Betalactamases de Espectro Ampliado (ESBL): um ... - NewsLab

ArtigoBetalactamases de Espectro Ampliado (ESBL):um Importante Mecanismo de ResistênciaBacteriana e sua Detecção no Laboratório ClínicoManuel Alves de Sousa Junior 1,2, Edvana dos Santos Ferreira 1 , Gildásio Carvalho da Conceição 2,31 - Universidade Católica de Salvador - UCSal2 - Laboratório de Análises Clínicas da Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais de Salvador (APAE - SSA)3 - Hospital Universitário Professor Edgard Santos - UFBAResumoAs betalactamases formam um grande grupo de enzimas que são capazes de hidrolizar o anel betalactâmico de penicilinas,cefalosporinas e monobactâmicos (antibióticos betalactâmicos). Dentre as betalactamases, destacam-se as betalactamasesde espectro ampliado (Extended-Spectrum Betalactamase - ESBL). A produção de ESBL é mediada por plasmídeos queconferem ampla resistência aos antimicrobianos que contém o anel betalactâmico em sua estrutura e agem neste anel betalactâmicorompendo-o e inativando assim, o antibiótico. Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae são as espécies bacterianasmais comumente encontradas produzindo ESBL, a detecção destas enzimas já foi observada em diversas outras espécies deEnterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. Pacientes com infecções por enterobactérias produtoras de ESBL não devem sermedicados com antibióticos betalactâmicos, o que acarretaria em falha terapêutica e agravamento do quadro infeccioso. Adetecção presuntiva de ESBL não acarreta custos adicionais ao laboratório, visto que os antimicrobianos necessários para taldetecção podem compor o conjunto de discos utilizados na rotina laboratorial em antibiogramas. O trabalho do laboratóriode microbiologia é imprescindível na detecção das enterobactérias produtoras de ESBL. A detecção precoce destas bactériasmultirresistentes é de suma importância para se instaurar o tratamento adequado e as medidas de isolamento dos pacientes,necessárias para se evitar a disseminação destes patógenos em surtos comunitários e nosocomiais.Palavras-chaves: ESBL, resistência bacteriana, betalactamasesIntroduçãoDiversos mecanismos emergentesde resistência aosantimicrobianos foram recentementedescritos e alguns delessão de difícil detecção pelas metodologiaslaboratoriais de rotina.Embora exista uma grandevariedade de mecanismos de resistênciaaos antibióticos betalactâmicos,um dos mecanismosmais importantes é a produçãode betalactamases, que são enzimascapazes de hidrolizar oanel betalactâmico de penicilinas,cefalosporinas e outros antimicrobianosrelacionados, tornando-osinativos. Entre estesdestacamos a produção de betalactamasesde espectro ampliado(Extended-Spectrum Betalactamase= ESBL) principalmenteem algumas espécies debactérias Gram-negativas (1).A primeira referência à resistênciaantibiótica surgiu nos anos152NewsLab - edição 63 - 2004

40 com as penicilinas, tendo ressurgidocom o advento dos novosantibióticos nos anos 50 e60. Atualmente, o mecanismo deresistência causa enormes problemasterapêuticos com implicaçõesde saúde pública (2). Asbetalactamases são produzidaspor bactérias Gram-positivas eGram-negativas. As bactériasGram-negativas apresentam umnúmero extraordinário de betalactamases,sobretudo cromossômicase plasmidiais.Há evidências de que as enzimasque inativam os antibióticosbetalactâmicos eram produzidaspelas bactérias muito antes daintrodução e aperfeiçoamentodestes antibióticos no uso clínico.O uso amplo e, às vezes, indiscriminadodestes antimicrobianoscertamente auxiliou na disseminaçãoda resistência, masnão se pode responsabilizar a utilizaçãoclínica pelo aparecimentodas betalactamases (3).Em 1983 foram detectados naAlemanha (Frankfurt) os primeirosisolados clínicos de Klebsiellapneumoniae e Escherichia coliresistentes às cefalosporinas deterceira geração. Desde então,têm sido descritas em todo mundonumerosas enzimas dos tiposTEM e SHV com este fenótipo deresistência (4).Muitas bactérias apresentamtambém pequenas moléculas deDNA circular conhecidas comoplasmídeos, que são independentesdo DNA cromossômico ecarregam genes que não são essenciaispara a vida. Possuem apropriedade de serem transferidosde uma bactéria para outra(conjugação) levando característicasgenéticas até então inexistentesna célula receptora. Muitasvezes, os plasmídeos carregamgenes que conferem à bactériaresistência a antibióticos.Essa é uma característica genéticamuito importante para a bactéria,pois permite sua sobrevivênciamesmo na presença deuma substância nociva (5).As ESBL hidrolizam as cefalosporinas(exceto as cefamicinas)e os monobactâmicos, nãohidrolizando, entretanto os carbapenêmicos.A ação hidrolíticadestas enzimas é bloqueadapelos inibidores de betalactamase(ácido clavulânico, sulbactame tazobactam).Um dos principais problemascausados por estas enzimas é decorrentedo fato de sua produçãoser induzida durante a terapêuticaantimicrobiana. Dessa maneira,quando a amostra bacterianaé detectada pelo laboratório demicrobiologia, ela é aparentementesensível às cefalosporinas deterceira geração e penicilinas deamplo espectro, porém, duranteo tratamento pode ocorrer induçãoda produção de grandes quantidadesde enzimas e o pacientecomeçar a evoluir mal, ocorrendo"recidiva" da infecção. Uma novaamostra da bactéria é isolada eesta poderá se mostrar resistentea um antimicrobiano (utilizadopara o tratamento) para o qual abactéria era inicialmente sensível,podendo até ser interpretadocomo erro laboratorial quando daavaliação da primeira amostra (6)Quando produzem estas enzimas,os organismos tornam-sealtamente efetivos pela inativaçãode diversos antibióticos betalactâmicos.Assim, os Clínicosdevem se familiarizar com o sig-NewsLab - edição 63 - 2004153

Figura 1 - Microfotografia eletrônica de duas Escherichia coli em processode conjugaçãonificado clínico destas enzimas e de ESBL em laboratórios de microbiologiaclínica, evidenciar as pos-estratégias potenciais para procedimentoscom este crescente síveis falhas terapêuticas de diversosantimicrobianos em pacientesproblema (7).É de suma importância avaliar com infecções por bactérias produtorasde ESBL e demonstrar quea freqüência de bactérias produtorasde ESBL para que se possa a sua detecção pode e deve serestabelecer como rotina no laboratóriode microbiologia clínica a tórios de microbiologia clínica.uma prática rotineira em labora-inclusão dos antibióticos nos testesde susceptibilidade aos antimicrobianosque auxiliam em tal iden-As bactérias possuem um úni-Genética Bacterianatificação como ceftriaxona, ceftazidima,cefotaxima, cefpodoxima, pelo citoplasma, composto de DNAco cromossomo circular, dispersoaztreonam, tobramicina, ciprofloxacinae os discos que possuem se totalidade das informações,(cadeia dupla) que contém a qua-os inibidores associados como incluindo as indispensáveis à vidaamoxicilina/ácido clavulânico, sulbactam/ampicilinaou ticarcilina/ Os plasmídeos replicam-se in-da célula (8).ácido clavulânico. Esta seleção dependentes do cromossomo,pode ajudar ao Clínico, evitando carregam genes que não são essenciaispara a vida das bactéri-ocorrência de falha terapêutica.Os objetivos deste trabalho são as e podem ser transferidos, deabordar a importância da detecção vez em quando por conjugação,de uma bactéria para outra. Atransferência de fragmentos deDNA cromossômico e de plasmídeosé altamente disseminadanos procariotos, sendo uma dascausas da notável diversidadegenética observada nas bactérias(3). O problema da resistênciase agrava, pois a transferênciade plasmídeos ocorre entrecélulas bacterianas de uma mesmapopulação e entre as bactériasde diferentes gêneros (10).Muitas vezes carregam genes queconferem à bactéria resistênciaaos antibióticos, como por exemploo gene que codifica algumaESBL (5) (Figura 1).Uma conseqüência dos eventosgenéticos ligados à transferênciaplasmidial tem sido observadana rápida propagação de resistênciaa antibióticos transmitidapor plasmídeos em populaçõesbacterianas após uso indiscriminadodos antibióticos emambientes comunitários e hospitalares(11, 12).As bactérias podem transferirmaterial genético de uma paraoutra por meio de quatro mecanismos:conjugação, transformação,transdução e transposição(13). A conjugação é um processode transferência de genes querequer o contato célula-célula, diferindodos demais processos;onde na transformação ocorrecaptação de DNA solúvel no meiopor células doadoras, na transduçãoocorre transferência gené-154NewsLab - edição 63 - 2004

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tica com auxílio dos bacteriófagose na transposição, os genessão transferidos dentro de umamesma célula por intermédio dostransposons (DNA). Estes segmentospodem "saltar" ou autotransferirem-sede uma moléculade DNA (plasmídeo, cromossomo)para outra (plasmídeo,cromossomo, fago) (9,10).AntimicrobianosSão produtos naturais de fungose bactérias ou sintéticos produzidosem laboratórios, capazesde impedir o crescimento de microorganismosou mesmo destruílos.Algumas drogas antimicrobianassão bactericidas (matam microorganismos),enquanto outrassão bacteriostáticas (inibem a suamultiplicação). Em pacientes como sistema imune funcionando emcondições adequadas, ambas asclasses de drogas são efetivas eagem como auxiliares ao sistemaeliminando a infecção. O principalobjetivo do uso de um antimicrobianoé o de prevenir ou tratar umainfecção, diminuindo ou eliminandoos organismos patogênicos e sepossível, preservando os germesda microbiota normal.É improvável que um únicoagente quimioterápico possaapresentar todas as qualidadesnecessárias para utilização notratamento eficaz de infecçõesmicrobianas. Portanto, podem-sefazer comparações entre osagentes disponíveis para selecionaro mais apropriado para otratamento (9).A ação antimicrobiana é direcionadacontra alvos peculiaresnos microorganismos (estruturase/ou vias metabólicas), ausentesno organismo humano. Este efeitominimiza o efeito tóxico dasdrogas antimicrobianas para aespécie humana. Pode ser atravésda inibição da síntese de paredecelular, inibição da membranacelular, inibição da síntese protéicaou através da inibição da síntesede ácidos nucléicos (13).Os antibióticos betalactâmicosconstituem uma grande família dediferentes grupos de compostoscontendo um anel betalactâmicoem sua estrutura (12). As penicilinase cefalosporinas (betalactâmicos)afetam a síntese dos componentesdo peptideoglicano inibindouma etapa particular, emque ligações cruzadas são formadasentre as cadeias de peptideoglicano,este fato permite umafalha na sustentabilidade da paredecelular (9). Os betalactâmicosagem ligando-se às proteínascarreadoras de penicilina na paredecelular bacteriana. A resistênciaa estes agentes geralmenteenvolve processos que interferemna atuação destas proteínas.Figura 2 - Núcleo central dos antibióticos betalactâmicosResistência BacterianaA resistência a antimicrobianostem aumentado rapidamentenos últimos anos no Brasil e156NewsLab - edição 63 - 2004

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no mundo, gerando uma necessidadecrescente do conhecimentodo perfil de sensibilidade dasbactérias que mais freqüentementecausam infecções e domodo de disseminação da resistência(15). Muitas bactériaspossuem resistência intrínseca avários grupos de antibióticos, porémo problema da resistênciaaos antimicrobianos é colocadoquando as bactérias sofrem mutações,originando formas resistentes(2).Os mecanismos genéticos quecodificam a resistência bacterianase exteriorizam por seis principaismecanismos bioquímicosde ação: inativação enzimática dadroga, alteração da permeabilidadebacteriana à droga, alteraçãode sistemas de transporte nacélula, retirada ativa da droga domeio intracelular, alteração do receptorà droga e modificação dosistema metabólico ativo para adroga e síntese das vias metabólicasalternativas (13). Todosestes mecanismos citados podemser reunidos em três grupos: inativaçãoenzimática, alteração dosítio de ação do antibiótico e alteraçãodo transporte do antibióticoatravés do invólucro bacteriano.Um quarto mecanismo, casoespecífico de resistência as sulfonamidase trimetropim, se relacionaà capacidade da célulabacteriana de evitar a rota metabólicainibida por estes antibióticos(16).A inibição ou inativação enzimáticaproduzida pelos microorganismosé provavelmente o principalmecanismo molecular de resistênciamicrobiana. Foi inicialmentedescrita por Abraham eChaim, em 1940, que demonstraramem extratos de Escherichiacoli uma enzima capaz de inativara ação da penicilina, provocandoa sua abertura por hidrólisee transformando o antibióticoem produto inativo. Com a introduçãodas cefalosporinas na décadade 60, o termo cefalosporinasepassou a ser empregadopara designar as enzimas que hidrolisavameste grupo de antibióticosbetalactâmicos (13).BetalactamasesAs betalactamases constituemum grupo heterogêneo de enzimascapazes de inativar as penicilinas,cefalosporinas e por vezes os monobactâmicos.Estas enzimas sãofreqüentemente produzidas porbactérias Gram-positivas e Gramnegativas,aeróbias e anaeróbias,e lizam o anel betalactâmico porhidroxilação irreversível da ligaçãoamida, com inativação do antibiótico.Embora o resultado finalde sua ação seja o mesmo, a atividadeenzimática é variável deacordo com o tipo de betalactamaseproduzida e os diversossubstratos existentes. Existe umavariação em especificidade desubstrato entre as betalactamases:algumas hidroxilam preferencialmenteas penicilinas, outrastêm atração pelas cefalosporinase algumas enzimas inativam ambasas classes de antibióticos. Emalguns patógenos, verifica-se aprodução de diferentes tipos debetalactamases, onde diferentescepas podem produzir diferentesenzimas, ou uma única cepa podeproduzir mais de um tipo de enzima.Os betalactâmicos são liberadosem condições naturais pelosmicroorganismos produtores esão os resultados de um processoevolutivo e da pressão seletivaque favorecem os produtoresde antibióticos. O uso amplo eindiscriminado destes agentescertamente auxiliou na disseminaçãoda resistência, mas nãoprovocou o aparecimento destasenzimas. (3).A produção destas enzimas pordeterminadas bactérias explica asua permanência em um foco infecciosoquando o antibiótico utilizadoé um betalactâmico. Alémdisso, pode interferir na sobrevivênciade outros microorganismos,sensíveis ao antibiótico,quando o germe produtor faz partede uma flora bacteriana mista.Pode ocorrer quando, em umaamigdalite tratada com penicilina,o Streptococcus do grupo A (sensívelao antibiótico) permaneceativo mesmo após o tratamento,devido à produção de betalactamasespor bactérias que fazemparte da microbiota oral como es-158NewsLab - edição 63 - 2004

