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Tornamos o nosso micro‐Raman confocal quando focalizamos a luz
retroespalhada do laser na fenda do monocromador. Para saber se o Raman irá incidir
no centro da fenda, usamos a luz do laser retroespalhada por um espelho colocado após
a objetiva no microscópio, para isso sintonizamos o Ti:Safira fora de 785 nm, onde é
transmitido pelo filtro NOTCH. Uma maneira de certificar se o sistema está confocal é
observar a imagem de um modo Raman na CCD, se ela estiver bem focalizada estamos
na configuração desejada. Dessa forma, os sinais Raman gerados fora do plano de visão
são bastante atenuados. Com essa montagem conseguimos ver sinais Raman Stokes e
anti‐Stokes de partículas capturadas e não capturadas, que serão descritos no capítulo 4.
Para as espectroscopias não lineares, ou seja, luminescência excitada por
absorção de dois fótons, Hiper Rayleigh e Hiper Raman, foram necessárias algumas
modificações. A mais importante foi trocar o laser de Ti:Safira cw pelo laser pulsado de
femtosegundos. Outra modificação importante foi a troca de espelhos e filtros, pois
agora desejamos coletar sinais nas regiões espectrais de 500 nm e 390 nm. O
retroespalhamento do próprio laser na região de 800 nm é facilmente bloqueado com
um filtro passa baixa que corta acima de 600 nm. O maior problema foi a resposta
espectral do BS pois deve refletir tanto o Nd:YAG, o Ti:Safira e os sinais retroespalhados
coletados pela objetiva para o monocromador. Usar o espelho dielétrico para os lasers
de Nd:YAG ou Ti:Safira significaria uma perda enorme na coleta dos sinais para 500 –
390 nm. Acabamos optando pelo uso de um espelho semi‐metálico, com refletividade
da ordem de 80% e resposta espectral praticamente constante na banda de 350‐1100 nm.
Essa resposta espectral constante é um fator importante para não introduzir artefatos
nos espectros. O uso de espelhos dielétricos em bandas espectrais muito largas é sempre
problemático nesse aspecto. Em relação às intensidades, nossa regra prática foi de
sacrificar a intensidade onde a luz é muito intensa em prol das intensidades menores. O
aumento da potência dos lasers pode compensar facilmente as perdas sofridas no BS.
Por outro lado, também aumentamos a intensidade do iluminador do microscópio para
poder compensar a perda de potência da luz visível que incide na câmera de vídeo JVC.
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