Visualizar Tese - Instituto de Biociências - Unesp

Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS34marcadas com 1,5µL de Cy3 e Cy5 dCTPs, respectivamente acrescidas de 5µL do dNTP mixe 1µL da enzima Exo-Klenow. A reação de marcação foi realizada a 37°C por 2horas, 65°Cpor 10min e mantidas em gelo durante a reação. As amostras foram purificadas em minicolunasde celulose (Microcon YM-30, Millipore) e ressuspendidas em 21µL de TE (tampãoTris-EDTA) 1x pH=8.0 (Prodimol). A eficiência de marcação das amostras foi obtidabaseando-se na razão entre pmol/µL do corante sobre concentração em µg/µL. Asamostras referência e teste com eficiências semelhantes foram combinadas. Adicionou-sea cada reação Human Cot DNA, 10X Blocking Agent e 2X Hi-RPM Hybridization Solution. Areação foi desnaturada a 95°C por 3min e incubada a 37°C por 30min. As amostras foramaplicadas nas lâminas e permaneceram a 65°C a 20rpm por 24hs. Após este período, asimagens de hibridação de cada lâmina foram capturadas usando o Scanner AgilentG2565CA. Os dados foram extraídos pelo programa Feature Extraction v.10.1.1.1 (AgilentTechnologies).A análise dos dados foi realizada utilizando o programa Nexus v.5.0 (Biodiscovery).Apenas os casos que apresentaram valores de qualidade de hibridação ≤0,3 foramselecionados para análise. Todas as amostras preencheram este critério. As amostrasforam hibridadas utilizando DNA de referência masculino pois essa estratégia, é umcontrole de hibridação a cada experimento, devido à competição não balanceada nahibridação das sequências dos cromossomos sexuais. Portanto, alterações envolvendo oscromossomos X e Y foram excluídas das análises.O algoritmo Rank Segmentation foi utilizado para segmentar cada intervalocromossômico e estimar o número de cópias. Este método é uma variante do algoritmoCBS, que utiliza um modelo paramétrico, em vez de testes de permutação, para determinara significância dos agrupamentos de segmentação (Olshen et al., 2004). Os parâmetros deanálise foram: limiar de significância de 1,00E- 4 , espaçamento máximo de 1Mb entresondas adjacentes e a presença de três sondas consecutivas alteradas para determinaçãode um segmento de DNA alterado. Os limiares para a classificação de ganhos ou perdas