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Dependendo do grau desses processos de decaimento, a fluorescência pode ser muito
pouco intensa. Por isso é comum a utilização de marcadores fluorescentes exógenos às
amostras analisadas, geralmente corantes orgânicos, envoltos em substâncias químicas
para evitar o “photobleaching” ou o “quenching” da fluorescência. A desvantagem dos
marcadores exógenos é que podem ser citotóxicos. O “photobleaching” tem sido um
dos grandes problemas da microscopia confocal de fluorescência, em muitos casos
fornecendo ao pesquisador apenas um intervalo de minutos para obtenção de suas
imagens.
Excitação
Emissão Excitação
Emissão
Figura 90. Esquema de absorção de um e múltiplos fótons.
A diferença fundamental entre processos de 1 fóton e multifóton vem da
quantidade de fótons absorvidos em um determinado volume. No caso da absorção de
1 fóton esse número só depende da espessura do volume e não da área do feixe, pois o
coeficiente de absorção α é independente da intensidade. Suponha dois feixes paralelos
com a mesma potência, mas diferentes intensidades, como mostra a Figura 91. As
quantidades de fótons absorvidos por unidade de tempo nessas duas situações, são
dadas por
∆n
∆t
I A − e
=
(1 1 1
hν
−α L
1
)
e
−α
∆n
I A − e
=
(1 L 2 2 2
)
(4. 16),
∆t
hν
e são iguais com a suposição de mesma potência, isto é, I
1A1
= I
2
A2
. A única diferença
entre esses dois casos é a densidade superficial do número de fótons absorvidos. Já na
absorção de dois fótons, onde o coeficiente de absorção depende da intensidade
incidente da forma
α = α 2
I
feixe mais intenso. Tal que,
, a quantidade de fótons absorvidos será muito maior para o
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