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10.07.2015 Views

Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS313. Material e Métodos3.1 CasuísticaOitenta amostras de tecido a fresco foram obtidas de 56 pacientes comLeiomiomas Uterinos. O miométrio normal adjacente também foi coletado (n=56). Asamostras foram transferidas imediatamente para nitrogênio líquido e estocadas a -80°C.Fragmentos destes tumores também foram avaliados pelo patologista responsável doDepartamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB-UNESP). Estasamostras foram obtidas de pacientes submetidas à histerectomia no Departamento deGinecologia e Obstetrícia (FMB-UNESP) entre Outubro de 1995 e Fevereiro de 2004. Asamostras fazem parte do Banco de Amostras do NeoGene Laboratório, Departamento deUrologia (FMB-UNESP), sob a responsabilidade da Dra Silvia Regina Rogatto. Este estudofoi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da FMB-UNESP (146/2007-CEP). Todas aspacientes assinaram “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” antes da coleta dasamostras, os quais se encontram sob a responsabilidade da Dra Anaglória Pontes,Departamento de Ginecologia e Obstetrícia (FMB-UNESP).3.1.1 Características clínicas e histopatológicasTreze pacientes apresentaram tumores únicos (n=13) e 43 tinham tumoresmúltiplos. Entre as pacientes com tumores múltiplos, 26 tiveram apenas uma amostraavaliada (n=26), dez tiveram duas amostras avaliadas (n=20) e sete tiveram três amostrasavaliadas (n=21).Todas as pacientes eram pré-menopáusicas e não fizeram uso de terapia hormonalpor pelo menos três meses antes da cirurgia. Tecidos conectivos e necróticos foramremovidos das amostras. Em 2008, os prontuários e achados histopatológicos foram

Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS32revisados para a atualização dos dados clínicos como, idade, idade à menarca, idade àprimeira gravidez, índice de massa corpórea (IMC), fase do ciclo, número de tumores, raça,gestações, história familial de LU e ou outros tumores e tipo histológico tumoral (Anexo 2).Todas as amostras foram classificadas como LU típicos. Para a determinação da fase dociclo, foi avaliado o status endometrial de cada paciente, utilizando o critério de Noyes etal. (1950). Os valores de referência para o IMC (índice de massa corpórea) foram ≤18abaixo do peso, 18,5 a 24,9 peso normal, 25 a 29.9 sobrepeso e ≥ 30 obesidade (WHO,1997).3.2 Extração de DNAAmostras de DNA genômico foram obtidas das 80 amostras. Para a extração, foiutilizado o método padrão fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Estas amostras foramtratadas com RNAse 20mg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para digestão de moléculasde RNA remanescentes do processo de extração. Após a extração do DNA, as amostrasforam ressuspendidas em até 50µL de água ultra-pura estéril e armazenadas á -20°C. Emseguida, 100ng/µL de cada amostra foram aplicados em gel de agarose 0,8% paraavaliação da integridade do DNA genômico. As amostras também foram quantificadas emespectrofotômetro (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer v.3.0.1, Labtrade) paraavaliação de pureza e qualidade da molécula.3.3 Extração de RNAA extração do RNA foi realizada em um subgrupo de tumores de 34 pacientes,totalizando 51 amostras. O critério de seleção destas amostras foi baseado na informaçãoda fase do ciclo menstrual no momento da cirurgia, onde 13 pacientes estavam na faseproliferativa e 21 encontravam-se na fase secretora.

Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS32revisados para a atualização dos dados clínicos como, ida<strong>de</strong>, ida<strong>de</strong> à menarca, ida<strong>de</strong> àprimeira gravi<strong>de</strong>z, índice <strong>de</strong> massa corpórea (IMC), fase do ciclo, número <strong>de</strong> tumores, raça,gestações, história familial <strong>de</strong> LU e ou outros tumores e tipo histológico tumoral (Anexo 2).Todas as amostras foram classificadas como LU típicos. Para a <strong>de</strong>terminação da fase dociclo, foi avaliado o status endometrial <strong>de</strong> cada paciente, utilizando o critério <strong>de</strong> Noyes etal. (1950). Os valores <strong>de</strong> referência para o IMC (índice <strong>de</strong> massa corpórea) foram ≤18abaixo do peso, 18,5 a 24,9 peso normal, 25 a 29.9 sobrepeso e ≥ 30 obesida<strong>de</strong> (WHO,1997).3.2 Extração <strong>de</strong> DNAAmostras <strong>de</strong> DNA genômico foram obtidas das 80 amostras. Para a extração, foiutilizado o método padrão fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Estas amostras foramtratadas com RNAse 20mg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para digestão <strong>de</strong> moléculas<strong>de</strong> RNA remanescentes do processo <strong>de</strong> extração. Após a extração do DNA, as amostrasforam ressuspendidas em até 50µL <strong>de</strong> água ultra-pura estéril e armazenadas á -20°C. Emseguida, 100ng/µL <strong>de</strong> cada amostra foram aplicados em gel <strong>de</strong> agarose 0,8% paraavaliação da integrida<strong>de</strong> do DNA genômico. As amostras também foram quantificadas emespectrofotômetro (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer v.3.0.1, Labtra<strong>de</strong>) paraavaliação <strong>de</strong> pureza e qualida<strong>de</strong> da molécula.3.3 Extração <strong>de</strong> RNAA extração do RNA foi realizada em um subgrupo <strong>de</strong> tumores <strong>de</strong> 34 pacientes,totalizando 51 amostras. O critério <strong>de</strong> seleção <strong>de</strong>stas amostras foi baseado na informaçãoda fase do ciclo menstrual no momento da cirurgia, on<strong>de</strong> 13 pacientes estavam na faseproliferativa e 21 encontravam-se na fase secretora.

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