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tafilococos, moraxelas ou bactériasanaeróbias (13).Os inibidores de betalactamasessão compostos que se assemelhamo suficiente aos antibióticosbetalactâmicos para uniremseàs betalactamases, de formareversível ou irreversível, paraproteger os antibióticos da destruição.Não é surpreendente queestes compostos, que podem realizaro mesmo funcionamento dosantibióticos betalactâmicos, tambémpossuam uma atividade antibacterianalimitada por si mesmos.Os três inibidores de betalactamasesque têm sido aplicadosna medicina clínica são o ácidoclavulânico, o sulbactam e otazobactam. Possuem efeitos contrapenicilinas produzidas por Staphylococcuse têm eficácia variávelcontra as enzimas cromossômicasou plasmidiais das bactériasGram-negativas. O ácido clavulânicoe o tazobactam são superioresao sulbactam em atividadecontra as betalactamasestransmitidas por plasmídeos demicroorganismos Gram-negativos,inibindo as ESBL. Algumasenzimas de amplo espectro sãoresistentes à atividade dos trêscompostos (17).Vários fatores determinam aeficácia de combinações de inibidores,antibióticos, enzimas e cepasbacterianas específicas. Estesfatores incluem a magnitudecom que os antibióticos ou os inibidoresinduzem a atividade dasbetalactamases, a quantidade deenzima produzida, e a eficácia doinibidor contra o tipo específicode betalactamase produzida. Entreas betalactamases de amploespectro, algumas são bloqueadaspor diferentes inibidores eoutras não são afetadas pela suapresença (17).ESBL (Extended-SpectrumBetaLactamase)As ESBL constituem um grupode enzimas derivadas das betalactamasesclássicas TEM-1, TEM-2 e SHV-1 (6). Estas enzimas conferemresistência às cefalosporinasde amplo espectro, penicilinase monobactans (aztreonam),sendo que essas amostras permanecemsensíveis às cefamicinas ecarbapenêmicos. Outra característicafenotípica importante é queessas enzimas são sensíveis àação dos inibidores de betalactamases,como sulbactam, ácidoclavulânico e tazobactam. As enzimasforam denominadas deESBL devido ao fato da maioriadessas enzimas serem codificadaspor genes localizados em plasmídeos,que geralmente carregamgenes de resistência a outros antimicrobianos,tais como aminoglicosídeos,trimetropim, sulfonamidas,tetraciclinas e cloranfenicol.As cepas produtoras de ESBLsão geralmente multirresistentes.A produção de betalactamasesé o principal mecanismo de resistênciadas bactérias Gram-negativas.O grau de resistência irádepender da quantidade de enzimaproduzida, da habilidade dessaenzima em hidrolisar o antimicrobianoem questão (potência) eda velocidade com que o betalactâmicopenetra pela membranaexterna da bactéria (permeabilidadeda membrana).A superprodução de enzimasinduzíveis cromossômicas ouplasmidiais pode inativar antibióticoscomo o imipenem ou as cefalosporinasde terceira geraçãoque eram resistentes à degradaçãopor quantidades normais deenzimas. As ESBL inativam muitasdas cefalosporinas de terceirageração, enquanto que os carbapenêmicossão relativamenteresistentes a estas enzimas versáteis.As bactérias Gram-negativastêm estado suficientementecheias de recursos como a produçãode betalactamases queinativam antibióticos em formaespecífica, como o imipenem, quesão resistentes à ação da maiorparte das outras enzimas (17).O primeiro relato de cepasprodutoras de ESBL ocorreu emFrankfurt, na Alemanha em1983, onde enzimas do tipo SHVforam isoladas de Klebsiellapneumoniae e Escherichia coli. Aanálise destas cepas demonstrouposteriormente que a resistênciadevia-se à produção de umabetalactamase plasmidial transferível,derivada de SHV-1, sendodenominada SHV-2. Desde160NewsLab - edição 63 - 2004

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então, têm sido descritas emtodo mundo numerosas enzimasdos tipos TEM e SHV com estefenótipo de resistência.Cepas de Klebsiella spp e Escherichiacoli são as bactériasmais comuns produtoras de ESBL,porém já foram detectadas emdiversas espécies de Enterobacteriaceaee em Pseudomonas aeruginosa.Atualmente existemmais de 150 ESBL descritas, dasquais mais de 90 são do tipo TEMe mais de 25 dos tipos SHV e OXA(14). As enterobactérias produtorasde ESBL têm sido isoladascom maior freqüência em amostrasprocedentes de pacienteshospitalizados, porém tambémpodem ser encontradas emamostras de origem comunitária.Estes isolamentos podem aparecerde forma esporádica, semrelação epidemiológica ou dar lugara surtos nosocomiais.O tubo digestivo atua comoreservatório potencial destesmicroorganismos multirresistentes.Além disso, é o habitatadequado para que a resistênciase transmita a outras espéciesbacterianas (4).O aparecimento de surtos nosocomiaisdevido a estes microorganismosdepende tanto dascondições ambientais (elevadoconsumo de cefalosporinas de terceirageração, manipulação dospacientes, etc.) como das característicasespeciais do microorganismo(fatores de virulência, aderência,etc). Além do consumo deantibióticos de amplo espectro,outros fatores de risco são importantespara adquirir infecção/colonizaçãocomo a cateterizaçãoarterial e/ou urinária (6).