Visualizar Tese - Instituto de Biociências - Unesp

Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS370,1M, 1µL de dNTP mix, 0,5µL da enzima RNaseOut e 1µL da enzima MMLV-RT. As reaçõesforam incubadas em um termociclador por 40°C por 2hs, 65°C por 15min e transferidaspara o gelo. A transcrição de cDNA para cRNA ocorreu em um volume final de 80µL porreação contendo 15,3µL de água ultra-pura estéril, 20µL de 4X Transcription Buffer, 6,4µLde 50% PEG, 6µL de DDT 0,1M, 8µL de NTP mix, 0,5µL de RNaseOUT, 0,6µL de InorganicPyrophosphatase, 2,4µL de Cy3 ou Cy5 e 0,8 µL da enzima T7 RNA Polimerase. As amostrasforam mantidas a 40°C por 2hs em termociclador sendo em seguida purificadas utilizandoo protocolo estabelecido pelo RNeasy Mini Kit (Qiagen). A atividade específica da marcaçãofoi obtida para todas amostras e 825ng de cada amostra teste foi combinada à mesmaconcentração da amostra referência. Foram adicionados 11µL de 10X Blocking Agent,2,2µL de 25X Fragmentation Buffer e água ultra pura estéril para um volume final de 55µL.A solução foi desnaturada a 95°C por 3min, incubada a 37°C por 30min e 100µL foramaplicados às lâminas. As lâminas foram transferidas para o forno de hibridação por17horas a 10rpm. Após este período, as imagens de hibridação de cada lâmina foramcapturadas no Scanner Agilent G2565CA (Agilent Technologies). Os dados foram extraídospelo programa Feature Extraction v.10.1.1.1 (Agilent Technologies).Para a obtenção do perfil de expressão gênica foi inicialmente avaliada a razãoentre as fluorescências dos corantes Cy3 e Cy5 (log 2Ratio) em cada ponto da lâmina. Foiobtida a média geométrica da intensidade de sinais das sondas para todos os casos,gerando uma lista única de genes significantes. Os dados brutos foram normalizados pelacentralização mediana dos genes de cada caso e sofreram transformação logarítmica. Alémdisso, os genes com 30% ou mais de score "ausentes" foram filtrados. Os restantes,aproximadamente 16 mil genes foram analisados. Esses dados serviram de entrada para oprograma TMeV v.4.5 (http://www.tm4.org), onde foi utilizado o método SAM(Significance Analysis of Microarrays) (Tusher et al., 2001) com 1000 permutações e