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Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS370,1M, 1µL de dNTP mix, 0,5µL da enzima RNaseOut e 1µL da enzima MMLV-RT. As reaçõesforam incubadas em um termociclador por 40°C por 2hs, 65°C por 15min e transferidaspara o gelo. A transcrição de cDNA para cRNA ocorreu em um volume final de 80µL porreação contendo 15,3µL de água ultra-pura estéril, 20µL de 4X Transcription Buffer, 6,4µLde 50% PEG, 6µL de DDT 0,1M, 8µL de NTP mix, 0,5µL de RNaseOUT, 0,6µL de InorganicPyrophosphatase, 2,4µL de Cy3 ou Cy5 e 0,8 µL da enzima T7 RNA Polimerase. As amostrasforam mantidas a 40°C por 2hs em termociclador sendo em seguida purificadas utilizandoo protocolo estabelecido pelo RNeasy Mini Kit (Qiagen). A atividade específica da marcaçãofoi obtida para todas amostras e 825ng de cada amostra teste foi combinada à mesmaconcentração da amostra referência. Foram adicionados 11µL de 10X Blocking Agent,2,2µL de 25X Fragmentation Buffer e água ultra pura estéril para um volume final de 55µL.A solução foi desnaturada a 95°C por 3min, incubada a 37°C por 30min e 100µL foramaplicados às lâminas. As lâminas foram transferidas para o forno de hibridação por17horas a 10rpm. Após este período, as imagens de hibridação de cada lâmina foramcapturadas no Scanner Agilent G2565CA (Agilent Technologies). Os dados foram extraídospelo programa Feature Extraction v.10.1.1.1 (Agilent Technologies).Para a obtenção do perfil de expressão gênica foi inicialmente avaliada a razãoentre as fluorescências dos corantes Cy3 e Cy5 (log 2Ratio) em cada ponto da lâmina. Foiobtida a média geométrica da intensidade de sinais das sondas para todos os casos,gerando uma lista única de genes significantes. Os dados brutos foram normalizados pelacentralização mediana dos genes de cada caso e sofreram transformação logarítmica. Alémdisso, os genes com 30% ou mais de score "ausentes" foram filtrados. Os restantes,aproximadamente 16 mil genes foram analisados. Esses dados serviram de entrada para oprograma TMeV v.4.5 (http://www.tm4.org), onde foi utilizado o método SAM(Significance Analysis of Microarrays) (Tusher et al., 2001) com 1000 permutações e
Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS38Discovery Ratio) é definido como a proporção esperada de “falsas descobertas” entre osgenes considerados significantes. Em seguida, foi aplicada a análise de agrupamento nãosupervisionadopelo teste de agrupamento hierárquico (HCL Hierarchical Clustering),utilizando a métrica de distância pela correlação de Pearson para verificar a existência deagrupamento entre os grupos de tumores e miométrios adjacentes.Foram também obtidos os genes diferencialmente expressos em relação aosmiométrios normais adjacentes. As análises de fold-change foram realizadas a partir darazão entre as médias geométricas das intensidades de expressão (log 2Ratio) dos tumoresem relação ao tecido normal. Para selecionar os genes potencialmente envolvidos com adoença, foram utilizados os fold-changes ≥1.5 e ≤-1.5, que indicam aumento e diminuiçãoda expressão de determinado gene na amostra tumoral em relação ao tecido normal,respectivamente. Os genes resultantes foram submetidos á análise funcional.3.7 Integração de dados genômicos e transcriptômicosPara a realização da análise integrada, foram selecionados os dados da log 2Ratioobtidos da análise de CGH array (genômicos) e de expressão gênica (transcriptômicos). As51 amostras submetidas à análise de expressão gênica e previamente avaliadas por CGHarray, foram selecionadas para a análise integrada. Para a obtenção de genes significantesmapeados em regiões com alterações no número de cópias de DNA foi realizada a análisede segmentação dos dados das 51 amostras de Leiomiomas Uterinos, utilizando o pacoteDNA Copy com o algorítimo JISTIC (Sanchez-Garcia et al., 2010). Este nova análise dosdados de CGH array foi realizada devido ao fato de que o algoritmo utilizado paraintegração dos dados não é compatível com os dados gerados pelo programa Nexus. OJISTIC é baseado no GISTIC (Beroukhim et al., 2007) que utiliza um método estatístico (Gscore)que representa a frequência e amplitude de cada alteração cromossômica. O JISTICé superior ao GISTIC por permitir a distinção entre CNVs “passageiras” (passengers:
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Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS38Discovery Ratio) é <strong>de</strong>finido como a proporção esperada <strong>de</strong> “falsas <strong>de</strong>scobertas” entre osgenes consi<strong>de</strong>rados significantes. Em seguida, foi aplicada a análise <strong>de</strong> agrupamento nãosupervisionadopelo teste <strong>de</strong> agrupamento hierárquico (HCL Hierarchical Clustering),utilizando a métrica <strong>de</strong> distância pela correlação <strong>de</strong> Pearson para verificar a existência <strong>de</strong>agrupamento entre os grupos <strong>de</strong> tumores e miométrios adjacentes.Foram também obtidos os genes diferencialmente expressos em relação aosmiométrios normais adjacentes. As análises <strong>de</strong> fold-change foram realizadas a partir darazão entre as médias geométricas das intensida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> expressão (log 2Ratio) dos tumoresem relação ao tecido normal. Para selecionar os genes potencialmente envolvidos com adoença, foram utilizados os fold-changes ≥1.5 e ≤-1.5, que indicam aumento e diminuiçãoda expressão <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminado gene na amostra tumoral em relação ao tecido normal,respectivamente. Os genes resultantes foram submetidos á análise funcional.3.7 Integração <strong>de</strong> dados genômicos e transcriptômicosPara a realização da análise integrada, foram selecionados os dados da log 2Ratioobtidos da análise <strong>de</strong> CGH array (genômicos) e <strong>de</strong> expressão gênica (transcriptômicos). As51 amostras submetidas à análise <strong>de</strong> expressão gênica e previamente avaliadas por CGHarray, foram selecionadas para a análise integrada. Para a obtenção <strong>de</strong> genes significantesmapeados em regiões com alterações no número <strong>de</strong> cópias <strong>de</strong> DNA foi realizada a análise<strong>de</strong> segmentação dos dados das 51 amostras <strong>de</strong> Leiomiomas Uterinos, utilizando o pacoteDNA Copy com o algorítimo JISTIC (Sanchez-Garcia et al., 2010). Este nova análise dosdados <strong>de</strong> CGH array foi realizada <strong>de</strong>vido ao fato <strong>de</strong> que o algoritmo utilizado paraintegração dos dados não é compatível com os dados gerados pelo programa Nexus. OJISTIC é baseado no GISTIC (Beroukhim et al., 2007) que utiliza um método estatístico (Gscore)que representa a frequência e amplitu<strong>de</strong> <strong>de</strong> cada alteração cromossômica. O JISTICé superior ao GISTIC por permitir a distinção entre CNVs “passageiras” (passengers: