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

condiçõesIDEAIS Anaerobiose; pH (4,8 a 8,5); Atividade de água de0,95 a 0,97; Temperatura ótima de37ºC. Os tipos A e B (25ºa 40ºC); Tipo E, multiplicação >3ºC.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

otulínicaTOXINAbotulínica Tipos de toxinas A, B, E, F: patogênicas parao homem; C, D: patogênicas para osanimais; Toxinas termolábeisinativadas a 100ºC por 15minutos.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Dose letal: 135-150 ng;toxina Bioterrorismo;INSTITUTO ADOLFO LUTZ

toxina Toxina - exotoxina ativa(mais que a tetânica), deação neurotrópica , únicaque tem a característica deser letal por ingestão; Proteína de 150 kda cadeiapesada de 100 kda e cadeialeve de 50 kda ligadas porpontes de sulfeto.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Síntese datoxina Presente em pequenaquantidade na faselogarítmica; Liberada durante a autólise; Bacteriófagos: tipos C e D; Plasmídeos.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Neurotoxina; Resistente ao ácido estomacal;toxina Absorvida intacta pelo tratogastrointestinal e entra nacorrente sangüínea; Se liga as células nervosas viagangliosídeos;INSTITUTO ADOLFO LUTZJUNÇÃO NEUROMUSCULAR NORMALJUNÇÃO NEUROMUSCULAR COMPRESENÇA DA TOXINA BOTULÍNICA

1. Ligação da cadeia leve aosreceptores na membrana;Cont.2. Internalização da toxinaativa;3. Translocação da toxina p/ ointerior da célula (pinocitose);4. Fase lítica - bloqueio daliberação da acetilcolina.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Ação da toxinaINSTITUTO ADOLFO LUTZO neurotransmissor envia impulsoselétricos p/contrair o músculo;Terminações nervosas secretam aacetilcolina responsável pelacontração muscular;Pacientes com botulismo:neurotoxina liga-se aos terminaisnervosos inibindo a liberação daacetilcolina, o músculo não contrai,ocorrendo a paralisia.

Formas detransmissão Alimentar: ingestão de alimentoscontaminados com a toxina; Ferimento: multiplicação domicrorganismo com produção detoxina em feridas contaminadas; Intestinal: produção endógena datoxina pela germinação deesporos do C. botulinum nointestino (< 1 ano) adultos(cirurgias intestinais, acloridria,doença de Crohn, uso prolongadode antibióticos).INSTITUTO ADOLFO LUTZ

otulismoalimentar Período de incubação: 12-36horas (2hs - 10 dias); Quanto > concentração detoxina no alimento ingerido,< período de incubação.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Alimentos associadosCom o botulismoINSTITUTO ADOLFO LUTZ Alimentos enlatados ouenvasados em vidros; Industrializados:subprocessamento oucontaminaçãopós-processo; Conservas caseiras:subprocessamento e acidez.

alimentosenvolvidosINSTITUTO ADOLFO LUTZ Conserva de peixe caseira(Brasil, 2007); Suco de cenoura (EUA e Canadá,2006); Tofu (Brasil, 2005); Patê de fígado industrializado(Brasil, 2005); Sardinha em molho de tomate(África do Sul, 2002); “Carne em lata” (Brasil, 2002); Mortadela (Marrocos, 1999); Torta, Brasil (2006 e 2007).

Controle Impedir a germinação deesporos e a proliferação dascélulas vegetativas; Importância da microbiotacompetitiva (ex. bactériaslácticas); Conservantes químicos -nitritos e nitratos; Tratamento térmico elevado; pH.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

SINTOMASbotulismoinfantilINSTITUTO ADOLFO LUTZ Letargia; Constipação; Dificuldade paraalimentar-se; Choro fraco; Flacidez muscular e perdado controle dos movimentosda cabeça; Morte súbita.

Mel (Midura, 1996);fonte Ambiente (Long, 1985; Nevas etal., 2005b; Fox et al., 2005); Fórmula infantil - Reino Unido(Brett et al., 2005); Ervas (chás) - Argentina(Satorres et al., 1999; Bianco etal., 2008); Cereal infantil - Canadá(Hauschild et al., 1988).INSTITUTO ADOLFO LUTZ

QUADRO CLÍNICOsta doença pode serconfundida com outrasenfermidades neurológicas:índrome de Guillain-Barré;üller-Fischer ;iastenia gravis.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

COLETA DE AMOSTRAS Deve ser realizada o maisprecocemente possível, atésete dias após o início dossintomas; Antes da administração dosoro anti-botulínico; Coleta tardia pode revelar umresultado falso negativo.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

TRANSPORTEINSTITUTO ADOLFO LUTZ Acondicionar as amostras emrecipientes à prova devazamento em caixasisotérmicas com gelo reciclávelobedecendo as normas debiossegurança; Devem ser devidamenteendereçados e etiquetados comos seguintes dizeres:EMERGÊNCIA MÉDICA, PERIGOBIOLÓGICO E REFRIGERAR NACHEGADA” .Obs.: Espécimes de ferimentos devemser transportados em temperaturaambiente

DIAGNÓSTICOlaboratorial Bioensaio emcamundongos; Amostras clínicas ebromatológicas.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

DIAGNÓSTICOlaboratorial Evidência da toxina (soro,vômito, lavado gástrico, fezes ealimentos) para todas as formasde botulismo; Evidência da presença de C.botulinum, produtor de toxina(fezes de bebê e exsudato deferimento); botulismoinfantil/intestinal e ferimento; Cultura de C. botulinum:exsudato de ferimento, vômito,lavado gástrico e fezes;botulismo infantil/intestinal eferimento.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

amostrasclínicasINSTITUTO ADOLFO LUTZ Soro: 15 a 20 mL de sanguetotal em frasco semanticoagulante, paraobtenção de 10 mL de soro; Fezes/lavado gástrico: 25 a50g ou Ml; Ferimento: coletar com“swab” a parte maisprofunda do ferimento,inocular num meio de culturaredutor (tioglicolato comrezasurina).