É importante conhecer o mecanismode resistência para queocorra a determinação fenotípicae genotípica do microorganismo,para posterior relevância epidemiológicado surto. Além de evidenciarse é a mesma cepa que estácausando determinado surto ou sesão cepas diferentes do mesmomicroorganismo.Detecção de ESBLA detecção destas enzimas emisolados de E. coli e Klebsiella pnemoniaeé problemática devido àvariabilidade fenotípica dos tiposenzimáticos, pois as expressõesguardam estreita correlação com osmecanismos de ação dos antibióticos.Alguns métodos têm sido propostos,baseados no fato da produçãode ESBL ser afetada pelosinibidores de betalactamases, comoo método da fita E-teste (fita dupla),o método da dupla difusão emágar ou método de aproximação dedisco, o método da adição de ácidoclavulânico ao disco de ceftazidimae o método automatizado.Apesar da aparente sensibilidadein vitro a vários antimicrobianos,pacientes com infecções porcepas produtoras de ESBL podemnão responder à terapia com betalactâmicose monobactâmicos. Oscarbapenêmicos, imipenem e meropenem,são opções terapêuticasindicadas para o tratamento de infecçõespor cepas produtoras dessasenzimas. Geralmente estasamostras exibem co-resistência àsquinolonas e aminoglicosídeos, portanto,o uso destes agentes deveser baseado no antibiograma.Mutações na cadeia de aminoácidospodem ser responsáveispela falha na detecção dessas enzimasporque alteram a capacidadeou a velocidade de hidrólisede oximino-betalactâmicos. AsESBL derivadas da enzima TEM ecom apenas uma substituição nacadeia de aminoácidos (TEM-7 ouTEM-12) apresentam baixo poderde hidrólise deste grupo de antibióticos,podendo não ser detectadasem testes laboratoriais.Outras, como aquelas derivadasdas enzimas TEM-3, TEM-26,SHV-2 e SHV-4, exibem alto poderde hidrólise de betalactâmicos.Por esta razão o betalactâmicoque será hidrolisado demaneira mais eficaz varia muitodependendo da enzima (6).Segundo o NCCLS, para as cepascom testes positivos paraESBL no laboratório de microbiologiaclínica, devem ser reportadasno laudo como resistentesaos antibióticos betalactâmicos eàs combinações de betalactamasescom inibidores de betalactamases(mesmo que sensíveis invitro). Além disso, deve seracrescentada uma observação re-162NewsLab - edição 63 - 2004

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latando que os testes laboratoriaissugerem a produção de ESBL,para que se tomem as medidasepidemiológicas adequadas e evitarque estas drogas sejam utilizadasno tratamento (Tabela 1).Os testes disponíveis para detectarcepas produtoras destasenzimas possuem limitações devidoà possibilidade das já mencionadasmutações. Interpretaçõesadequadas dos testes de susceptibilidadeantimicrobiana são imprescindíveisna detecção destemecanismo de resistência (18).Discos de tobramicina e ciprofloxacinadevem ser incluídos nostestes de detecção, pois geralmenteas amostras bacterianas produtorasde ESBL também são resistentesa estes antibióticos (4).Tabela I - Teste para a detecção de ESBL em Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca e Escherichia coli segundo o NCCLSMétodo Teste de Triagem Teste ConfirmatórioMeio de Cultura ágar Mueller Hinton ágar Mueller HintonConcentração do discode AntibióticoCefpodoxima 10µg ouCeftazidima 30µg ouAztreonam 30µg ouCefotaxima 30µg ouCeftriaxona 30µgO uso de mais de um agenteantimicrobiano para a triagemaumenta a sensibilidade de detecçãoCeftazidima 30µgCeftazidima/ác. clavulânico 30/10µgE cefotaxima 30µg cefotaxima/ác.clavulânico 30/10µgO teste confirmatório deverá serfeito com ambos antibióticos,sozinho e combinado com ác.clavulânicoInóculo econdiçõesdeincubaçãoDe acordo com as recomendações da padronização do teste de difusãoResultadosCefpodoxima ≤ 22mmCeftazidima ≤ 22mmAztreonam ≤ 27mmCefotaxima ≤ 27mmCeftriaxona ≤ 25mm= suspeita de produção de ESBLUm aumento de ≥ 5mm no diâmetropara qualquer agente antimicrobianotestado em combinação com o ácidoclavulânico comparado com oagente sozinho = produção de ESBLRecomendações doControle de QualidadeE.coli ATCC 25922K. pneumoniae ATCC 700603Cefpodoxima 9-16mmCeftazidima 10-18mmAztreonam 9-17mmCefotaxima 17-25mmCeftriaxona 16-24mmE. coli = um aumento de ≤ 2mm nohalo do antibiótico testado sozinhocomparado com a zona de inibiçãoquando combinado com ácidoclavulânicoK. pneumoniaeAumento de ≥ 5mm no halo daceftazidimaAumento de ≥ 3mm no halo dacefotaxima164NewsLab - edição 63 - 2004

