Associação de marcadores do tipo microssatélite expressos ... - IAC

INSTITUTO AGRONÔMICOCURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURATROPICAL E SUBTROPICALASSOCIAÇÃO DE MARCADORES EST-SSR ÀRESISTÊNCIA AO BICHO-MINEIRO EM CAFEEIROSFERNANDA DE OLIVEIRA PINTOOrientador: Oliveiro Guerreiro FilhoCo-orientadora: Mirian Perez MalufDissertação submetida como requisitoparcial para obtenção do grau deMestre emAgricultura Tropical e SubtropicalÁrea de Concentração em MelhoramentoGenético VegetalCampinas, SPMaio 2006

AGRADECIMENTOS- Primeiramente a Deus, por ter-me permitido chegar até aqui. Agradeço pela Sua força eproteção que me permitiram alcançar os difíceis objetivos;- Ao Instituto Agronômico, pela oportunidade de realização do Curso de Mestrado;- A EMBRAPA - Café, pela concessão de bolsa de estudo;- Ao CNPq, pelo financiamento deste projeto;- Ao orientador, Dr. Oliveiro Guerreiro Filho e a co-orientadora, Drª Mirian Perez Maluf,pelos ensinamentos importantes durante o curso e na minha vida profissional;- Aos Professores da área de concentração Melhoramento Genético Vegetal, pelosensinamentos indispensáveis à minha formação;- Aos funcionários da PG-IAC, pelo auxílio dado no decorrer do curso;- Aos colegas da pós-graduação e a todos do Laboratório de Biologia Molecular do Centrode Café, pela constante amizade e pelo apoio durante o desenvolvimento desta dissertação;- A funcionária Sílvia, pela constante amizade e pela inestimável ajuda na organizaçãodesta dissertação;- Aos meus pais, Luís e Marlene, à minha irmã Carolina e à minha avó Maria Elisa, peloamor, incentivo e força que sempre me deram para que conseguisse chegar até o fim;- Ao meu namorado, Marcio, pela força, companheirismo e apoio que sempre dedicou amim;

- Aos meus tios e tias, avô e primos, por sempre acreditarem e torcerem por mim;- Às minhas amigas Paula, Michelle e Bethe pela constante amizade e companheirismodedicados a mim durante todo este período.

ESCLARECIMENTOSAs seqüências genômicas analisadas nesta dissertação foram obtidas no Banco deESTs do Genoma Café. O acesso a este Banco de Dados é restrito e condicionado àautorização pelo Comitê Gestor do Genoma Café, cujos membros são formados pelaFAPESP, CBP&D do Café e EMBRAPA. Os dados são confidenciais e não podem serdivulgados publicamente durante o período previsto de confidenciabilidade. Portanto, asseqüências utilizadas não serão apresentadas neste trabalho.

SUMÁRIOÍNDICE DE TABELAS.......…………..…………………………………………... viÍNDICE DE FIGURAS............................................................................................. viiRESUMO................................................................................................................... viiiABSTRACT............................................................................................................... ix1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 12 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................ 32.1 A Cultura do Café……………..…………………………………………............ 32.2 Melhoramento do Cafeeiro.………………………............................................... 42.2.1 Biologia do bicho-mineiro…………………………………………………….. 52.2.2 Seleção de cafeeiros resistentes ao bicho-mineiro.……………………............ 52.3 Mecanismos de defesa da planta........................................................................... 72.4 Marcadores Microssatélites…………………………………............................... 102.5 Importância da Busca de Microssatélites em Banco de ESTs……....…………... 123. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 143.1 Local de Experimentação………………………………………………….......... 143.2 Material Vegetal.................................................................................................... 143.3 Avaliação da Resistência....................................................................................... 153.3.1 Técnica de criação de insetos..…......………………......................................... 153.3.2 Infestação das plantas e avaliação da resistência……………………………... 163.4 Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites................................................. 173.4.1 Busca de microssatélites em banco de dados ESTs de café………...……….... 173.4.2 Isolamento do DNA genômico........................................................................... 173.4.3 Amplificação de microssatélites via PCR (reação da polimerase em cadeia).... 183.4.4 Eletroforese dos fragmentos…………………………………………............... 193.4.5 Análise dos resultados........................................................................................ 194 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 214.1 Avaliação da Resistência……………................................................................... 214.2 Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites………………………………. 234.2.1 Tipo de repetição e função dos SSR…………………………………………... 254.2.2 Posição do SSR no gene……………………………………………………..... 284.2.3 Amplificação de microssatélites via PCR…………………………………….. 305 CONCLUSÕES........................................................................................................ 386 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 39

ÍNDICE DE TABELASTabela 1. Genealogia da população segregante para resistência ao bichomineirooriunda do programa de melhoramento desenvolvido peloInstituto Agronômico de Campinas………………..……................15Tabela 2.Escala de pontos para a classificação de cafeeiros quanto ao tipo de lesão desenvolvida a partirda infestação pelo bicho-mineiro......17Tabela 3.Tabela 4.Tabela 5.Tabela 6.Nível de resistência ao bicho-mineiro dos 136 indivíduos daprogênie H14954-46 C1351 EP 473................................................. 21Buscas em ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas) do Banco deDados do Genoma Café…………......………………………............. 24Associação das seqüências de vinte e nove microssatélites quanto à suafunção e posição no gene, obtida a partir das anotações do banco dedados do Genoma Café........……………………………………......... 27Caracterização dos locos SSR quanto à quantidade de alelos/loco equanto à variação no tamanho dos alelos……….............................. 35

ÍNDICE DE FIGURASFigura 1.Tipos de lesões desenvolvidas por Leucoptera coffeella em folhas comdiferentes níveis de resistência avaliados numa mediante escala de 1 a4 pontos.........................................................................22Figura 2. Padrão de amplificação dos oligos SSR em bulks de DNA (A1 e A2 -SSR 6; B1 e B2- SSR 15; C1 e C2- SSR 9). PM- Peso Molecular de 250pb; 1 a 11- bulks de plantas resistentes ao bicho-mineiro; 12 a 21- bulksde plantas suscetíveis ao bicho-mineiro....................................................... 31Figura 3.Figura 4.Figura 5.Figura 6.Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 4, com doisalelos, em bulks de plantas resistentes (1 a 11) e plantas suscetíveis (12 a21) ao bicho-mineiro.................................................................................... 32Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 15, comdois alelos, em bulks de plantas resistentes (1 a 11) e plantas suscetíveis(12 a 21) ao bicho-mineiro........................................................................... 32Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, comquatro alelos, em bulks de plantas resistentes (1 a 11) e de plantassuscetíveis (12 a 21) ao bicho-mineiro.................................................... 33Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, emgenótipos do bulk suscetível (P1-C1195-5-6-2; P2-H13685-1; P3-H14954-46; P4-IAC 81) – parentais; 90, 92, 94, 95, 97 - genótiposindividuais do bulk18)................................................................................................ 33

PINTO, Fernanda de Oliveira. Analysis of EST-SSR markers in coffee progeniessegregating to leaf-miner resistance. 2006. Dissertação (Mestrado em MelhoramentoGenético Vegetal) – Pós-Graduação-IAC.ABSTRACTThe development of new coffee cultivars has been limited by the difficulty in early ofselection desirable agronomic traits, since those characteristics exhibit complex geneticinheritance and significant environmental influence. Currently, molecular markers havebeen used as an alternative and efficient selection tool by breeding programs of severalplant species. In coffee, some RAPD and AFLP markers were already identified and cosegregatewith agronomic characteristics such as pathogen resistance. The main purpose ofthis work was to identify expressed microsatellite (SSR) markers associated with resistanceto leaf-miner in coffee progenies These markers will be useful during selection forresistance to this insect by coffee breeding programs. The identification of potential SSRmarkers has been accomplished by directed search on the Brazilian Coffee ESTs Database.EST- SSR were preferentially selected from genes expressed in leaves and stressed tissues.Sequence analysis of 32 selected SSR loci showed that complex repeats (65%) are morefrequent than tri- (21%) and di- (14%) nucleotide repeats. Also, expressed SSR arelocalized frequently in the 5’- UTR of the gene transcript. Moreover, most of the genescontaining evaluated SSR are associated with defense mechanisms. Polimorphisms wereanalyzed in advanced progenies segregating for resistance to the leaf-miner. Genomic DNAextracted from 136 plants, all corresponding to advanced generations of a Coffea arabica XCoffea racemosa hybrid, were used for EST-SSR amplifications. Frequency of SSR alleleswas 2.1/locus, and only one locus SSR showed polymorphism, but did not cosegregat withthe resistance to leaf-miner. These results suggest that marker assisted-selection in coffeebreeding should be performed on initial crosses and selection, where the genetic variabilityis still significant.Key words: coffee, molecular markers, assisted-selection.

