Diagnostico Laboratorial das Imunodeficiencias.pdf - Ucg

Departamento de Medicina UCGImunologia LaboratorialProf. Hermínio M. da Rocha SobrinhoDiagnóstico Laboratorial dasImunodeficiênciasImunodeficiências CongênitasA Imunodeficiência Primária é uma desordem imunológica,onde componentes do sistema imune estão ausentes noorganismo humano em decorrência de defeitos genéticos.Pode envolver:Imunidade Inata:complemento;defeito nos fagócitos ou no sistemaImunidade Adquirida: desenvolvimento, ativação oufuncionamento anormal de linfócitos.Conseqüências:A principal conseqüência da imunodeficiência asuscetibilidade aumentada às infecções.Propensão a certos tipos de câncer.As manifestações estão associadas ao tipo de elementoimune afetado.Imunodeficiências Congênitas1

Imunodeficiências Secundárias ou Adquiridas:Ocorrem em conseqüência ou associadas a outraspatologias. Doenças Auto-Imunes; Neoplasias malígnas (Leucemias); Infecção pelo HIV (AIDS); Infecções; Diabetes; Queimaduras; Uso de drogas imunossupressoras; Desnutrição grave.2

Doença Granulomatosa Crônica (DGC)A Doença Granulomatosa Crônica (DGC) é uma patologia rara cujaincidência mundial é em torno de 1 para cada 250.000 indivíduos (Roos &Curnutte,1999). No Brasil, a DGC é responsável por 7,4% dasimunodeficiências primárias (Zelasko e col, 1998). É causada por defeitosdo metabolismo oxidativo (sistema NADPH oxidase) que normalmenteacompanha a fagocitose em todas as células mielóides. Por meio destemetabolismo oxidativo são produzidos os superóxidos e peróxidos quetêm papel fundamental na eliminação de bactérias patogênicas e fungos.Como resultado desta falha, os pacientes com DGC apresentaminfecções profundas de repetição como pneumonias, abcessos cutâneose hepáticos, linfadenites, osteomielites e septicemia já a partir do primeiroano de vida. Raramente o diagnóstico é feito em adolescentes ou naidade adulta. As infecções são geralmente causadas por organismoscomo S. aureus, Aspergillus, Serratia, Pseudomonas e Salmonella (Roos& Curnutte,1999). O quadro clínico da DGC se sobrepõe ao quadro deoutras imunodeficiências primárias, em particular, as deficiênciashumorais, que no Brasil são causa de 64% das imunodeficiênciasprimárias (Zelasko e col, 1998). Por este motivo, em geral, inicialmenteafasta-se o diagnóstico de deficiência humoral para depois se investigar aDGC.Teste de Redução do Nitroblue Tetrazolium - NBTFinalidade:Destina-se à demonstração histoquímica da redução intracitoplásmática doNBT em neutrófilos para identificar a disfunção neutrofílica (deficiência daenzima NADPH oxidase) e/ou distinguir uma infecção pirogênica.As células de doentes com disfunções metabólicas dos fagócitos (porexemplo, doença granulomatosa crônica, DGC) não apresentaram umaresposta positiva, mesmo quando estimuladas com antígenos bacterianos.O diagnóstico da DGC é feito através da mensuração da atividade daenzima NADPH oxidase sobre o NBT, formando precipitado de Formazan,após ativação dos neutrófilos.O NBT é um dos métodos disponíveis, no teste do NBT (nitrobluetetrazolium) conta-se o número de neutrófilos que contêm um precipitadoazul no citoplasma (normais), decorrente da redução do NBT (coranteamarelo) por superóxidos produzidos pelos neutrófilos ativados. Acontagem é feita por visualização direta da coloração azulada da reduçãodo NBT, intracitoplasmática ao microscópio sendo, portanto, um método umpouco subjetivo e também suscetível a erros.Teste de Redução do Nitroblue Tetrazolium - NBTSem estimulação:É possível realizar um teste de NBT estimulado (tratamentodo sangue com extracto bacteriano do “kit”) como umcontrolo positivo em conjunto com, ou subsequentemente a,este teste de NBT não estimulado para detectar os defeitosmetabólicos da função dos neutrófilos.3