Figura 4Figura 3Método E-TesteO método E-teste utiliza umafita plástica que contém concentraçõescrescentes do agente emestudo numa placa de Mueller Hintonsemeada com o inóculo bacterianopadronizado com a escala 0,5de MacFarland. Neste caso, em umdos lados da fita existe ceftazidima,e do outro ceftazidima associadaa uma concentração fixa de2µg/mL de ácido clavulânico. Abactéria será considerada produtorade ESBL quando a leitura apresentaruma diminuição de pelo menosduas diluições logarítmicas(quando a razão entre os dois breakpointsfor igual ou maior que 8)da ceftazidima/ácido clavulânicoem relação ao MIC (ConcentraçãoInibitória Mínima) da ceftazidima.O método se baseia no aumentoda sensibilidade em presença doácido clavulânico, como recomendao NCCLS para testes confirmatóriosde presença de ESBL. Estatécnica é de fácil realização; entretanto,pode gerar resultadosconfusos se usada isoladamente,pois neste caso será testada somenteuma droga (Figura 4).Método da dupla difusão ou métododa aproximação de discoA identificação de amostras pro-Figura 5 - Presença de "ghost-zone"dutoras de ESBL pode ser feitamediante a sinergia de duplo disco.Realiza-se a difusão em ágarutilizando uma placa de ágar MuellerHinton inoculada com uma suspensãobacteriana ajustada com opadrão 0,5 da escala de MacFarland;logo após colocam-se os discoscom carga padronizada deNewsLab - edição 63 - 2004165

aztreonam e cefalosporinas de terceirageração como cefotaxima,ceftazidima, ceftriaxona; dispostosa uma distância de 20mm de discosde amoxicilina / ác. clavulânico.É considerada sinergia positiva(e, portanto, detecta-se a produçãode ESBL), quando se observauma ampliação do halo de inibiçãoem alguma das cefalosporinas oudo aztreonam ou o aparecimentode uma terceira zona irregular deinibição (conhecida como ghostzone)entre o disco composto e odisco de uma das drogas betalactâmicas.Esta técnica é de fácil realizaçãoe acessível a qualquer laboratóriode microbiologia clínica.Este método é o mais utilizado narotina laboratorial pelo baixo custo,fácil acesso à metodologia e pelotempo de obtenção dos resultados.Para cepas isoladas que demonstramzonas de inibição grandes, odisco deve ser colocado a 30mmde distância e para cepas isoladascom zona de inibição menores, umadistância menor deve ser utilizada(20mm). A determinação desta distânciaconstitui a maior dificuldadedo método (Figuras 3 e 5).Método da adição do ácido clavulânicoao disco de ceftazidimaEste método baseia-se na comparaçãodo tamanho do halo formadoem torno dos discos de ceftazidima(30µg) com o halo do disco deácido clavulânico/ceftazidima (10µg/30µg). Um aumento maior ou iguala 5mm no halo de inibição do discocomposto em comparação com ohalo do disco sem ácido clavulânico,indica bactéria produtora de ESBL.Método automatizadoAlguns painéis de microdiluiçãoestão disponíveis, comercializadosprincipalmente para os sistemasMicroScan® (Dade Behring) e Vitek®(bioMériux). A análise fenotípicada bactéria por este métodoproporciona uma padronização erapidez, o que garante boa consistêncianos resultados em detrimentoaos testes em discos, comresultados após 18-24 horas. Todavia,o método automatizado temalgumas desvantagens quandocomparado com difusão em ágar,porque certas bactérias não crescemou o fazem pobremente após4-5 horas de incubação (Proteussp, Morganella sp, Providencia sp,Yersinia sp e outras). Outro pontoseria a dificuldade em detectar obaixo nível de expressão destemecanismo de resistência. Algunscomplexos fenotípicos resultantesde combinações destes mecanismossão pobremente diferenciadospelo método automatizado (18).Desvantagens na realizaçãodestas técnicas• A hiperprodução de betalactamasecromossômica por Proteusvulgaris, Proteus penneri ou Citrobacterkoseri (que é uma cefuroximaseinibida pelo ácido clavulânico),pode resultar em uma ampliaçãodo halo com a cefuroxima,cefotaxima e ceftriaxona. A hiperproduçãodesta enzima confereresistência a estas drogas, permanecendoa bactéria sensível à ceftazidimae ao aztreonam (6)• A hiperprodução de betalactamaseK-1 por K. oxytoca produzampliação do halo com a cefuroxima,ceftriaxona, aztreoname cefotaxima, mas nunca com aceftazidima. A hiperprodução debetalactamases confere resistênciaa estas drogas, mas não à ceftazidima.Portanto, para diferenciaruma cepa de K. oxytoca hiperprodutorade K-1 de uma produtorade ESBL deve-se realizarsempre o método de determinaçãodo MIC da ceftazidima, observandose este valor se reduz napresença de ácido clavulânico (6)• A hiperprodução de SHV-1 porK. pneumoniae, causada pela presençade múltiplas cópias do plasmídeoque as codifica, tambémpode ocasionar um fenótipo compátivelcom a produção de ESBL.Nestes casos, há uma aumento dosMICs da ceftazidima (4-8µg/mL) edo aztreonam (1-2µg/mL), afetandoescassamente os MICs da cefotaximae ceftriaxona (6)• A produção de L-2 por Stenotrophomonasmaltophila resultaem sinergia positiva com aztreonamdevido à ação hidrolítica destaenzima sobre o aztreonam, sendoinibida pelo ácido clavulânico.Portanto, não devemos confundireste tipo de resistência com a provávelprodução de ESBL (6)166NewsLab - edição 63 - 2004