1 INTRODUÇÃOO Brasil é o principal produtor e exportador do café com o equivalente a 30% do totalglobal e com uma produção nacional representando cerca de 25% do volume internacional.Apresenta um parque cafeeiro com 6,0 bilhões de pés, sendo 75% em produção. Uma áreade 2,0 milhões de hectares encontra-se em franca produção e 484 mil hectarescompreendem cafezais novos, ou em formação (EMBRAPA, 2001).Apesar da acentuada redução da área cultivada nas últimas décadas e de diversosfatores abióticos como seca e geada e, de fatores bióticos como pragas e doenças(GONÇALVES, 1998), têm determinado oscilações na sua produção total, o Brasil aindaocupa uma posição dominante no mercado mundial. A estimativa oficial de produção nasafra de 2005/2006 é de 39,272 milhões de sacas, contando com 2.222 milhões de hectaresplantados (Anuário Estatístico do Café, 2005/2006 - Companhia Nacional deAbastecimento - CONAB).Conhecem-se mais de cem espécies do gênero Coffea originárias da África e sul da Ásia(CHEVALIER, 1947) apesar de somente as espécies Coffea arabica e C. canephora teremimportância econômica ativa no mercado mundial. Por outro lado, as espécies nãocultivadas do gênero Coffea apresentam uma grande importância do ponto de vistaadaptativo, sendo fontes de variabilidade genética. Tais espécies possuem característicasaltamente vantajosas tais como resistência a doenças e pragas, tolerância à seca e outrasalterações ambientais (FAZUOLI et al., 1999). Um exemplo da utilização destes recursosgenéticos é a variedade IAC2258 (Apoatã) de C. canephora desenvolvida pelo InstitutoAgronômico de Campinas (IAC), utilizada como porta enxerto de C. arabica devido àresistência a nematóides (FAHL et al., 1998).

Quênia (CHEVALIER, 1947; CHARRIER, 1978; BRIDSON, 1982). A diversidade genéticade cultivares de Coffea arabica L. é relativamente pequena e a sua ampliação torna-seimportante para o futuro do melhoramento do cafeeiro. Esta estreita diversidade deve-se ao fatode serem plantas autógamas com centro de origem limitado e de terem sido utilizadas pequenasquantidades de sementes durante o processo de dispersão do café, foram introduzidos poucosacessos (CARVALHO et al., 1993), além de serem bastante aparentadas e em grande maioria,derivam-se das cultivares Típica, originalmente introduzida no Brasil em 1727 e BourbonVermelho, oriunda da ilha de mesmo nome (ANTHONY et al., 2001). Trata-se de umaespécie nobre e que produz café de boa qualidade. Existem muitas variedades de C. arabica emais de 40 mutantes já descritos (CARVALHO et al., 1991). As características desses mutantessão variáveis como, por exemplo, crescimento e forma da planta, tipo de ramificação, forma ecoloração das folhas, tamnho das sementes, resistência a moléstias, pragas e nematóides, dentreoutras.Estudos baseados na análise da seqüência de DNA suportam que C. arabica é resultado daassociação de duas espécies diplóides de Coffea. Em trabalho conduzido por LASHERMES etal. (1999), foram identificados dois grupos de cromossomos ou genomas combinados. Aorganização do genoma de C. arabica foi confirmada utilizando metodologia de hibridação(GISH). Foi utilizado como sonda DNA genômico de duas prováveis espécies doadoras eos resultados sugeriram que C. arabica é um anfidiplóide formado pela hibridação entre C.eugeniodes e C. canephora ou ecotipos relacionados a estas espécies diplóides. Além destesresultados os autores indicaram a baixa divergência existente entre os dois genomasconstituintes de C arabica e sugeriram que o processo de especiação ocorreu recentemente,com origem na África Central.A outra espécie de interesse comercial, C. canephora, possui distribuição geográfica amplaocorrendo nas regiões ocidental, central tropical e subtropical do continente africano(CHARRIER & BERTHAUD, 1985). A variabilidade existente dentro dessa espécie é muitogrande, e pode ser verificada em relação ao tamanho e forma das plantas, folhas, frutos esementes.

As demais espécies de Coffea não são cultivadas economicamente, mas ocorrem de formasilvestre e possuem variabilidade elevada para algumas características tais como resistência apragas e doenças.Por se tratar de uma cultura perene e de período juvenil longo, o melhoramento genético docafeeiro é lento, sendo necessária a implementação de técnicas que facilitem e acelerem aobtenção, avaliação e seleção de materiais superiores. Análises genéticas em espécies de Coffeajá vêm sendo feitas para aproveitamento de características importantes para o melhoramento,tais como tamanho e forma da planta, fruto e sementes, além da resistência a doenças, pragas enematóides (FAZUOLI, 1999).2.2 Melhoramento do CafeeiroA crescente demanda mundial por alimentos de melhor qualidade, principalmente livresde resíduos de defensivos agrícolas, tem promovido um avanço significativo em diversasáreas da produção vegetal.Recentemente, métodos avançados de melhoramento genético vegetal têm se destacadoprincipalmente devido à possibilidade de obtenção de resultados uniformes e direcionadospara características desejáveis. Dentre as técnicas de biotecnologia moderna que poderiamauxiliar o programa de melhoramento do cafeeiro destacam-se a cultura de tecidos, atransformação genética e os marcadores moleculares.O Programa de Melhoramento do Cafeeiro do IAC além de visar o desenvolvimento decultivares produtivas, com resistência a ferrugem e nematóides, foca também a obtenção devariedades de café tolerantes a insetos. Algumas espécies tais como C. canephora, C.racemosa e C. congensis vêm sendo utilizadas como fontes importantes de variabilidadegenética neste programa (FAZUOLI et al., 1984; BERTRAND et al., 2000).Para o desenvolvimento de cultivares resistentes ao bicho-mineiro, C. racemosa temsido utilizada como doadora de genes de resistência ao inseto devido à facilidade docruzamento com C. arabica (CARVALHO & MONACO, 1968).Embora a seleção de plantas melhoradas esteja em nível avançado, e já tenha sidopossível relacionar a resistência ao inseto a dois genes complementares e dominantes

(GUERREIRO-FILHO et al., 1999), pouco se sabe ainda sobre a natureza e sobre osmarcadores associados a esta resistência.2.2.1 Biologia do bicho-mineiroO inseto bicho-mineiro Leucoptera coffeella (GUÉRIN-MÉNEVILLE, 1842), é ummicro-lepdóptero de hábito crepuscular noturno. As mariposas medem 6,5 mm deenvergadura, têm coloração branca pardacenta e as asas anteriores e posteriores franjadas.As lagartas vivem dentro de lesões ou minas foliares por elas mesmas construídas. Quandocompletamente desenvolvidas, medem cerca de 3,5 mm de comprimento. Este inseto éconsiderado de metamorfose completa, passando pelas fases de ovo, lagarta, crisálida eadulta (SOUZA et al., 1998). A postura dos ovos sempre é feita na face superior das folhase, após a eclosão, as lagartas penetram na folha através da epiderme pelo mesofilo foliardirigindo-se ao parênquima paliçádico, iniciando a alimentação e levando ao dano.As lesões causadas pelo bicho-mineiro entre as epidermes, também denominadasgalerias ou minas, têm bordas irregulares, são de coloração amarelo-pálido eposteriormente tornam-se pardacentas (KORONNOVA & DE LA VEJA, 1985). Nomesofilo, as minas provocadas pelo inseto estão exclusivamente no parênquima paliçádico(CARDENAS, 1981).2.2.2 Seleção de cafeeiros resistentes ao bicho-mineiroUm gradiente de infestação pode ser observado entre as folhas jovens até as maisvelhas durante a infestação natural de variedades de café suscetíveis ao bicho-mineiro(NANTES & PARRA, 1977), com lesões pequenas e irregulares sendo observadas com

maior freqüência em folhas jovens (CARDENAS-MURILLO & POSADA-OCHOA,1984).No gênero Coffea são identificados diferentes níveis de resistência ao bicho-mineiroentre as espécies. GUERREIRO-FILHO et al. (1991) sugeriram o agrupamento dasespécies em altamente resistentes (C. stenophylla, C. brevipes, C. salvatrix e C. liberica),moderadamente resistentes (C. racemosa, C. kapakata, C.devrevei e C. eugenioides),suscetíveis (C. congensis e C. canephora) e altamente suscetíveis (C. arabica). Outrasespécies provenientes da África Continental como C. humilis, Coffea sp. Moloundou, C.jasminoides, ou da Ilha de Madagascar, como, C. perrieri e C. resinosa, tambémapresentaram níveis elevados de resistência ao inseto (GUERREIRO-FILHO, 1994). Aespécie C. racemosa vem sendo utilizada como doadora de genes de resistência ao insetopara a espécie C. arabica (CARVALHO & MONACO, 1968).A seleção de indivíduos resistentes é realizada em uma primeira etapa no viveirodescartando-se plantas suscetíveis de cada progênie obtidas por cruzamentos dirigidos ouautofecundações. Plantas não atacadas são avaliadas individualmente em laboratórioutilizando-se metodologia descrita por GUERREIRO-FILHO (1994). A avaliação daresistência é feita pelo tipo de reação observada nas folhas.O desenvolvimento de cultivares de C. arabica resistentes teve início a partir decruzamentos entre os cafeeiros C1195-5-6-1 e C1195-5-6-2 com plantas selecionadas dascultivares Icatu Vermelho, Catimor e Híbrido de Timor, resistentes ao fungo Hemileiavastatrix, causador da ferrugem do cafeeiro.A combinação híbrida H11421 (RC 3 –C1195-5-6-2 x H4782-7-882 Icatu Vermelho)destacou-se pela produtividade média e pelo maior nível de resistência das plantas aobicho-mineiro (GUERREIRO-FILHO et al., 1991). Uma das melhores plantas da progênie,H11421-11 foi utilizada em retrocruzamentos com a cultivar Catuaí Vermelho IAC 81,dando origem à progênie H13685 (RC 4 ). Plantas selecionadas na geração anterior foramretrocruzadas com a cultivar Catuaí Amarelo IAC 62. Um desses cruzamentos, realizadoscom o indivíduo H13685-1 deu origem à progênie H14954 (RC 5 ), que se encontra plantadano ensaio de progênies EP473, no Centro Experimental Central do IAC, em Campinas, SP.