Teste de Redução do Nitroblue Tetrazolium - NBTIncubação da amostra e preparação dos esfregaços:1. Utilizando uma pipeta de plástico, transferir 0,12 mL de solução de NBT para umfrasco.2. Adicionar 0,2 mL de sangue heparinizado devidamente misturado. Misturarcuidadosamente, mas de forma completa, inclinando ligeiramente e “rodando” ofrasco.Não inverter o frasco. Tapar bem.3. Incubar a 37 °C durante 10 minutos. Retirar e deixar assentar, à temperaturaambiente (18–26 °C), durante mais 10 minutos.4. Misturar novamente a mistura de sangue heparinizado com NBT, “rodando”suavemente.5. Com uma pipeta de plástico, transferir 50 a 75 µL da mistura para uma lâmina devidro limpa.NOTA: É necessário prestar especial atenção para minimizar quaisquer danos nosglóbulos brancos durante a preparação do esfregaço.6. Preparar um esfregaço moderadamente espesso para reduzir os danosmecânicos nas células que contêm formazan, que ficam mais frágeis. Deixar secarao ar.7. Proceder ao tratamento do esfregaço com corante de Wright ACCUSTAIN:a. Imergir o esfregaço seco em 1 mL de corante durante 15 segundos.b. Ao esfregaço imerso adicionar 1 mL de água destilada e deixar assentar durante30 segundos (um período de tempo mais longo poderá aumentar a intensidade dacoloração).c. Passar o esfregaço por água, escoar e secar ou deixar secar ao ar.Teste de Redução do Nitroblue Tetrazolium - NBTCom estimulação:Este procedimento pode ser realizado em simultâneo com o,ou subsequentemente ao, teste de NBT não estimulado comouma forma possível para auxiliar a detecção de defeitosmetabólicos da função dos neutrófilos.Incubação da amostra e preparação dos esfregaços:1. Transferir 0,1 mL de solução de NBT para um frasco.2. Utilizando uma pipeta de plástico, adicionar 0,05 mL desangue heparinizado e 5 µL de solução estimulante (extrato deantígenos bacterianos). Misturar cuidadosamente, mas deforma completa, inclinando ligeiramente e “rodando” o frasco.Tapar bem.3. Continuar de acordo com os Passos 3 a 7 descritos em“Procedimento (Semestimulação)” e continuar conforme a secção “Examemicroscópico e contagem”.Teste de Redução do Nitroblue Tetrazolium - NBTTeste de Redução do Nitroblue Tetrazolium - NBTInterpretação:Os valores do teste são apresentados em termos depercentagem de neutrófilos positivos (contendo formazan).Exame microscópico e contagem:Observar o esfregaço corado, utilizando uma objetiva deimersão em óleo (100x) e proceder à contagem de 100 ou maisneutrófilos. Registar como positivos os neutrófilos queapresentarem depósitos de formazan. Estes neutrófilospoderão aparecer difusivamente granulares, mas irão ocorrerpredominantemente como inclusões intracitoplasmáticas degrande dimensão, de forma irregular, com uma cor púrpuraescura a preta.Valores de Referência para Neutrófilos:Intervalo normal: 2–17 % Células positivas.Média de 9 % Células positivas.Obs.: Não contar os monócitos apresentando precipitado de Formazan sóos PMN.(PMN +)(PMN -)4

Doença Granulomatosa Crônica (DGC)Atualmente, o teste recomendado para o diagnósticodesta patologia é a medida da atividade da NADPH oxidasepor citometria de fluxo – teste de oxidação dadiidrorrodamina (DHR) (Holland, 1997; Atkinson e col, 1997;Vowells e col, 1995; Emmendörffer e col, 1994). As célulassão ativadas com PMA (phorbol myristate acetate), umpotente estímulo da atividade da NADPH oxidase, passam aproduzir peróxidos e superóxidos que oxidam a DHR 123 emrodamina 123 com liberação de fluorescência que pode sermensurada por citometria de fluxo.5