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Prevenção e tratamentoAs medidas básicas de prevençãodo aparecimento da resistênciabacteriana e disseminação decepas resistentes consistem naadoção de medidas higiênicas, dedesinfecção, no reforço das técnicasassépticas e no isolamento dosdoentes afetados (2).Para o controle de surtos ocasionadospor cepas produtoras deESBL têm sido aplicadas medidascomo a restrição do consumo decefalosporinas de terceira geração,isolamento dos pacientes colonizadose/ou infectados e educaçãodas pessoas que trabalhamdiretamente com os pacientesquanto ao cuidado com a manipulaçãodestes e a correta lavagemdas mãos (6). O problemado tratamento das infecções causadaspor cepas de bactérias queproduzem ESBL é universal e ocorreprincipalmente em hospitaisque utilizam de maneira indiscriminadaas cefalosporinas de amploespectro de ação.O tratamento de pacientes cominfecções causadas por cepas queproduzem ESBL fica limitado apoucos agentes de amplo espectrode ação, os quais poderão tambémfalhar diante de microorganismosque produzem múltiplasbetalactamases, que associadasproduzem múltipla resistência.Somente alguns antibióticosbetalactâmicos conservam suaatividade frente às enterobactériasprodutoras de ESBL. Os carbapenêmicossão os antibióticosmais efetivos, estas drogas sãomuito resistentes à hidrólise poreste tipo de enzima. O uso deantibióticos carbapenêmicos deveriaser moderado, pois tem sidodescrito um aumento da resistênciaa estas drogas.A duração da permanência nohospital (Enfermaria ou Unidadede Tratamento Intensivo - UTI) éum fator primordial, porque,quanto maior a estadia, mais gravea doença, mais intensos os procedimentosinvasivos e a administraçãode antibióticos.É essencial que o laboratóriode microbiologia clínica estejapreparado para a detecção destesmecanismos de resistênciaque têm surgido principalmenteem surtos nosocomiais.DiscussãoVários trabalhos de prevalênciade ESBL relatam porcentagens demicroorganismos produtores deESBL para todas as Enterobacteriaceaee algumas Pseudomonadaceaeem diversas partes do mundo.As bactérias isoladas com maiorfreqüência na produção de ESBLsão cepas do gênero Klebsiella seguidaspor isolados de Escherichiacoli. Alguns autores apresentamporcentagens maiores de outrasenterobactérias do que em Klebsiellaspp, porém devem ser casosisolados de surtos ou trabalhos emque o número de amostras foi pequeno,o que aumenta a porcentagemfinal, como Pagani et al queutilizaram apenas 70 cepas encontrando48% de Proteus mirabiliscomo produtoras de ESBL e Otkumet al, que encontraram 30% decepas de Salmonella typhimuriumprodutoras de ESBL de um total de75 cepas isoladas.O teste de aproximação de discosé o mais utilizado para realizara detecção de ESBL, pois não acarretacustos adicionais ao laboratóriovisto que os antimicrobianosenvolvidos neste método podem serincluídos no antibiograma rotineiropara microorganismos Gram-negativos.Assim, a detecção por estemétodo pode e deve ser realizadaem qualquer laboratório de microbiologiaclínica mesmo não sendoem ambiente hospitalar, porém algunsaspectos devem ser enfatizadosapesar da facilidade de realizaçãona rotina laboratorial. A determinaçãoda distância entre osdiscos deve ser feita de maneira apermitir a visualização do aumentoou distorção dos halos. Se a amostraformar halos grandes, a distânciadeve ser aumentada, entretantose os halos forem menores devesediminuir a distância dos discospara visualizar o efeito da ghostzone,essa variação da distânciadificulta a realização do teste, poisdeve ser adequada para cadaamostra. O NCCLS recomenda adistância de 20mm centro-centro.A interpretação é altamente subjetiva,uma vez que o aparecimento168NewsLab - edição 63 - 2004

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de uma terceira zona de inibiçãonão pode ser quantificada.O método de E-teste e a análiseautomatizada requerem custos adicionaisao laboratório, sendo entãorealizados somente por laboratóriosde grande porte e centros dereferência. O método de adição deácido clavulânico ao disco de ceftazidimapode ser realizado em qualquerlaboratório de microbiologia,porém acarreta custos adicionais,visto que este disco combinado nãoestá disponível pelo mercado paraa terapêutica e não é usualmenteutilizado pelos Clínicos.Palasubramaniam & Parasakthiem 2001 na Malásia compararamos três métodos de identificaçãopresuntiva de ESBL (excluindo ométodo automatizado) e concluíramque o método E-teste com fitadupla combinada mostrou-se maisefetivo em todas as amostras deKlebsiella pneumoniae resistentesà ceftazidima analisadas.Bedenic & Boras em 2001 naCroácia concluíram em seu trabalhosobre os métodos de detecçãode ESBL que o métodode dupla-difusão necessita deuma padronização mais rigorosado inóculo com a escala deMacFarland do que os outrosmétodos manuais, o que demonstraa importância do inóculopara o antibiograma.Segundo Blatt em 2000, o surgimentode resistência bacterianaaos antimicrobianos é inevitável,pela conservação das espécies, maso controle na utilização dos mesmospode limitar o aparecimentode cepas multirresistentes. Barbosaet al em 1998, concordam comesta afirmação dizendo que somentea utilização indiscriminada