A progênie da planta H14954-46 foi selecionada para o estudo de associação da resistênciacom microssatélites expressos.Finalmente, plantas selecionadas deste último retrocruzamento foram utilizadas comoparentais masculinos em cruzamentos com a cultivar Catuaí Vermelho IAC 144 (H 20033;RC 6 ).A metodologia de seleção adotada consiste em uma associação entre os métodos deretrocruzamentos e genealógico, sendo a cultivar Catuaí utilizada nos retrocruzamentoscom o intuito de se obter plantas produtivas, resistentes ao inseto e de porte baixo (MALUF& GUERREIRO-FILHO, 2005).Por se tratar de uma espécie perene, de ciclo longo, uma primeira seleção de plantasresistentes é realizada ainda na fase de mudas. Plantas jovens suscetíveis são descartadasprecocemente em viveiro a partir da análise da infestação natural por L. coffeella. As mudasresistentes ou não atacadas no viveiro são avaliadas posteriormente em testes de laboratóriomediante utilização do método de discos de folhas (GUERREIRO-FILHO et al., 1992).Apenas plantas consideradas resistentes são plantadas em ensaios de progênies paraavaliação de suas características agronômicas de interesse. Supõe-se que a utilização demarcadores moleculares possa potencializar a redução dos custos financeiros e o aumentoda eficiência do programa de seleção de plantas resistentes ao inseto.2.3 Mecanismos de Defesa da PlantaO sistema de defesa das plantas contra insetos pode atuar de duas formas. A primeira, aresistência estática ou constitutiva, ocorre mesmo sem a ação de agentes agressores e édefinida como o efeito combinado de todas as barreiras constitutivas presentes na plantaantes do ataque. Esta resistência é recebida por herança dos ancestrais e torna as plantasimunes (ou não-hospedeiras) à maioria dos patógenos. A segunda é a resistência ativa ouinduzida, que é desenvolvida via mecanismos de proteção ativados durante o contato com opatógeno (GATEHOUSE, 2002).Os mecanismos de resistência são ativados perto da área infectada para tentar prevenir adifusão do patógeno ou deter a contínua predação por insetos. A velocidade com que aplanta reconhece a presença do agressor determina o tempo de resposta à invasão,desencadeando uma ou mais reações de defesa. Se a resposta é mais rápida do que o

processo de infecção, a planta pode conter o agente (resistência). A interação entre umpatógeno e um vegetal é dita ‘compatível’ quando leva à doença, mas se a planta resiste àagressão a interação é dita incompatível (MARGIS-PINHEIRO, 1993).Os processos biossintéticos envolvidos nos mecanismos de defesa estática e ativa sãopraticamente os mesmos, envolvendo os mesmos genes, porém, diferem entre si apenas naexpressão dos mesmos. Na resistência estática, a expressão gênica é o resultado doprocesso normal de desenvolvimento da planta, enquanto que na resistência ativa, aexpressão é regulada por um sinal ativado durante estímulo externo (GATEHOUSE, 2002).A resistência ativa pode ser reconhecida pela chamada reação de hipersensibilidade ouHR, com a morte de células situadas nos locais por onde o agressor penetra. Com isso, aplanta impede o acesso do patógeno a células vizinhas, limitando a infecção. Os aspectosfisiológicos da hipersensibilidade incluem o aumento rápido e transitório de agentesoxidantes, a perda de íons potássio (K+) e ganho de íons hidrogênio (H+) pelas células, adestruição de compartimentos e o espessamento das paredes celulares e da cutícula, além dasíntese de toxinas e proteínas relacionadas à defesa. Além destes compostos, a resistênciaativa pode trazer proteção a planta contra um grupo de patógenos (MARGIS-PINHEIRO,1993).O metabolismo secundário das plantas é o responsável pela produção de compostosorgânicos que não apresentam função direta no crescimento e desenvolvimento da planta eque estão presentes no mecanismo de defesa (BENNETT & WALLSGROVE, 1994).Os compostos fenólicos produzidos pelo metabolismo secundário (APPEL, 1993)foram identificados como integrantes de mecanismos de defesa das plantas contra diversospatógenos (KOSUGE, 1969) e parecem influenciar os processos fisiológicos das plantascomo síntese de moléculas sinalizadoras, proteção contra estresse ambiental e constituiçãoda parede celular (BI et al., 1997). São exemplos de compostos fenólicos, o ácidoclorogênico, antocianinas, fitoalexinas, taninos e ligninas entre outros.As interações entre fenólicos oxidados e proteínas da dieta são deletérias para os insetos(FELTON et al., 1989a), pois alteram a disponibilidade de aminoácidos e são irreversíveis.Em trabalho desenvolvido com folhas de morangueiros, LUCZYNSKI et al. (1990)descreveram o desenvolvimento retardado do ácaro Tatranychus urticae. Em cultivares

contendo altas concentrações de compostos fenólicos o crescimento deste ácaro foisuprimido, supostamente pela inativação de suas enzimas digestivas.Outro exemplo de compostos que oxidam fenóis são as enzimas conhecidas comopolifenoloxidases (PPO) e peroxidases (PO) (MAYER, 1987). Nas plantas, ainda não sesabe ao certo sobre o papel fisiológico das PPOs, embora a função mais provável seja oenvolvimento com em mecanismos de defesa contra patógenos e predadores(CONSTABEL et al., 2000). Vários autores têm relatado a indução de atividade de PPOcomo resposta a fatores bióticos e abióticos, incluindo danos causados por herbívoros,infecções por bactérias e fungos, ferimentos aplicação de regurgitantes de insetos eexposição ao composto sinalizador da via metabólica do jasmonato (CONSTABEL &RYAN, 1998; KRUZMANE et al., 2002).A PO, presente nos tecidos das plantas, catalisa a conversão de peróxidos de hidrogênio(H 2 O 2 ) em água utilizando fenóis como doadores de hidrogênio. Alterações na suaatividade durante o desenvolvimento das doenças nas plantas tem sido correlacionadas coma expressão de resistência em diferentes sistemas patógeno-hospedeiro (OLIVEIRA et al.,1997). A atividade da peroxidase pode aumentar em plantas submetidas a diversos tipos deestresse (SIEGEL, 1993) e suas funções fisiológicas nas plantas estão relacionadas aoespessamento da parede celular e cicatrização de ferimentos, incluindo lignificação esuberização (GOLDBERG et al., 1985; ESPELIE et al., 1986).Em cafeeiros, poucas informações sobre ação da peroxidase foram publicadas até omomento. SALGADO (2004) mostrou que o teor de fenóis totais não varia entre folhas decafeeiros com e sem produção de frutos. Porém, as concentrações de fenóis totais em folhasjovens foram superiores àquelas observadas em folhas adultas com produção de frutos(25%) ou sem produção de frutos (46%). O autor sugere que os compostos secundáriosestariam sendo desviados para as folhas mais novas, ainda pouco lignificadas, para suamaior proteção contra a herbivoria.A importância da oxidação fenólica na resistência de cafeeiros ao ataque de L. coffeella,nas espécies parentais C. arabica e C. racemosa, e em híbridos provenientes destecruzamento foi analisada por RAMIRO (2003). Os autores verificaram que os fenóis nãoexercem papel central na expressão da resistência ao bicho-mineiro. Foram detectadasdiferenças entre as espécies parentais quanto à concentração total de fenóis solúveis e à

atividade das enzimas oxidativas PO e PPO. Entretanto, as plantas híbridas resistentes esuscetíveis não diferiram entre si em nenhuma das características analisadas. Somente nasplantas da espécie C. racemosa, parental doador dos genes de resistência ao inseto, foidetectada indução significativa da produção do ácido clorogênico e de PPO. Os resultadosindicam que a indução de atividade fenólica das enzimas PO e PPO em resposta ao ataquede insetos pode não ser evidência concreta da participação destas em um mecanismo dedefesa direto.2.4 Marcadores MicrossatélitesA utilização da biologia molecular como ferramenta nos programas de melhoramentogenético tem propiciado extrema agilidade. Atualmente uma gama de marcadoresmoleculares tem sido identificada, através de técnicas que permitem uma amplacaracterização do polimorfismo genético existente em plantas. Esses marcadoresrepresentam uma ferramenta importante em programas de melhoramento assistido. Umexemplo da utilização destes marcadores foi demonstrado por PONCET et al. (2004), quevisou avaliar a distribuição geográfica de espécies de Coffea. Foram utilizados 110 oligosmicrossatélites para analisar a diversidade genética de 6 espécies e as espécies C.canephorae C. pseudozanguebariae compartilharam, porém, não houve nenhuma correlação entreestas duas espécies.Marcadores de DNA têm sido utilizados para análise de divergência genética(CATTANEO, 2001); identificação de cultivares (BAUM et al., 2000), mapeamentogenético (RAFALSKI, 2002; BRESSAN-SMITH, 1998), filogenia (GEHRIG et al., 1997);melhoramento genético visando resistência a doenças (SANTOS, 2000), sexagem(URASAKI et al., 2002). Todos estes estudos buscam identificar variações em seqüênciasgenômicas que possam estar relacionadas com um fenótipo específico. Assim, a análise davariação das seqüências é de maior importância nos estudos genéticos e os marcadoresmoleculares são uma ferramenta útil para determinar e analisar essas variações. Atualmenteuma gama de marcadores como RFLP, RAPD, AFLP e Microssatélites (SSR) têm sidoutilizados para diferentes espécies (PHILIPS et al., 2001 e VARSHNEY et al., 2004).Os Microssatélites ou SSR (Sequência Simples Repetida) têm sido muito utilizados emprogramas de melhoramento. Estes marcadores são compostos de seqüências simples

