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Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS313. Material e Métodos3.1 CasuísticaOitenta amostras de tecido a fresco foram obtidas de 56 pacientes comLeiomiomas Uterinos. O miométrio normal adjacente também foi coletado (n=56). Asamostras foram transferidas imediatamente para nitrogênio líquido e estocadas a -80°C.Fragmentos destes tumores também foram avaliados pelo patologista responsável doDepartamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB-UNESP). Estasamostras foram obtidas de pacientes submetidas à histerectomia no Departamento deGinecologia e Obstetrícia (FMB-UNESP) entre Outubro de 1995 e Fevereiro de 2004. Asamostras fazem parte do Banco de Amostras do NeoGene Laboratório, Departamento deUrologia (FMB-UNESP), sob a responsabilidade da Dra Silvia Regina Rogatto. Este estudofoi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da FMB-UNESP (146/2007-CEP). Todas aspacientes assinaram “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” antes da coleta dasamostras, os quais se encontram sob a responsabilidade da Dra Anaglória Pontes,Departamento de Ginecologia e Obstetrícia (FMB-UNESP).3.1.1 Características clínicas e histopatológicasTreze pacientes apresentaram tumores únicos (n=13) e 43 tinham tumoresmúltiplos. Entre as pacientes com tumores múltiplos, 26 tiveram apenas uma amostraavaliada (n=26), dez tiveram duas amostras avaliadas (n=20) e sete tiveram três amostrasavaliadas (n=21).Todas as pacientes eram pré-menopáusicas e não fizeram uso de terapia hormonalpor pelo menos três meses antes da cirurgia. Tecidos conectivos e necróticos foramremovidos das amostras. Em 2008, os prontuários e achados histopatológicos foram
Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS32revisados para a atualização dos dados clínicos como, idade, idade à menarca, idade àprimeira gravidez, índice de massa corpórea (IMC), fase do ciclo, número de tumores, raça,gestações, história familial de LU e ou outros tumores e tipo histológico tumoral (Anexo 2).Todas as amostras foram classificadas como LU típicos. Para a determinação da fase dociclo, foi avaliado o status endometrial de cada paciente, utilizando o critério de Noyes etal. (1950). Os valores de referência para o IMC (índice de massa corpórea) foram ≤18abaixo do peso, 18,5 a 24,9 peso normal, 25 a 29.9 sobrepeso e ≥ 30 obesidade (WHO,1997).3.2 Extração de DNAAmostras de DNA genômico foram obtidas das 80 amostras. Para a extração, foiutilizado o método padrão fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Estas amostras foramtratadas com RNAse 20mg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para digestão de moléculasde RNA remanescentes do processo de extração. Após a extração do DNA, as amostrasforam ressuspendidas em até 50µL de água ultra-pura estéril e armazenadas á -20°C. Emseguida, 100ng/µL de cada amostra foram aplicados em gel de agarose 0,8% paraavaliação da integridade do DNA genômico. As amostras também foram quantificadas emespectrofotômetro (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer v.3.0.1, Labtrade) paraavaliação de pureza e qualidade da molécula.3.3 Extração de RNAA extração do RNA foi realizada em um subgrupo de tumores de 34 pacientes,totalizando 51 amostras. O critério de seleção destas amostras foi baseado na informaçãoda fase do ciclo menstrual no momento da cirurgia, onde 13 pacientes estavam na faseproliferativa e 21 encontravam-se na fase secretora.
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Cirilo, PDRMATERIAL E MÉTODOS313. Material e Métodos3.1 CasuísticaOitenta amostras <strong>de</strong> tecido a fresco foram obtidas <strong>de</strong> 56 pacientes comLeiomiomas Uterinos. O miométrio normal adjacente também foi coletado (n=56). Asamostras foram transferidas imediatamente para nitrogênio líquido e estocadas a -80°C.Fragmentos <strong>de</strong>stes tumores também foram avaliados pelo patologista responsável doDepartamento <strong>de</strong> Patologia da Faculda<strong>de</strong> <strong>de</strong> Medicina <strong>de</strong> Botucatu (FMB-UNESP). Estasamostras foram obtidas <strong>de</strong> pacientes submetidas à histerectomia no Departamento <strong>de</strong>Ginecologia e Obstetrícia (FMB-UNESP) entre Outubro <strong>de</strong> 1995 e Fevereiro <strong>de</strong> 2004. Asamostras fazem parte do Banco <strong>de</strong> Amostras do NeoGene Laboratório, Departamento <strong>de</strong>Urologia (FMB-UNESP), sob a responsabilida<strong>de</strong> da Dra Silvia Regina Rogatto. Este estudofoi aprovado pelo Comitê <strong>de</strong> Ética e Pesquisa da FMB-UNESP (146/2007-CEP). Todas aspacientes assinaram “Termo <strong>de</strong> Consentimento Livre e Esclarecido” antes da coleta dasamostras, os quais se encontram sob a responsabilida<strong>de</strong> da Dra Anaglória Pontes,Departamento <strong>de</strong> Ginecologia e Obstetrícia (FMB-UNESP).3.1.1 Características clínicas e histopatológicasTreze pacientes apresentaram tumores únicos (n=13) e 43 tinham tumoresmúltiplos. Entre as pacientes com tumores múltiplos, 26 tiveram apenas uma amostraavaliada (n=26), <strong>de</strong>z tiveram duas amostras avaliadas (n=20) e sete tiveram três amostrasavaliadas (n=21).Todas as pacientes eram pré-menopáusicas e não fizeram uso <strong>de</strong> terapia hormonalpor pelo menos três meses antes da cirurgia. Tecidos conectivos e necróticos foramremovidos das amostras. Em 2008, os prontuários e achados histopatológicos foram
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