dosantibióticos não pode ser responsabilizadapelas resistências emergentes.Porém, Silva & Salvino em2000, dizem que um longo períodode hospitalização e o uso abusivode cefalosporinas de terceira geraçãosão fatores de risco primordiaispara a disseminação de surtospor bactérias produtoras de ESBL;o que demonstra a divergência deautores a respeito do uso indiscriminadode antibióticos como responsávelpela múltipla resistência.O papel do laboratório de microbiologiaclínica é de extremaimportância para o diagnóstico,visto que é a partir da análise doantibiograma que o Clínico deveprescrever o antimicrobiano aopaciente. Se o Clínico prescreverum antibiótico betalactâmico parao paciente portador de uma infecçãopor bactéria produtora de ESBLpoderá acarretar em falha terapêutica,seja por erro do laboratórioque pode não ter detectado a produçãoda enzima ou por equívocodo Clínico ao indicar uma drogadotada de anel betalactâmico. Assim,o paciente não vai responderpositivamente ao tratamento epode ocorrer agravamento da infecção,pois com a diminuição daflora bacteriana normal (que podese demonstrar sensível ao betalactâmico),certamente ocorrerá umadiminuição da competitividade coma flora normal a depender do sítioanatômico da infecção.Como a produção de ESBL podeocorrer espontaneamente, há a possibilidadedessa produção se evidenciarno decorrer do tratamento. Então,o paciente que estaria respondendopositivamente à uma infecçãopor uma bactéria não produtorade ESBL, passa a demonstrar umagravamento do quadro infecciosoe ocorre recidiva da infecção. Umanova amostra do material clínicopode detectar a presença da produçãode ESBL, o que pode ser interpretadocomo erro laboratorial.As drogas que a totalidadedos autores recomendam para otratamento das infecções porbactérias produtoras de ESBL sãoos carbapenêmicos (imipenem emeropenem), por estas drogasnão sofrerem hidrólise pelaESBL. No entanto, Kocazeybec &Arabaci em 2002 encontraram89,7% e 95,1% de sensibilidadein vitro para imipenem e meropenem,respectivamente, em185 cepas isoladas de enterobactérias.Para as espécies de Klebsiellaa sensibilidade foi de98,4% para imipenem e 100%para meropenem. Já em Pseudomonasaeruginosa a resistênciafoi de 21,6% para imipeneme 10,8% para meropenem, o quedemonstra uma maior resistênciapara as cepas de Pseudomonasaeruginosa. Esta resistência170NewsLab - edição 63 - 2004

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vem ocorrendo devido à produçãode carbapenamases simultaneamenteà produção de ESBL.Assim, as drogas de escolha parao tratamento de bactérias produtorasde ESBL passam a ficarvulneráveis e a demonstrar umaresistência até então desconhecidaaos carbapenêmicos. Estesdados alertam para a necessidadedo uso racional dos antibióti-cos carbapenêmicos para prevenira aparição de novos microorganismosmultirresistentes.Como observado nas estatísticas,bactérias produtoras de ESBLvêm sendo isoladas de surtos nosocomiaisno mundo inteiro. Surtoscomunitários também têmocorrido e mesmo sendo com umafreqüência menor possuem importânciaepidemiológica.Correspondência para:Manuel Alves de Sousa JuniorAssociação de Pais e Amigos dosExcepcionais de Salvador - APAE SSACentro Médico e Laboratorial.Laboratório de Análises ClínicasSetor de MicrobiologiaRua Rio Grande do Sul, 545CEP: 41830-161. Salvador. BAE-mail: masjbiologo@bol.com.brReferências Bibliográficas1. Francisco W, Jea AHY. Resistência à β-Lactamases por Presença de ESBL. www.fleury.com.br/mednews/0301/mdcontfcb0302.htmAcesso em: 15/10/2002.2. Soares MA. Resistência Antibiótica. Pharmacia Brasileira, p. 59-62, Jan/Fev 2001.3. Barbosa HM, Torres BB, Furlaneto MC. Microbiologia Básica. Ed. Atheneu, São Paulo, 1998.4. Silva CHPM. Bacteriologia - Um texto ilustrado. Ed. Eventos, Teresópolis/RJ, 1999.5. Farah Solange Bento, DNA - Segredos & Mistérios. Ed. Sarvier, São Paulo, 1997.6. Silva CHPM, Salvino CR. Importância do Reconhecimento das Enterobactérias Hospitalares Produtorasde Beta-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) e suas Implicações Terapêuticas. Newslab (41):104-112, 2000.7. Nathisuwan S, Burgess DS, Lewis JS. Extended-spectrum beta-lactamases: epidemiology, detection andtreatment. Pharmacotherapy. 21(8): 920-8, 2001.8. Trabulsi LR, Toledo MRF. Microbiologia. Ed. Atheneu, 2ªed., São Paulo, 1996.9. Pelczar MJ, Chan ECS, Krieg NR, Edwards DD, Pelczar MF. Microbiologia - Conceitos e Aplicações. Ed.Makron Brooks do Brasil, 2ªed, vol. 1, São Paulo, 1996.10. Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiologia. Ed. Artes Médicas Sul, 6ªed, Porto Alegre, 2000.11. Brooks GF, Butel JS, Ornston LN, Jawetz E, Melnick JL, Adelberg EA. Microbiologia Médica. Ed.Guanabara Koogan, 20ºed., Rio de Janeiro, 1998.12. Mims C, Playfair J, Wakelin D, Willians R, Roitt I. Microbiologia Médica. Ed. Manole Ltda, 2ªed, SãoPaulo, 2001.172NewsLab - edição 63 - 2004

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