epetidas de 2 a 5 nucleotídeos “in tandem” na seqüência de DNA, tais como (CA) n(AGAT) n (ATT) n . O polimorfismo nestes locos é resultado de variações do número derepetições das seqüências de nucleotídeos (AKKAYA et al., 1992). A repetição pode serperfeita ou interrompida por muitos nucleotídeos não repetidos sendo chamada derepetições compostas (SAGHAI-MAROOF et al., 1994).Os marcadores SSR são úteis para uma variedade de aplicações em genética de plantase melhoramento pela sua reprodutibilidade, natureza multialélica, alto grau depolimorfismo, herança co-dominante, relativa abundância e boa cobertura do genoma(POWELL et al., 1996). Os marcadores SSR têm sido úteis para integração de mapasgenéticos e mapas físicos e tem provido os melhoristas e geneticistas com uma ferramentaeficiente para associar variação genética e fenotípica (GUPTA & VARSHNEY, 2000).As seqüências das regiões que flanqueiam os SSRs são conservadas em indivíduos damesma espécie. Dessa maneira, os SSRs são amplamente distribuídos em todo genoma deeucariotos e podem ser amplificados por oligos específicos sintetizados a partir destasregiões flanqueadoras (PONCET et al., 2004).A variação encontrada nos microssatélites pode ser devida tanto ao “escorregamento”da DNA polimerase durante a replicação ou devido a recombinação desigual, durante ameiose, resultando em diferenças no número de cópias das sequências de nucleotídeos. OsSSRs polimórficos aumentam a possibilidade de detecção de diferenças alélicas entreespécies próximas, dentro de uma espécie, ou até mesmo entre indivíduos numa população(YU et al., 1999). O polimorfismo é detectado após a amplificação do DNA via PCR eseparação dos produtos por eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose (WU &TANKSLEY, 1993).Vários trabalhos utilizando SSR foram desenvolvidos com sucesso para avaliar adiversidade genética entre genótipos. Em trabalho desenvolvido por AKKAYA et al.(1992) demonstraram que SSRs estavam presentes em genótipos de soja e altos níveis depolimorfismo foram detectados entre os grupos. Foi observada uma média de 7 alelos emcada 3 locos SSRs, permitindo assim a identificação de 43 genótipos de soja.Outro trabalho que demonstrou a capacidade dos marcadores SSR foi desenvolvido porKIJAS et al. (1995), mostrando que há grande variação de tamanho nos locos SSR emespécies de citros. Neste trabalho foram avaliados acessos provenientes de um cruzamento

intergenérico entre limão cravo (Citrus limonia Osbeck) e Poncirus trifoliata. Foramanalisados dois locos SSR quanto à variação e herança alélica, a partir da amplificação ehibridização com a sonda TAA. Demonstrou-se com este estudo que todas as plantas daprogênie avaliada apresentaram o SSR (TAA) indicando assim que a região flanqueadora éconservada nos diferentes genomas testados.Em trabalho semelhante, SAHA et al. (2002) avaliaram a presença de SSR em cDNAde 11 acessos de algodão e 4 gêneros próximos. Trinta e um pares de oligos SSR, dos 120testados, amplificaram fragmentos de cDNA. A análise das sequências mostrou que 25%dos 24 clones de cDNA selecionados aleatoriamente amplificaram regiões contendorepetições e mostraram que os SSR contendo cDNA foram conservados em duas diferentesespécies de algodão (Gossypium barbadense e G. hirsutum). Este estudo revelou aimportância dos marcadores SSR para o mapeamento comparativo de genes transcritos.2.5 Importância da Busca de Microssatélites em Bancos de ESTAs pesquisas em biotecnologia estão trazendo grande impacto para a agricultura e aindústria alimentícia em todo o mundo. Um dos requisitos primordiais para o uso das novasferramentas biotecnológicas é a identificação de genes. Os métodos para se analisar aestrutura e função de genes, em larga escala, denominados coletivamente de tecnologiagenômica, têm proporcionado uma enorme produção de informações e a geração de bancosde dados de seqüências de DNA, que possibilitam a identificação dos fatores genéticosdeterminantes e ou associados com características de interesse agronômico.O Projeto Genoma Café que resultou na construção de um banco de dados com mais de200 mil seqüências de DNA, permitiu a identificação de mais de 30 mil genes, responsáveispelos diversos mecanismos fisiológicos de crescimento e desenvolvimento do cafeeiro(EMBRAPA, 2004).O seqüenciamento do genoma total de organismos superiores, como o cafeeiro, é umatarefa árdua e de custo elevado, devido à sua complexidade e tamanho. Por isso, váriosprojetos de seqüenciamento de plantas vêm optando pelo seqüenciamento de Etiquetas deSeqüências Expressas ou EST, onde apenas os genes expressos pelo organismo são

seqüenciados. Genes expressos são aqueles que se encontram ativos no momento e nascondições da análise. O banco de dados obtido pelos pesquisadores brasileiros é o resultadodo seqüenciamento de várias bibliotecas de cDNA, ou seja, seqüências de DNAcorrespondentes aos genes expressos nos vários tecidos da planta (folhas, raízes, frutos,flores e ramos - sadios e submetidos a estresses bióticos e abióticos como pragas, doenças,frio, calor, seca) em diversos estágios de desenvolvimento.O método padrão para desenvolvimento de marcadores SSR envolve a criaçãode uma pequena biblioteca genômica, com subseqüente hibridização comoligonucleotídeos repetidos “in tandem”, seleção de clones contendo repetições eo seqüênciamento de clones candidatos. Este processo, apesar de ser muitolaborioso e de consumir muito tempo e recursos (THIEL et al., 2002), tem sidomuito utilizado em diferentes espécies para o desenvolvimento de SSR (LUI etal., 1996; STRUSS & PLIESKE, 1998).Uma estratégia alternativa para a identificação de locos SSR utiliza a informaçãodisponível em Bancos de Seqüências de DNA. Os SSRs podem ser identificados nestesbancos de dados, através de algoritmos específicos, encurtando tempo e custos requeridospara seu desenvolvimento. Atualmente com o aumento da disponibilidade de seqüências degenes expressos de diversas espécies vegetais, resultado de projetos de seqüênciamento emlarga escala, a busca por SSR “in silico” é uma estratégia muito atraente. Segundo RUDD(2003), através do uso de aplicativos computacionais, seqüências correspondentes tanto aEST (Etiquetas de Sequências Expressas), quanto a clones de cDNA, podem seridentificadas e copiadas dos Bancos de Dados para análise e caracterização de SSRs. Aestratégia básica de obtenção de EST constitui um método rápido e eficiente deamostragem do genoma para seqüências ativas de genes. O EST representa uma seqüênciatotal ou parcial de um gene que foi expresso em um tecido, em um momento determinado(STERKY & LUNDEBERG, 2000).Estes são chamados de EST-SSRs ou microssatélites de sequências expressas. Odesenvolvimento destes marcadores é relativamente fácil e barato por serem bioprodutosdas sequências de genes ou ESTs disponíveis publicamente nos bancos de dados. Nestecontexto, a utilização de SSR baseados em genes expressos tem sido relatada para muitasespécies incluindo uvas (SCOTT et al., 2000), cana-de-açúcar (CORDEIRO et al., 2001),trigo duro (EUJAYL et al., 2001) e centeio (HACKAUF & WEHLING, 2002).

Atualmente, vários estudos já utilizam a estratégia de busca de SSR em Bancos deESTs, como descrito por CATO et al. (2001). Os autores descrevem algumas vantagens dautilização destas seqüências expressas com marcadores genéticos. Primeiro, se ummarcador EST estiver geneticamente associado a uma característica de interesse, é provávelque o mesmo afete diretamente a característica. Segundo, os ESTs que apresentamhomologia com genes candidatos podem ser utilizados de forma específica paramapeamento genético.Embora o polimorfismo dos SSRs seja uma limitação para muitas espécies, osmarcadores SSR ainda são ferramentas valiosas para a genética e melhoramento de plantas.Transcritos de genes também contendo motivos repetidos e a abundância de ESTs faz desteuma fonte potencial atrativa de marcadores microssatélites. A comparação decomprimentos de repetição de SSR em clones de bibliotecas enriquecidas versus SSRderivados de banco de dados, mostrou que repetições encontradas em bibliotecasenriquecidas foram significantemente maiores do que aqueles encontrados em SSRderivados de banco de dados (RAMSAY et al., 2000). Além disso, a presença de SSR emtranscritos de genes conhecidos sugere que eles podem ter importante papel na expressão efunção gênica (KANTETY et al., 2001).Estudos mostram que os SSRs têm sido encontrados na região 5’- UTR (Região nãotraduzida) de genes de plantas e animais. Em alguns organismos, estes polimorfismos estãotambém correlacionados com padrões de expressão gênica como foi avaliado em ervilha(STAFSTRAM & INGRAM, 2004). Neste estudo foram avaliados 15 acessos do gêneroPisum e de gêneros próximos (Cicer, Lathyrus, Lens, e Vicia) com relação à seqüência docDNA PsSat5 que continha o SSR. Os resultados demonstraram que todas as seqüênciasanalisadas com a repetição TCA foram similares, com exceção do número de repetições(expansões e contrações no número de repetições). Porém não houve uma correlação claraentre o número de repetições TCA na região 5’- UTR e o nível de expressão do genePsSat5.3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Local de ExperimentaçãoAs atividades experimentais foram desenvolvidas no Centro de Café "AlcidesCarvalho" do Instituto Agronômico - IAC, Campinas, São Paulo.3.2 Material VegetalA genealogia do material em estudo é apresentada na tabela 1. Trata-se de populaçãoobtida a partir de um cruzamento interespecífico inicial entre a espécie Coffea arabica (2n= 4x = 44 cromossomos), que é suscetível ao bicho-mineiro e C. racemosa (2n = 2x = 22cromossomos), que é resistente à praga.