amostrasbromatológicas Sobras do alimentoefetivamente consumidopelo afetado; Na ausência de sobras,enviar recipientes vaziosque contiveram o alimentoconsumido.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

ExtraçãoDa toxina Solução de gel fosfato (1:1p/v, homogeneização); Centrífuga refrigerada (4ºC/12.000 x g/20 min.).INSTITUTO ADOLFO LUTZ

tratamentoDo sobrenadante Separado em 2 porções: Tratada termicamente: águaebulição/10 min.; Tripsinizada: acertar o pH p/6,2; 1,8 ml do sobrenadante,acrescente 0,2 ml de sol.Tripsina; incubar a 37ºC/1h.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Triagem daPresença de toxinaINSTITUTO ADOLFO LUTZ Selecionar no mínimo 8camundongos (20-25g); 2 animais: inoculados comporção fervida já resfriada; 2 animais: inoculados comporção tripsinizada; 2 animais: inoculados c/ aporção extraída, não tratadatermicamente e nãotripsinizada; 2 animais são controle doensaio.

INOCULAÇÃOINTRAPERITONEAlINSTITUTO ADOLFO LUTZ

SINTOMATOLOGIA Observação constante por 6h; Após este período, os animaissão observados a cada 6h, atéum período máximo de 96h; Sintomas: respiração difícil,elaborada, acinturamento tipo“cintura de vespa”, porparalisia do diafragma emcontração; Morte.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

SINTOMATOLOGIAANIMAL ACINTURADOANIMAL SEM SINTOMASINSTITUTO ADOLFO LUTZFONTE: http://www.nc3rs.org.uk/

identificaçãoDa toxina Misturar amostra positivacom anti-soros polivalentes emonovalentes (A,B,E e F); Inocular em camundongos; Os animais inoculados,deverão apresentar ossintomas de botulismo,exceto aqueles que foraminoculados com a antitoxinaque foi capaz de inativação.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

interpretaçãoINSTITUTO ADOLFO LUTZ Os animais que não apresentaremsintomas permitem aidentificação do tipo presente; Se os camundongos não foremprotegidos por 1 dosmonovalentes:1. Pode ter muita toxina no alimento;2. Pode ter mais de 2 tipos de toxinas;3. Mortes podem ser devidas a outras causas.Se ambos os sobrenadantes,aquecido e não aquecido, foremletais, as mortes provavelmentenão são devidas a toxinabotulínica.

Aplicação daToxina botulínica Tratamento de espasmosmusculares de vários tipos:estrabismos, doresmusculares de faces epescoço; Limitação da terapia:injeção deve ser repetida.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

otoxTOXINA BOTULÍNICATIPO A (BOTOX)TRATAMENTO DERUGAS COM APLICAÇÃODO BOTOXINSTITUTO ADOLFO LUTZ

Vigilância nacionalDE BOTULISMO 1982: Implantação do diagnóstico debotulismo, IAL/SP; 1999: Início da estruturação davigilância CR Bot/SP; 2001: Notificação obrigatória; 2002: Implantação da vigilância nosEstados; 2003: Produção de antitoxina peloInstituto Butantan; 2008: Habilitação do IAL como LRNpela ANVISA.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Laboratório deBOTULISMOINSTITUTO ADOLFO LUTZINAUGURAÇÃO DO LABORATÓRIO NB-2

Laboratório de botulismoDesenho e organização Portas de acesso duplas comfechamento automático (trava); Pass-trough para passagem deamostras e animais; Área de preparação de amostras; Área de inoculação; Área de manutenção dos animais; Ar de exaustão não circulante, fluxode ar negativo dentro do laboratório.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Laboratório deBOTULISMO Cabine de segurança biológicacom exaustão/filtro HEPA; Centrífuga refrigerada (12.000 x g); Ambiente climatizado (22 ± 2°C) esem ruído; Câmara de CO 2(eutanásia); Autoclave (descarte de amostrasbromatológicas e biológicas).INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Descarte de animaisDe laboratório Acondicionamento paradescontaminação (sacoautoclavável); Acondicionamento para descarte(NBR 9191/2000 - ABNT); Congelamento; Preenchimento de planilha(biossegurança); Coleta pela Prefeitura.INSTITUTO ADOLFO LUTZ

PORTAS COM FECHAMENTO AUTOMÁTICO (TRAVAS)Laboratório deBOTULISMOINSTITUTO ADOLFO LUTZ

“PASS-THROUGH” (PASSAGEM DE AMOSTRAS E ANIMAISLaboratório deBOTULISMOINSTITUTO ADOLFO LUTZ

ÁREA DE INOCULAÇÃO / PRATELEIRAS P/ CAMUNDONGOSLaboratório deBOTULISMOINSTITUTO ADOLFO LUTZ

Laboratório deBOTULISMOINSTITUTO ADOLFO LUTZCABINE DE SEGURANÇA BIOLÓGICA NÍVEL 2

desafios/RecomendaçõesINSTITUTO ADOLFO LUTZ Capacitação de médicos; Melhoria no diagnósticoclínico; Coleta oportuna de amostras; Administração de antitoxinaoportunamente; Tratamento adequado; Desenvolvimento de métodoslaboratoriais rápidos.

Laboratório deBOTULISMOMIJ AK AB I@IAL .S P .G OV .B RMUIT OOB RIG ADA!DÚV IDAS ? !?INSTITUTO ADOLFO LUTZ