Tabela 1. Genealogia da população segregante para resistência ao bicho-mineiro oriunda doprograma de melhoramento desenvolvido pelo Instituto Agronômico de Campinas.GeraçãoParentalF 1RC 1RC 2RC 3RC 4RC 5F 2 RC 5GenealogiaC. racemosa C1195 (resistente) X C. arabica Blue Montain (suscetível)C1195-5 (resistente)C1195-5-6 (resistente) (C. arabica X C1195-5)∗C1195-5-6-2 (resistente) (C. arabica X C1195-5-6)H11421 (H4782-7-882 Icatu vermelho X C1195-5-6-2)∗H13685 (IAC81 Catuaí vermelho X H11421-11)H14954 (IAC62 Catuaí amarelo X H13685-1)∗H14954-46 (polinização livre) C1351∗ Material vegetal avaliado neste estudoOs genótipos utilizados no experimento constituem uma progênie de 136 plantasobtidas por polinização livre do acesso - H14954-46 C1351 EP473 - classificado em ensaiode campo como resistente ao bicho-mineiro e localizados no viveiro do Centro de Café doIAC (Figura 1). Este acesso pertence à geração F 2 RC 5 do programa de melhoramentovisando resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro desenvolvido pelo Instituto Agronômico.Foram analisados, além da progênie, quatro genótipos como parentais: C1195-5-6-2 (C.arabica X C1195-5-6); H13685-1 C1841 EP 369 (IAC 81 Catuaí vermelho X H12114-1);H14954-46 C 1351-EP 473; IAC 81 (Catuaí vermelho). Os parentais do cruzamentointerespecífico original não puderam ser utilizados neste trabalho devido à eliminaçãodestas plantas, após quarentena realizada em 1954.3.3 Avaliação da Resistência3.3.1 Técnica de criação de insetos e condições ambientaisUma população de L. coffeella foi mantida em laboratório segundo a metodologiadescrita por KATIYAR & FERRER (1968) e adaptada por PARRA (1985).

Foram utilizadas gaiolas de 60 x 60 x 60 cm constituídas por estrutura e fundo demadeira, sendo as paredes laterais e superiores, revestidas por tecido branco de algodão. Ospés de sustentação foram pintados com uma mistura de cal e inseticida, para impedir oataque de formigas.As gaiolas foram mantidas sob temperatura de 27 o C ± 3 o C, umidade relativa de 70% ±10% e fotofase de 14 horas, condições que permitem a obtenção de insetos em maiornúmero e ciclos mais curtos (PARRA, 1985). Os adultos foram alimentados com soluçãode sacarose a 10% (NANTES & PARRA, 1977), fornecida aos insetos em papel de filtro,depositado na parede superior das gaiolas e renovado periodicamente para evitar afermentação da solução açucarada e o desenvolvimento dos fungos.Mudas de cafeeiros da cultivar Obatã IAC1669-20 foram utilizadas para a multiplicaçãodos insetos, sendo o número de mudas nas gaiolas determinado em função do seu estágio dedesenvolvimento e da densidade populacional do inseto. Como as posturas são realizadasnas folhas preferencialmente à noite, as mudas foram substituídas diariamente por novasmudas isentas de infestação. Uma vez infestadas, as plantas foram transferidas paraprateleiras mantidas no mesmo laboratório de criação.Entre quinze e vinte dias após a postura, folhas contendo grande número de crisálidas, eramdestacadas das mudas e introduzidas nas gaiolas para a emergência dos adultos, fechandoassim o ciclo biológico do inseto.3.3.2 Infestação das plantas e avaliação da resistênciaO nível de resistência dos 136 indivíduos da progênie H14954-46 C1351 EP473 foi avaliado em laboratório de acordo com ametodologia descrita por GUERREIRO-FILHO (1994), que consiste na utilização de um suporte de isopor medindo 2 x 10 x 30 cm,vasado por microtubos de 2,0 mL, distanciados 3 cm um do outro, onde o pecíolo das folhas destacadas das plantas avaliadas foimantido hidratado e inserido na gaiola de criação durante o período de exposição aos insetos. Após a oviposição, discos de folhasforam retirados dos locais onde as posturas foram realizadas, os ovos excedentes foram eliminados deixando-se dois ou três ovos pordiscos de folhas, mantidos em câmara úmida (caixas plásticas com espumas úmidas), até a avaliação do tipo de reação. A avaliaçãofoi realizada dez dias após a eclosão das lagartas, mediante escala de 1 a 4 pontos, que consiste na classificação das plantas quanto àresistência ao bicho-mineiro em função do tipo de lesão apresentada após infestação artificial em laboratório de acordo com a tabela2.Tabela 2. Escala de pontos para a classificação de cafeeiros quanto ao tipo de lesãodesenvolvida a partir da infestação pelo bicho-mineiro.

Pontos Classificação Descrição1 Resistente (R) Lesões pontuais2 Moderadamente Resistente (MR) Lesões filiformes pequenas3 Moderadamente Suscetível (MS) Lesões grandes irregulares4 Suscetível (S) Lesões grandes arredondadas3.4 Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites3.4.1 Busca de microssatélites em banco de dados ESTs de caféO Banco de seqüências ESTs oriundos do Projeto Genoma Café foi submetido a buscaspara identificação de seqüências do tipo SSR potencialmente relacionados com a resistênciaao bicho-mineiro.Para estas buscas foram utilizadas ferramentas como o algoritmo BLAST (ALTSCHULet al., 1990), através do programa “Tandem Repeats Finder” versão 3.01 (BENSON, 1999)desenvolvidas pela equipe de Bioinformática do Projeto Genoma Café. Estes aplicativospermitem a identificação de ESTs contendo SSR, e também a identificação do motivorepetido, número de repetições e número de cópias do SSR no genoma.As seqüências identificadas no banco serviram como base para a síntese de oligosespecíficos para amplificação dos locos SSR.3.4.2 Isolamento do DNA genômicoFolhas oriundas de plantas resistentes e suscetíveis foram coletadas e imediatamentecongeladas em nitrogênio líquido para isolamento do DNA genômico segundo método dePAILLARD et al. (1996).Neste protocolo, 1g de folha fresca foi lavada em etanol 70% e macerada em N 2 . O póobtido foi ressuspendido em 1,5 mL de Tampão de Extração (0,35 M de Sorbitol; 0,10 Mde Tris-HCl pH 8,0; 50 mM EDTA pH 8,0; 1,5% β-mercaptoetanol) e centrifugado a 1000

g, por 20 minutos à 4 o C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendidoem 1,5 mL de tampão de extração. A essa solução acrescentou-se 520 μL de tampão de lise(0,2 M Tris-HCl pH 8,0; 50 mM EDTA pH 8,0; 2 M NaCl, 2% (w/v) MATAB) e 110 μLde SDS 10 %. Após incubação da mistura a 65 o C por 30 minutos adicionou-se 1 mL dasolução de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1), misturando até que ficasse homogênea.Depois de centrifugação a 1000 g, por 15 minutos à 4 o C foi feita a transferência da faseaquosa superior para um novo tubo. O DNA foi precipitado adicionando-se 0,1 volume deacetato de sódio 3 M pH 5,2 e 1 volume de etanol absoluto gelado. A solução foicentrifugada a 10.000 g por 15 minutos e o sobrenadante descartado. Após a evaporação doetanol do precipitado, ressuspendeu-se o DNA em 1 mL de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA pH 8,0) com RNAse a 200 μg/mL. Após incubação por 30 minutos a 37 o C,adicionou-se 1 mL de solução fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) ecentrifugou-se a 8.000 g, por 10 minutos a 4 o C. A fase aquosa superior foi transferida paranovo tubo para outra precipitação do DNA (adicionando-se 0,1 volume de acetato de sódio3 M pH 5,2 e 1 volume de etanol absoluto gelado). A solução foi centrifugada a 10.000 gpor 15 minutos, o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspendido em 50 μL de TE,após a evaporação do etanol.O DNA foi quantificado em gel de agarose 1%, através de medidas da absorbânciaentre 260-280 nm em espectrofotômetro. A partir da visualização e definida a concentração,foram realizadas diluições para concentração final de 20 ng/μL. As amostras de DNA de102 plantas, entre resistentes e suscetíveis, foram agrupadas em 21 bulks, contendo emmédia cinco genótipos de cada planta, de acordo com metodologia descrita porMICHELMORE et al. (1991). Foram formados 11 bulks de plantas resistentes e 10 deplantas suscetíveis.3.4.3 Amplificação de microssatélites via PCR (reação da polimerase em cadeia)A obtenção de pares de oligos SSR foi feita mediante utilização do software Primer 3(ROZEN, 1998). Foram priorizados oligos com tamanho entre 18 a 20 pb e conteúdo CG %entre 50-60%.

As seqüências SSR foram amplificadas primeiramente nos genótipos parentais, C1195-5-6-2 (C. arabica X C1195-5-6); H13685-1 C1841 EP 369 (IAC 81 Catuaí vermelho XH12114-1); H14954-46 C 1351- EP 473; IAC 81 (Catuaí vermelho). Para otimização dascondições de reação e do padrão de amplificação de cada par de oligos, as seqüências SSRforam amplificadas primeiramente nos 21 bulks. Após amplificação dos SSRs nos bulks, oslocos SSR polimórficos foram avaliados em todos os genótipos.As reações de amplificação foram conduzidas em volume final de 25 μL, contendo 40ng de DNA genômico, tampão PCR 1X (100 mM Tris-HCl, pH 8,4 e 500 mM KCl), 0,1mM de cada dNTP, 2,0 mM de MgCl 2 , 0,2 μM de cada oligo (foward e reverse) e 0,5 UTaq DNA polimerase (Invitrogen). As amplificações foram realizadas nas seguintescondições: 94° C por 3 minutos; seguido de 30 ciclos de 94° C por 1 minuto; temperaturade anelamento específica para cada par de oligo por 1 minuto (55-57ºC), 72° C por 1minuto, e extensão final a 72°C por 2 minutos.3.4.4 Eletroforese dos fragmentosInicialmente, os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel deagarose 2%, por 3 horas a 90 volts. Foram então, corados com brometo de etídeo evisualizados sob luz ultravioleta.Em uma segunda etapa, os fragmentos amplificados foram separados em geldenaturante de poliacrilamida 6% e visualizados pela coloração com prata, segundo métodode CRESTE et al. (2001). A eletroforese foi realizada a 1.200 volts durante 1hora e 40minutos. A coloração do gel de acrilamida com prata foi realizada com o kit da Promega,Silver Sequence DNA Staining Reagents. A coloração seguiu três passos: fixação do gelcom uma solução de ácido acético glacial (Merk) 10% por 20 minutos; coloração do gel poruma solução de AgNO 3 acrescido de formaldeído 37 % (2g de AgNO 3 em 2 L de águamilli-Q mais 3 mL de formaldeído 37%) por 30 minutos; revelação do gel com umasolução de Na 2 CO 3 gelado (60 g de Na 2 CO 3 em 2 L de água milli-Q com 3 mL deformaldeído 37% e 400 μL de Na 2 O 3 S 2 10 mg/mL) por aproximadamente 10 minutos ouaté que as bandas pudessem ser visualizadas.

3.4.5 Análise dos resultadosA caracterização dos SSRs envolveu dois tipos de análises. A primeira visou umaavaliação da possível função desempenhada por estas seqüências. Para isto realizaram-seestudos “in silico” para identificar a posição do SSR no EST, tipo de repetição e identidadedo gene contendo o SSR. A segunda análise foi realizada a partir dos produtos amplificadose envolveu a caracterização dos alelos com relação ao tamanho, freqüência na populaçãoestudada e polimorfismos.O número médio de alelos por loco (A) foi obtido pela média aritmética do númerototal de alelos dividido pelo número total de locos.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO4.1 Avaliação da ResistênciaDas 136 plantas de cafeeiro da progênie H14954-46 C1351 EP473 avaliadas a partir dainfestação artificial do bicho-mineiro, 54 plantas receberam nota 1 sendo consideradasresistentes ao bicho-mineiro; 48 receberam nota 4 sendo suscetíveis ao bicho-mineiro; 4plantas receberam nota 2 sendo moderadamente resistentes e 30 receberam nota 3 sendomoderadamente suscetíveis (Tabela 3).Tabela 3. Nível de resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro avaliado em 136 indivíduos daprogênie H14954-46 C1351 EP 473, medida pela escala de pontos definida em função do tipo delesão desenvolvida a partir da infestação deste inseto.Tipo de reaçãoPontosTotalPlantaIdentificaçãoResistente 1 541, 2, 7, 10, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 24, 29, 31, 32, 33, 36,38, 39, 41, 44, 45, 49, 51, 57, 60, 62, 65, 66, 73, 74, 77, 78,80, 86, 88, 93, 96, 99, 100, 101, 102, 104, 106, 108, 117,122, 124, 125, 127, 132, 134, 139, 140ModeradamenteResistente2 4 9, 50, 59, 91ModeradamenteSuscetível3 306, 26, 30, 35, 37, 40, 47, 48, 61, 64, 67, 68, 69, 72, 79, 82,84, 98, 103, 105, 107, 109, 111, 115, 116, 118, 119, 129,130, 135Suscetível 4 483, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 21, 22, 23, 25, 27, 28, 34, 42, 43, 52,53, 54, 55, 56, 58, 63, 70, 71, 75, 76, 81, 83, 85, 89, 90, 92,94, 95, 97, 110, 113, 114, 120, 121, 123, 126, 128, 131,133, 137, 138As plantas que receberam nota 1 na escala de pontos, apresentaram lesões pontuais nasfolhas; as que receberam nota 2 apresentaram lesões filiformes; as que receberam nota 3apresentaram lesões grandes irregulares e as com nota 4 apresentaram lesões grandesarredondadas (Figura 1).

O tipo de lesão desenvolvida pelas plantas revelou que existe variação do nível deresistência das plantas avaliadas. Como os discos foliares avaliados apresentaram notas 1,2, 3 e 4, mostram que ainda há segregação para o caráter da resistência ao bicho-mineiro docafeeiro na progênie, pois, são de indivíduos provenientes de um cruzamentointerespecífico embora se trate de uma população avançada de retrocruzamento.As plantas resistentes foram homogêneas quanto à expressão da resistência ao bichomineiro,sendo que a maioria dos discos foliares apresentaram lesões pontuais (nota 1),nota mínima na escala adotada. O mesmo foi observado em relação às plantassuscetíveis que apresentaram o mesmo padrão de desenvolvimento das lesões.De acordo com teste de χ 2 , a proporção de plantas resistentes e suscetíveis ao bichomineirona F 2 RC 5 foi similar a segregação esperada de 9 resistentes: 7 suscetíveis. Esteresultado concorda com trabalho de GUERREIRO et al. (1999), que encontraram asmesmas proporções de plantas resistentes e suscetíveis ao bicho-mineiro em F 2 do RC 4 .A fenotipagem precisa dos indivíduos é de fundamental importância para sua corretaassociação com marcadores moleculares em plantas. Trabalhos semelhantes vêm sendorealizados com cafeeiro em relação a outras características. RIBEIRO et al. (2005)visou-se incorporar resistência à nematóides em cafeeiros. Foram avaliadas 50 progêniesde híbridos interespecífico de C. arabica e C. canephora provenientes do banco degermoplasma da Universidade Federal de Viçosa, com resistência a uma população deMeloidogyne exigua. Os autores verificaram que 31 progênies foram resistentes aonematóide e as demais eram suscetíveis. As progênies avaliadas apresentaramcaracterísticas de imunes, altamente resistentes, moderadamente resistentes e suscetíveissendo a maioria pertencente ao híbrido do Timor.ABCD

Figura 1. Tipos de lesões desenvolvidas por Leucoptera coffeella em folhas com diferentes níveisde resistência, avaliados numa escala de 1 a 4 pontos. A) Lesões pontuais – plantas resistentes; B)Lesões filiformes pequenas – plantas moderadamente resistentes; C) Lesões grandes irregulares –plantas moderadamente suscetíveis; D) Lesões grandes arredondadas – plantas suscetíveis(RAMIRO et al., 2004).1 ponto 2 pontos 3 pontos 4 pontos10 mm

4.2 Desenvolvimento de Marcadores MicrossatélitesAs atividades de busca, por seqüências, realizadas neste trabalho conhecidas tambémcomo “data-mining” incluíram buscas dirigidas no Banco de Dados do Genoma Café,através do programa “Tandem Repeats Finder” versão 3.01 (BENSON, 1999). Nestasbuscas foram identificados 315 ESTs-SSR, dos quais foram selecionadas e analisadas 32seqüências SSR expressas em bibliotecas de folhas, submetidas ou não a algum tipo de“stress”, tais como inóculo de patógeno, uso de indutores químicos de defesa, entre outros.Nesta busca foram priorizadas seqüências expressas em folhas infectadas por bicho-mineiroe ferrugem (Hemileia vastatrix). Além disso, foram também selecionados SSR expressosem folhas tratadas com indutores de defesa como o BION. Esta estratégia visou aumentar aprobabilidade de serem identificados marcadores associados com a resistência a patógenose provavelmente relacionadas à mecanismos de defesa da planta.A partir das buscas foi realizada a caracterização “in silico” dos alelos SSR quanto aonúmero e padrão de repetição, localização do SSR no gene, identidade dos genes contendoo SSR e sua provável função. O resultado destas análises está apresentado na tabela 4.

Tabela 4. Buscas em ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas) do Banco de Dados do GenomaCafé.Bibliotecas de cDNAPadrão de repetiçãoFreqüência de repetiçõesno BancoTamanhoesperado (pb)Calo embriogênico TC 39,5 169Folha CAGGGA 10,2 211Folha + BION TCCTCCTCTTCT 3,4 244Folha GAGAGAG 13 203Folha; células em suspensão GAA 22 204Folha + bicho-mineiro CAA 10 201Folha; calo embriogênico GAT 19 173Folha + BION CTCTT 8 296Folha + BION GCT 10,7 291Folha + bicho-mineiro CT 17 283Folha + bicho-mineiro CCT 13,3 303Folha AAGG 9,8 306Folha GCGTGGGCGGAC 3,6 214Folha + ferrugem + bichomineiroCAGCAGCATCAG 3,7 205Sementes ATTGCAGAA 7,6 186BION plântulas; células emsuspensãoFolhaLinhagem embriogênicaCCCACGCGTCCG 6,1 235ATGCCC 9,0 186GAGAGAGAAAGG 5,6 216Células + BION CAGGGA 10,2 238FolhasTTCTTC 22 202Folha + BIONFolha + raiz CCA 18 205Folha TTTGGCT 44 200Folha + bicho-mineiro GGAGAA 7,8 208Folha GAAGGT 6,7 205Folha AG 30 276Sementes TCGTCGTCATCA 5,2 201Calo embriogênico GGAGGAGGCCAC 5,7 213Calo embriogênico GCCCACGCGTCC 4,1 194Calo embriogênico CT 17,5 200

4.2.1 Tipo de repetição SSR e função dos SSRsA seleção dos EST-SSR para as análises seguiu inicialmente o critério de freqüência deocorrência do loco no genoma. Desta forma, foram selecionados os ESTs-SSR com o maiornúmero de repetições detectado. Um segundo critério para seleção foi a complexidade daseqüência repetida. Para tal foi avaliada a freqüência dos tipos de repetições comoapresentado na tabela 4.Os locos SSR apresentaram em sua maioria repetições mais complexas: 65% dasrepetições foram de tetranucleotídeos, 21% de trinucleotídeos e 14% de dinucleotídeos.Para as análises de segregação foram preferencialmente selecionados repetições do tipoperfeito sem interrupções em sua seqüência. A distribuição do número de repetições dosmotivos analisados foi o maior em dinucleotídeo variando de 17 a 30 repetições nogenoma, seguida por repetições de trinucleotídeos variando de 10 a 22 repetições nogenoma, e as mais complexas de tetranucleotídeos variando de 3 a 13 repetições com únicaexceção de 44 repetições no genoma.Outro aspecto avaliado foi a possível identidade dos genes contendo os SSRsselecionados. Esta associação foi feita a partir das análises da anotação do Banco de Dadosdo Genoma Café. Os resultados destas análises são apresentados na tabela 5, e indicam queos SSR avaliados estão associados com genes que codificam proteínas com diferentesfunções, tais como enzimas metabólicas, proteínas estruturais e fatores de transcrição. Alémdisso, significativamente, parte das proteínas contendo SSR tem papel relevante emmecanismos de defesa.Repetições de trinucleotídeos são mais comuns, seguidas igualmente por repetições dedinucleotídeos ou tetranucleotídeos, dependendo do estudo em questão. Por exemplo,VARSHNEY et al. (2002), demonstraram que entre algumas espécies de cereais, repetiçõesde trinucleotídeos foram mais freqüentes (54-78%), seguidos por repetições dedinucleotídeos (17,1- 40,4%) e repetições de tetranucleotídeos (3-6%).As funções dos genes que contém SSRs e o papel dos motivos SSR na função de genesde plantas são documentados na literatura. Repetições de trinucleotídeos em alguns geneshumanos mostraram estar associado a desordens neurológicas em humanos (SASAKI et al.,1996; NERI et al., 1996). O gene normal contém de 6-34 repetições CAG e a doença e ossintomas tornam-se mais severos quando a repetição CAG está presente de 36-121 vezes.

CERESINI et al. (2005) buscaram SSR em bancos de dados de Eucalipto. Nestetrabalho foram identificados 37% de repetições diméricas e 33% repetições triméricas. Arepetição dimérica AG/CT foi a mais freqüente seguida de repetições triméricasCCG/CGG. Além disso, os autores mostraram que 48% dos EST-SSR avaliados foramhomólogos a proteínas com alguma função biológica, além das repetições estaremlocalizadas nas regiões 5’ou 3’ do gene.

Tabela 5. Associação das seqüências de vinte e nove microssatélites quanto à sua função e posiçãono gene, obtida a partir das anotações do banco de dados do Genoma Café.SSR Contig Função Localização no gene2 1687 Proteína expressa Região 5’ - UTR*3 2074 Fator auxiliar SnRNP Região codificadora4 2988 Proteína associada a microfibrilaRegião codificadora próximaao domínio funcional5 3024 Proteína ligante GAGA Região 5’ - UTR6 3388 Proteína ligante de ácido nucléico Região 5’ - UTR9 2452 Proteína ligante de RNA AML1 Região 5’ - UTR11 10226 Provável proteína de resistência Região codificadora14 987 Provável Kinase Região 5’- UTR15 1177 Proteína desconhecida -16 6290 Precursor da peroxidase Região 5’- UTR17 13778 Proteína desconhecida -18 13034 U1 ribonucleoprotein C Regiao codificadora19 12445 Proteína desconhecida -20 10 Fator de elongamento EF2 Região codificadora21 945 Proteína ligante de RNA Região codificadora 5’22 1150 Proteína desconhecida -23 1246 Proteína desconhecida -24 1379 Proteína desconhecida Região 5’- UTR25 2074 Fator auxiliar de SnRNPRegião codificadora próximoao domínio funcional26 3445 Proteína contendo RRMRegião codificadora próximoao domínio funcional27 4446 Fator de processamento RNA Região 5’- UTR28 9600 Pectinesterase Região 5’- UTR29 11952 Proteína da família TraBRegião codificadora próximaao domínio funcional30 13345 Proteína expressa Região 5’- UTR31 152 Proteína expressa Região 5’- UTR32 1458 Proteína desconhecida Região 5’- UTR33 1704 Provável proteína regulatória de auxina Região 5’- UTR34 2044 Proteína família da histidina ácido Região 5’- UTR35 2131 Sucrose sintase 2 Região 5’- UTR

* UTR- “Untranslated region”

4.2.2 Posição do SSR no geneOs SSR foram avaliados com relação à posição no transcrito. Os resultados destaanálise estão apresentados na tabela 5.Os locos SSR avaliados encontram-se preferencialmente na região 5’- UTR do gene(53,57%), representando mais da metade dos locos avaliados. Esta região está envolvidacom a estabilidade do transcrito e seu reconhecimento pela maquinaria de síntese protéica(SHERAMETI et al., 2002).Os SSR têm sido encontrados na região 5’-UTR de um grande número de genes deplantas e animais. Em estudos conduzidos em arroz, um número variável de repetições CTna região 5’-UTR do gene Waxy está correlacionado com o conteúdo de amilose no grão.Embora, a maior variabilidade no conteúdo seja resultado de um SNP adjacente a estemicrossatélite, as repetições CT parecem afetar o sítio de processamento do íntron (BLIGHet al., 1995; AYRES et al., 1997; LARKIN & PARK, 1999).A presença de SSR na região 5’-UTR não necessariamente sugere ou implica que alelospolimórficos existirão na população. Estudo desenvolvido por KALCHEVA et al. (1999),com gene humano MAP 2 que continha sete repetições CAG na região 5’-UTR, mostrouque o mesmo número de repetições foi encontrado num total de 86 indivíduos, incluindo 31controles e 55 indivíduos com uma doença neuropsiquiátrica. Neste caso, nenhumavariabilidade ou polimorfismo nos SSR é conhecido na população.Também CHO et al. (2000), em estudos de polimorfismos de SSR em arroz, relatou 27genes que continham SSR em regiões de exons (8), introns (5), 5’-UTR (8) ou 3’-UTR.SCOTT et al. (2000), em estudo com EST-SSR, também relataram que existiamdiferenças de polimorfismos entre os microssatélites derivados de 3’-UTR (maispolimórfico ao nível de cultivar), 5’-UTR (mais polimórfico entre cultivar e espécie) e SSRna seqüência codificadora (mais polimórfico entre espécie e gênero). Similar a este estudo,marcadores SSR (CCG) na região 5’-UTR de genes de proteínas ribossomais de milhoparecem estar envolvidos na regulação da fertilização (DRESSELHAUS et al., 1999).Um outro aspecto interessante é que aproximadamente 69% dos EST-SSR foramhomólogos a proteínas com alguma função biológica. Os SSRs 4, 11, 25, 26 e 29localizam-se dentro ou perto da seqüência codificadora dos domínios conservados daproteína. De maneira geral estes domínios são diretamente responsáveis pela função

iológica destas proteínas. Por exemplo, o grupo das peroxidases (PO) inclui enzimascapazes de catalisar a transferência do hidrogênio de um doador para o H 2 0 2 . Em plantas, aação desse grupo de enzimas constitui uma proteção antioxidativa. A atividade daperoxidase pode aumentar em plantas submetidas a diversos tipos de estresses (SIEGEL,1993).Um outro exemplo interessante é o domínio RRM encontrado no loco SSR 26. Estedomínio é conhecido como proteína ligante de RNA e são encontrados em uma variedadede proteínas, e está envolvido na regulação do processamento de RNA. Sua estruturaconsiste de quatro fitas e duas hélices arranjadas em estrutura alfa e beta e são maispresentes em sementes (BIRNEY et al., 1993).Outro aspecto interessante no que se refere à função da proteína é o domínio da proteínada família traB apresentada pelo loco SSR 29. Esta proteína parece estar envolvida comsinais de respostas a feromônios em bactérias (AN & CLEWELL, 1994). Também no locoSSR 5 a proteína ligante de GAGA desempenha papel importante no controle da expressãogênica em animais. Esta proteína é uma proteína específica regulatória. Em trabalhosemelhante desenvolvido em soja por SANGWAN et al. (2002), demonstrou-se que aproteína recombinante GBP que naturalmente não se liga a seqüências de dinucleotídeosrepetidas, ligou-se à região promotora do elemento GAGA. Os autores sugeriram que ainteração entre os elementos GAGA e proteínas GBP apresentam característica regulatóriaem plantas.Estes resultados sugerem que a presença de SSR em regiões transcritas do gene podedesempenhar uma função importante durante a síntese e/ou atividade da proteína. Destamaneira, pode-se esperar que não somente os polimorfismos de tamanho dos SSRs sejampotenciais marcadores para seleção. Além destas, a presença ou ausência de um SSR podeinterferir com a atividade do gene, representando assim um potencial marcador paraseleção. Para que isto seja possível, no entanto, estudos de genômica funcional, visando àcaracterização da expressão de genes contendo SSR, serão fundamentais para umacompreensão da função destas seqüências nos genes expressos durante a resposta de defesaao ataque pelo bicho-mineiro.

4.2.3 Amplificação de microssatélites via PCRPara o isolamento do DNA genômico somente plantas que receberam notas extremas 1e 4 para avaliação do nível de resistência foram utilizadas para as análises de segregação deSSR. Foi extraído o DNA das folhas jovens, correspondente a terceira folha emitida, das102 plantas avaliadas, sendo 54 resistentes com nota 1 e 48 suscetíveis com nota 4.Os 102 genótipos foram agrupados em 11 bulks de plantas resistentes e 10 bulks deplantas suscetíveis. A estratégia de agrupar os genótipos em bulk objetivou uma rápidaavaliação de possíveis polimorfismos.Para caracterização genômica dos EST-SSR, foram avaliados 32 locos SSR. Estesforam amplificados através de oligos específicos obtidos a partir da seqüênciacorrespondente à região flanqueadora de cada loco. Os SSRs foram amplificados através dereações de PCR nos genótipos parentais e nos 21 bulks de plantas resistentes e suscetíveis.Posteriormente, os diferentes bulks foram individualizados conduzindo-se as reações deamplificação.

Os fragmentos amplificados nos bulks resistentes e suscetíveis foram separadosprimeiramente por eletroforese em gel de agarose 2%, para verificação do padrão deamplificação das bandas. Estes apresentaram, em sua maioria, um padrão de amplificaçãode banda única, como exemplificado pelas amplificações utilizando-se os oligos 6, 15 e 9 emostrados na figura 2.PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 PMA1A2B1B2C1C2Figura 2. Padrão de amplificação dos oligos SSR em bulks de DNA (A1 e A2 - SSR 6; B1 e B2-SSR 15; C1 e C2- SSR 9). PM- Peso Molecular de 250 pb; 1 a 11- bulks de plantas resistentes aobicho-mineiro; 12 a 21- bulks de plantas suscetíveis ao bicho-mineiro.

Apenas um loco apresentou polimorfismo, o SSR 18 no bulk 18 de planta suscetível etambém no parental P4 suscetível (IAC 81- Catuaí Vermelho). O polimorfismo se repetiupara o genótipo 90 do bulk 18 como mostrado nas figuras 5 e 6.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21Figura 5. Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, com quatro alelos, embulks de plantas resistentes (1 a 11) e de plantas suscetíveis (12 a 21) ao bicho-mineiro.P1 P2 P3 P4 90 92 94 95 97Figura 6. Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, em genótipos do bulksuscetível (P1-C1195-5-6-2; P2-H13685-1; P3-H14954-46; P4-IAC 81) – parentais; 90, 92,94, 95, 97 - genótipos individuais do bulk 18).

Os resultados das amplificações dos SSRs estão apresentados na tabela 6 mostrando quedos 32 oligos avaliados 29 amplificaram fragmentos/alelos correspondentes ao tamanhoesperado a partir da análise de “data-mining”. Os alelos apresentaram variação de tamanhoentre 140 a 300 pares de base. Alguns locos amplificados tais como os locos 3, 5, 6, 18, 25,27 e 33 apresentaram tamanhos acima do esperado pelas análises de “data mining”, entre700 a 900 pares de base (Tabela 6). Esta discrepância no resultado sugere a presença deíntrons nestes produtos amplificados como observado também por JANY et al. (2003).Neste trabalho foram selecionados EST-SSR de uma espécie de fungo ectomicorrizoHebeloma cylindrosporum de Pinus pinaster. De onze locos SSR avaliados, trêsamplificaram locos com tamanho acima do esperado, sugerindo a presença de íntrons emprodutos genômicos.Resultados similares foram observados por THIEL et al. (2003) e VARSHNEY et al.(2002). Nestes estudos, comparando os SSR oriundos de ESTs e SSR genômico, mostrouseque é mais freqüente a amplificação de fragmentos de tamanho não esperados. Esteresultado é provavelmente devido a presença de íntrons e inserções-deleções(aproximadamente 20 pb) no ESTs-SSR que podem alterar o tamanho do fragmento.

Tabela 6. Caracterização dos locos SSR quanto à quantidade de alelos/loco e quanto à variação notamanho dos alelos.SSR Tamanho esperado (pb) Variação do tamanhodos alelosAlelos/locoRepetição dos SSR2 169 198 - 200 2 (TC) 403 211 700 - 800 2 (CAGGGA) 104 244 240 - 250 2 (TCCTCCTCTTCT) 45 203 890 - 900 2 (GAGAGAG) 456 204 795 - 800 2 (GAA) 229 200 247 - 250 2 (CAA) 1011 173 245 - 250 2 (GAT) 1914 296 295 - 300 2 (CTCTT) 815 291 245 - 250 2 (GCT) 1116 283 248 - 250 2 (CT) 1717 303 292 - 300 4 (CCT) 1318 186 700 - 706 2 (ATGCCC) 919 306 288 - 300 4 (AAGG) 1020 214 200 - 212 2 (GCGTGGGCGGAC)421 205 200 1 (CAGCAGCATCAG) 422 186 140 - 200 2 (ATTGCAGAA) 823 235 700 1 (CCCACGCGTCCG) 624 216 140 - 200 2 (GAGAGAGAAAGG) 625 238 794 - 800 2 (CAGGGA) 10

desenvolvidos por THIEL et al. (2003), os microssatélites derivados de ESTs sãosignificativamente menos polimórficos do que aqueles derivados de regiões genômicas.Este fato explicaria o não aparecimento de polimorfismo para os locos avaliados nasplantas de café resistentes e suscetíveis ao bicho-mineiro. Para este estudo foi selecionadauma progênie segregante com origem em uma hibridação interespecífica entre C. arabica eC. racemosa. Em estudos de diversidade genética realizada por RUAS et al. (2003), dentreas espécies do gênero Coffea, C. racemosa, espécie doadora dos genes de resistência aobicho-mineiro, é a mais distante de C. arabica do ponto de vista genético. Assim, esperavaseque o nível de diversidade genética dentro desta população fosse maior, apesar da jádescrita reduzida diversidade genética de C. arabica. O fato de ter sido selecionada umapopulação de geração avançada (F 2 RC 5 ) pode ter contribuído para a ausência depolimorfismos. No entanto, as avaliações de genótipos parentais anteriores demonstram quenestas gerações também não foram observados polimorfismos. Assim pode-se supor quepossíveis polimorfismos presentes nos parentais iniciais foram rapidamente diminuídosdurante os primeiros ciclos de seleção.Uma vez que a seleção para resistência ao bicho-mineiro foi direcionada desde osprimeiros cruzamentos era esperado que os locos envolvidos em mecanismos de defesaapresentassem baixa diversidade genética. Assim, a estratégia de selecionar EST-SSRpotencialmente associados a locos de defesa pode ter resultado na ausência de alelospolimórficos. Uma seleção aleatória de locos SSR para avaliação poderia então revelar ummaior número de alelos polimórficos. Por outro lado, a chance destes possíveispolimorfismos co-segregarem com a característica de resistência ao bicho-mineiro épequena. De fato, o único loco SSR polimórfico observado não apresentou co-segregaçãocom a característica de resistência, uma vez que foi detectado, apenas em alguns genótipossuscetíveis. Tendo isto em vista, os resultados deste estudo sugerem que a utilização deEST-SSR para seleção assistida em café é pouco eficiente para populações avançadas emprogramas de melhoramento.Apesar deste estudo não ter revelado nenhum marcador para seleção assistida, o seucaráter exploratório é fundamental para a compreensão dos eventos genéticos envolvidosdos cruzamentos interespecíficos. Uma hipótese para a função dos SSRs é que estesmarcadores estariam associados com algum outro mecanismo genético relacionado ao

controle da expressão de genes de interesse. Estudos recentes demonstram que espéciespoliplóides apresentam padrões particulares de expressão gênica. ADAMS et al. (2003),fizeram análises da expressão de genes em algodão, uma espécie alopoliplóide resultado dahibridação de Gossypium herbaceum X G. raimondii, sugerindo que a seleção de alelosexpressos nos diferentes tecidos e órgãos da planta não é aleatória. Os autores identificaramregiões específicas de alguns genes que correspondem às seqüências dos alelos orignadosem cada uma das espécies parentais. Assim, avaliando o nível de expressão destes alelos,foi verificado que em alguns tecidos apenas o alelo da espécie parental A era expresso,mesmo na presença de alelos provenientes de outra espécie, sugerindo a existência demecanismos genéticos de escolha de alelos ativos. Estes aspectos são importantes para seestabelecer o papel de determinados grupos de genes em um cruzamento interespecífico, epara se prever a taxa de introgressão de cada genótipo em um híbrido. Neste contexto, aidentificação de marcadores tais como os SSR, associados a locos preferencialmenteexpressos, poderá possibilitar a seleção de genes de interesse em cruzamentos iniciais. Noentanto, para que estas hipóteses sejam comprovadas é necessária uma amplacaracterização da expressão de genes contendo SSR.

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